CN101486998A - 摩尔根氏变形杆菌的(d)-专一性羰基还原酶的基因序列和氨基酸组成 - Google Patents
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Abstract
摩尔根氏变形杆菌CMCC(B)49208的(D)－专一性羰基还原酶的基因序列和氨基酸组成，属于生物工程技术领域。本发明确定摩尔根氏变形杆菌(Morganella morganii)CMCC(B)49208的(D)－专一羰基还原酶，其基因核苷酸序列为SEQ ID NO：1，其氨基酸组成为SEQ ID NO：2，该(D)－专一性羰基还原酶基因用于生物法拆分外消旋化合物，利用该基因可使其重组菌用于外消旋手性拆分，并为进一步研究用于手性拆分的微生物立体选择性氧化还原酶的多样性，转化途径及反应机理创造条件。
Description
技术领域
摩尔根氏变形杆菌(Morganella morganii)CMCC(B)49208的(D)-羰基还原酶的基因序列和氨基酸组成，该(D)-专一性羰基还原酶基因用于生物法拆分外消旋化合物，属于生物工程技术领域。
背景技术
光学纯d-伪麻黄碱，在医药上是多功能多用途的药物。在临床上主要用于支气管哮喘，过敏型反应，低血压及鼻粘膜充血肿胀引起的鼻塞等治疗。由于麻黄碱分子中含有复合官能团，因此还常被用于有机合成，研制新型药物。因此，开展麻黄碱拆分方法的研究极有意义。
利用生物法转化制备光学纯的手性化合物具有反应条件温和，产物单一，立体选择性、区域选择性和化学选择性较高，并能完成一些化学合成难以进行的反应等优点。合成光学活性物质转化反应大致可分为两类：一类是把外消旋体拆分为两个具有光学活性的对映体；另一类是从外消旋或手性的前体出发，通过催化反应得到不对称的光学活性产物。
90年代起国际上对微生物及酶拆分手性化合物进行大量的研究。酶由氨基酸构成，其活性中心构成了一个不对称环境，有利于对消旋体的识别，是一种高度手性的催化剂。其催化效率高，有较强的专一性。酶促拆分消旋体是比较理想的选择。利用完整细胞对外消旋化合物进行转，可以获得光学纯对映体，在非水相及有机—水双相反应体系中，也可酶促转化制备光学纯化合物。
目前，部分立体选择性氧化还原酶基因已通过基因工程手段获得，而对于来源于Morganella morganii CMCC(B)49208的立体选择性氧化还原酶基因，国内外研究很少，其基因组序列等信息几乎为空白。
发明内容
本发明的目的是提供Morganella morganii CMCC(B)49208的(D)-羰基还原酶的基因序列和氨基酸组成，以便利用该基因的重组菌株进行外消旋手性拆分，并为进一步研究用于手性拆分的微生物立体选择性氧化还原酶的多样性，转化途径及反应机理创造条件。
本发明的技术方案：摩尔根氏变形杆菌(Morganella morganii)CMCC(B)49208的(D)-专一性羰基还原酶，其基因核苷酸序列为SEQ ID NO：1。该摩尔根氏变形杆菌(Morganella morganii)CMCC(B)49208的(D)-专一性羰基还原酶，其氨基酸组成为SEQ ID NO：2。
通过对立体选择性氧化还原酶酶学性质进行研究，认为来源于Morganellamorganii CMCC 490868的(D)-羰基还原酶将底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK)转化为d-伪麻黄碱的反应机理为：在NAD+的存在下，添加葡萄糖，葡萄糖脱氢酶，使NAD+还原为NADH，然后在NADH的存在下，将底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK)不对称还原为d-伪麻黄碱。
该酶催化氧化还原反应的最合适的初始pH为7.5，最合适的转化温度为30℃。底物MAK浓度、葡萄糖的添加量和葡萄糖脱氢酶的浓度分别为150mg/L、100μmol/L、15U/mL。
本发明所采用的微生物为摩尔根氏变形杆菌(Morganella morganii)，保藏于中国医学细菌保藏管理中心，保藏号CMCC(B)NO.49208。
本发明的有益效果：本发明用转化效果较好的菌株Morganella morganiiCMCC(B)49208，分离获得(D)-羰基还原酶进行不对称转化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK)得到单一产物d-伪麻黄碱。
经转化液组成和转化条件优化后，所用酶蛋白不对称转化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK)，产物的产量有较大的提高，确定了优化的转化液组成和转化条件。
获得Morganella morganii CMCC(B)49208的(D)-专一性羰基还原酶的基因，并利用表达该基因的重组大肠杆菌进行外消旋手性拆分，为进一步研究用于手性拆分的微生物立体选择性还原酶的多样性、转化途径及反应机理创造条件。
附图说明
图1CMCC(B)49208的(D)-羰基还原酶的肽指纹图谱。
具体实施方式
