Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen Phenylacetyl- carbinolen aus Acetaldehyd und Benzaldehyd in Gegenwart von Pyr vatdecarboxylase aus Zymomonas
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen Phenylacetylcarbinolen aus Acetaldehyd und Benzaldehyden in Gegenwart von Pyruvatdecarboxylase (PDC) aus Zymomonas .
Enantiomerenreine Phenylacetylcarbinole spielen als Zwischenprodukt bei der Ephedrinsynthese eine wichtige Rolle.
In WO 96/37620 wird die Herstellung von Acyloinen aus Acetaldehyd und Benzaldehyd durch Katalyse mit einer gentechnisch veränderten Pyruvatdecarboxylase aus Zymomonas mobilis beschrieben. Es werden insbesondere solche Enzyme als geeignet beschrieben, bei denen der Tryptophanrest in Position 392 durch einen sterisch kleineren Rest wie Alanin, Glycin, Phenylalanin, eucin, Isoleucin, Arginin, Histidin, Serin oder Threonin ersetzt ist. Es wird jedoch beschrieben, daß Acetaldehyd das Enzym inaktiviert und deshalb vorteilhafterweise aus dem Reaktionsgemisch entfernt wird, beispielsweise durch enzymatische Umsetzung mit Alkoholdehydroge- nase zu Ethanol.
Von Bornemann et al . (J.Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 425-430, 1996) werden die Herstellung von R-aromatischen Acyloinen aus Benzaldehyd bzw. Fluor- und Chlor- substituierten Benzaldehyden und Acetaldehyd unter Katalyse mit PDC aus Zymomonas mobilis beschrieben. Die Autoren finden, daß die Reaktionsprodukte zwar mit hoher optischer Reinheit (98 % ee) gebildet werden, jedoch ist die Reaktionsgeschwindigkeit bei Einsatz von Acetaldehyd mehrfach kleiner als bei Einsatz von Pyruvat.
In der Dissertation von H. Bruhn (Verbesserung von Acyloinkon- densationsfähigkeit der Pyruvatdecarboxylase aus Zymomonas mobilis, Heinrich Heine Universität Düsseldorf, 1995) wird die Umset- zung von Acetaldehyd mit Benzaldehyd unter Katalyse durch PDC aus Zymomonas mobilis beschrieben. Die Autorin gelangt zu der Schlußfolgerung, daß Acetaldehyd die enzymatische Synthese des Phenyl- acetylcarbinols inhibiert.
Die beschriebenen Verfahren erfüllen bezüglich ihrer Raum- Zeit - Ausbeute noch nicht die Anforderungen, die an ein technisch und ökonomisch sinnvolles Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen Phenylacetylcarbinolen gestellt werden.
Gefunden wurde ein Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen Phenylacetylcarbinolen der allgemeinen Formel (I)
wobei R für H, F, Cl oder Br steht,
aus Acetaldehyd und Benzaldehyden der allgemeinen Formel (II)
in Gegenwart von Pyruvatdecarboxylase aus Zymomonas, dadurch ge- kennzeichnet, daß im Verlauf der Biotransformation Acetaldehyd in einer solchen Weise kontinuierlich oder diskontinuierlich nachdosiert wird, daß die Konzentration von Acetaldehyd im Reaktions- medium zwischen 20 und 50 mMol/1 beträgt.
Als Benzaldehyde (II) können in dem erfindungsgemäßen Verfahren am Phenylring substituierte und unsubstituierte Verbindungen eingesetzt werden. Bei den substituierten Benzaldehyden werden bevorzugt solche verwendet, die ein oder mehrere Halogenatome, insbesondere Fluor, Chlor oder Brom, enthalten. Die Substitution kann in 2-, 3- oder 4-Stellung erfolgen. Die Ausbeute bei 4-sub- stituierten Benzaldehydedukten ist im allgemeinen höher als bei den 2- oder 3 -substituierten Edukten.
Bevorzugt wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht-substi- tuierter Benzaldehyd (R=H) eingesetzt.
Benzaldehyd wird üblicherweise in etwa stöchiometrischer Menge bezogen auf Acetaldehyd eingesetzt. Man erhält jedoch auch gute Ergebnisse, wenn ein Reaktionspartner in einem Überschuß von bis zu 100 Mol% zugegeben wird. Benzaldehyd wird in der Regel in einer Anfangskonzentration von 40 bis 100 mMol/1 eingesetzt. Eine Nachdosierung von Benzaldehyd im Verlauf der Biotransformation
bis zu den Anfangskonzentrationen ist empfehlenswert, da ansonsten bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein relativer Acetal- dehydüberschuß entsteht, der zu Nebenreaktionen führen kann.
5 Das Verfahren wird in der Regel so durchgeführt, daß die Edukte im Reaktionsmedium vorgelegt werden und die Reaktion durch Zugabe der PDC gestartet wird.
