CN117866869A - 一种针对芽胞杆菌的遗传转化方法 - Google Patents
一种针对芽胞杆菌的遗传转化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种针对野生型芽胞杆菌的转化方法,属于分子生物学技术领域。本发明首先在芽胞杆菌中建立限制系统消除的模型,使外源DNA可以进入细胞中,其次,为了让野生型芽胞杆菌更好的识别外源DNA,又在该模型中引入芽胞杆菌基因组数据库中搜索到的甲基化修饰酶基因,如此构建的模型使不能转化的野生型芽胞杆菌实现转化可遗传操作,或提高野生型芽胞杆菌的转化效率。实验表明,本发明针对地衣芽孢杆菌、解淀粉芽胞杆菌、特基拉芽胞杆菌,其转化效率均有提高,因此具有十分广泛的应用意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种针对野生型芽胞杆菌的转化方法,属于分子生物学技术领域。
背景技术
芽胞杆菌Bacillus species属于革兰氏阳性菌,具有安全无毒,生长周期短,发酵密度高,单层细胞膜结构便于产物后处理等优点,因此芽胞杆菌在外源蛋白和高附加值化学品的生产中具备独特优势,是合成生物学领域备受关注的底盘细胞之一。目前常用的芽胞杆菌底盘细胞主要有枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis,地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis和解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens,主要生产各种酶类,维生素和功能糖等,特别是食品和纺织工业,芽胞杆菌生产的酶制剂占了相当大的市场份额。
相比较大肠杆菌的研究,芽胞杆菌底盘细胞的开发较为滞后,需要开发和建立更多性能优良的芽胞杆菌底盘细胞。然而,受转化方法和遗传操作技术的限制,一些具有良好性状(例如分泌能力强,自身蛋白酶表达背景较低,代谢副产物产量较高等)的芽胞杆菌菌株无法得到充分的开发利用。有效转化的限制导致许多芽胞杆菌遗传背景不清晰,无法实现对其代谢通路的精确调控,因此实现这些菌株的有效转化进而建立高效遗传操作方法,能够为底盘细胞的开发和应用提供技术保障,具有重要的科学意义和应用价值。
限制修饰系统(Restriction and Modification system)广泛存在于细菌和古生菌中,是宿主菌在面对噬菌体,质粒等外源DNA入侵时采取的一种保护机制,又被称为细菌的免疫系统。限制修饰系统通常由限制性内切酶(REases)和DNA甲基转移酶(MTases)组成,宿主通过甲基转移酶对DNA进行甲基化修饰,将自身DNA特定位点的进行甲基化修饰,限制性内切酶则根据这些甲基化烙印区分自身和外来的DNA,并对外源DNA进行切割分解,从而保护机体免受外源DNA入侵。限制修饰系统作为一种防御保护机制对于宿主菌意义重大,但不同菌株之间限制修饰系统的差异性阻碍了质粒向目标菌株的转化。
发明内容
本发明通过对野生型芽胞杆菌甲基转移酶基因的筛选和分析,构建了芽胞杆菌DNA甲基化修饰模型,经该模型处理后的质粒转化效率有所提升同时具备较好的菌种普适性。本发明目的是为野生型芽胞杆菌提供一种有效的质粒转化方法,包括三部分内容:芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模拟模型菌株,质粒DNA甲基化修饰模拟方法,和以模拟模型菌株为基础开发的针对野生型芽胞杆菌的质粒转化方法。
本发明提供一种芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模拟模型菌株,其是敲除芽胞杆菌的限制修饰系统关键酶BsuMI的编码基因bsuMA、bsuMB、bsuRAbsuRB和bsuRC中的一个或多个,并在其基因组上整合表达甲基转移酶BAMs的编码基因S205_GM003528 和 S205_GM004202而得到;
或者其是敲除芽胞杆菌的限制修饰系统关键酶BsuMI的编码基因bsuMA、bsuMB、bsuRAbsuRB和bsuRC中的一个或多个,并在其基因组上整合表达甲基转移酶BLMs的编码基因M1.Bli962ORF4005P,M2.Bli962ORF4005P,M1.Bli11148ORF13295P和M2.Bli11148ORF13295P。
优选地,弱化或敲除芽胞杆菌的限制修饰系统关键酶BsuMI的编码基因bsuMA、bsuMB、bsuRAbsuRB和bsuRC;
所述编码基因S205_GM003528 和 S205_GM004202,或者编码基因M1.Bli962ORF4005P,M2.Bli962ORF4005P,M1.Bli11148ORF13295P和M2.Bli11148ORF13295P通过基因串联后整合到菌株基因祖上进行表达。
所述敲除是采用基因编辑的方法实现,具体采用CRISPR/Cas9技术实现。所述在基因组上整合是采用同源重组技术实现。
