CN117658341A - 一种硝基还原酶Ntr3在降解CL-20中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种硝基还原酶Ntr3在降解CL‑20中的应用。所述硝基还原酶Ntr3氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明首次明确了硝基还原酶Ntr3属于YdjA类硝基还原酶，作为一类新型硝基还原酶，其具有更为宽泛的黄素蛋白和底物结合区，在有害化合物生物降解方面可发挥重要作用。

Description

一种硝基还原酶Ntr3在降解CL-20中的应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种硝基还原酶Ntr3在降解CL-20中的应用。

背景技术

六硝基六氮杂异伍兹烷(Hexanitrohexaazaisowurtzitane，CL-20)作为一种新型含能材料，具有较高的能量和热稳定性，在发射药、推进剂中具有广阔应用前景。然而，CL-20可造成小鼠微核率显著升高，并造成骨髓细胞染色体断片及缺失，并形成非整倍体，对哺乳动物具有明显致突变性；在生态毒性方面，CL-20对蚯蚓和土壤微生物具有明显毒性，可导致成虫存活率及幼虫繁殖率显著降低。

本申请部分发明人前期研究发现，CL-20可由需氧土壤细菌发挥生物降解作用，这些细菌能够利用CL-20作为唯一氮源生长。在此基础上筛选获得一株可降解含能材料的假单胞菌(Pseudomonas sp.)，公开于申请号为202010775655.1的中国专利，该假单胞菌可在48h内使含能材料浓度降低到0μg/mL左右，然而，该降解菌在CL-20代谢过程中哪些基因和酶蛋白参与尚不清楚。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种硝基还原酶Ntr3在降解CL-20中的应用。

本发明具体采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种硝基还原酶Ntr3的如下任一应用：

1)降解含能材料；

2)制备降解含能材料的产品；

所述硝基还原酶Ntr3氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述含能材料为六硝基六氮杂异伍兹烷。

所述产品中以所述硝基还原酶Ntr3为唯一有效成分或有效成分之一，所述产品中还包括组成任何利于六硝基六氮杂异伍兹烷降解的体系。

第二方面，本发明提供编码所述硝基还原酶Ntr3的基因。

在本发明的一具体实施方案中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

第三方面，本发明提供携带所述基因的质粒。

第四方面，本发明提供携带所述质粒的宿主表达菌株。

在本发明的一具体实施例中，所述宿主表达菌株为BL21(DE3)菌株。

第五方面，本发明提供所述基因、所述质粒或所述宿主表达菌株在制备降解含能材料的产品中的应用，所述含能材料为六硝基六氮杂异伍兹烷。

第六方面，本发明提供一种降解含能材料的方法，包括在含有所述含能材料的环境中加入所述宿主表达菌株的表达产物的步骤，所述含能材料为六硝基六氮杂异伍兹烷。

进一步的，所述表达产物为含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的融合蛋白。

在本发明的一具体实施例中，所述含能的环境为含有六硝基六氮杂异伍兹烷的水溶液体系。

本发明具有如下有益效果：

本发明获得的硝基还原酶Ntr3属于YdjA类硝基还原酶，作为一类新型硝基还原酶，其具有更为宽泛的黄素蛋白和底物结合区，在有害化合物生物降解方面可发挥重要作用。

附图说明

图1为Pseudomonas sp.ZyL-01Ntr3硝基还原酶系统发育树。

图2中，(a)为Pseudomonas sp.ZyL-01Ntr3硝基还原酶与已知YdjA酶氨基酸序列比对，(b)为Pseudomonas sp.ZyL-01Ntr3硝基还原酶的三级空间结构。

图3为含目的基因的pET-30a表达载体质粒。

图4为融合蛋白表达SDS-PAGE分析图，M：Marker蛋白；1：诱导前总蛋白；2、3：20℃上清/沉淀；4、5：37℃上清/沉淀。

图5为融合蛋白镍琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE分析图，M：marker蛋白；1：上样；2：流出；3：20mM洗脱组分；4：50mM；5：100mM；6：500mM

图6为纯化蛋白SDS-PAGE分析图，M：蛋白marker；1：融合目的蛋白。

图7为最终纯化蛋白Western Blot分析图，M：蛋白marker；1：融合目的蛋白。

图8为CL-20浓度对降解速度的影响，图a为不同底物浓度CL-20降解1小时的剩余量，图b为底物浓度与降解速率双倒数图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：硝基还原酶的筛选和结构分析

1.硝基还原酶的筛选

从CL-20微生物降解菌Pseudomonas.Sp.ZyL-01(CGMCC No.18373)中筛选获得了一种硝基还原酶，该菌株的保藏证明和遗传资源信息已披露于申请号为202010775655.1的中国专利。

所述硝基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因如SEQ ID NO.2所示.