Acetaldehyd wird üblicherweise in einer Konzentration von 20 bis 10 50 mMol/1 vorgelegt. Der Verbrauch von Acetaldehyd wird vorteilhafterweise über den gesamten Verlauf der Biotransformation bestimmt und das umgesetzte Acetaldehyd durch Nachdosieren zum Reaktionsansatz ergänzt.
15 Die Nachdosierung kann kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden. Die Konzentration von Acetaldehyd soll dabei möglichst die Grenzen von 20 bis 50 mMol/1, bevorzugt 20 bis 35 mMol/1 nicht über- oder unterschreiten. Bei einem deutlichen Ober- oder Unterschreiten dieser Grenzen, entstehen häufig nicht -
20 gewünschte Nebenprodukte oder die Umsetzung wird zu langsam.
Durch diese Fahrweise lassen sich unerwartet hohe Phenylacetyl- carbinolkonzentrationen von mehreren Gramm pro Liter Reaktionsmedium erreichen. Eine Inhibierung der PDC wie sie in der eingangs 25 zitierten Literatur beschrieben wird, wurde bei dieser Fahrweise nicht beobachtet.
Wenn sich die Reaktionsgeschwindigkeit infolge Abnahme der Acetaldehydkonzentration verlangsamt, kann durch Nachdosieren von 30 Acetaldehyd wieder eine Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit erreicht werden, was ein klares Zeichen dafür ist, daß das Enzym nicht durch Acetaldehyd inhibiert worden ist.
Eine besonders geeignete Ausführungsform des erfindungsgemäßen 5 Verfahrens ist eine Fahrweise, bei der beide Edukte kontinuierlich oder diskontinuierlich nachdosiert werden.
Als Enzym für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich Pyruvat- decarboxylasen aus Mikroorganismen der Gattung Zymomonas, ins- 0 besondere aus der Art Zymomonas mobilis.
Besonders bevorzugt sind solche PDC-Enzyme, bei denen eine Mutation des Aminosäurerests Nr. 392 (Trp) durchgeführt wurde. Die Positionszählung bezieht sich auf die Sequenz der PDC, wie sie in 5 WO 96/37620 angegeben worden ist. Dort ist auch die gentechnische
Erzeugung solcher Mutationen und die Isolierung der mutierten Enzyme beschrieben.
Besonders gut geeignet sind solche mutierten PDC-Enzyme, bei de- nen der Trp-Rest an Position 392 durch Isoleucin, Alanin oder Methionin ersetzt ist. Diese PDC-Enzyme zeichnen sich durch eine gegenüber dem Wildtyp erhöhte Stabilität und sehr gute Carboliga- seaktivität aus.
Die PDC kann sowohl in löslicher als auch in immobilisierter Form verwendet werden. Als Katalysator eignet sich die PDC in gereinigter Form, wie sie mit üblichen Mitteln der Proteinchemie erhältlich ist. Man kann aber auch gentechnisch veränderte PDC-En- zyme, die sich besonders effektiv isolieren lassen, verwenden, beispielsweise eine PDC, die am C-Terminus noch mehrere zusätzliche His -Reste trägt und die sich mit Hilfe dieser His -Reste leicht durch Metallionenaffinitätschromatographie rein darstellen läßt (Hochuli, Dobli, Schader, J. Chromat. Bd. 411, 177-184, (1987) ) .
Die PDC kann aber auch un- oder teilgereinigt als zellfreier Extrakt in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden.
Als Reaktionsmedium sind Wasser bzw. wäßrige Pufferlösungen bevorzugt. Man führt die Reaktion üblicherweise bei einem pH-Wert zwischen 6 bis 8 aus. Man kann jedoch auch durch Zusatz von mit Wasser verträglichen organischen Lösungsmitteln, beispielsweise niederen Alkoholen, bevorzugt Ethanol oder Isopropanol, die Löslichkeit der Edukte im Reaktionsmedium erhöhen und dadurch die Reaktionsgeschwindigkeit positiv beeinflussen. Gute Ergebnisse erhält man bei Zugabe von 1 bis 5, bevorzugt 1 bis 3 mol Ethanol pro Liter wäßriges Lösungsmittel.
Die Reaktion wird üblicherweise bei einer Temperatur zwischen 10 und 40, bevorzugt zwischen 20 und 30°C durchgeführt.
Neben den bereits beschriebenen Edukten und dem Enzym PDC fügt man noch den Cofaktor Thiaminpyrophosphat in einer Konzentration von 0,1 bis 5 mM, bevorzugt 0,5 bis 2 mM zu.
Ferner gibt man noch Mg -Ionen, bevorzugt in Form von Magnesium- sulfat in einer Konzentration von 1 bis 100 mM, bevorzugt 5 bis 50 mM zu.
Die Reaktion ist in verschiedenen Reaktoren ausführbar, insbesondere in Enzymmembranreaktoren, Rührkesselreaktoren und Strö- mungsrohrrekatoren.
Das erfindungsgemäße Verfahren liefert Phenylacetylcarbinole der allgemeinen Formel I in der R-Konfiguration in hoher Enantio- merenreinheit von 98 % ee und mehr.