所述芽胞杆菌选自枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽胞杆菌、特基拉芽胞杆菌。
本发明进一步提供一种芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模拟方法,其包括如下步骤:
S1 将待修饰的质粒加入到制备好的上述芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模拟模型菌株的感受态细胞中,混匀后进行细胞复苏得到质粒-菌液混合物;
S2将复苏完成的质粒-菌液混合物涂布固体培养基平板进行培养,并根据待修饰质粒携带的筛选标记选用抗性;
S3挑取平板上单克隆进行扩大培养,提取质粒即得模拟后特异性甲基化修饰质粒DNA。
具体地,所述待修饰化质粒是pUC980-2或以其为出发质粒的重组质粒。
所述芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模拟模型菌株的感受态细胞的制备方法可按常规方法进行,具体地,对于枯草芽孢杆菌为例,其制备方法如下:将菌株单克隆于GM1培养基中培养后转接GM2培养基中进行培养得到,其中培养条件具体为37℃,200 rpm的摇床中培养,在GM2培养基中培养时间为1-2 h即得感受态细胞。
所述复苏是使菌液OD600nm达到1.0,该步骤中需根据质粒复制子类型设定复苏温度。
所述S2步骤中,在平板上培养20h-48h。
本发明进一步提供一种芽胞杆菌质粒转化方法,其步骤如下:将上述制备得到模拟后特异性甲基化修饰质粒DNA加入到制备好的芽胞杆菌感受态细胞中,混匀后进行转化操作以完成转化。
所述转化方法是化学转化方法,或者电转化方法。
对于化学转化方法而言,其步骤如下:
S1 将上述制备得到模拟后特异性甲基化修饰质粒DNA加入到制备好的芽胞杆菌感受态细胞中,混匀后进行细胞复苏得到质粒-菌液混合物;
S2将复苏完成的质粒-菌液混合物涂布固体培养基平板进行培养,并根据模拟后特异性甲基化修饰质粒DNA携带的筛选标记选用抗性;
S3挑取平板上的单克隆即实现质粒转化。
任选地,还包括对所述单克隆进行扩大培养并提取质粒。
所述复苏是使菌液OD600nm达到1.0,该步骤中需根据质粒复制子类型设定复苏温度。
所述S2步骤中,在平板上培养20h-48h。
所述芽胞杆菌的感受态细胞的制备方法可按常规方法进行,具体地以枯草芽孢杆菌为例,其制备方法如下:将菌株单克隆于GM1培养基中培养后转接GM2培养基中进行培养得到,其中培养条件具体为37℃,200 rpm的摇床中培养,在GM2培养基中培养时间为1-2 h即得感觉态细胞。
对于电转化方法而言,可以采用常规的电转化方法实现。在具体的一个方法中,其步骤如下:
S1 将上述制备得到模拟后特异性甲基化修饰质粒DNA加入到制备好的芽胞杆菌感受态细胞中,轻轻混匀后得到质粒-菌液混合物;
S2将混合物加入到预冷好的电击杯中进行电击,优选地于1500 v-2500 v电压下进行电击;
S3电击完成后立刻向电击杯中加入复苏培养基混匀后吸出进行复苏培养,
S4将复苏培养的菌液摇匀后放置于46℃水浴处理后,取出再经瞬时离心后,涂布于固体平板上培养,其中并根据模拟后特异性甲基化修饰质粒DNA携带的筛选标记选用抗性;
S5挑取平板上的单克隆即实现质粒转化。
任选地,还包括对所述单克隆进行扩大培养并提取质粒。
优选地,其中感受态细胞的制备方法如下:将待转化菌株培养至菌液OD600 nm在0.85-0.95,将菌液收集于离心管中,冰浴后4℃离心,弃去上清保留菌体;再用SHMP吹洗菌液收集到的菌体,4℃离心弃上清留菌体,该步骤重复二至四次,最后用SHMP吹悬菌体即得,使用前可于-80℃冻存,使用时进行重悬。
本发明最后还提供所述芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模拟模型菌株在芽胞杆菌遗传转化中的应用。优选地,所述芽胞杆菌选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽胞杆菌、特基拉芽胞杆菌。
本发明芽胞杆菌转化方法与现有技术相比不同之处在于:本发明抛开传统的细物理和化学处理细胞的方式,在芽胞杆菌细胞内部建立了芽胞杆菌质粒甲基化修饰模型来对DNA进行特异性甲基化修饰的功能。在这一模型基础之上,本发明针对野生型芽胞杆菌开发了一种菌种普适性较好且转化效率较高的遗传转化方法,解决了野生型芽胞杆菌的转化难题,为底盘菌株的开发利用提供了有力的技术支撑。与现在常用的费用较高的DNA体外甲基转移酶处理方法和需要在特定条件下诱导表达甲基转移酶才能对DNA进行修饰的大肠杆菌Escherichia coliEC135模型相比,本发明所述DNA甲基化修饰方法具有实验成本低,操作步骤简单等优点。
附图说明
图1A:pHT43-cas9-RAN20S13-DRtemp质粒图谱。其用于bsuRA-bsuRB-bsuRC基因敲除。
