JPS60186287A - 嫌気性好熱細菌に由来する新規プラスミド - Google Patents
嫌気性好熱細菌に由来する新規プラスミドInfo
- Publication number
- JPS60186287A JPS60186287A JP59043366A JP4336684A JPS60186287A JP S60186287 A JPS60186287 A JP S60186287A JP 59043366 A JP59043366 A JP 59043366A JP 4336684 A JP4336684 A JP 4336684A JP S60186287 A JPS60186287 A JP S60186287A
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- JP
- Japan
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- plasmid
- anaerobic
- thermophile
- vector
- psh49
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は嫌気性好熱菌を宿主とする組換えＤＮＡ実験の
ベクターとして有用な新規なプラスミドに関するもので
あり、より詳しくはその分子量が約５．０メガダルトン
であり、図に示される制限酵素開裂地図により特徴づけ
られる新規なプラスミドに関するものである。
ベクターとして有用な新規なプラスミドに関するもので
あり、より詳しくはその分子量が約５．０メガダルトン
であり、図に示される制限酵素開裂地図により特徴づけ
られる新規なプラスミドに関するものである。
従来、組換えＤＮＡ実験は主として大腸菌を宿主とする
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。大腸菌の宿主・ベクター系はほ
ぼ完成されており、また大腸菌以外にも酵母、枯草菌な
どで宿主・ベクター系が開発される応用への道が検討さ
れつつある。
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。大腸菌の宿主・ベクター系はほ
ぼ完成されており、また大腸菌以外にも酵母、枯草菌な
どで宿主・ベクター系が開発される応用への道が検討さ
れつつある。
５０〜８０℃の高温条件下でセルロース、ヘミセルロー
ス、デンプン等を分解し、アルコール類、有機酸、メタ
ン等を生産する嫌気性好熱菌は、バイオマス変換の効率
的生体触媒として、あるいは耐熱性、安定性に優れる有
用酵素の供給源として注目を集めている。従って、嫌気
性好熱性細菌の育種が重要と考えられるが、その為の一
つの、しかも有力な手段と考えられる嫌気性好熱性細菌
の宿主・ベクター系の開発研究は、これまで全く行なわ
れていない。しかも、ベクターの開発研究の基礎となる
べきプラスミドＤＮＡの検索という点についても、嫌気
性好熱菌を材料とした研究は全く知られていない。そこ
で、本発明者らは、嫌気性好熱菌より、選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有し、しかも分子量の小さいプラスミドの検索
を行った。その結果エリスロマイシン耐性を示したサー
モアナエロバクターから分子量約５．０メガダルトンの
プラスミドを単離する事に成功した。
ス、デンプン等を分解し、アルコール類、有機酸、メタ
ン等を生産する嫌気性好熱菌は、バイオマス変換の効率
的生体触媒として、あるいは耐熱性、安定性に優れる有
用酵素の供給源として注目を集めている。従って、嫌気
性好熱性細菌の育種が重要と考えられるが、その為の一
つの、しかも有力な手段と考えられる嫌気性好熱性細菌
の宿主・ベクター系の開発研究は、これまで全く行なわ
れていない。しかも、ベクターの開発研究の基礎となる
べきプラスミドＤＮＡの検索という点についても、嫌気
性好熱菌を材料とした研究は全く知られていない。そこ
で、本発明者らは、嫌気性好熱菌より、選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有し、しかも分子量の小さいプラスミドの検索
を行った。その結果エリスロマイシン耐性を示したサー
モアナエロバクターから分子量約５．０メガダルトンの
プラスミドを単離する事に成功した。
このプラスミドは、前記の制限酵素開裂地図に示される
如く、分子量が小さくしかも数種の制限酵素による切断
