JPH0787963A - ビオチン高産生微生物およびその育種方法 - Google Patents
ビオチン高産生微生物およびその育種方法Info
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- JPH0787963A JPH0787963A JP19939193A JP19939193A JPH0787963A JP H0787963 A JPH0787963 A JP H0787963A JP 19939193 A JP19939193 A JP 19939193A JP 19939193 A JP19939193 A JP 19939193A JP H0787963 A JPH0787963 A JP H0787963A
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- Japan
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- pimelic acid
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ピメリン酸からビオチンを高産生する能力を
有するコリネ型細菌の提供。 【構成】 ビオチン生合成に関与する酵素をコードする
遺伝子群の少なくとも一つの遺伝子が導入されたプラス
ミドで形質転換されたピメリン酸からビオチン産生能を
有するコリネ型細菌を、グルコースを単一炭素源として
含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しない平
板培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの大き
さによって選別して得られるビオチン高産生能コリネ型
細菌ブレビバクテリウム・フラバムMJ233−709
株および該菌株をコハク酸を単一炭素源とした以外は上
記と同様の平板培地上で培養し、該培地上に生育したコ
ロニーの大きさによって選別して得られるビオチン高産
生能コリネ型細菌ブレビバクテリウム・フラバムMJ2
33−SL2株。 【効果】 本発明のコリネ型細菌を用いて、ピメリン酸
からビオチンを著量産生することができる。
有するコリネ型細菌の提供。 【構成】 ビオチン生合成に関与する酵素をコードする
遺伝子群の少なくとも一つの遺伝子が導入されたプラス
ミドで形質転換されたピメリン酸からビオチン産生能を
有するコリネ型細菌を、グルコースを単一炭素源として
含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しない平
板培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの大き
さによって選別して得られるビオチン高産生能コリネ型
細菌ブレビバクテリウム・フラバムMJ233−709
株および該菌株をコハク酸を単一炭素源とした以外は上
記と同様の平板培地上で培養し、該培地上に生育したコ
ロニーの大きさによって選別して得られるビオチン高産
生能コリネ型細菌ブレビバクテリウム・フラバムMJ2
33−SL2株。 【効果】 本発明のコリネ型細菌を用いて、ピメリン酸
からビオチンを著量産生することができる。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はビオチン高産生能を有す
るコリネ型細菌およびその育種方法に関する。ビオチン
はヒト、動物、植物及びある種の微生物の生育に必要と
されるビタミンの1種であり、特に皮膚代謝の調整剤と
して、あるいはヒトの脱毛防止養毛剤として、あるい
は、家畜飼料への添加剤として用いられる有用な物質で
ある。
るコリネ型細菌およびその育種方法に関する。ビオチン
はヒト、動物、植物及びある種の微生物の生育に必要と
されるビタミンの1種であり、特に皮膚代謝の調整剤と
して、あるいはヒトの脱毛防止養毛剤として、あるい
は、家畜飼料への添加剤として用いられる有用な物質で
ある。
【0002】
【従来の技術】ビオチンは卵黄から分離され、またビー
ル酵母、穀類、様々な動物の器官等の中に遊離型もしく
は蛋白質に結合した型で見出されている。微生物を用い
たビオチンの製造法としては、バチルス(Bacill
us)属、エシェリヒア(Escherichia)
属、アグロバクテリウム(Agrobacteriu
m)属、クロモバクテリウム(Chromobacte
rium)属、シュードモナス(Pseudomona
s)属、アースロバクター(Arthrobacte
r)属、セラチア(Serratia)属等の微生物を
用いる方法が知られている。
ル酵母、穀類、様々な動物の器官等の中に遊離型もしく
は蛋白質に結合した型で見出されている。微生物を用い
たビオチンの製造法としては、バチルス(Bacill
us)属、エシェリヒア(Escherichia)
属、アグロバクテリウム(Agrobacteriu
m)属、クロモバクテリウム(Chromobacte
rium)属、シュードモナス(Pseudomona
s)属、アースロバクター(Arthrobacte
r)属、セラチア(Serratia)属等の微生物を
用いる方法が知られている。
【0003】また、工業的利用上多くの利点及びアミノ
酸、核酸発酵などに実績のあるコリネ型細菌のある種の
菌株はビオチンを生産しないが、本発明者らは先にこの
ビオチン要求性コリネ型細菌に、エシェリヒア・コリ由
来のビオチン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子
群を保有するプラスミドを導入し、この菌株を用いてビ
オチンを産生させることに成功し、提案した(特開平3
−240489)。
酸、核酸発酵などに実績のあるコリネ型細菌のある種の
菌株はビオチンを生産しないが、本発明者らは先にこの
ビオチン要求性コリネ型細菌に、エシェリヒア・コリ由
来のビオチン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子
群を保有するプラスミドを導入し、この菌株を用いてビ
オチンを産生させることに成功し、提案した(特開平3
−240489)。
【0004】一方、ビオチン生合成に関与する酵素をコ
ードする遺伝子群としてbioA、bioB、bio
C、bioD、bioF、bioH、bioW、bio
X、bioY等が各種の微生物から単離されている。こ
のうち、bioAは7,8−ジアミノペラルゴン酸アミ
ノトランスフェラーゼ、bioBはデスチオビオチンか
らビオチンへの変換に関与する酵素、bioDはデスチ
オビオチンシンテターゼ、bioFは7−ケト−8−ア
ミノペラルゴン酸シンテターゼ、bioWはピメリルC
oAシンテターゼをコードすることが知られているが、
bioC、bioH、bioX、bioYについて、そ
の働きはいまだ明らかとなっていない。また、大腸菌
(エシェリヒア・コリ)においては、これらビオチン生
合成に関与する酵素をコードする遺伝子群のうち、bi
oA、bioB、bioC、bioD、bioF遺伝子
はbioABFCDなるオペロンを形成している。
ードする遺伝子群としてbioA、bioB、bio
C、bioD、bioF、bioH、bioW、bio
X、bioY等が各種の微生物から単離されている。こ
のうち、bioAは7,8−ジアミノペラルゴン酸アミ