图1B:pHT43-cas9和pUC980-7-M2N20S15-DMtemp质粒图谱。其用于bsuMA-bsuMB基因敲除,构建得到限制修饰系统敲除菌株B. subtilis 168-R-M-。
图1C: pDG1730-P43-BAMs和pDG1730-P43-BLMs质粒图谱。其用于甲基转移酶编码基因簇向菌株B. subtilis 168-R-M-基因组的整合。
图1D:用于野生型芽胞杆菌遗传转化的质粒pUC980-2。
图2:芽胞杆菌甲基化修饰模拟模型的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。A为限制系统敲除菌株的全基因组PCR验证产物凝胶电泳结果。B为甲基化修饰系统敲除菌株的全基因组PCR验证产物凝胶电泳结果。C为基因组分别整合甲基转移酶基因簇BAMs和BLMs的菌株全基因组PCR验证产物琼脂糖凝胶电泳图。其中,胶图中的样品C:未编辑的菌株基因组PCR结果。
图3:不同修饰类型的质粒化学转化野生型芽胞杆菌的转化效率对比图。
图4:从野生型芽胞杆菌阳性转化子中提取的质粒琼脂糖凝胶电泳图。其中,1为从E.coliDH5α中提取的质粒转化;2为从E.coliEC35(pBM)中提取的质粒转化;3为从168-R-M--P43-BAMs中提取的质粒转化;4为从168-R-M--P43-BLMs中提取的质粒转化(胶图中样品C:从DH5a中提取的质粒pUC980-2)。
图5:不同修饰类型的质粒电击转化解淀粉芽胞杆菌205的转化效率对比图。
图6:从解淀粉芽胞杆菌205阳性转化子中提取的质粒琼脂糖凝胶电泳图。其中,2为从E.coliEC35(pBM)中提取的质粒转化;3为从168-R-M--P43-BAMs中提取的质粒转化;4为从168-R-M--P43-BLMs中提取的质粒转化(胶图中样品C:从DH5a中提取的质粒pUC980-2)。
生物材料保藏信息
解淀粉芽胞杆菌BA-205,在2020年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,分类命名为解淀粉芽胞杆菌Bacillus. amyloliquefaciens,保藏编号为CGMCC No.20093。
特基拉芽胞杆菌BT-BL01,在2021年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,分类命名为特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis,保藏编号为CGMCC No.23661。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行阐述,以期更好的理解本发明,但并不构成对本发明限制。
本发明实施例所涉及实验材料
1.实施例所用菌株如下:
大肠杆菌:模式菌大肠杆菌Escherichia coliDH5α由实验室自有保存;携带有芽胞杆菌甲基化修饰酶表达质粒pBM的大肠杆菌EC135由实验室根据文献(参考文献:Zhang,G et al., A mimicking-of-DNA-methylation-patterns pipeline for overcoming therestriction barrier of bacteria. Plos Genetics, 2012, 8(9): e1002987.)构建获得。
枯草芽胞杆菌:实施例中所用到的枯草芽胞杆菌(B. subtilis):B. subtilis 168,由实验室自有保存。
地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis,以下简称BL):实施例中所用到的BL-124和BL-10101由实验室筛选获得。
解淀粉芽胞杆菌(B. amyloliquefaciens,以下简称BA):菌株BA-23260,BA-66,BA-3450由实验室筛选获得;实施例中所用的BA-205由实验室筛选获得,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.20093。
特基拉芽胞杆菌(Bacillus tequilensis,以下简称BT):实施例中所用的BT-BL01,由实验室筛选获得,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.23661。
2.培养基配方如下:
LB:100 mL培养基含蛋白胨1 g,酵母粉0.5 g和1 g NaCl,用双蒸水补齐体积,调pH=7.0,121℃高压灭菌20min。
CaCl2洗液:100 mL培养基含无水CaCl20.666 g,甘油15 g,121℃高压灭菌20min。
GM1:5 mL培养基含40%葡萄糖100 μL,2%酸水解酪素100 μL,5%酵母提取物100 μL,20% MgSO4·7H2O 5 μL,10×Spizizen基本盐培养基500 μL,0.5% L-色氨酸50 μL,双蒸水4145 μL,所有成分提前灭菌或过滤除菌后再使用。
GM2:5 mL培养基含40%葡萄糖100 μL,2%酸水解酪素50μL,20% MgSO4·7H2O 35 μL,10×Spizizen基本盐培养基500 μL,0.5% L-色氨酸5 μL,双蒸水4310μL,所有成分提前灭菌或过滤除菌后再使用。
10×Spizizen基本盐培养基:100 mL培养基含2 g的 (NH4)2SO4,18.3 g的K2HPO4,6g的KH2PO4和1.2 g柠檬酸钠,调pH=7.2,121℃高压灭菌20 min。
生长培养基LBS:100 mL培养基含蛋白胨1 g,酵母粉0.5 g,1 g NaCl和9 g山梨醇,加入双蒸水补齐体积,调节pH至7.2,121℃高压灭菌20 min。
洗涤培养基SHMP:100 mL培养基含蔗糖8.558 g,0.02 g的MgCl2·6H2O,甘油10 g,加入双蒸水补齐体积,121℃高压灭菌20 min。
复苏培养基LBSPG:100 mL培养基含蛋白胨1 g,酵母粉0.5 g,1 g的NaCl,蔗糖8.558 g,甘油100 g,用0.05M磷酸钾缓冲液(pH=7.0)补齐体积后,121℃高压灭菌20 min。
3.质粒:本发明所述限制修饰系统双敲除菌株的构建采用CRISPR/Cas9技术,所用质粒为pHT43-cas9-RAN20S13-DRtemp(用于构建菌株B. subtilis168-R-),pHT43-cas9和pUC980-7-M2N20S15-DMtemp(用于构建菌株B. subtilis168-R-M-),均由实验室自行构建获得,质粒图谱分别如图1A和图1B所示。本发明所述甲基化修饰模型菌株的构建利用基因组同源重组整合方法,采用质粒为pDG1730-P43-BAMs和pDG1730-P43-BLMs,均以实验室保存的芽胞杆菌非自主复制型质粒pDG1730为基础构建获得,图谱如图1C所示。测定甲基化修饰模型处理后质粒DNA转化效率实验采用大肠杆菌/芽胞杆菌穿梭型高拷贝质粒pUC980-2,由实验室以大肠杆菌常用载体pUC19和枯草芽胞杆菌常用载体pWB980为基础构建获得,质粒图谱见图1D。
4.基因序列:本发明所述枯草芽胞杆菌168限制修饰系统靶基因序列为bsuRA-bsuRB-bsuRC(基因编号分别为:BSU_06090,BSU_06100和BSU_06110)和bsuMA-bsuMB(基因编号分别为:BSU_06060和BSU_06070),参考基因组NCBI收录序列号为NC_000964.3。本发明所述芽胞杆菌DNA甲基化模拟模型中涉及的甲基转移酶编码基因簇,由实验室利用REBASE数据库(网址为http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html)以实验室菌株解淀粉芽胞杆菌205基因组序列为参照进行挖掘后获得,分别为:来源自菌株205基因组的序列S205_GM003528和S205_GM004202(NCBI数据库收录号为NO.CP054415),该基因簇命名为BAMs;由基因M1.Bli962ORF4005P(NCBI数据库收录号NCTC962_04005),M2.Bli962ORF4005P(NCBI收录号NCTC962_04006),M1.Bli11148ORF13295P (NCBI收录号D9Y32_13295)和M2.Bli11148ORF13295P(NCBI收录号D9Y32_13300)组成的基因簇命名为BLMs。
5.多聚核苷酸和引物:本发明所述的B. subtilis168 限制修饰系统关键基因为基因簇bsuRA-bsuRB-bsuRC和bsuMA-bsuMB,分别编码限制性内切酶和甲基转移酶。RA-N20-S13和M2-N20-S15是CRISPR/Cas9编辑技术中靶位点N20序列,分别位于基因bsuRA和bsuMB内部。V-DR-1/V-DR-2用于限制系统敲除菌株的基因组PCR验证,V-DM-1/V-DM-2用于甲基化修饰系统敲除菌株的PCR验证。pDG-S/pDG-A用于甲基转移酶基因基因组整合结果的PCR验证。
引物序列如表1所示。
表1、引物序列
6.其他材料:本发明所述的试剂购买自北京索莱宝科技有限公司,高保真PCR聚合酶购自大连宝生物科技有限公司,DNA marker,Easytaq PCR聚合酶,质粒提取试剂盒,细菌基因组提取试剂盒等材料购买自上海翌圣科技有限公司,引物合成和DNA序列测序鉴定均由实验室委托苏州金唯智生物科技有限公司完成。
实施例1:限制修饰系统双敲除菌株枯草芽胞杆菌B. subtilis 168-R-M-的构建
1.1枯草芽胞杆菌B. subtilis 168感受态细胞的制备