Morganella morganii CMCC(B)49208的(D)-专一性羰基还原酶基因的PCR产物经试剂盒纯化后，利用BigDye测序试剂盒和应用生物系统自动DNA测序仪进行核苷酸序列的测序，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，该还原酶氨基酸组成为SEQ ID NO：2。
实施例1：通过常规蛋白质分离纯化方法，获得M.morganii CMCC(B)49208的(D)-专一性羰基还原酶。取一定量酶液加入0.2mol/LpH 7.5的磷酸缓冲液，150mg/L MAK，100μmol/L葡萄糖，10mol/L NADH，15U/mL葡萄糖脱氢酶，双蒸水补足至1mL，在30℃下反应10h，HPLC(Agilent 1100 serices色谱仪，ZORBAX SB C18柱，G1314A紫外检测器，柱温：40℃，检测波长：220nm，进样量：10μL，流动相为甲醇：0.02mol/L的磷酸二氢钾缓冲液:乙酸:三乙胺＝4:96:0.2:0.13(v:v:v:v))。检测结果表明，反应液中89％以上的MAK被转化为d-伪麻黄碱。
利用MADLI-TOF-MS方法获得该羰基不对称还原酶的肽指纹图谱，如图1所示。经NCBI利用MASCOT通过Protein Prospector蛋白数据库对目的蛋白进行鉴定，通过MOWSE评分方法，未能得到100％的匹配识别，初步显示为一种新蛋白。
通过MOWSE评分方法获得最主要的一个匹配，检索所得有意义匹配蛋白为一芽孢杆菌中的亮氨酸脱氢酶，而M morganii CMCC(B)49208菌株也属于芽孢杆菌属，且羰基不对称还原酶与亮氨酸脱氢酶都为氧化还原酶系，此匹配蛋白与目的酶应该有一定的同源性。
与Protein Prospector蛋白数据库的下列序列比对，只与黑体字所标的孩苷酸相同。
1 MALEIFEYLE KYDYEQVVFC QDKESGLKAI IAIHDTTLGP ALGGTRMWTY
51 DSEEAAIEDA LRLAKGMTYK NAAAGLNLGG AKTVIIGDPR KDKSEAMFRA
101 LGRYIQGLNG RYITAEDVGT TVDDMDIIHE ETDFVTGISP SFGSSGNPSP
151 VTAYGVYRGM KAAAKEAFGT DNLEGKVIAV QGVGNVAYHL CKHLHAEGAK
201 LIVTDINKEA VQRAVEEFGA TAVEPNEIYG VECDIYAPCA LGATVNDETI
251 PQLKAKVIAG SANNQLKEDR HGDIIHEMGI VYAPDYVINA GGVINVADEL
301 YGYNRERALK RVESIYDTIA KVIEISKRDG IATYVAADRL AEERIASLKN
351 SRSTYLRNGH DIISRR
实施例2：取上下两部分(“IAIHDTTL”和“IATYVAAD”)核苷酸序列设计兼并引物：
上游引物Z1为：5’-ATHGCNATHCAYGAYACNAC-3’；
下游引物Z1为：5’-GCNGCNACRTANGTNGCDAT-3’
对M.morganii CMCC(B)49208细菌基因组进行PCR扩增。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环后于72℃继续延伸10min，得到900bp左右的基因片段。回收900bp左右的特异性片段，测定该基因片段序列，该段序列与在NCBI网站上面公布的数据库中比对以后，得到同源性较高的均为芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因(leucine dehydrogenaseLeuDH gene)。
选取同源性较高的几个基因序列，分析其保守序列，由此设计全基因PCR扩增引物Z3、Z4：
上游引物Z3：5’-CGCCTGCAGGCGATGGCATTAGAAATCTTCGA-3’
PstI酶切位点
下游引物Z4：5’-CGCCTGCAGGCGTTAGCGACGGCTAATAATGT-3’
PstI酶切位点
以M.morganii CMCC(B)49208细菌基因组为模板进行PCR扩增。反应条件：
95℃预变性5min，95℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环后于72℃继续延伸10min。扩增出1.1kb左右的基因片段，回收1.1kb左右的特异性片段，测定该基因片段序列，得到SEQ ID NO：1，即为M.morganiiCMCC(B)49208的(D)-专一性羰基还原酶目的基因。
实施例3：提取质粒pKK223经PstI酶切后，与同样酶切的目的基因片段连接后转化到E.coli JM109感受态细胞中，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，随机挑取转化子，提取重组质粒，PstI酶切验证已插入目的基因的重组质粒再采用EcoRI酶切，验证获得目的基因正向连接的重组质粒，含有该重组质粒的重组菌进行进一步酶活验证工作。
实施例4：重组菌与宿主菌E.coli JM109(作为对照)在37℃，LB培养基中，200r/min条件下过夜培养后，按1％接种量转接，相同条件培养至对数生长中后期(约4h)，用终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导6h，6000r/min离心6min收集菌体，40mmol/L磷酸缓冲液重新悬浮菌体，在冰浴条件下超声破碎(工作时间1s，间隔时间2s，破壁10min)。4℃，6000r/min离心10min，上清即为无细胞抽提液，取一定量抽提液加入0.2mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液，150mg/L MAK，100μmol/L葡萄糖，10mol/L NADH，15U/mL葡萄糖脱氢酶，双蒸水补足至1mL，在30℃下反应10h，HPLC检测，结果见下表，表明表达目的基因的重组大肠杆菌含有能够专一性转化MAK为d-伪麻黄碱的来源于M.morganii CMCC(B)49208的(D)-专一性羰基还原酶。
序列表
<210>SEQ ID NO：1
<211>1046
<212>DNA
<213>摩尔根氏变形杆菌(Morganella morganii)CMCC(B)NO.49208
<400>1
<210>SEQ ID NO：2
<211>365
<212>PRT
<213>摩尔根氏变形杆菌(Morganella morganii)CMCC(B)NO.49208
<400>2
Claims (2)
1、摩尔根氏变形杆菌(Morganella morganii)CMCC(B)49208的(D)-专一性羰基还原酶，其基因核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
2、如权利要求1所述的摩尔根氏变形杆菌(Morganella morganii)CMCC(B)49208的(D)-专一性羰基还原酶，其氨基酸组成为SEQ ID NO：2。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2019002459A1 (de) | 2017-06-28 | 2019-01-03 | Technische Universität Dresden | Enzyme und verfahren zur stereoselektiven reduktion von carbonylverbindungen, oxidation sowie stereoselektiven reduktiven aminierung - zur enantioselektiven darstellung von alkoholaminverbindungen |
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2008
- 2008-12-29 CN CNA2008102432841A patent/CN101486998A/zh active Pending
Cited By (4)
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| WO2019002459A1 (de) | 2017-06-28 | 2019-01-03 | Technische Universität Dresden | Enzyme und verfahren zur stereoselektiven reduktion von carbonylverbindungen, oxidation sowie stereoselektiven reduktiven aminierung - zur enantioselektiven darstellung von alkoholaminverbindungen |
| DE102017210944A1 (de) | 2017-06-28 | 2019-01-03 | Technische Universität Dresden | Alkoholdehydrogenasen und Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen |
| DE102017210944A9 (de) | 2017-06-28 | 2019-02-28 | Technische Universität Dresden | Alkoholdehydrogenasen und Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen |
| DE102017210944B4 (de) | 2017-06-28 | 2019-05-23 | Technische Universität Dresden | Alkoholdehydrogenasen und Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen |
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