ノトランスフェラーゼ、bioBはデスチオビオチンか
らビオチンへの変換に関与する酵素、bioDはデスチ
オビオチンシンテターゼ、bioFは7−ケト−8−ア
ミノペラルゴン酸シンテターゼ、bioWはピメリルC
oAシンテターゼをコードすることが知られているが、
bioC、bioH、bioX、bioYについて、そ
の働きはいまだ明らかとなっていない。また、大腸菌
(エシェリヒア・コリ)においては、これらビオチン生
合成に関与する酵素をコードする遺伝子群のうち、bi
oA、bioB、bioC、bioD、bioF遺伝子
はbioABFCDなるオペロンを形成している。
【0005】これらビオチン生合成に関与する酵素をコ
ードする遺伝子群の詳細は、次の文献に開示されてい
る。A.J.Otsuka et.al.,J.Bio
l.Chem.,263,p19577−19585
(1988)、特開平2−27980、O.Ploux
et.al.,Biochem.J.,287,p6
85−690(1992)、R.Gloeckler
et.al.,Gene,87(1990)、特開平4
−330284、特開平4−278088等。
ードする遺伝子群の詳細は、次の文献に開示されてい
る。A.J.Otsuka et.al.,J.Bio
l.Chem.,263,p19577−19585
(1988)、特開平2−27980、O.Ploux
et.al.,Biochem.J.,287,p6
85−690(1992)、R.Gloeckler
et.al.,Gene,87(1990)、特開平4
−330284、特開平4−278088等。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、先に提
案したビオチン生合成に関与する酵素をコードする遺伝
子群を保有するプラスミドが導入されたコリネ型細菌
(特開平3−240489)のビオチン産生能を改良す
べく鋭意検討を行った。その結果、該コリネ型細菌をビ
オチン欠乏かつピメリン酸存在の選択圧下で特定の炭素
源を用いて培養することにより、ビオチン産生能が増強
された菌株が取得可能なことを見い出し、本発明を完成
するに至った。
案したビオチン生合成に関与する酵素をコードする遺伝
子群を保有するプラスミドが導入されたコリネ型細菌
(特開平3−240489)のビオチン産生能を改良す
べく鋭意検討を行った。その結果、該コリネ型細菌をビ
オチン欠乏かつピメリン酸存在の選択圧下で特定の炭素
源を用いて培養することにより、ビオチン産生能が増強
された菌株が取得可能なことを見い出し、本発明を完成
するに至った。
【0007】
【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、(1)ビオチン生合成に関与する酵素をコードする
遺伝子群の少なくとも一つの遺伝子が導入されたプラス
ミドで形質転換されたピメリン酸からビオチン産生能を
有するコリネ型細菌を、グルコースを単一炭素源として
含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しない寒
天培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの大き
さによって選別して得られるビオチン高産生能コリネ型
細菌およびその育種方法、(2)ビオチン生合成に関与
する酵素をコードする遺伝子群の少なくとも一つの遺伝
子が導入されたプラスミドで形質転換されたピメリン酸
からビオチン産生能を有するコリネ型細菌を、グルコー
スを単一炭素源として含有し且つピメリン酸を含有しビ
オチンを含有しない寒天培地上で培養し、該培地上に生
育したコロニーの大きさによって選別して得られるビオ
チン高産生能コリネ型細菌を、さらに有機酸を単一炭素
源として含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有
しない寒天培地上で培養し、該培地上に生育したコロニ
ーの大きさによって選別して得られるビオチン高産生能
コリネ型細菌およびその育種方法が提供される。
ば、(1)ビオチン生合成に関与する酵素をコードする
遺伝子群の少なくとも一つの遺伝子が導入されたプラス
ミドで形質転換されたピメリン酸からビオチン産生能を
有するコリネ型細菌を、グルコースを単一炭素源として
含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しない寒
天培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの大き
さによって選別して得られるビオチン高産生能コリネ型
細菌およびその育種方法、(2)ビオチン生合成に関与
する酵素をコードする遺伝子群の少なくとも一つの遺伝
子が導入されたプラスミドで形質転換されたピメリン酸
からビオチン産生能を有するコリネ型細菌を、グルコー
スを単一炭素源として含有し且つピメリン酸を含有しビ
オチンを含有しない寒天培地上で培養し、該培地上に生
育したコロニーの大きさによって選別して得られるビオ
チン高産生能コリネ型細菌を、さらに有機酸を単一炭素
源として含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有
しない寒天培地上で培養し、該培地上に生育したコロニ
ーの大きさによって選別して得られるビオチン高産生能
コリネ型細菌およびその育種方法が提供される。
【0008】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。本発明において、親株として用いるビオチン生合成
に関与する酵素をコードする遺伝子群の少なくとも一つ
の遺伝子が導入されたプラスミドで形質転換されたピメ
リン酸からビオチン産生能を有するコリネ型細菌(以下
これを「ピメリン酸要求性コリネ型細菌」ということが
ある。)としては、宿主ビオチン要求性のコリネ型細菌
に前記したビオチン生合成に関与する酵素をコードする
遺伝子群の少くとも一つの遺伝子が導入されたプラスミ
ドで形質転換された菌株であって、該プラスミドの導入
によりピメリン酸からビオチンの産生能が付与された菌
株を意味する。
る。本発明において、親株として用いるビオチン生合成
に関与する酵素をコードする遺伝子群の少なくとも一つ
の遺伝子が導入されたプラスミドで形質転換されたピメ
リン酸からビオチン産生能を有するコリネ型細菌(以下
これを「ピメリン酸要求性コリネ型細菌」ということが
ある。)としては、宿主ビオチン要求性のコリネ型細菌
に前記したビオチン生合成に関与する酵素をコードする
遺伝子群の少くとも一つの遺伝子が導入されたプラスミ
ドで形質転換された菌株であって、該プラスミドの導入
によりピメリン酸からビオチンの産生能が付与された菌
株を意味する。
【0009】ここで、宿主ビオチン要求性コリネ型細菌
としては、例えば、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム(Brevibacterium lacto
fermentum)ATCC13869、コリネバク
テリウム・グルタミカム(Corynebacteri
um glutamicum)ATCC31830並び
にブレビバクテリウム・フラバム(Brevibact
erium flavum)MJ−233(FERM
BP−1497)およびその由来株を挙げることができ