2.硝基还原酶氨基酸序列分析及三级结构模拟

从Pseudomonas.Sp.ZyL-01全基因组测序结果中提取所述硝基还原酶的氨基酸序列，并与Genbank数据库中的序列进行Blast比对，用Mega5.0软件进行系统发育树分析。如图1所示，该硝基还原酶与硝基还原酶YdjA的序列一致性最高，达到44.44％，将该酶命名为Pseudomonas sp.ZyL-01Ntr3。

以Escherichia coli K12中的硝基还原酶Ntr3为Pseudomonas sp.ZyL-01Ntr3同源建模的模板，将序列发送到Swiss model server(http://www.expasy.org/swissmod/)进行建模，获得三级结构模拟结果。如图2所示，获得的Pseudomonas sp.ZyL-01Ntr3由两个α螺旋和一个β折叠以同源二聚体组成。

实施例2：Pseudomonas sp.ZyL-01Ntr3的表达与纯化

1实验方法

1.1硝基还原酶Ntr3基因表达载体的构建

将扩增得到的Pseudomonas sp.ZyL-01Ntr3基因克隆到表达载体pET30a中，以NdeI/Xho I作为酶切位点，在酶基因C端加入6×His标签用于产物分离纯化。将构建的质粒转入感受态BL21(DE3)中进行表达。详细构建步骤如下：

(1)提取Pseudomonas pulida.ZyL-01菌的基因组

参照菌体基因组提取方法提取Pseudomonas sp.ZyL-01菌的基因组。

(2)引物设计

PCR引物由实验室自行设计，并由上海生工合成。

ZyL-01/Ntr3_F(SEQ ID NO.3)：CAGTCATATGATGCAGGCTCTCGACG CTTT；

ZyL-01/Ntr3_R(SEQ ID NO.4)：CGATCTCGAGGGCCTTCCCGGGCCA GGCGC。

(3)PCR产物扩增

PCR反应加样体系详见表1，反应程序详见表2。

表1PCR反应加样体系

表2PCR反应程序

(4)PCR产物纯化

用1.5％琼脂糖凝胶电泳，5v/cm电压，跑胶20min，将Ntr3(564bp)的电泳产物在紫外灯下切取出来进行胶回收。

①将PCR产物进行电泳。

②在紫外灯照射下，从凝胶上切下PCR产物目的条带装于EP管中并称取凝胶重量。

③按照1:1比例加入Binding Solution溶液，55℃条件下溶胶10min，直至凝胶完全融化。

④将完全融化的凝胶液体全部转移至吸附柱内，室温条件下静置2min，6,000rpm离心1min后弃废液。

⑤向吸附柱内加入500μL WA Solution，12,000rpm离心1min后弃去废液。

⑥向吸附柱内加入500μL Wash Solution溶液，12,000rpm离心1min后弃去废液。

⑦重复⑥一次。

⑧12,000rpm离心1min，打开盖子，室温放置，晾干Wash Solution。

⑨将吸附柱放入新的EP管，吸附柱内加入30μL ddH₂O，室温静置5min，12,000rpm离心1min得到DNA片段回收液。

(5)载体酶切

酶切连接体系和反应条件详见表3、表4。

表3酶切连接体系

表4酶切反应程序

(6)目的基因酶切

酶切连接体系和反应条件详见表5、表6。

表5酶切连接体系

表6酶切反应程序

(7)连接反应

DNA连接反应体系及程序详见表7、表8。

表7DNA连接反应加样体系

表8连接反应程序

(8)转化

将5-10μL连接产物加入BL21(DE3)感受态中，涂布于卡那霉素抗性平皿上，于37℃培养12h后进行菌斑PCR鉴定。

(9)菌斑PCR鉴定

挑取10个单菌落分别接种至3mL含有卡那霉素的LB培养基试管中，37℃培养12h后进行PCR鉴定，引物：customVector鉴定引物。PCR加样体系和程序详见表9、表10。

表9PCR反应加样体系

表10PCR反应程序

取100μL阳性反应结果对应的菌液进行测序，将其余400μL菌液接种于LB液体培养中，30℃，120rpm进行培养。

1.2融合蛋白的表达与纯化

(1)蛋白表达

①细菌活化：挑取单菌落，接种于30μg/mL的卡那霉素LB培养基中，30℃、120rpm培养12h。

②诱导：均匀悬浮菌液，使用分光光度计检测菌液OD₆₀₀，待达到0.6时，向培养基中加入0.5mM的IPTG进行诱导，并将未添加诱导剂的细菌作为阴性对照。分别于20℃培养12h、30℃培养6h；

③收集菌体：4,000rpm，4℃条件下离心10min后弃去上清，收集菌体沉淀，使用缓冲液A洗涤3次；

④表达检测：使用缓冲液A重新悬浮收集到的菌体，超声破碎后：4,000rpm，4℃条件下离心20min，分别收集上清和沉淀，沉淀加入缓冲液B进行溶解。向上清和沉淀中加入Loading Buffer进行制样。

⑤蛋白表达：在含30μg/mL卡那霉素的100ml LB液体培养基中培养，37℃120rpm，待其OD₆₀₀达到大约0.6左右时，添加0.5mM IPTG 1mL，20℃条件下培养过夜，表达蛋白，离心收集菌体，洗涤3次。

(2)蛋白纯化

①收集总蛋白：使用缓冲液C悬浮菌体，超声破碎使其充分裂解，12,000rpm，4℃离心30min，收集上清粗蛋白，过0.45μm滤膜；

②平衡：取5mL Ni-NTA重力柱，用5倍柱床体积的Binding buffer清洗；

③上柱：将总蛋白加入重力柱，平衡后的柱填料孵育1h，收集穿透液；

④平衡：使用5倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱；

⑤洗杂：使用5倍柱床体积的Washing buffer洗柱，并收集杂蛋白；

⑥洗脱：使用Elution buffer洗脱，收集目的蛋白；

⑦纯化检测：向总蛋白，穿透液，杂蛋白，目的蛋白等组分中加入Loading Buffer，煮沸10min，制样，进行SDS-PAGE，浓缩胶80V，分离胶120V。

⑧透析浓缩：将纯化后的组分透析到20mM Tris中，梯度透析，透析结束后用PEG20000浓缩，0.45μm滤膜过滤后分装至离心管中，-80℃保存。

试剂配制方法详见表11。

表11试剂配制方法

(3)SDS-PAGE检测

①SDS制胶：离心管中配制12％的SDS分离胶混合液，将制备好的混合液迅速倒入胶槽中，避免产生气泡。向分离胶液面上层缓慢添加适量双蒸水，防止氧化，保持液面平整。室温静置30min，使其凝固。弃去上层双蒸水，加入提前制备的5％浓缩胶混合液，插入梳子，室温静置30min；

②上样：将凝胶置于电泳液中，小心拔去梳子，用移液器依次加入蛋白Maker及样品；

③电泳：将电泳仪调至电压档，80V恒压运行。待溴酚蓝指示线平整后调节电压为120V，电泳至溴酚蓝指示线靠近凝胶边缘。

(4)Western Blot

①转膜：取电泳完成的SDS凝胶，将其放置在夹心转膜装置上，表面覆盖活化完成的PVDF膜，将转膜装置放入电泳槽中，恒流200mA，电泳1h；

②封闭：取出PVDF膜，加入3％BSA，室温封闭1h；

③一抗孵育：将膜放入孵育盒中，加入鼠抗His标签的一抗，4℃，30rpm，孵育10h；

④二抗孵育：洗去一抗，加入HRP标记的羊抗鼠二抗，室温孵育1.5h；

⑤显色：使用TMB显色法进行显色，观察目标抗原。

2结果与分析

2.1成功构建了含Pseudomonas sp.ZyL-01Ntr3质粒的工程菌

取3-5个阳性条带对应的菌液，取100μL送样测序，其余400μL菌液接种到含有3mL卡那抗性的LB培养基试管中在摇床上于30℃条件下培养，待测序结果出来后，取测序正确的菌液提取质粒，质粒命名为：[pET30a-Ntr3硝基还原酶克隆+]。

将质粒用Esp3 I酶切，得到片段分别为1127bp、1577bp和3101bp，其中目的基因位于3101bp片段中。详见图3。

2.2融合蛋白的纯化及验证

诱导剂在原核表达体系的外源基因表达中往往起到重要作用。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强且稳定的诱导剂，常用于原核表达体系中，可与Lac阻遏蛋白结合，导致其蛋白构象发生变化，导致阻遏物从基因上解离下来，促使RNA聚合酶开启反应发生转录。

本研究采用含pET30a-Ntr3质粒的BL21(DE3)菌，进一步进行活化培养，IPTG诱导表达，收集菌体后进行蛋白纯化，并经过SDS-PAGE以及Western Blot验证，获得纯度>80％的含Pseudomonas sp.ZyL-01Ntr3的融合蛋白。

(1)IPTG诱导后目的融合蛋白表达量明显升高

融合蛋白的分子量约为21kDa。采用SDS-PAGE检测在20℃和37℃条件下IPTG诱导后上清和沉淀中的目的蛋白表达情况。结果表明，IPTG诱导后目的蛋白表达量明显增加，其中20℃诱导上清中表达量最高(图4)。

(2)采用不同洗脱组分进行蛋白纯化

分别选择20mM、50mM、100mM和500mM咪唑洗脱组分进行蛋白纯化。纯化结果详见图5。

(3)采用SDS-PAGE和Western Blot验证目的蛋白

融合蛋白经过纯化，使用SDS-PAGE进行初步验证。实验结果表明，在理论分子量(21kDa)附近位置出现了明显条带(图6)，成功获得了纯化的融合蛋白。

为进一步确定纯化获得的蛋白为是否为目的蛋白，使用Western Blot方法进行特异性检测。发现在相应位置出现明显条带(图7)，表明该融合蛋白即为目的蛋白。

采用非干扰型蛋白定量试剂盒检测最终纯化蛋白的浓度，为0.90mg/mL。将其保存在缓冲液中(20mM Tris,pH＝8.0)。分装，-80℃冰箱保存，避免反复冻融。

实施例3：酶代动力学研究

将50μg/mL实施例2纯化的融合蛋白加入不同浓度(CL-20浓度系列为：1、10、25、50、100和200μM)的CL-20溶液中，在室温(20-25℃)下连续反应1h，采用HPLC方法检测CL-20浓度。每组设置3个重复。结果如图8(a)所示。

本研究获得的硝基还原酶Ntr3属于氧化还原酶，为双底物反应。酶反应初始速度(v)为1小时的降解速度，酶反应初始速度(v)与初始底物浓度(S)关系的计算公式为：

以不同浓度CL-20为底物，以酶反应初始速度的倒数与初始底物浓度倒数/>进行双倒数作图，得到：

其中，直线与y轴截距为线性回归系数为/>

CL-20浓度系列为：1、10、25、50、100和200μM。以初始底物浓度与初始反应速度双倒数作图，结果如图8(b)所示，得到回归方程为：

计算得到最大速度为Vmax＝1.418μM/L·min，米氏常数Km＝84.20μM。

需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种硝基还原酶Ntr3的如下任一应用：

1)降解含能材料；

2)制备降解含能材料的产品；

所述硝基还原酶Ntr3氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述含能材料包括六硝基六氮杂异伍兹烷。

3.编码权利要求1中所述硝基还原酶Ntr3的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.携带权利要求4所述基因的质粒。

6.携带权利要求5所述质粒的宿主表达菌株。

7.根据权利要求6所述的宿主表达菌株，其特征在于，其为BL21(DE3)菌株。

8.权利要求3所述基因、权利要求5所述质粒或权利要求6所述宿主表达菌株在制备降解含能材料的产品中的应用，其特征在于，所述含能材料为六硝基六氮杂异伍兹烷。

9.一种降解含能材料的方法，其特征在于，包括在含有所述含能材料的环境中加入权利要求7所述宿主表达菌株的表达产物的步骤，所述含能材料为六硝基六氮杂异伍兹烷。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述表达产物为含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的融合蛋白。