Die auf diesem Wege zugänglichen α-Hydroxyketone sind in hohem Maße racemisierungsanfällig. Die racemisierungsfreie Aufarbeitung gelingt durch Chromatographie an Kieselgel 60.
Die Erfindung ist in den folgenden Beispielen näher veranschaulicht.
Beispiel 1 (Vergleichsbeispiel)
Zellfreie Synthese von R-Phenylacetylcarbinol (R-PAC) aus Acetaldehyd und Benzaldehyd
Aus Acetaldehyd und Benzaldehyd wurde in Gegenwart der PDC aus Zymomonas mobilis, bei der Trp 392 durch Methionin ersetzt wurde, R-Phenylacetylcarbinol synthetisiert.
Bedingungen:
Benzaldehyd 40 mM
Acetaldehyd 25 mM
Ethanol 1,5 M Thiaminpyrophosphat 1,0 mM
MgS04 20 mM
Morpholinethansulfonsäure 50 mM
PDC 15,4 μg
(gelöst in Wasser, pH 7,0)
Nach einstündiger Inkubation bei 25°C wurde das Protein durch Zugabe von TFA (10 %ig) denaturiert und durch anschließende Zentri- fugation aus der Reaktionsmischung entfernt.
R-Phenylacetylcarbinol wurde mittels HPLC quantifiziert. Unter diesen Bedingungen entstand 0,62 μmol R-PAC/min mg Protein.
HPLC-Bedingungen
Säule: Spherisorb C8, Fa. Latek, temperiert auf 40°C
Laufmittel: 120 VT Acetonitril, 380 VT Wasser, 0,5 VT Eisessig Flußrate: 1 ml/min
Detektion: UV-Absorption bei 283 nm Referenz: authentisches R-PAC.
Beispiel 2
Zellfreie Synthese von R-Phenylacethylcarbinol (R-PAC) aus Acetaldehyd und Benzaldehyd mit kontinuierlicher Zugabe der Edukte.
Benzaldehyd 40 mM Acetaldehyd 30 mM
Ethanol 1, 5 M
Thiaminpyrophosphat 1,0 mM
MgS04 20 mM
Morpholinethansulfonsäure 50 mM PDC 1,5 mg
(gelöst in Wasser, pH 7,0)
Alle 30 Minuten wurde Acetaldehyd und Benzaldehyd bestimmt. Anschließend wurden die Anfangskonzentrationen der Edukte durch Nachdosieren wiederhergestellt.
Die Quantifizierung von Benzaldehyd erfolgte unter den gleichen HPLC-Bedingungen wie in Beispiel 1 dargestellt. Die Analytik von Acetaldehyd wurde nach dem Verfahren von Beutler (H.O. Beutler, Methods of enzymatic analyses, H.U. Bergmeyer, 606-623) durchgeführt.
R-Phenylacetylcarbinol wurde mittels HPLC quantifiziert. Die Bio- transformation wurde über einen Zeitraum von 10 Stunden durchge- führt.
Unter diesen Bedingungen entstand R-PAC in einer Konzentration von mehreren Gramm pro Liter Reaktionsansatz.
Beispiel 3
Enzymatische Synthese von (R) -1-Hydroxy-l- (3 ' -fluoro- phenyl) propan- 2 -on (meta-Fluor- Phenylacetylcarbinol)
Analog zur Beispiel 2 wurde ein m-Fluorbenzaldehyd eingesetzt. Man erhielt das entsprechende R-l-Hydroxy-1- (3' -fluoro- phenyl) propan- 2 -on in einer Enantiomerenreinheit von > 98 % ee.
Charaktersisierung von (R) -1-Hydroxy-l- (3' -fluorophe- nyl) propan- 2 -on:
Drehwert: aD 25 = -310,1° (c = 1,26, Chloroform)
iH-NMR1 300 MHz, Lösungsmittel CDC13 (s: Singulett; d: Duplett, m: Multiplett) d = 2,15 (s, 3H, CH3); 4,35 (s, 1H, OH); 5,09 (s, 5 1H, CHOH) ; 7,05-7,3 (m, 4H, H-2 ' , 4 ' , 5' , 6 ' ) ppm.
13C-NMR: (75 MHz, Lösungsmittel CDC13) d = 25,2 (CH3) ; 79,5 (CHOH); 114,3 (d, 2J(13C, 19F) = 21 Hz, C-4' 115,8 (d, 2J(13C, 19F) = 21 Hz, C-2') ; 123,1 0 (d, J(13C, 19F) = 3 Hz, C-6') ; 130,6 (d,d, 3J(13C, 9F) = 8 Hz, C-5') ; 140,4 (d, 3J(13C, 19F) = 8 Hz, C-l') ; 163,1 (d, 1J(13C 19F) = 247 Hz, C-3') ; 206,4 (C=0) ppm
I frarotspektroskopie: Kapillar 5 n = 292«
17:
13(
20 1016; 969; 952; 920; ... ._ ..
(769; 752; 735, 697 (d (C=C) aromat. ; 657; 609; 523;
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