る。なお宿主としてブレビバクテリウム・フラバムMJ
−233由来の菌株を用いる場合、本菌株が保有するプ
ラスミドpBY502(特開昭63−36787号公報
参照)のため、形質転換が困難である場合があるので、
そのような場合には、本菌株よりプラスミドpBY50
2を除去することが望ましい。そのようなプラスミドp
BY502を除去する方法としては、例えば、継代培養
を繰り返すことにより、自然に欠失させることも可能で
あるし、人為的に除去することも可能である〔Bac
t.Rev.36p.361〜405(1972)参
照〕。
としては、例えば、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム(Brevibacterium lacto
fermentum)ATCC13869、コリネバク
テリウム・グルタミカム(Corynebacteri
um glutamicum)ATCC31830並び
にブレビバクテリウム・フラバム(Brevibact
erium flavum)MJ−233(FERM
BP−1497)およびその由来株を挙げることができ
る。なお宿主としてブレビバクテリウム・フラバムMJ
−233由来の菌株を用いる場合、本菌株が保有するプ
ラスミドpBY502(特開昭63−36787号公報
参照)のため、形質転換が困難である場合があるので、
そのような場合には、本菌株よりプラスミドpBY50
2を除去することが望ましい。そのようなプラスミドp
BY502を除去する方法としては、例えば、継代培養
を繰り返すことにより、自然に欠失させることも可能で
あるし、人為的に除去することも可能である〔Bac
t.Rev.36p.361〜405(1972)参
照〕。
【0010】ビオチン生合成に関与する酵素をコードす
る遺伝子群の少くとも1つの遺伝子が導入されたプラス
ミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリ由来のビオ
チンオペロン(bioABFCD)DNA断片、エシェ
リヒア・コリ由来のbioHを含有するDNA断片、コ
リネ型細菌細胞内で複製増殖能を有するDNA断片及び
プラスミド安定化機能を有するDNA断片を保有するプ
ラスミドpCRY30−BIO1(特開平3−2404
89)およびエシェリヒア・コリ由来のビオチンオペロ
ン(bioABFCD)DNA断片、コリネ型細菌細胞
内で複製増殖能を有するDNA断片及びプラスミド安定
化機能を有するDNA断片を保有するプラスミドpCR
Y30−BIO(特開平3−240489)を挙げるこ
とができる。
る遺伝子群の少くとも1つの遺伝子が導入されたプラス
ミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリ由来のビオ
チンオペロン(bioABFCD)DNA断片、エシェ
リヒア・コリ由来のbioHを含有するDNA断片、コ
リネ型細菌細胞内で複製増殖能を有するDNA断片及び
プラスミド安定化機能を有するDNA断片を保有するプ
ラスミドpCRY30−BIO1(特開平3−2404
89)およびエシェリヒア・コリ由来のビオチンオペロ
ン(bioABFCD)DNA断片、コリネ型細菌細胞
内で複製増殖能を有するDNA断片及びプラスミド安定
化機能を有するDNA断片を保有するプラスミドpCR
Y30−BIO(特開平3−240489)を挙げるこ
とができる。
【0011】前記コリネ型細菌への上記プラスミドの導
入は、電気パルス法〔Satoh,Y.et al.,
Journal of Industrial Mic
robiology,5,159(1990)参照〕等
により容易に行うことができる。上記した本発明で親株
として用いるピメリン酸要求性コリネ型細菌としては、
例えば、プラスミドpCRY30−BIO1を保持する
ブレビバクテリウム・フラバムMJ233−BIO1
(FERM P−11121)およびプラスミドpCR
Y30−BIOを保持するブレビバクテリウム・フラバ
ムMJ233−BIO(FERM P−13765)を
挙げることができる。
入は、電気パルス法〔Satoh,Y.et al.,
Journal of Industrial Mic
robiology,5,159(1990)参照〕等
により容易に行うことができる。上記した本発明で親株
として用いるピメリン酸要求性コリネ型細菌としては、
例えば、プラスミドpCRY30−BIO1を保持する
ブレビバクテリウム・フラバムMJ233−BIO1
(FERM P−11121)およびプラスミドpCR
Y30−BIOを保持するブレビバクテリウム・フラバ
ムMJ233−BIO(FERM P−13765)を
挙げることができる。
【0012】前記した3種のビオチン要求性コリネ型細
菌は同様にピメリルCoA生合成に関与する酵素をコー
ドする遺伝子(bioH,bioC等)および7−ケト
−8−アミノペラルゴン酸シンテターゼをコードする遺
伝子(bioF)が欠損あるいはその発現が欠如してお
り、また少くとも7,8−ジアミノペラルゴン酸アミノ
トランスフェラーゼをコードする遺伝子(bioA)、
デスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝子(b
ioD)およびデスチオビオチンからビオチンへの変換
に関与する酵素をコードする遺伝子を保有しており(特
開平4−278088)、前記ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムおよびコリネバクテリウム・グルタ
ミカムに前記プラスミド、例えば、pCRY30−BI
O1又はpCRY30−BIOが導入された菌株もまた
ピメリン酸要求性コリネ型細菌として用いることができ
る。
菌は同様にピメリルCoA生合成に関与する酵素をコー
ドする遺伝子(bioH,bioC等)および7−ケト
−8−アミノペラルゴン酸シンテターゼをコードする遺
伝子(bioF)が欠損あるいはその発現が欠如してお
り、また少くとも7,8−ジアミノペラルゴン酸アミノ
トランスフェラーゼをコードする遺伝子(bioA)、
デスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝子(b
ioD)およびデスチオビオチンからビオチンへの変換
に関与する酵素をコードする遺伝子を保有しており(特
開平4−278088)、前記ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムおよびコリネバクテリウム・グルタ
ミカムに前記プラスミド、例えば、pCRY30−BI
O1又はpCRY30−BIOが導入された菌株もまた
ピメリン酸要求性コリネ型細菌として用いることができ
る。
【0013】これらピメリン酸要求性コリネ型細菌から
ビオチン高産生株の育種は次のとおり行うことができ
る。先ず、ピメリン酸要求性コリネ型細菌、例えばブレ
ビバクテリウム・フラバムMJ233−BIO(FER
M P−13765)を、窒素源、無機塩、ビタミンを
含み、単一炭素源としてグルコースのみを含み、且つピ
メリン酸を含みビオチンを含まない培地(以下これを
「ピメリン酸/グルコース最小培地」ということがあ
る。)に寒天を加えた平板培地上に塗沫して培養する。
培養後、コロニーの大きさを指標として生育の速いコロ
ニー(大きなコロニー)を採取し、各々のコロニーから