挑取LB固体平板上枯草芽胞杆菌168单克隆于5 mL GM1培养基中,37℃,200 rpm培养14 h后,转接500 μL菌液于4.5 mL GM1中,37℃,200 rpm培养4.5 h,转接500 μLGM1培养物于5 mL GM2培养基中,37℃,200 rpm培养1.5 h,1mL/管分装GM2培养物,感受态细胞制备完成,需现用现配。
1.2质粒pHT43-cas9-RAN20S13-DRtemp转化枯草芽胞杆菌168
质粒pHT43-cas9-RAN20S13-DRtemp同时携带有Cas9蛋白表达元件和根据基因bsuRA-bsuRB-bsuRC而设计的CRISPR靶位点N20序列,以及RA-N20-S1和基因上下游同源臂。取质粒1 μg加入到1mL枯草芽胞杆菌168感受态细胞中混匀,转移至玻璃试管中,37℃,200rpm培养3 h,吸取全部菌液,涂布含5 μg/mL浓度氯霉素(chloramphenicol)的LB固体平板上,37℃静置培养20h-48h。
1.3枯草芽胞杆菌168限制系统关键基因的敲除
挑取转化子转接于2mL含5 μg/mL浓度氯霉素和0.8 mM IPTG诱导剂的液体LB培养基中,37℃,200 rpm培养20h以上。提取全基因组序列,用引物对V-DR-1/V-DR-2验证敲除结果,未被编辑条带大小为6421 bp,敲除成功条带大小为3016 bp,PCR验证结果如图2中A所示。取敲除成功转化子菌液100μL转接于2 mL LB培养基中,37℃,200 rpm培养8 h后转移至45℃,200 rpm条件下继续培养16h后,取20μL菌液在LB固体平板上划线,37℃静置培养20h后,选择50个单克隆做好标记后依次挑取单克隆点板于含5 μg/mL氯霉素LB固体平板,37℃静置培养20h。选择抗性平板上未生长的单克隆在LB液体培养基中扩大培养后保菌,即得限制系统敲除菌株枯草芽胞杆菌168-R-。
1.4重组菌株枯草芽胞杆菌168-R-感受态细胞的制备
枯草芽胞杆菌168-R-的感受态细胞按照本发明实施例1中1.1所述方法制备。
1.5质粒pHT43-cas9和pUC980-7-M2N20S15-DMtemp转化枯草芽胞杆菌168-R-
pHT43-cas9用于表达Cas9蛋白,pUC980-7-M2N20S15-DMtemp携带有根据基因bsuMA-bsuMB而设计的CRISPR靶位点N20序列M2-N20-S15和基因上下游同源臂。取质粒各1μg同时加入到1mL枯草芽胞杆菌168感受态细胞中混匀,转移至玻璃试管中,37℃,200 rpm培养3 h,吸取全部菌液,涂布含5 μg/mL浓度氯霉素和25 μg/mL卡那霉素的LB固体平板上,37℃静置培养20h-48h。
1.6枯草芽胞杆菌168-R-修饰系统关键基因的敲除
挑取转化子转接于2mL含5 μg/mL浓度氯霉素,25 μg/mL卡那霉素和0.8 mM IPTG诱导剂的液体LB培养基中,37℃,200 rpm培养20h以上。提取全基因组序列,用引物对V-DM-1/V-DM-2验证敲除结果,未被编辑条带5466 bp,敲除成功组为2991 bp,PCR验证结果见图2中B。取敲除成功转化子菌液100μL转接于2 mL LB培养基中,37℃,200 rpm培养8 h后,按1%接种量转接于2 mL含0.001% SDS的LB培养基中,37℃,200 rpm培养8 h后按1%接种量转接于2 mL LB培养基中,如此反复传代9-12次后,取20μL菌液在LB固体平板上划线,37℃静置培养20h后,选择50个单克隆做好标记后依次挑取单克隆,分别在含5 μg/mL氯霉素LB固体平板和含25 μg/mL卡那霉素的LB固体平板上点板,37℃静置培养20h。选择抗性平板上未生长的单克隆在LB液体培养基中扩大培养后保菌,即得限制修饰系统双敲除菌株枯草芽胞杆菌168-R-M-。
实施例2:芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模型菌株的构建
2.1限制修饰系统双敲除菌株枯草芽胞杆菌168-R-M-感受态细胞的制备
枯草芽胞杆菌168-R-M-感受态细胞按照本发明实施例1中1.1所述方法制备。
2.2甲基化修饰模型菌株枯草芽胞杆菌168-R-M--P43-BAMs的构建
质粒pDG1730-P43-BAMs由实验室在枯草芽胞杆菌常用的整合型质粒pDG1730基础上,在amyE同源臂中间依次插入甲基转移酶编码基因S205_GM003528和S205_GM004202,两条基因之间插入RBS序列,S205_GM003528上游插入P43启动子和其相应的RBS序列。取1μg质粒pDG1730-P43-BAMs与1 mL枯草芽胞杆菌168-R-M-感受态混合,37℃,200 rpm培养3 h,吸取全部菌液涂布含200 μg/mL 壮观霉素spectinomycin的固体LB平板,37℃静置培养20h后挑取平板上生长的单克隆,转接于2 mL含200 μg/mL壮观霉素的液体LB中,37℃,200 rpm培养20 h。从培养液中提取基因组,利用引物对pDG-S/pDG-A对基因组整合结果进行筛选,基因簇BAMs整合成功菌株基因组鉴定条带大小为3786 bp,未整合则无扩增条带,验证结果如图2中C所示。将整合成功的单克隆扩大培养并保菌,即得甲基化修饰模型菌株枯草芽胞杆菌168-R-M--P43-BAMs。