点を特異的に有している（以下、本プラスミドをｐＳＨ
４９と略称する）。
如く、分子量が小さくしかも数種の制限酵素による切断
点を特異的に有している（以下、本プラスミドをｐＳＨ
４９と略称する）。
なお、図に示されている制限酵素の略称は次のとおりで
ある。
ある。
ＥｃｏＲＩはエシァリシア・コリ由来の酵素、ＣｌａＩ
はカリオファノン・ラツム由来の酵素、ＰｓｔＩはプロ
ビデンシア・スツアルティ由来の酵素、ＨｐａＩはハエ
モフィルス・パラインフルエンザエ由来の酵素、Ｈｐａ
ＩＩはハエモフィルス・パラインフルエンザエ由来の酵
素、ＰｖｕＩＩはプロテウス・ブルガリス由来の酵素を
それぞれ示している。
はカリオファノン・ラツム由来の酵素、ＰｓｔＩはプロ
ビデンシア・スツアルティ由来の酵素、ＨｐａＩはハエ
モフィルス・パラインフルエンザエ由来の酵素、Ｈｐａ
ＩＩはハエモフィルス・パラインフルエンザエ由来の酵
素、ＰｖｕＩＩはプロテウス・ブルガリス由来の酵素を
それぞれ示している。
プラスミドＤＮＡがベクターたり得る為には、そのプラ
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主に存在していることを示すマーカ
ー）を有していることが必須である。しかし、嫌気性好
熱菌の様に、その育成環境が栄養源に乏しくしかも抗生
物質が存在下しない温泉等である菌について考えた場合
、薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミドを得る事は容易
ではない。従って、性質が不明のいわゆるクリプティッ
ク・プラスミドに宿主染色体由来のマーカーを賦与する
という方式でベクター開発を行わなければならないであ
ろう。その際にｐＳＨ４９を利用すれば、極めて便利で
あるものと考えられる。何故ならば、第１にｐＳＨ４９
は嫌気性好熱菌で複製が可能なプラスミドであるからで
あり、第２には、小さい分子量を有するという点から、
本プラスミドの必須領域、例えば複製開始点領域、複製
に関与する遺伝子等の解析が、容易に行えるという利点
を有しているからである。
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主に存在していることを示すマーカ
ー）を有していることが必須である。しかし、嫌気性好
熱菌の様に、その育成環境が栄養源に乏しくしかも抗生
物質が存在下しない温泉等である菌について考えた場合
、薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミドを得る事は容易
ではない。従って、性質が不明のいわゆるクリプティッ
ク・プラスミドに宿主染色体由来のマーカーを賦与する
という方式でベクター開発を行わなければならないであ
ろう。その際にｐＳＨ４９を利用すれば、極めて便利で
あるものと考えられる。何故ならば、第１にｐＳＨ４９
は嫌気性好熱菌で複製が可能なプラスミドであるからで
あり、第２には、小さい分子量を有するという点から、
本プラスミドの必須領域、例えば複製開始点領域、複製
に関与する遺伝子等の解析が、容易に行えるという利点
を有しているからである。
更にｐＳＨ４９は図からも明らかなように、ＥｃｏＲＩ
、ＨｐａＩＩなどの制限酵素による開裂部位を特定のし
かも限られた位置に有している。このことはｐＳＨ４９
をベクターとして利用する際に、挿入すべき異種遺伝子
の導入部位を有意に保持できるという点で有利である。
、ＨｐａＩＩなどの制限酵素による開裂部位を特定のし
かも限られた位置に有している。このことはｐＳＨ４９
をベクターとして利用する際に、挿入すべき異種遺伝子
の導入部位を有意に保持できるという点で有利である。
本プラスミドをベクターとして用いることにより、バイ
オマス変換効率が高く、有用化成品を生産する嫌気性好
熱菌の育種が可能となろう。
オマス変換効率が高く、有用化成品を生産する嫌気性好
熱菌の育種が可能となろう。
ｐＳＨ４９の入手は、本発明者らが温泉水中から新たに
分離した嫌気性好熱菌、サーモアナエロバクターＮｏ．
４９をＹＰＧ培地（ディフコ・イーストエキストラクト
０．２％、ポリペプトン（大五栄養）０．４％、ＮａＣ
ｌ０．２％、グルコース１％、Ｎａ２ＣＯ３０．３％、
Ｌ−システイン０．２％、ｐＨ７．５）により対数増殖
後期迄増殖させて得た菌体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理
によって溶菌させる事によって達せられる。
分離した嫌気性好熱菌、サーモアナエロバクターＮｏ．