得られた菌体を再度ピメリン酸/グルコース最小培地
(平板培地あるいは液体培地)で培養し、生育速度が速
く、且つビオチン産生能の増加した菌株を採取する。
ビオチン高産生株の育種は次のとおり行うことができ
る。先ず、ピメリン酸要求性コリネ型細菌、例えばブレ
ビバクテリウム・フラバムMJ233−BIO(FER
M P−13765)を、窒素源、無機塩、ビタミンを
含み、単一炭素源としてグルコースのみを含み、且つピ
メリン酸を含みビオチンを含まない培地(以下これを
「ピメリン酸/グルコース最小培地」ということがあ
る。)に寒天を加えた平板培地上に塗沫して培養する。
培養後、コロニーの大きさを指標として生育の速いコロ
ニー(大きなコロニー)を採取し、各々のコロニーから
得られた菌体を再度ピメリン酸/グルコース最小培地
(平板培地あるいは液体培地)で培養し、生育速度が速
く、且つビオチン産生能の増加した菌株を採取する。
【0014】次に、このようにして得られる生育速度が
速く、ビオチン産生能の増大した菌株を、窒素源、無機
塩、ビタミンを含み、単一炭素源として有機酸のみを含
み、且つピメリン酸を含みビオチンを含まない培地(以
下これを「ピメリン酸/有機酸最小培地」ということが
ある。)に寒天を加えた平板培地上に塗沫し培養する。
培養後、コロニーの大きさを指標として生育の速いコロ
ニー(大きなコロニー)を採取し、各々のコロニーから
得られた菌体を再度ピメリン酸/有機酸最小培地(平板
培地あるいは液体培地)で培養し、生育速度が速く、且
つビオチン産生能の増加した菌株を採取する。
速く、ビオチン産生能の増大した菌株を、窒素源、無機
塩、ビタミンを含み、単一炭素源として有機酸のみを含
み、且つピメリン酸を含みビオチンを含まない培地(以
下これを「ピメリン酸/有機酸最小培地」ということが
ある。)に寒天を加えた平板培地上に塗沫し培養する。
培養後、コロニーの大きさを指標として生育の速いコロ
ニー(大きなコロニー)を採取し、各々のコロニーから
得られた菌体を再度ピメリン酸/有機酸最小培地(平板
培地あるいは液体培地)で培養し、生育速度が速く、且
つビオチン産生能の増加した菌株を採取する。
【0015】ここで、ピメリン酸/グルコース最小培地
およびピメリン酸/有機酸最小培地の窒素源としては、
例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独もしく
は混合して用いられる。また無機塩としては、例えば、
リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マ
グネシウム等が単独もしくは混合して用いられ、ビタミ
ンとしては、チアミンが用いられる。
およびピメリン酸/有機酸最小培地の窒素源としては、
例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独もしく
は混合して用いられる。また無機塩としては、例えば、
リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マ
グネシウム等が単独もしくは混合して用いられ、ビタミ
ンとしては、チアミンが用いられる。
【0016】また、炭素源として用いる有機酸として
は、例えば、コハク酸もしくはそのナトリウム塩、リン
ゴ酸もしくはそのナトリウム塩、クエン酸もしくはその
ナトリウム塩等が挙げられるが、それらの中でコハク酸
ナトリウムを用いるのが最も好ましい。前記最小培地中
の炭素源として用いるグルコース又は有機酸の濃度に特
に制限はなく、微生物の培養に通常用いる濃度0.2〜
5%(wt/vol)、好ましくは1〜3%(wt/v
ol)を用いることができる。また、窒素源、無機塩、
ビタミン等の濃度にも特別な制限はなく、微生物の培養
に通常用いる濃度を用いることができる。
は、例えば、コハク酸もしくはそのナトリウム塩、リン
ゴ酸もしくはそのナトリウム塩、クエン酸もしくはその
ナトリウム塩等が挙げられるが、それらの中でコハク酸
ナトリウムを用いるのが最も好ましい。前記最小培地中
の炭素源として用いるグルコース又は有機酸の濃度に特
に制限はなく、微生物の培養に通常用いる濃度0.2〜
5%(wt/vol)、好ましくは1〜3%(wt/v
ol)を用いることができる。また、窒素源、無機塩、
ビタミン等の濃度にも特別な制限はなく、微生物の培養
に通常用いる濃度を用いることができる。
【0017】最小培地中のピメリン酸濃度にも特別な制
限はなく、通常0.1mg/l〜20g/l、好ましく
は10mg/l〜1g/lが適当である。平板培地上で
の培養は、通常、約1〜10日間、温度約20〜40℃
で行うことができ、また必要に応じて液体培地で培養す
る場合は、通常、通気撹拌、振盪等の好気的条件下に、
温度約20〜40℃、約1〜5日間行うことができる。
限はなく、通常0.1mg/l〜20g/l、好ましく
は10mg/l〜1g/lが適当である。平板培地上で
の培養は、通常、約1〜10日間、温度約20〜40℃
で行うことができ、また必要に応じて液体培地で培養す
る場合は、通常、通気撹拌、振盪等の好気的条件下に、
温度約20〜40℃、約1〜5日間行うことができる。
【0018】液体培養における菌体の生育速度は濁度
計、例えばスペクトロニック20A(島津製作所社製)
を用いて濁度を測定して求めることができ、培養物中の
ビオチン量は、サッカロミセス・セレビシエ(Sacc
haromyces cerevisiae)ATCC
7754による微生物定量法(ビタミン学実験法〔I
I〕、日本ビタミン学会(1985)p486−49
2)で測定することができる。
計、例えばスペクトロニック20A(島津製作所社製)
を用いて濁度を測定して求めることができ、培養物中の
ビオチン量は、サッカロミセス・セレビシエ(Sacc
haromyces cerevisiae)ATCC
7754による微生物定量法(ビタミン学実験法〔I
I〕、日本ビタミン学会(1985)p486−49
2)で測定することができる。
【0019】かくして得られるビオチン高産生微生物と
しては、ピメリン酸/グルコース最小培地で選択するこ
とにより得られるブレビバクテリウム・フラバムMJ2
33−709(FERM P−13764)、さらにこ
の微生物をピメリン酸/有機酸最小培地で選択すること
により得られるブレビバクテリウム・フラバムMJ23
3−SL2(FERM P−13791)を挙げること
ができる。
しては、ピメリン酸/グルコース最小培地で選択するこ
とにより得られるブレビバクテリウム・フラバムMJ2
33−709(FERM P−13764)、さらにこ
の微生物をピメリン酸/有機酸最小培地で選択すること
により得られるブレビバクテリウム・フラバムMJ23
3−SL2(FERM P−13791)を挙げること
ができる。
【0020】これらビオチン高産生能変異株の菌学的性
質は、ピメリン酸/グルコース最小培地又はピメリン酸
/有機酸最小培地での生育速度の増加およびビオチン産
生能のちがいを除いては、プラスミドpCRY30−B
IO導入の宿主として用いたブレビバクテリウムフラバ
ムMJ−233と同様であった(菌学的性質の詳細につ
いては、特開昭51−130592号公報参照)。
質は、ピメリン酸/グルコース最小培地又はピメリン酸
/有機酸最小培地での生育速度の増加およびビオチン産
生能のちがいを除いては、プラスミドpCRY30−B