2.3甲基化修饰模型菌株枯草芽胞杆菌168-R-M--P43-BLMs的构建
pDG1730-P43-BLMs由实验室以pDG1730为出发质粒自行构建获得,amyE同源臂中间依次插入甲基转移酶编码基因M1.Bli962ORF4005P,M2.Bli962ORF4005P,M1.Bli11148ORF13295P,M2.Bli11148ORF13295P,各基因中间插入RBS序列,受上游的P43启动子调控而形成多顺反子结构。质粒pDG1730-P43-BLMs转化菌株168-R-M-步骤与所述一致。从培养液中提取基因组后利用引物对pDG-S/pDG-A对基因组整合结果进行筛选,基因簇BLMs整合成功基因组PCR验证结果条带大小为3982 bp,未整合则无扩增条带,结果验证如图2中C所示。将整合成功的单克隆扩大培养并保菌,即得甲基化修饰模型菌株枯草芽胞杆菌168-R-M--P43-BLMs。
实施例3:芽胞杆菌的转化
本发明所述测定经甲基化修饰模拟模型处理后质粒转化野生型芽胞杆菌的转化效率实验,设立两个对照组:常用于质粒构建的大肠杆菌Escherichia coliDH5α,现有的携带有芽胞杆菌甲基化修饰酶表达质粒pBM的大肠杆菌EC135。
3.1甲基化修饰模拟模型菌株感受态制备
本发明所述甲基化修饰模拟模型菌株感受态细胞参照本发明实施例1.1所述方法制备。
本发明所述对照组菌株大肠杆菌DH5α感受态细胞制备方法如下:从LB固体平板上挑取单克隆接种于2 mL LB液体培养基中,37℃,200 rpm培养12 h-16 h。按2%接种量转接于50 mL LB中,37℃,200 rpm培养到OD600nm=0.4,将菌液收集在50 mL离心管中,冰浴30 min后5000 g,4℃离心10 min,弃上清收集菌体。取CaCl2洗液15 mL吹洗离心后的菌体,混匀后5000 g,4℃离心10 min,重复此操作三次。用1.5 mL的CaCl2洗液吹悬菌体,混匀后50 μL/管分装,-80℃冻存。
本发明所述对照组菌株大肠杆菌EC135(pBM)感受态细胞制备方法与上述类似,不同之处在于菌液培养温度为30℃。
3.2具有不同甲基化修饰的质粒DNA的制备
取1 μg质粒pUC980-2加入到1 mL 甲基化修饰模拟菌株感受态细胞中,混匀后在37℃,200 rpm复苏3 h后涂布含25 μg/mL卡那霉素的LB固体平板,37℃静置培养20 h,挑取单克隆转接于2 mL含25 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃,200 rpm培养20 h后提取质粒即为经特异性甲基化修饰的质粒DNA,分别标记为pUC980-2(BAMs)和pUC980-2(BLMs)。
取5 μL质粒pUC980-2与100 μL大肠杆菌DH5α感受态细胞混匀,冰浴30 min后转移至42℃热激90 s,向混合物中加入500 μL液体LB,吸取菌液涂布含25 μg/mL卡那霉素的LB固体平板,37℃静置培养20 h,挑取单克隆转接于2 mL含25 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃,200 rpm培养20 h后提取质粒。从大肠杆菌DH5α中提取的质粒代表常见实验条件下的质粒DNA甲基化修饰,标记为pUC980-2(DH5α)。
取5 μL质粒pUC980-2与100 μL大肠杆菌EC135感受态细胞混匀,冰浴30 min后转移至42℃热激90 s,向混合物中加入500 μL液体LB,吸取菌液涂布含25 μg/mL卡那霉素的LB固体平板,30℃静置培养30 h,挑取单克隆转接于2 mL含25 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,30℃,200 rpm培养至菌液OD600nm=0.2时向培养基中加入终浓度为0.2%的阿拉伯糖(母液配制为20%浓度,百倍稀释),继续在30℃,200 rpm培养20 h提取质粒,即为具备EC1351表达的甲基转移酶特异性修饰的质粒DNA,代表现有提高芽胞杆菌转化效率的质粒甲基化模拟技术,标记为pUC980-2(EC135)。
3.3具备不同甲基化修饰的质粒pUC980-2转化野生型芽胞杆菌菌株
野生型芽胞杆菌菌株BL-124,BL-10101,BA-23260,BA-66,BA-3450和BT-BL01的感受态细胞参照本发明实施例1中1.1所述方法制备。实施例2已经制备完成代表不同甲基化修饰情况的质粒pUC980-2(BAMs),pUC980-2(BLMs),pUC980-2(DH5α)和pUC980-2(EC135)。每组质粒各取1 μg单独加入到1 mL野生型芽胞杆菌感受态细胞中,混匀后在37℃,200 rpm复苏3 h,测定菌液OD600nm后适当稀释或浓缩保证菌液OD600nm=1.0,将菌液全部涂布含25 μg/mL卡那霉素的LB固体平板,37℃静置培养20 h后取出统计转化子数目,同时挑取单克隆转接于2 mL含25 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃,200 rpm培养20 h后提取质粒验证,结果见图4。
3.4不同甲基化修饰组质粒pUC980-2转化野生型芽胞杆菌的转化效率比较
本发明所述质粒转化野生型芽胞杆菌的转化效率测定实验,本实验室测定本发明中实施例中所用芽胞杆菌(包括解淀粉芽胞杆菌BA-66、BA-23260、BA-3450,以及枯草芽孢杆菌BL-124、BL-1010,以有特基拉芽胞杆菌BT-BL01),1 mL的OD600nm=1.0的菌液活菌数相同,为3.2x1010-3.4x1010之间,因此直接采用转化子数目为标准对转化效率进行比较,比较结果汇总展示见图3。
经甲基化修饰模型处理后质粒不仅能在对照组质粒无法转化的菌株中成功实现转化(BL-124),还具有良好的菌株普适性。其中经BLMs修饰环境模拟后的质粒在本发明所述所有野生型芽胞杆菌菌株中均实现成功转化,具有最佳菌株普适性。与对照组相比,经甲基化修饰环境模拟后的质粒不仅能转化多种菌株,转化效率也得到较大提升。经本发明所述芽胞杆菌DNA甲基化修饰模拟模型修饰后中的质粒转化效率均高于对照组,最高可达对照组pUC980-2(DH5α)和pUC980-2(EC135)的31.5倍和63倍(菌株BA-3450的转化)。这些结果充分表明该质粒甲基化修饰模型作为一项新技术,能够实现较为广泛的野生型芽胞杆菌的遗传转化,对后续底盘细胞的开发和应用工作具有促进作用。
实施例4:解淀粉芽胞杆菌B. amyloliquefaciens205的电转化
本发明所述野生型芽胞杆菌菌株,解淀粉芽胞杆菌BA- 205采用电转化法进行质粒的转化和转化效率的比较。
4.1质粒pUC980-2经不同甲基化修饰模型处理
甲基化修饰模拟模型菌株感受态细胞参照本发明实施例2所述方法制备。本发明所述对照组菌株大肠杆菌DH5α和EC135感受态细胞参照本发明实施例3.1制备。质粒pUC980-2针对各模型菌株的转化和代表不同甲基化修饰情况的质粒pUC980-2的制备均参照本发明实施例3.2所述方法制备,获得四种不同甲基化修饰类型的质粒pUC980-2(BAMs),pUC980-2(BLMs),pUC980-2(DH5α)和pUC980-2(EC135)。
4.2解淀粉芽胞杆菌205感受态细胞的制备
从LB固体平板上挑取菌株单克隆转接于2 mL液体LB培养基中,37℃,200 rpm培养14 h。按2%接种量将菌液转接于40 mL生长培养基LBS中,37℃,200 rpm培养至菌液OD600 nm=0.92,停止培养,将菌液收集于50 mL离心管中,冰浴20 min后12,000 g,4℃离心10 min,弃去上清保留菌体。用25 mL的SHMP吹洗40 mL菌液离心后的菌体,12,000 g,4℃离心10 min,弃去上清保留菌体,如此重复操作三次,最后用1.5mL SHMP吹悬菌体,100 μL/管分装后-80℃冻存。
4.3不同甲基化修饰情况的质粒pUC980-2转化解淀粉芽胞杆菌205
取100 μL重悬后的感受态细胞,加入1 μg具备不同甲基化修饰的质粒pUC980-2,轻柔混匀后静置于冰上20 min。将混合液加入到预冷的2 mm规格的电击杯中,2000v电压下进行电击。电击完成后立刻向电击杯中加入900 μL复苏培养基LBSPG,混匀后吸出至于2 mLEP管中,37℃,220 rpm复苏培养7 h。将菌液摇匀后放置于46℃水浴处理8 min,取出再经瞬时离心后,吸取菌液全部涂布于含25 μg/mL的卡那霉素(kanamycin)固体LB平板上,37℃培养箱培养48 h。统计转化子数目,挑取单克隆转接于2 mL含25 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃,200 rpm培养20 h后提取质粒验证,结果见图6。
4.4不同甲基化修饰组质粒pUC980-2转化解淀粉芽胞杆菌205的转化效率比较
本发明所述经不同甲基化模型处理后的质粒转化同一株解淀粉芽胞杆菌205,感受态同一批制备因而生长状态一致,因此质粒转化效率的比较采用转化子数目作为指标,比较结果见图5。根据结果分析可得,pUC980-2(DH5α)难以实现在解淀粉芽胞杆菌205中的转化,而质粒pUC980-2(BAMs)不仅成功转化,且转化效率最高,分别是对照组pUC980-2(EC135)和实验组pUC980-2(BLMs)的19.5倍和65倍。这一提升说明本发明所述特异性甲基化修饰方法和转化方法确能实现和促进质粒对解淀粉芽胞杆菌205的转化。