４９をＹＰＧ培地（ディフコ・イーストエキストラクト
０．２％、ポリペプトン（大五栄養）０．４％、ＮａＣ
ｌ０．２％、グルコース１％、Ｎａ２ＣＯ３０．３％、
Ｌ−システイン０．２％、ｐＨ７．５）により対数増殖
後期迄増殖させて得た菌体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理
によって溶菌させる事によって達せられる。
また、サーモアナエロバクターＮｏ．４９の菌学的性質
を表に示すがｐＳＨ４９を保有する点では従来には認め
られない新規な微生物である。
を表に示すがｐＳＨ４９を保有する点では従来には認め
られない新規な微生物である。
本菌株はエリスロマイシン耐性株として温泉水中より分
離されたものである。
離されたものである。
表
（分類学的性質）
生育至適温度；７０℃
生育温度範囲；５０〜７８℃
形態；周鞭毛を有する桿菌０．３〜０．４×１〜４μｍ
胞子形成性；なし グラム染色；不定 ＧＣ含量；３４％ 主要生産物；酢酸、乳酸 糖の利用性；グルコース、ラクトース、マルトースキシ
ロース、デンプン なお、本菌株は微工研菌寄第７４９５号として寄託され
ている。
胞子形成性；なし グラム染色；不定 ＧＣ含量；３４％ 主要生産物；酢酸、乳酸 糖の利用性；グルコース、ラクトース、マルトースキシ
ロース、デンプン なお、本菌株は微工研菌寄第７４９５号として寄託され
ている。
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述する。
実施例１（菌株のスクリーニング）
静岡県熱川温泉の温泉水約１ｍｌをＹＰＧ培地（ディフ
コ・イーストエキストラクト０．２％、大五栄養ポリペ
プトン０．４％、グルコース１％、ＮａＣｌ０．２％、
Ｎａ２ＣＯ３０．３％、Ｌ−システイン０．２％、ｐＨ
７．５）１０ｍｌに加え、炭酸ガス嫌気条件下、７０℃
で約１８時間培養後、エリスロマイシン５０μｇ／ｍｌ
を含むＹＰＧロールチューブで生育したコロニーの一つ
からサーモアナエロバクターＮｏ．４９（微工研菌寄第
７４９５号）が得られた。
コ・イーストエキストラクト０．２％、大五栄養ポリペ
プトン０．４％、グルコース１％、ＮａＣｌ０．２％、
Ｎａ２ＣＯ３０．３％、Ｌ−システイン０．２％、ｐＨ
７．５）１０ｍｌに加え、炭酸ガス嫌気条件下、７０℃
で約１８時間培養後、エリスロマイシン５０μｇ／ｍｌ
を含むＹＰＧロールチューブで生育したコロニーの一つ
からサーモアナエロバクターＮｏ．４９（微工研菌寄第
７４９５号）が得られた。
実施例２
プラスミドｐＳＨ４９のサーモアナエロバクターＮｏ．
４９からの分離 サーモアナエロバクターＮｏ．４９（微工研菌寄第７４
９５号）の生物学的に純粋な培養液から２０ｍｌのＹＰ
Ｇ培地に接種し炭酸ガス嫌気条件下７０℃で１２時間培
養する。この培養液を１ｌのＹＰＧ培地に接種し、７０
℃嫌気条件下１２時間培養する。菌体を遠心によって集
め、アジ化ナトリウム１０ｍＭを添加したＴＥＳ（２０
ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄後、菌体湿重量４ｇ当り
アジ化ナトリウム１０ｍＭを添加した２５％ショ糖含有
ＴＥＳ１０ｍｌに懸濁する。リゾチーム（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を３ｍｌ、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ２ｍｌを加え、０
℃２０分間放置する。この細胞混合液に３００μｌの１
０％ジエチルピロカーボネイトエタノール溶液、１６ｍ
ｌのアルカリＳＤＳ溶液（１％ＳＤＳ、０．２Ｎ Ｎａ
ＯＨ）、１２ｍｌの酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ４．８
）を加え、０℃に２時間放置する。
４９からの分離 サーモアナエロバクターＮｏ．４９（微工研菌寄第７４
９５号）の生物学的に純粋な培養液から２０ｍｌのＹＰ
Ｇ培地に接種し炭酸ガス嫌気条件下７０℃で１２時間培
養する。この培養液を１ｌのＹＰＧ培地に接種し、７０
℃嫌気条件下１２時間培養する。菌体を遠心によって集
め、アジ化ナトリウム１０ｍＭを添加したＴＥＳ（２０
ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄後、菌体湿重量４ｇ当り
アジ化ナトリウム１０ｍＭを添加した２５％ショ糖含有