IO導入の宿主として用いたブレビバクテリウムフラバ
ムMJ−233と同様であった(菌学的性質の詳細につ
いては、特開昭51−130592号公報参照)。
【0021】かくして得られる本発明のビオチン高産能
コリネ型細菌は、ピメリン酸からビオチンを高産生する
能力を有しており、本発明のビオチン高産生能コリネ型
細菌を用い、ピメリン酸からビオチンを著量製造するこ
とができる。上記の方法で得られるビオチン高産生コリ
ネ型細菌、例えば、ブレビバクテリウム・フラバムMJ
233−709およびブレビバクテリウム・フラバムM
J233−SL2を用いるビオチンの製造法を以下に述
べる。
コリネ型細菌は、ピメリン酸からビオチンを高産生する
能力を有しており、本発明のビオチン高産生能コリネ型
細菌を用い、ピメリン酸からビオチンを著量製造するこ
とができる。上記の方法で得られるビオチン高産生コリ
ネ型細菌、例えば、ブレビバクテリウム・フラバムMJ
233−709およびブレビバクテリウム・フラバムM
J233−SL2を用いるビオチンの製造法を以下に述
べる。
【0022】培養は炭素源、窒素源、無機塩等を含む通
常の栄養培地に少なくともピメリン酸を適量添加したも
ので行うことができ、炭素源としては、例えば、グルコ
ース、エタノール、メタノール、廃糖蜜等が、そして窒
素源としては、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそ
れぞれ単独もしくは混合して用いられる。また無機塩と
しては、例えば、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他に
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリ
カー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添
加することもできる。
常の栄養培地に少なくともピメリン酸を適量添加したも
ので行うことができ、炭素源としては、例えば、グルコ
ース、エタノール、メタノール、廃糖蜜等が、そして窒
素源としては、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそ
れぞれ単独もしくは混合して用いられる。また無機塩と
しては、例えば、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他に
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリ
カー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添
加することもできる。
【0023】培地中に添加するピメリン酸濃度に特に制
限はないが、通常10mg/l〜50g/l、好ましく
は100mg/l〜5g/lが適当である。培養は、通
常、通気撹拌、振盪等の好気的条件下に、約20〜40
℃、好ましくは25〜35℃の温度で行うことができ
る。培養途中のpHは5〜10、好ましくは7〜8付近
で行い、培養中のpHの調整は酸又はアルカリを添加し
て行うことができる。
限はないが、通常10mg/l〜50g/l、好ましく
は100mg/l〜5g/lが適当である。培養は、通
常、通気撹拌、振盪等の好気的条件下に、約20〜40
℃、好ましくは25〜35℃の温度で行うことができ
る。培養途中のpHは5〜10、好ましくは7〜8付近
で行い、培養中のpHの調整は酸又はアルカリを添加し
て行うことができる。
【0024】培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは1
〜5%(wt/vol)、更に好ましくは2〜3%(w
t/vol)である。また、培養期間は通常1〜7日間
とすることができ、最適期間は3日間である。培養を終
了した後、培養液からのビオチンの抽出精製にあたって
は、ビオチンの諸性質を利用して、一般の天然物からの
抽出精製法が応用できる。すなわち、培養物から菌体を
除き活性炭に吸着させ、その後溶出させ、イオン交換樹
脂で精製するか、あるいは培養濾液を直接イオン交換樹
脂で処理して精製し、水またはアルコールより再結晶す
ることにより、ビオチンを取得することができる。
〜5%(wt/vol)、更に好ましくは2〜3%(w
t/vol)である。また、培養期間は通常1〜7日間
とすることができ、最適期間は3日間である。培養を終
了した後、培養液からのビオチンの抽出精製にあたって
は、ビオチンの諸性質を利用して、一般の天然物からの
抽出精製法が応用できる。すなわち、培養物から菌体を
除き活性炭に吸着させ、その後溶出させ、イオン交換樹
脂で精製するか、あるいは培養濾液を直接イオン交換樹
脂で処理して精製し、水またはアルコールより再結晶す
ることにより、ビオチンを取得することができる。
【0025】
【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、実施
例は本発明の具体的に認識を得る一助とみなすべきもの
であり、本発明の範囲を限定するためのものではない。
例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、実施
例は本発明の具体的に認識を得る一助とみなすべきもの
であり、本発明の範囲を限定するためのものではない。
【0026】参考例1 プラスミドpCRY30−BI
Oの作製及びコリネ型細菌への導入 ビオチン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子とし
ては、特開平3−240489の実施例1に記載の方法
で調製されたプラスミドpHSG398−bioに含有
されるエシェリヒア・コリ由来のビオチンオペロン(b
ioABFCD)DNA断片を用い、コリネ型細菌細胞
内で複製増殖能を有するDNA断片及びプラスミド安定
化機能を有するDNA断片としては、特開平3−240
489の実施例2に記載の方法で調製されたプラスミド
ベクターpCRY30を用いた。
Oの作製及びコリネ型細菌への導入 ビオチン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子とし
ては、特開平3−240489の実施例1に記載の方法
で調製されたプラスミドpHSG398−bioに含有
されるエシェリヒア・コリ由来のビオチンオペロン(b
ioABFCD)DNA断片を用い、コリネ型細菌細胞
内で複製増殖能を有するDNA断片及びプラスミド安定
化機能を有するDNA断片としては、特開平3−240
489の実施例2に記載の方法で調製されたプラスミド
ベクターpCRY30を用いた。
【0027】プラスミドpHSG398−bio 5μ
g及びプラスミドベクターpCRY30 1μgを各々
制限酵素EcoRI 5unitsを用い、37℃で1
時間反応させ分解した。両分解DNAを混合し、T4D
NAリガーゼにて結合させ、常法に従いエシェリヒア・
コリCV530C Gal−UvrB3株〔F- :le
uA371 δ(lac−pro) thi δ(ga
l−bio−UvrB);国立遺伝学研究所遺伝実験生
物保存センターより分譲〕を形質転換し、カナマイシン
50mgを含む選択培地〔K2 HPO4 7g、KH2 P
O4 2g、(NH4 )2 SO4 1g、MgSO4 ・7H
2 O0.1g、カザミノ酸10g、グルコース2g及び
寒天16gを蒸留水1lに溶解〕に塗沫した。
g及びプラスミドベクターpCRY30 1μgを各々
制限酵素EcoRI 5unitsを用い、37℃で1
時間反応させ分解した。両分解DNAを混合し、T4D
NAリガーゼにて結合させ、常法に従いエシェリヒア・
コリCV530C Gal−UvrB3株〔F- :le
uA371 δ(lac−pro) thi δ(ga
l−bio−UvrB);国立遺伝学研究所遺伝実験生
物保存センターより分譲〕を形質転換し、カナマイシン
50mgを含む選択培地〔K2 HPO4 7g、KH2 P
O4 2g、(NH4 )2 SO4 1g、MgSO4 ・7H
2 O0.1g、カザミノ酸10g、グルコース2g及び
寒天16gを蒸留水1lに溶解〕に塗沫した。
【0028】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドベクターpCRY30
の長さ8.6kbのDNA断片に加え、長さ6.0kb
の挿入DNA断片が認められた。上記の如く調製された
プラスミドDNAを、コリネ型細菌へ形質転換した。
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドベクターpCRY30
の長さ8.6kbのDNA断片に加え、長さ6.0kb
の挿入DNA断片が認められた。上記の如く調製された
プラスミドDNAを、コリネ型細菌へ形質転換した。
【0029】形質転換は、電気パルス法を用いて行っ
た。ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233(FE
RM BP−1497)プラスミドpBY502除去株
を100mlの半合成A培地(尿素2g/1、硫安7g
/1、KH2 PO4 0.5g/1、K2 HPO4 0.5
g/1、MgSO4 ・7H2 O0.5g/1、FeSO
4 ・7H2 O6mg/1、MnSO4 ・4〜5H2 O6
mg/1、塩酸チアミン100μg/1、ビオチン20
0μg/1、カザミノ酸1g/1、酵母エキス1g/
1;NaOHにてpHを7.2に調節)で対数増殖期初
期まで培養し、ペニシリンGを1ユニット/mlになる
ように添加して、さらに2時間振盪培養し、遠心分離に
より菌体を集め、菌体を20mlのパルス用溶液(27
2mM Sucrose、7mM KH2 PO4 、1m
M MgCl2 :pH7.4)にて洗浄した。さらに菌
体を遠心分離して集め、5mlのパルス用溶液に懸濁
し、0.75mlの細胞と、前記で得られたプラスミド
DNA溶液50μlとを混合し、水中にて20分間静置
した。ジーンパルサー(バイオラド社製)を用いて、2
500ボルト、25μFDに設定し、パルスを印加後氷
中に20分間静置した。全量を3mlの前記A培地に移
し30℃にて1時間培養後、カナマイシン15μg/m
l(最終濃度)を含む前記A寒天培地に植菌し30℃で
2〜3日間培養した。出現したカナマイシン耐性株よ
り、アルカリ−SDS法〔Satoh,Y.eta
l.,Journal of Industrial
Microbiology,5,159(1990)〕
によりプラスミドを得た。このプラスミドを各種制限酵
素で切断し、切断片の大きさをアガロースゲル電気永動
で測定した。その結果を下記の表1に示す。
た。ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233(FE
RM BP−1497)プラスミドpBY502除去株
を100mlの半合成A培地(尿素2g/1、硫安7g
/1、KH2 PO4 0.5g/1、K2 HPO4 0.5
g/1、MgSO4 ・7H2 O0.5g/1、FeSO
4 ・7H2 O6mg/1、MnSO4 ・4〜5H2 O6
mg/1、塩酸チアミン100μg/1、ビオチン20
0μg/1、カザミノ酸1g/1、酵母エキス1g/
1;NaOHにてpHを7.2に調節)で対数増殖期初
期まで培養し、ペニシリンGを1ユニット/mlになる
ように添加して、さらに2時間振盪培養し、遠心分離に
より菌体を集め、菌体を20mlのパルス用溶液(27
2mM Sucrose、7mM KH2 PO4 、1m
M MgCl2 :pH7.4)にて洗浄した。さらに菌
体を遠心分離して集め、5mlのパルス用溶液に懸濁
し、0.75mlの細胞と、前記で得られたプラスミド
DNA溶液50μlとを混合し、水中にて20分間静置
した。ジーンパルサー(バイオラド社製)を用いて、2
500ボルト、25μFDに設定し、パルスを印加後氷
中に20分間静置した。全量を3mlの前記A培地に移
し30℃にて1時間培養後、カナマイシン15μg/m
l(最終濃度)を含む前記A寒天培地に植菌し30℃で
2〜3日間培養した。出現したカナマイシン耐性株よ
り、アルカリ−SDS法〔Satoh,Y.eta
l.,Journal of Industrial
Microbiology,5,159(1990)〕
によりプラスミドを得た。このプラスミドを各種制限酵
素で切断し、切断片の大きさをアガロースゲル電気永動
で測定した。その結果を下記の表1に示す。
【0030】
【表1】 表 1 制限酵素 認識部位数 切断片の大きさ(kb) EcoRI 2 8.6,6.0 Kpn I 1 14.6 Sal I 2 14.4,0.2 上記制限酵素により特徴づけられるプラスミドをpCR
Y30−BIOと命名した。
Y30−BIOと命名した。
【0031】なお、プラスミドpCRY30−BIOに
より形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムMJ
233−BIOは、茨城県つくば市東1丁目1番3号の
工業技術院生命工学工業技術研究所に、平成5年7月2
7日付で受託番号:FERMP−13765として寄託
されている。
より形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムMJ
233−BIOは、茨城県つくば市東1丁目1番3号の
工業技術院生命工学工業技術研究所に、平成5年7月2
7日付で受託番号:FERMP−13765として寄託
されている。
【0032】実施例1 ピメリン酸/グルコース最小培
地生育速度増大株の選択 前記半合成A培地100mlを容量500mlの振盪フ
ラスコに入れ120℃で15分間殺菌した。この培地に
5mg/mlカナマイシン1ml及び滅菌した50%グ
ルコース4mlを添加した後、ブレビバクテリウム・フ
ラバムMJ233−BIO(FERM P−1376
5)を1白金耳量植菌し、33℃で2日間振盪培養し
た。
地生育速度増大株の選択 前記半合成A培地100mlを容量500mlの振盪フ
ラスコに入れ120℃で15分間殺菌した。この培地に
5mg/mlカナマイシン1ml及び滅菌した50%グ
ルコース4mlを添加した後、ブレビバクテリウム・フ
ラバムMJ233−BIO(FERM P−1376
5)を1白金耳量植菌し、33℃で2日間振盪培養し
た。
【0033】遠心分離により培養物から菌体を回収し、
この菌体を前記半合成A培地からカザミノ酸および酵母
エキスを除いた培地にて2回洗浄したのち、カナマイシ
ン50μg/mlを含むピメリン酸/グルコース最小培
地(尿素2g/l、硫安7g/l、KH2 PO4 0.5
g/l、K2 HPO4 0.5g/l、MgSO4 ・7H
2 O 0.5g/l、FeSO4 ・7H2 O 6mg/
l、MnSO4 ・4〜5H2 O 6mg/l、チアミン
塩酸100μg/l、ピメリン酸0.1g/l、グルコ
ース20g/l;NaOHにてpHを7.2に調節)に
寒天を加えた平板培地上に塗沫した。33℃で3日間培
養することにより出現した生育の速いコロニー(大きな
コロニー)を白金耳で釣り上げ、再度ピメリン酸/グル
コース最小平板培地に塗沫し、33℃で培養した結果、
得られた菌株はピメリン酸/グルコース最小培地上での
生育速度が上昇していることが確認された。
この菌体を前記半合成A培地からカザミノ酸および酵母
エキスを除いた培地にて2回洗浄したのち、カナマイシ
ン50μg/mlを含むピメリン酸/グルコース最小培
地(尿素2g/l、硫安7g/l、KH2 PO4 0.5
g/l、K2 HPO4 0.5g/l、MgSO4 ・7H
2 O 0.5g/l、FeSO4 ・7H2 O 6mg/
l、MnSO4 ・4〜5H2 O 6mg/l、チアミン
塩酸100μg/l、ピメリン酸0.1g/l、グルコ
ース20g/l;NaOHにてpHを7.2に調節)に
寒天を加えた平板培地上に塗沫した。33℃で3日間培
養することにより出現した生育の速いコロニー(大きな
コロニー)を白金耳で釣り上げ、再度ピメリン酸/グル
コース最小平板培地に塗沫し、33℃で培養した結果、
得られた菌株はピメリン酸/グルコース最小培地上での
生育速度が上昇していることが確認された。
【0034】該菌株をブレビバクテリウム・フラバムM
J233−709と命名した。該菌株は、茨城県つくば
市東1丁目1番3号の工業技術院生命工学工業技術研究
所に、平成5年7月27日付で受託番号:FERM P
−13764として寄託されている。
J233−709と命名した。該菌株は、茨城県つくば
市東1丁目1番3号の工業技術院生命工学工業技術研究
所に、平成5年7月27日付で受託番号:FERM P
−13764として寄託されている。
【0035】実施例2 ピメリン酸/コハク酸最小培地
生育速度増大株の選択 前記半合成A培地100mlを容量500mlの振盪フ
ラスコに入れ120℃で15分間殺菌した。この培地に
5mg/mlカナマイシン1ml及び滅菌した50%コ
ハク酸ナトリウム4mlを添加した後、実施例1で得ら
れたブレビバクテリウム・フラバムMJ233−709
(FERM P−13764)を1白金耳量植菌し、3
3℃で2日間振盪培養した。
生育速度増大株の選択 前記半合成A培地100mlを容量500mlの振盪フ
ラスコに入れ120℃で15分間殺菌した。この培地に
5mg/mlカナマイシン1ml及び滅菌した50%コ
ハク酸ナトリウム4mlを添加した後、実施例1で得ら
れたブレビバクテリウム・フラバムMJ233−709
(FERM P−13764)を1白金耳量植菌し、3
3℃で2日間振盪培養した。
【0036】遠心分離により培養物から菌体を回収し、
この菌体を前記半合成A培地からカザミノ酸および酵母
エキスを除いた培地にて2回洗浄したのち、カナマイシ
ン50μg/mlを含むピメリン酸/コハク酸最小培地
(尿素2g/l、硫安7g/l、KH2 PO4 0.5g
/l、K2 HPO4 0.5g/l、MgSO4 ・7H 2
O 0.5g/l、FeSO4 ・7H2 O 6mg/
l、MnSO4 ・4〜5H2 O 6mg/l、チアミン
塩酸100μg/l、ピメリン酸0.1g/l、コハク
酸ナトリウム20g/l;NaOHにてpHを7.2に
調節)に寒天を加えた平板培地上に塗沫した。33℃で
3日間培養することにより出現した生育の速いコロニー
を白金耳で釣り上げ、再度ピメリン酸/コハク酸最小平
板培地に塗沫し、33℃で培養した結果、得られた菌株
はピメリン酸/コハク酸最小培地上で生育速度が上昇し
ていることが確認された。
この菌体を前記半合成A培地からカザミノ酸および酵母
エキスを除いた培地にて2回洗浄したのち、カナマイシ
ン50μg/mlを含むピメリン酸/コハク酸最小培地
(尿素2g/l、硫安7g/l、KH2 PO4 0.5g
/l、K2 HPO4 0.5g/l、MgSO4 ・7H 2
O 0.5g/l、FeSO4 ・7H2 O 6mg/
l、MnSO4 ・4〜5H2 O 6mg/l、チアミン
塩酸100μg/l、ピメリン酸0.1g/l、コハク
酸ナトリウム20g/l;NaOHにてpHを7.2に
調節)に寒天を加えた平板培地上に塗沫した。33℃で
3日間培養することにより出現した生育の速いコロニー
を白金耳で釣り上げ、再度ピメリン酸/コハク酸最小平
板培地に塗沫し、33℃で培養した結果、得られた菌株
はピメリン酸/コハク酸最小培地上で生育速度が上昇し
ていることが確認された。
【0037】該菌株をブレビバクテリウム・フラバムM
J233−SL2と命名した。該菌株は、茨城県つくば
市東1丁目1番3号の工業技術院生命工学工業技術研究
所に、平成5年8月6日付で受託番号:FERM P−
13791として寄託されている。
J233−SL2と命名した。該菌株は、茨城県つくば
市東1丁目1番3号の工業技術院生命工学工業技術研究
所に、平成5年8月6日付で受託番号:FERM P−
13791として寄託されている。
【0038】実施例3 ビオチンの製造 合成CP培地(尿素2g/l、硫安7g/l、KH2 P
O4 0.5g/l、K 2 HPO4 0.5g/l、MgS
O4 ・7H2 O 0.5g/l、FeSO4 ・7H2 O
6mg/l、MnSO4 ・4〜5H2 O 6mg/
l、チアミン塩酸塩100μg/l、ピメリン酸1g/
l;NaOHにてpHを7.2に調節)5mlを直径1
8mmの試験管に分注し120℃で15分間殺菌した。
この培地に5mg/mlカナマイシン0.05mlと滅
菌した50%グルコース0.2mlを添加した後、ブレ
ビバクテリウム・フラバムMJ233−709(FER
MP−13764)、ブレビバクテリウム・フラバムM
J233−SL2(FERM P−13791)、また
対照としてブレビバクテリウム・フラバムMJ233−
BIO(FERM P−13765)を1白金耳量それ
ぞれ植菌し、33℃で24時間振盪培養した。
O4 0.5g/l、K 2 HPO4 0.5g/l、MgS
O4 ・7H2 O 0.5g/l、FeSO4 ・7H2 O
6mg/l、MnSO4 ・4〜5H2 O 6mg/
l、チアミン塩酸塩100μg/l、ピメリン酸1g/
l;NaOHにてpHを7.2に調節)5mlを直径1
8mmの試験管に分注し120℃で15分間殺菌した。
この培地に5mg/mlカナマイシン0.05mlと滅
菌した50%グルコース0.2mlを添加した後、ブレ
ビバクテリウム・フラバムMJ233−709(FER
MP−13764)、ブレビバクテリウム・フラバムM
J233−SL2(FERM P−13791)、また
対照としてブレビバクテリウム・フラバムMJ233−
BIO(FERM P−13765)を1白金耳量それ
ぞれ植菌し、33℃で24時間振盪培養した。
【0039】次に、上記CP培地100mlを容量50
0mlの振盪フラスコに入れ120℃で15分間殺菌し
た。この培地に5mg/mlカナマイシン1.0mlと
滅菌した50%グルコース4mlを添加した後、上記の
前培養物1mlをそれぞれ植菌し、33℃で3日間振盪
培養した。培養終了後、遠心分離(4000rpm、1
5分間、4℃)にて培養物から菌体を除去し、上清中の
ビオチンを定量した。その結果を表2に示す。
0mlの振盪フラスコに入れ120℃で15分間殺菌し
た。この培地に5mg/mlカナマイシン1.0mlと
滅菌した50%グルコース4mlを添加した後、上記の
前培養物1mlをそれぞれ植菌し、33℃で3日間振盪
培養した。培養終了後、遠心分離(4000rpm、1
5分間、4℃)にて培養物から菌体を除去し、上清中の
ビオチンを定量した。その結果を表2に示す。
【0040】なお、表中ビオチン生成量は、サッカロミ
セス・セレビシエ(Saccharomyces ce
revisiae)ATCC7754による微生物定量
法(ビタミン学実験法〔II〕日本ビタミン学会(198
5)p486−492)により定量した値である。
セス・セレビシエ(Saccharomyces ce
revisiae)ATCC7754による微生物定量
法(ビタミン学実験法〔II〕日本ビタミン学会(198
5)p486−492)により定量した値である。
【0041】
【表2】表 2 菌 株 ビオチン生成量 MJ233−709 15μg/l MJ233−SL2 50μg/lMJ233−BIO 5μg/l
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 (C12N 1/21 C12R 1:13) (C12N 15/09 C12R 1:13) (C12P 17/18 C12R 1:13) C12R 1:13) (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央8丁目3番1号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内
Claims (6)
- 【請求項1】 ビオチン生合成に関与する酵素をコード
する遺伝子群の少なくとも一つの遺伝子が導入されたプ
ラスミドで形質転換されたピメリン酸からビオチン産生
能を有するコリネ型細菌を、グルコースを単一炭素源と
して含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しな
い平板培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの
大きさによって選別して得られるビオチン高産生能コリ
ネ型細菌。 - 【請求項2】 ビオチン高産生能コリネ型細菌がブレビ
バクテリウム・フラバムMJ233−709(FERM
P−13764)である請求項1記載のビオチン高産
生能コリネ型細菌。 - 【請求項3】 ビオチン生合成に関与する酵素をコード
する遺伝子群の少なくとも一つの遺伝子が導入されたプ
ラスミドで形質転換されたピメリン酸からビオチン産生
能を有するコリネ型細菌を、グルコースを単一炭素源と
して含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しな
い平板培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの
大きさによって選別することを特徴とするビオチン高産
生能コリネ型細菌の育種方法。 - 【請求項4】 ビオチン生合成に関与する酵素をコード
する遺伝子群の少なくとも一つの遺伝子が導入されたプ
ラスミドで形質転換されたピメリン酸からビオチン産生
能を有するコリネ型細菌を、グルコースを単一炭素源と
して含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しな
い平板培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの
大きさによって選別して得られるビオチン高産生能コリ
ネ型細菌を、さらに有機酸を単一炭素源として含有し且
つピメリン酸を含有しビオチンを含有しない寒天培地上
で培養し、該培地上に生育したコロニーの大きさによっ
て選別して得られるビオチン高産生能コリネ型細菌。 - 【請求項5】 ビオチン高産生能コリネ型細菌がブレビ
バクテリウム・フラバムMJ233−SL2(FERM
P−13791)である請求項4記載のコリネ型細
菌。 - 【請求項6】 ビオチン生合成に関与する酵素をコード
する遺伝子群の少なくとも一つの遺伝子が導入されたプ
ラスミドで形質転換されたピメリン酸からビオチン産生
能を有するコリネ型細菌を、グルコースを単一炭素源と
して含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しな
い平板培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの
大きさによって選別して得られるビオチン高産生能コリ
ネ型細菌を、さらに有機酸を単一炭素源として含有し且
つピメリン酸を含有しビオチンを含有しない平板培地上
で培養し、該培地上に生育したコロニーの大きさによっ
て選別することを特徴とするビオチン高産生能コリネ型
細菌の育種方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19939193A JPH0787963A (ja) | 1993-08-11 | 1993-08-11 | ビオチン高産生微生物およびその育種方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19939193A JPH0787963A (ja) | 1993-08-11 | 1993-08-11 | ビオチン高産生微生物およびその育種方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0787963A true JPH0787963A (ja) | 1995-04-04 |
Family
ID=16407003
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP19939193A Pending JPH0787963A (ja) | 1993-08-11 | 1993-08-11 | ビオチン高産生微生物およびその育種方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0787963A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114015632A (zh) * | 2020-12-01 | 2022-02-08 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 产l-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 |
-
1993
- 1993-08-11 JP JP19939193A patent/JPH0787963A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114015632A (zh) * | 2020-12-01 | 2022-02-08 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 产l-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 |
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