本发明所述实施例3和4野生型芽胞杆菌质粒转化结果表明,经本发明构建的两株甲基化模拟模型菌株枯草芽胞杆菌168-R-M--P43-BAMs和168-R-M--P43-BLMs处理后的质粒具有最高转化效率和最优菌株适应性,该质粒甲基化修饰模型具有广泛的菌株应用前景和良好的使用效果。
本发明所述以芽胞杆菌甲基化修饰模拟模型为基础搭建的野生型芽胞杆菌质粒转化具方法备操作简单,转化效率较高,菌种普适性较好等优势。虽然这些优势已在实施例中公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰。因此,本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模拟模型菌株,其是弱化或敲除芽胞杆菌的限制修饰系统关键酶BsuMI的编码基因bsuMA、bsuMB、bsuRAbsuRB和bsuRC中的一个或多个,并在其基因组上整合表达甲基转移酶BAMs的编码基因S205_GM003528 和 S205_GM004202而得到;
或者其是敲除芽胞杆菌的限制修饰系统关键酶BsuMI的编码基因bsuMA、bsuMB、bsuRAbsuRB和bsuRC中的一个或多个,并在其基因组上整合表达甲基转移酶BLMs的编码基因M1.Bli962ORF4005P,M2.Bli962ORF4005P,M1.Bli11148ORF13295P和M2.Bli11148ORF13295P。
2.如权利要求1所述的芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模拟模型菌株,其特征在于,弱化或敲除芽胞杆菌的限制修饰系统关键酶BsuMI的编码基因bsuMA、bsuMB、bsuRAbsuRB和bsuRC;
所述编码基因S205_GM003528 和 S205_GM004202,或者编码基因M1.Bli962ORF4005P,M2.Bli962ORF4005P,M1.Bli11148ORF13295P和M2.Bli11148ORF13295P通过基因串联后整合到菌株基因祖上进行表达。
3.如权利要求1或2所述的芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模拟模型菌株,其特征在于,所述敲除是采用基因编辑的方法实现,具体采用CRISPR/Cas9技术实现;在基因组上整合是采用同源重组技术实现。
4.如权利要求1或2所述的芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模拟模型菌株,其特征在于,所述芽胞杆菌选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽胞杆菌、特基拉芽胞杆菌。
5.一种芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模拟方法,其包括如下步骤:
S1 将待修饰的质粒加入到制备好的如权利要求1至4任一项所述的芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模拟模型菌株的感受态细胞中,混匀后进行细胞复苏得到质粒-菌液混合物;
S2将复苏完成的质粒-菌液混合物涂布固体培养基平板进行培养,并根据待修饰质粒携带的筛选标记选用抗性;
S3挑取平板上单克隆进行扩大培养,提取质粒即得模拟后特异性甲基化修饰质粒DNA。
6.如权利要求5所述的芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模拟方法,其特征在于,所述待修饰化质粒是pUC980-2或以其为出发质粒的重组质粒。
7.如权利要求5所述的芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模拟方法,其特征在于,所述芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模拟模型菌株的感受态细胞的制备方法如下:将菌株单克隆于GM1培养基中培养后转接GM2培养基中进行培养得到,其中培养条件具体为37℃,200 rpm的摇床中培养,在GM2培养基中培养时间为1-2 h即得感受态细胞。
8.如权利要求5所述的芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模拟方法,其特征在于,所述复苏是使菌液OD600nm达到1.0,该步骤中需根据质粒复制子类型设定复苏温度;所述S2步骤中,在平板上培养20h-48h。
9.一种芽胞杆菌质粒转化方法,其步骤如下:将如权利要求5至8任一项所述芽胞杆菌质粒DNA甲基化修饰模拟方法制备得到模拟后特异性甲基化修饰质粒DNA加入到制备好的芽胞杆菌感受态细胞中,混匀后进行转化操作以完成转化。
10.如权利要求9所述的芽胞杆菌质粒转化方法,其特征在于,所述转化方法是化学转化方法,或者电转化方法。
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