ＴＥＳ１０ｍｌに懸濁する。リゾチーム（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を３ｍｌ、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ２ｍｌを加え、０
℃２０分間放置する。この細胞混合液に３００μｌの１
０％ジエチルピロカーボネイトエタノール溶液、１６ｍ
ｌのアルカリＳＤＳ溶液（１％ＳＤＳ、０．２Ｎ Ｎａ
ＯＨ）、１２ｍｌの酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ４．８
）を加え、０℃に２時間放置する。
これを７０００ｒｐｍ、１時間の遠心をおこない上清を
得る。この上清に１００ｍｌの９５％エタノールを加え
、２時間−２０℃に静置し、７０００ｒｐｍ、１０分の
遠心で沈澱を得る。この沈澱を５０ｍｌの９５％エテノ
ールで洗浄し減圧乾燥後、１４ｍｌのＴＥＳに溶解し、
ＣｓＣｌ及びエチジウムブロマイドを加えて密度を１．
５８に調整する。この試料を３８０００ｒｐｍで３０〜
４０時間、平衡密度勾配遠心する。生じたプラスミドＤ
ＮＡのバンドを集め、イソアミルアルコールでエチジウ
ムブロマイドを除去した後、ＴＥＮ（２０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，２０ｍＭ ＮａＣｌ）に透
析する事によってプラスミド溶液が得られる。
得る。この上清に１００ｍｌの９５％エタノールを加え
、２時間−２０℃に静置し、７０００ｒｐｍ、１０分の
遠心で沈澱を得る。この沈澱を５０ｍｌの９５％エテノ
ールで洗浄し減圧乾燥後、１４ｍｌのＴＥＳに溶解し、
ＣｓＣｌ及びエチジウムブロマイドを加えて密度を１．
５８に調整する。この試料を３８０００ｒｐｍで３０〜
４０時間、平衡密度勾配遠心する。生じたプラスミドＤ
ＮＡのバンドを集め、イソアミルアルコールでエチジウ
ムブロマイドを除去した後、ＴＥＮ（２０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，２０ｍＭ ＮａＣｌ）に透
析する事によってプラスミド溶液が得られる。
ｐＳＨ４９の特性決定の手順
ｐＳＨ４９の分子量は、その超らせん構造（ｓｕｐｅｒ
ｃｏｉｌｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び制限
酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気泳動
及びポリアクリルアミド・ゲル電気泳動より得られた。
ｃｏｉｌｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び制限
酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気泳動
及びポリアクリルアミド・ゲル電気泳動より得られた。
この際の分子量マーカーはｐＢＲ３２２ＤＮＡ（２．６
７ｍｄ）、ＣｏｌＥＩＤＮＡ（４．２ｍｄ）及びラムダ
ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ分解断片（１４．６、５．８４
、４．０５、２．６７、１．３０、１．１７、０．３４
ｍｄ）、ラムダＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解断片（１３．７
、４．７４、３．７３、３．４８、３．０２、２．１３
ｍｄ）、φ×１７４ＤＮＡのＨａｅＩＩＩ分解断片（０
．８３６、０．６６６、０．５３９、０．３７３、０．
１９２、０．１７４、０．１６７、０．１４５、０．１
２０、０．０７３、０．０４４ｍｄ）を用いた。制限酵
素による切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタノール
沈澱によってＤＮＡを沈澱させ、適当な緩衝液に溶解し
て行なった。制限酵素は宝酒造及び、ベーリンガー・マ
ンハイム社よりの市販品を用いた。アガロースゲル電気
泳動はシーケム社のアガロースを０．５％又は０．７％
の濃度で用い、水平ゲル電気泳動槽によってゲル長さ１
ｃｍ当り１．５Ｖの定電圧で１５〜１７時間行なった。
７ｍｄ）、ＣｏｌＥＩＤＮＡ（４．２ｍｄ）及びラムダ
ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ分解断片（１４．６、５．８４
、４．０５、２．６７、１．３０、１．１７、０．３４
ｍｄ）、ラムダＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解断片（１３．７
、４．７４、３．７３、３．４８、３．０２、２．１３
ｍｄ）、φ×１７４ＤＮＡのＨａｅＩＩＩ分解断片（０
．８３６、０．６６６、０．５３９、０．３７３、０．
１９２、０．１７４、０．１６７、０．１４５、０．１
２０、０．０７３、０．０４４ｍｄ）を用いた。制限酵
素による切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタノール
沈澱によってＤＮＡを沈澱させ、適当な緩衝液に溶解し
て行なった。制限酵素は宝酒造及び、ベーリンガー・マ
ンハイム社よりの市販品を用いた。アガロースゲル電気
泳動はシーケム社のアガロースを０．５％又は０．７％
の濃度で用い、水平ゲル電気泳動槽によってゲル長さ１
ｃｍ当り１．５Ｖの定電圧で１５〜１７時間行なった。
ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動は、生化学工業社製
のポリアクリルアミド・ビスアクリルアミドを用い、５
％濃度３０：１の架橋度のゲルによって垂直型スラブゲ
ル電気泳動槽により、ゲル長さ１ｃｍあたり１０Ｖの定
電圧によって２〜３時間行った。
のポリアクリルアミド・ビスアクリルアミドを用い、５
％濃度３０：１の架橋度のゲルによって垂直型スラブゲ
ル電気泳動槽により、ゲル長さ１ｃｍあたり１０Ｖの定
電圧によって２〜３時間行った。
従来、嫌気性好熱菌においてプラスミドが検出された例
は知られておらず、嫌気性好熱菌サーモアナエロバクタ
ーＮｏ．４９の有するｐＳＨ４９は全く新規なプラスミ
ドである。
は知られておらず、嫌気性好熱菌サーモアナエロバクタ
ーＮｏ．４９の有するｐＳＨ４９は全く新規なプラスミ
ドである。
図−１はｐＳＨ４９の制限酵素開裂地図を示し、図中の
ＥｃｏＲＩはエシァリシア・コリ由来の酵素、ＣｌａＩ
はカリオファノン・ラツム由来の酵素、ＰｓｔＩはプロ
ビデンシア・スツアルティ由来の酵素、ＨｐａＩはハエ
モフィルス・パラインフルエンザエ由来の酵素、Ｈｐａ
ＩＩはハエモフィルス・パラインフルエンザエ由来の酵
素、ＰｖｕＩＩはプロテウス・ブルガリス由来の酵素を
それぞれ示ししている。
ＥｃｏＲＩはエシァリシア・コリ由来の酵素、ＣｌａＩ
はカリオファノン・ラツム由来の酵素、ＰｓｔＩはプロ
ビデンシア・スツアルティ由来の酵素、ＨｐａＩはハエ
モフィルス・パラインフルエンザエ由来の酵素、Ｈｐａ
ＩＩはハエモフィルス・パラインフルエンザエ由来の酵
素、ＰｖｕＩＩはプロテウス・ブルガリス由来の酵素を
それぞれ示ししている。
Claims (1)
- 分子量が約５．０メガダルトンであり、図に示される制
限酵素開裂地図で特徴づけられる嫌気性好熱細菌に由来
する新規プラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59043366A JPS60186287A (ja) | 1984-03-07 | 1984-03-07 | 嫌気性好熱細菌に由来する新規プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59043366A JPS60186287A (ja) | 1984-03-07 | 1984-03-07 | 嫌気性好熱細菌に由来する新規プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60186287A true JPS60186287A (ja) | 1985-09-21 |
| JPS6221516B2 JPS6221516B2 (ja) | 1987-05-13 |
Family
ID=12661846
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59043366A Granted JPS60186287A (ja) | 1984-03-07 | 1984-03-07 | 嫌気性好熱細菌に由来する新規プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60186287A (ja) |
-
1984
- 1984-03-07 JP JP59043366A patent/JPS60186287A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6221516B2 (ja) | 1987-05-13 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |