JPH0787963A - ビオチン高産生微生物およびその育種方法 - Google Patents
ビオチン高産生微生物およびその育種方法Info
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- JPH0787963A JPH0787963A JP19939193A JP19939193A JPH0787963A JP H0787963 A JPH0787963 A JP H0787963A JP 19939193 A JP19939193 A JP 19939193A JP 19939193 A JP19939193 A JP 19939193A JP H0787963 A JPH0787963 A JP H0787963A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ピメリン酸からビオチンを高産生する能力を
有するコリネ型細菌の提供。 【構成】 ビオチン生合成に関与する酵素をコードする
遺伝子群の少なくとも一つの遺伝子が導入されたプラス
ミドで形質転換されたピメリン酸からビオチン産生能を
有するコリネ型細菌を、グルコースを単一炭素源として
含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しない平
板培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの大き
さによって選別して得られるビオチン高産生能コリネ型
細菌ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−７０９
株および該菌株をコハク酸を単一炭素源とした以外は上
記と同様の平板培地上で培養し、該培地上に生育したコ
ロニーの大きさによって選別して得られるビオチン高産
生能コリネ型細菌ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２
３３−ＳＬ２株。 【効果】 本発明のコリネ型細菌を用いて、ピメリン酸
からビオチンを著量産生することができる。
有するコリネ型細菌の提供。 【構成】 ビオチン生合成に関与する酵素をコードする
遺伝子群の少なくとも一つの遺伝子が導入されたプラス
ミドで形質転換されたピメリン酸からビオチン産生能を
有するコリネ型細菌を、グルコースを単一炭素源として
含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しない平
板培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの大き
さによって選別して得られるビオチン高産生能コリネ型
細菌ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−７０９
株および該菌株をコハク酸を単一炭素源とした以外は上
記と同様の平板培地上で培養し、該培地上に生育したコ
ロニーの大きさによって選別して得られるビオチン高産
生能コリネ型細菌ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２
３３−ＳＬ２株。 【効果】 本発明のコリネ型細菌を用いて、ピメリン酸
からビオチンを著量産生することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はビオチン高産生能を有す
るコリネ型細菌およびその育種方法に関する。ビオチン
はヒト、動物、植物及びある種の微生物の生育に必要と
されるビタミンの１種であり、特に皮膚代謝の調整剤と
して、あるいはヒトの脱毛防止養毛剤として、あるい
は、家畜飼料への添加剤として用いられる有用な物質で
ある。
るコリネ型細菌およびその育種方法に関する。ビオチン
はヒト、動物、植物及びある種の微生物の生育に必要と
されるビタミンの１種であり、特に皮膚代謝の調整剤と
して、あるいはヒトの脱毛防止養毛剤として、あるい
は、家畜飼料への添加剤として用いられる有用な物質で
ある。
【０００２】
【従来の技術】ビオチンは卵黄から分離され、またビー
ル酵母、穀類、様々な動物の器官等の中に遊離型もしく
は蛋白質に結合した型で見出されている。微生物を用い
たビオチンの製造法としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）
属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）属、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属等の微生物を
用いる方法が知られている。
ル酵母、穀類、様々な動物の器官等の中に遊離型もしく
は蛋白質に結合した型で見出されている。微生物を用い
たビオチンの製造法としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）
属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）属、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属等の微生物を
用いる方法が知られている。
【０００３】また、工業的利用上多くの利点及びアミノ
酸、核酸発酵などに実績のあるコリネ型細菌のある種の
菌株はビオチンを生産しないが、本発明者らは先にこの
ビオチン要求性コリネ型細菌に、エシェリヒア・コリ由
来のビオチン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子
群を保有するプラスミドを導入し、この菌株を用いてビ
オチンを産生させることに成功し、提案した（特開平３
−２４０４８９）。
酸、核酸発酵などに実績のあるコリネ型細菌のある種の
菌株はビオチンを生産しないが、本発明者らは先にこの
ビオチン要求性コリネ型細菌に、エシェリヒア・コリ由
来のビオチン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子
群を保有するプラスミドを導入し、この菌株を用いてビ
オチンを産生させることに成功し、提案した（特開平３
−２４０４８９）。
【０００４】一方、ビオチン生合成に関与する酵素をコ
ードする遺伝子群としてｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏ
Ｃ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＨ、ｂｉｏＷ、ｂｉｏ
Ｘ、ｂｉｏＹ等が各種の微生物から単離されている。こ
のうち、ｂｉｏＡは７，８−ジアミノペラルゴン酸アミ
ノトランスフェラーゼ、ｂｉｏＢはデスチオビオチンか
らビオチンへの変換に関与する酵素、ｂｉｏＤはデスチ
オビオチンシンテターゼ、ｂｉｏＦは７−ケト−８−ア
ミノペラルゴン酸シンテターゼ、ｂｉｏＷはピメリルＣ
ｏＡシンテターゼをコードすることが知られているが、
ｂｉｏＣ、ｂｉｏＨ、ｂｉｏＸ、ｂｉｏＹについて、そ
の働きはいまだ明らかとなっていない。また、大腸菌
（エシェリヒア・コリ）においては、これらビオチン生
合成に関与する酵素をコードする遺伝子群のうち、ｂｉ
ｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦ遺伝子
はｂｉｏＡＢＦＣＤなるオペロンを形成している。
ードする遺伝子群としてｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏ
Ｃ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＨ、ｂｉｏＷ、ｂｉｏ
Ｘ、ｂｉｏＹ等が各種の微生物から単離されている。こ
のうち、ｂｉｏＡは７，８−ジアミノペラルゴン酸アミ
ノトランスフェラーゼ、ｂｉｏＢはデスチオビオチンか
らビオチンへの変換に関与する酵素、ｂｉｏＤはデスチ
オビオチンシンテターゼ、ｂｉｏＦは７−ケト−８−ア
ミノペラルゴン酸シンテターゼ、ｂｉｏＷはピメリルＣ
ｏＡシンテターゼをコードすることが知られているが、
ｂｉｏＣ、ｂｉｏＨ、ｂｉｏＸ、ｂｉｏＹについて、そ
の働きはいまだ明らかとなっていない。また、大腸菌
（エシェリヒア・コリ）においては、これらビオチン生
合成に関与する酵素をコードする遺伝子群のうち、ｂｉ
ｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦ遺伝子
はｂｉｏＡＢＦＣＤなるオペロンを形成している。
【０００５】これらビオチン生合成に関与する酵素をコ
ードする遺伝子群の詳細は、次の文献に開示されてい
る。Ａ．Ｊ．Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，ｐ１９５７７−１９５８５
（１９８８）、特開平２−２７９８０、Ｏ．Ｐｌｏｕｘ
ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８７，ｐ６
８５−６９０（１９９２）、Ｒ．Ｇｌｏｅｃｋｌｅｒ
ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８７（１９９０）、特開平４
−３３０２８４、特開平４−２７８０８８等。
ードする遺伝子群の詳細は、次の文献に開示されてい
る。Ａ．Ｊ．Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，ｐ１９５７７−１９５８５
（１９８８）、特開平２−２７９８０、Ｏ．Ｐｌｏｕｘ
ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８７，ｐ６
８５−６９０（１９９２）、Ｒ．Ｇｌｏｅｃｋｌｅｒ
ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８７（１９９０）、特開平４
−３３０２８４、特開平４−２７８０８８等。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、先に提
案したビオチン生合成に関与する酵素をコードする遺伝
子群を保有するプラスミドが導入されたコリネ型細菌
（特開平３−２４０４８９）のビオチン産生能を改良す
べく鋭意検討を行った。その結果、該コリネ型細菌をビ
オチン欠乏かつピメリン酸存在の選択圧下で特定の炭素
源を用いて培養することにより、ビオチン産生能が増強
された菌株が取得可能なことを見い出し、本発明を完成
するに至った。
案したビオチン生合成に関与する酵素をコードする遺伝
子群を保有するプラスミドが導入されたコリネ型細菌
（特開平３−２４０４８９）のビオチン産生能を改良す
べく鋭意検討を行った。その結果、該コリネ型細菌をビ
オチン欠乏かつピメリン酸存在の選択圧下で特定の炭素
源を用いて培養することにより、ビオチン産生能が増強
された菌株が取得可能なことを見い出し、本発明を完成
するに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、（１）ビオチン生合成に関与する酵素をコードする
遺伝子群の少なくとも一つの遺伝子が導入されたプラス
ミドで形質転換されたピメリン酸からビオチン産生能を
有するコリネ型細菌を、グルコースを単一炭素源として
含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しない寒
天培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの大き
さによって選別して得られるビオチン高産生能コリネ型
細菌およびその育種方法、（２）ビオチン生合成に関与
する酵素をコードする遺伝子群の少なくとも一つの遺伝
子が導入されたプラスミドで形質転換されたピメリン酸
からビオチン産生能を有するコリネ型細菌を、グルコー
スを単一炭素源として含有し且つピメリン酸を含有しビ
オチンを含有しない寒天培地上で培養し、該培地上に生
育したコロニーの大きさによって選別して得られるビオ
チン高産生能コリネ型細菌を、さらに有機酸を単一炭素
源として含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有
しない寒天培地上で培養し、該培地上に生育したコロニ
ーの大きさによって選別して得られるビオチン高産生能
コリネ型細菌およびその育種方法が提供される。
ば、（１）ビオチン生合成に関与する酵素をコードする
遺伝子群の少なくとも一つの遺伝子が導入されたプラス
ミドで形質転換されたピメリン酸からビオチン産生能を
有するコリネ型細菌を、グルコースを単一炭素源として
含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しない寒
天培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの大き
さによって選別して得られるビオチン高産生能コリネ型
細菌およびその育種方法、（２）ビオチン生合成に関与
する酵素をコードする遺伝子群の少なくとも一つの遺伝
子が導入されたプラスミドで形質転換されたピメリン酸
からビオチン産生能を有するコリネ型細菌を、グルコー
スを単一炭素源として含有し且つピメリン酸を含有しビ
オチンを含有しない寒天培地上で培養し、該培地上に生
育したコロニーの大きさによって選別して得られるビオ
チン高産生能コリネ型細菌を、さらに有機酸を単一炭素
源として含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有
しない寒天培地上で培養し、該培地上に生育したコロニ
ーの大きさによって選別して得られるビオチン高産生能
コリネ型細菌およびその育種方法が提供される。
【０００８】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。本発明において、親株として用いるビオチン生合成
に関与する酵素をコードする遺伝子群の少なくとも一つ
の遺伝子が導入されたプラスミドで形質転換されたピメ
リン酸からビオチン産生能を有するコリネ型細菌（以下
これを「ピメリン酸要求性コリネ型細菌」ということが
ある。）としては、宿主ビオチン要求性のコリネ型細菌
に前記したビオチン生合成に関与する酵素をコードする
遺伝子群の少くとも一つの遺伝子が導入されたプラスミ
ドで形質転換された菌株であって、該プラスミドの導入
によりピメリン酸からビオチンの産生能が付与された菌
株を意味する。
る。本発明において、親株として用いるビオチン生合成
に関与する酵素をコードする遺伝子群の少なくとも一つ
の遺伝子が導入されたプラスミドで形質転換されたピメ
リン酸からビオチン産生能を有するコリネ型細菌（以下
これを「ピメリン酸要求性コリネ型細菌」ということが
ある。）としては、宿主ビオチン要求性のコリネ型細菌
に前記したビオチン生合成に関与する酵素をコードする
遺伝子群の少くとも一つの遺伝子が導入されたプラスミ
ドで形質転換された菌株であって、該プラスミドの導入
によりピメリン酸からビオチンの産生能が付与された菌
株を意味する。
【０００９】ここで、宿主ビオチン要求性コリネ型細菌
としては、例えば、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏ
ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバク
テリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３０並び
にブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）およびその由来株を挙げることができ
る。なお宿主としてブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株が保有するプ
ラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７８７号公報
参照）のため、形質転換が困難である場合があるので、
そのような場合には、本菌株よりプラスミドｐＢＹ５０
２を除去することが望ましい。そのようなプラスミドｐ
ＢＹ５０２を除去する方法としては、例えば、継代培養
を繰り返すことにより、自然に欠失させることも可能で
あるし、人為的に除去することも可能である〔Ｂａｃ
ｔ．Ｒｅｖ．３６ｐ．３６１〜４０５（１９７２）参
照〕。
としては、例えば、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏ
ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバク
テリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３０並び
にブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）およびその由来株を挙げることができ
る。なお宿主としてブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株が保有するプ
ラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７８７号公報
参照）のため、形質転換が困難である場合があるので、
そのような場合には、本菌株よりプラスミドｐＢＹ５０
２を除去することが望ましい。そのようなプラスミドｐ
ＢＹ５０２を除去する方法としては、例えば、継代培養
を繰り返すことにより、自然に欠失させることも可能で
あるし、人為的に除去することも可能である〔Ｂａｃ
ｔ．Ｒｅｖ．３６ｐ．３６１〜４０５（１９７２）参
照〕。
【００１０】ビオチン生合成に関与する酵素をコードす
る遺伝子群の少くとも１つの遺伝子が導入されたプラス
ミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリ由来のビオ
チンオペロン（ｂｉｏＡＢＦＣＤ）ＤＮＡ断片、エシェ
リヒア・コリ由来のｂｉｏＨを含有するＤＮＡ断片、コ
リネ型細菌細胞内で複製増殖能を有するＤＮＡ断片及び
プラスミド安定化機能を有するＤＮＡ断片を保有するプ
ラスミドｐＣＲＹ３０−ＢＩＯ１（特開平３−２４０４
８９）およびエシェリヒア・コリ由来のビオチンオペロ
ン（ｂｉｏＡＢＦＣＤ）ＤＮＡ断片、コリネ型細菌細胞
内で複製増殖能を有するＤＮＡ断片及びプラスミド安定
化機能を有するＤＮＡ断片を保有するプラスミドｐＣＲ
Ｙ３０−ＢＩＯ（特開平３−２４０４８９）を挙げるこ
とができる。
る遺伝子群の少くとも１つの遺伝子が導入されたプラス
ミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリ由来のビオ
チンオペロン（ｂｉｏＡＢＦＣＤ）ＤＮＡ断片、エシェ
リヒア・コリ由来のｂｉｏＨを含有するＤＮＡ断片、コ
リネ型細菌細胞内で複製増殖能を有するＤＮＡ断片及び
プラスミド安定化機能を有するＤＮＡ断片を保有するプ
ラスミドｐＣＲＹ３０−ＢＩＯ１（特開平３−２４０４
８９）およびエシェリヒア・コリ由来のビオチンオペロ
ン（ｂｉｏＡＢＦＣＤ）ＤＮＡ断片、コリネ型細菌細胞
内で複製増殖能を有するＤＮＡ断片及びプラスミド安定
化機能を有するＤＮＡ断片を保有するプラスミドｐＣＲ
Ｙ３０−ＢＩＯ（特開平３−２４０４８９）を挙げるこ
とができる。
【００１１】前記コリネ型細菌への上記プラスミドの導
入は、電気パルス法〔Ｓａｔｏｈ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，１５９（１９９０）参照〕等
により容易に行うことができる。上記した本発明で親株
として用いるピメリン酸要求性コリネ型細菌としては、
例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０−ＢＩＯ１を保持する
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＢＩＯ１
（ＦＥＲＭ Ｐ−１１１２１）およびプラスミドｐＣＲ
Ｙ３０−ＢＩＯを保持するブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ２３３−ＢＩＯ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６５）を
挙げることができる。
入は、電気パルス法〔Ｓａｔｏｈ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，１５９（１９９０）参照〕等
により容易に行うことができる。上記した本発明で親株
として用いるピメリン酸要求性コリネ型細菌としては、
例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０−ＢＩＯ１を保持する
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＢＩＯ１
（ＦＥＲＭ Ｐ−１１１２１）およびプラスミドｐＣＲ
Ｙ３０−ＢＩＯを保持するブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ２３３−ＢＩＯ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６５）を
挙げることができる。
【００１２】前記した３種のビオチン要求性コリネ型細
菌は同様にピメリルＣｏＡ生合成に関与する酵素をコー
ドする遺伝子（ｂｉｏＨ，ｂｉｏＣ等）および７−ケト
−８−アミノペラルゴン酸シンテターゼをコードする遺
伝子（ｂｉｏＦ）が欠損あるいはその発現が欠如してお
り、また少くとも７，８−ジアミノペラルゴン酸アミノ
トランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ）、
デスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝子（ｂ
ｉｏＤ）およびデスチオビオチンからビオチンへの変換
に関与する酵素をコードする遺伝子を保有しており（特
開平４−２７８０８８）、前記ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムおよびコリネバクテリウム・グルタ
ミカムに前記プラスミド、例えば、ｐＣＲＹ３０−ＢＩ
Ｏ１又はｐＣＲＹ３０−ＢＩＯが導入された菌株もまた
ピメリン酸要求性コリネ型細菌として用いることができ
る。
菌は同様にピメリルＣｏＡ生合成に関与する酵素をコー
ドする遺伝子（ｂｉｏＨ，ｂｉｏＣ等）および７−ケト
−８−アミノペラルゴン酸シンテターゼをコードする遺
伝子（ｂｉｏＦ）が欠損あるいはその発現が欠如してお
り、また少くとも７，８−ジアミノペラルゴン酸アミノ
トランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ）、
デスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝子（ｂ
ｉｏＤ）およびデスチオビオチンからビオチンへの変換
に関与する酵素をコードする遺伝子を保有しており（特
開平４−２７８０８８）、前記ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムおよびコリネバクテリウム・グルタ
ミカムに前記プラスミド、例えば、ｐＣＲＹ３０−ＢＩ
Ｏ１又はｐＣＲＹ３０−ＢＩＯが導入された菌株もまた
ピメリン酸要求性コリネ型細菌として用いることができ
る。
【００１３】これらピメリン酸要求性コリネ型細菌から
ビオチン高産生株の育種は次のとおり行うことができ
る。先ず、ピメリン酸要求性コリネ型細菌、例えばブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＢＩＯ（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３７６５）を、窒素源、無機塩、ビタミンを
含み、単一炭素源としてグルコースのみを含み、且つピ
メリン酸を含みビオチンを含まない培地（以下これを
「ピメリン酸／グルコース最小培地」ということがあ
る。）に寒天を加えた平板培地上に塗沫して培養する。
培養後、コロニーの大きさを指標として生育の速いコロ
ニー（大きなコロニー）を採取し、各々のコロニーから
得られた菌体を再度ピメリン酸／グルコース最小培地
（平板培地あるいは液体培地）で培養し、生育速度が速
く、且つビオチン産生能の増加した菌株を採取する。
ビオチン高産生株の育種は次のとおり行うことができ
る。先ず、ピメリン酸要求性コリネ型細菌、例えばブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＢＩＯ（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３７６５）を、窒素源、無機塩、ビタミンを
含み、単一炭素源としてグルコースのみを含み、且つピ
メリン酸を含みビオチンを含まない培地（以下これを
「ピメリン酸／グルコース最小培地」ということがあ
る。）に寒天を加えた平板培地上に塗沫して培養する。
培養後、コロニーの大きさを指標として生育の速いコロ
ニー（大きなコロニー）を採取し、各々のコロニーから
得られた菌体を再度ピメリン酸／グルコース最小培地
（平板培地あるいは液体培地）で培養し、生育速度が速
く、且つビオチン産生能の増加した菌株を採取する。
【００１４】次に、このようにして得られる生育速度が
速く、ビオチン産生能の増大した菌株を、窒素源、無機
塩、ビタミンを含み、単一炭素源として有機酸のみを含
み、且つピメリン酸を含みビオチンを含まない培地（以
下これを「ピメリン酸／有機酸最小培地」ということが
ある。）に寒天を加えた平板培地上に塗沫し培養する。
培養後、コロニーの大きさを指標として生育の速いコロ
ニー（大きなコロニー）を採取し、各々のコロニーから
得られた菌体を再度ピメリン酸／有機酸最小培地（平板
培地あるいは液体培地）で培養し、生育速度が速く、且
つビオチン産生能の増加した菌株を採取する。
速く、ビオチン産生能の増大した菌株を、窒素源、無機
塩、ビタミンを含み、単一炭素源として有機酸のみを含
み、且つピメリン酸を含みビオチンを含まない培地（以
下これを「ピメリン酸／有機酸最小培地」ということが
ある。）に寒天を加えた平板培地上に塗沫し培養する。
培養後、コロニーの大きさを指標として生育の速いコロ
ニー（大きなコロニー）を採取し、各々のコロニーから
得られた菌体を再度ピメリン酸／有機酸最小培地（平板
培地あるいは液体培地）で培養し、生育速度が速く、且
つビオチン産生能の増加した菌株を採取する。
【００１５】ここで、ピメリン酸／グルコース最小培地
およびピメリン酸／有機酸最小培地の窒素源としては、
例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独もしく
は混合して用いられる。また無機塩としては、例えば、
リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マ
グネシウム等が単独もしくは混合して用いられ、ビタミ
ンとしては、チアミンが用いられる。
およびピメリン酸／有機酸最小培地の窒素源としては、
例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独もしく
は混合して用いられる。また無機塩としては、例えば、
リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マ
グネシウム等が単独もしくは混合して用いられ、ビタミ
ンとしては、チアミンが用いられる。
【００１６】また、炭素源として用いる有機酸として
は、例えば、コハク酸もしくはそのナトリウム塩、リン
ゴ酸もしくはそのナトリウム塩、クエン酸もしくはその
ナトリウム塩等が挙げられるが、それらの中でコハク酸
ナトリウムを用いるのが最も好ましい。前記最小培地中
の炭素源として用いるグルコース又は有機酸の濃度に特
に制限はなく、微生物の培養に通常用いる濃度０．２〜
５％（ｗｔ／ｖｏｌ）、好ましくは１〜３％（ｗｔ／ｖ
ｏｌ）を用いることができる。また、窒素源、無機塩、
ビタミン等の濃度にも特別な制限はなく、微生物の培養
に通常用いる濃度を用いることができる。
は、例えば、コハク酸もしくはそのナトリウム塩、リン
ゴ酸もしくはそのナトリウム塩、クエン酸もしくはその
ナトリウム塩等が挙げられるが、それらの中でコハク酸
ナトリウムを用いるのが最も好ましい。前記最小培地中
の炭素源として用いるグルコース又は有機酸の濃度に特
に制限はなく、微生物の培養に通常用いる濃度０．２〜
５％（ｗｔ／ｖｏｌ）、好ましくは１〜３％（ｗｔ／ｖ
ｏｌ）を用いることができる。また、窒素源、無機塩、
ビタミン等の濃度にも特別な制限はなく、微生物の培養
に通常用いる濃度を用いることができる。
【００１７】最小培地中のピメリン酸濃度にも特別な制
限はなく、通常０．１ｍｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ、好ましく
は１０ｍｇ／ｌ〜１ｇ／ｌが適当である。平板培地上で
の培養は、通常、約１〜１０日間、温度約２０〜４０℃
で行うことができ、また必要に応じて液体培地で培養す
る場合は、通常、通気撹拌、振盪等の好気的条件下に、
温度約２０〜４０℃、約１〜５日間行うことができる。
限はなく、通常０．１ｍｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ、好ましく
は１０ｍｇ／ｌ〜１ｇ／ｌが適当である。平板培地上で
の培養は、通常、約１〜１０日間、温度約２０〜４０℃
で行うことができ、また必要に応じて液体培地で培養す
る場合は、通常、通気撹拌、振盪等の好気的条件下に、
温度約２０〜４０℃、約１〜５日間行うことができる。
【００１８】液体培養における菌体の生育速度は濁度
計、例えばスペクトロニック２０Ａ（島津製作所社製）
を用いて濁度を測定して求めることができ、培養物中の
ビオチン量は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ
７７５４による微生物定量法（ビタミン学実験法〔I
I〕、日本ビタミン学会（１９８５）ｐ４８６−４９
２）で測定することができる。
計、例えばスペクトロニック２０Ａ（島津製作所社製）
を用いて濁度を測定して求めることができ、培養物中の
ビオチン量は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ
７７５４による微生物定量法（ビタミン学実験法〔I
I〕、日本ビタミン学会（１９８５）ｐ４８６−４９
２）で測定することができる。
【００１９】かくして得られるビオチン高産生微生物と
しては、ピメリン酸／グルコース最小培地で選択するこ
とにより得られるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２
３３−７０９（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６４）、さらにこ
の微生物をピメリン酸／有機酸最小培地で選択すること
により得られるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３
３−ＳＬ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７９１）を挙げること
ができる。
しては、ピメリン酸／グルコース最小培地で選択するこ
とにより得られるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２
３３−７０９（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６４）、さらにこ
の微生物をピメリン酸／有機酸最小培地で選択すること
により得られるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３
３−ＳＬ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７９１）を挙げること
ができる。
【００２０】これらビオチン高産生能変異株の菌学的性
質は、ピメリン酸／グルコース最小培地又はピメリン酸
／有機酸最小培地での生育速度の増加およびビオチン産
生能のちがいを除いては、プラスミドｐＣＲＹ３０−Ｂ
ＩＯ導入の宿主として用いたブレビバクテリウムフラバ
ムＭＪ−２３３と同様であった（菌学的性質の詳細につ
いては、特開昭５１−１３０５９２号公報参照）。
質は、ピメリン酸／グルコース最小培地又はピメリン酸
／有機酸最小培地での生育速度の増加およびビオチン産
生能のちがいを除いては、プラスミドｐＣＲＹ３０−Ｂ
ＩＯ導入の宿主として用いたブレビバクテリウムフラバ
ムＭＪ−２３３と同様であった（菌学的性質の詳細につ
いては、特開昭５１−１３０５９２号公報参照）。
【００２１】かくして得られる本発明のビオチン高産能
コリネ型細菌は、ピメリン酸からビオチンを高産生する
能力を有しており、本発明のビオチン高産生能コリネ型
細菌を用い、ピメリン酸からビオチンを著量製造するこ
とができる。上記の方法で得られるビオチン高産生コリ
ネ型細菌、例えば、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
２３３−７０９およびブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ＳＬ２を用いるビオチンの製造法を以下に述
べる。
コリネ型細菌は、ピメリン酸からビオチンを高産生する
能力を有しており、本発明のビオチン高産生能コリネ型
細菌を用い、ピメリン酸からビオチンを著量製造するこ
とができる。上記の方法で得られるビオチン高産生コリ
ネ型細菌、例えば、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
２３３−７０９およびブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ＳＬ２を用いるビオチンの製造法を以下に述
べる。
【００２２】培養は炭素源、窒素源、無機塩等を含む通
常の栄養培地に少なくともピメリン酸を適量添加したも
ので行うことができ、炭素源としては、例えば、グルコ
ース、エタノール、メタノール、廃糖蜜等が、そして窒
素源としては、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそ
れぞれ単独もしくは混合して用いられる。また無機塩と
しては、例えば、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他に
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリ
カー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添
加することもできる。
常の栄養培地に少なくともピメリン酸を適量添加したも
ので行うことができ、炭素源としては、例えば、グルコ
ース、エタノール、メタノール、廃糖蜜等が、そして窒
素源としては、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそ
れぞれ単独もしくは混合して用いられる。また無機塩と
しては、例えば、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他に
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリ
カー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添
加することもできる。
【００２３】培地中に添加するピメリン酸濃度に特に制
限はないが、通常１０ｍｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌ、好ましく
は１００ｍｇ／ｌ〜５ｇ／ｌが適当である。培養は、通
常、通気撹拌、振盪等の好気的条件下に、約２０〜４０
℃、好ましくは２５〜３５℃の温度で行うことができ
る。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近
で行い、培養中のｐＨの調整は酸又はアルカリを添加し
て行うことができる。
限はないが、通常１０ｍｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌ、好ましく
は１００ｍｇ／ｌ〜５ｇ／ｌが適当である。培養は、通
常、通気撹拌、振盪等の好気的条件下に、約２０〜４０
℃、好ましくは２５〜３５℃の温度で行うことができ
る。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近
で行い、培養中のｐＨの調整は酸又はアルカリを添加し
て行うことができる。
【００２４】培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは１
〜５％（ｗｔ／ｖｏｌ）、更に好ましくは２〜３％（ｗ
ｔ／ｖｏｌ）である。また、培養期間は通常１〜７日間
とすることができ、最適期間は３日間である。培養を終
了した後、培養液からのビオチンの抽出精製にあたって
は、ビオチンの諸性質を利用して、一般の天然物からの
抽出精製法が応用できる。すなわち、培養物から菌体を
除き活性炭に吸着させ、その後溶出させ、イオン交換樹
脂で精製するか、あるいは培養濾液を直接イオン交換樹
脂で処理して精製し、水またはアルコールより再結晶す
ることにより、ビオチンを取得することができる。
〜５％（ｗｔ／ｖｏｌ）、更に好ましくは２〜３％（ｗ
ｔ／ｖｏｌ）である。また、培養期間は通常１〜７日間
とすることができ、最適期間は３日間である。培養を終
了した後、培養液からのビオチンの抽出精製にあたって
は、ビオチンの諸性質を利用して、一般の天然物からの
抽出精製法が応用できる。すなわち、培養物から菌体を
除き活性炭に吸着させ、その後溶出させ、イオン交換樹
脂で精製するか、あるいは培養濾液を直接イオン交換樹
脂で処理して精製し、水またはアルコールより再結晶す
ることにより、ビオチンを取得することができる。
【００２５】
【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、実施
例は本発明の具体的に認識を得る一助とみなすべきもの
であり、本発明の範囲を限定するためのものではない。
例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、実施
例は本発明の具体的に認識を得る一助とみなすべきもの
であり、本発明の範囲を限定するためのものではない。
【００２６】参考例１ プラスミドｐＣＲＹ３０−ＢＩ
Ｏの作製及びコリネ型細菌への導入 ビオチン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子とし
ては、特開平３−２４０４８９の実施例１に記載の方法
で調製されたプラスミドｐＨＳＧ３９８−ｂｉｏに含有
されるエシェリヒア・コリ由来のビオチンオペロン（ｂ
ｉｏＡＢＦＣＤ）ＤＮＡ断片を用い、コリネ型細菌細胞
内で複製増殖能を有するＤＮＡ断片及びプラスミド安定
化機能を有するＤＮＡ断片としては、特開平３−２４０
４８９の実施例２に記載の方法で調製されたプラスミド
ベクターｐＣＲＹ３０を用いた。
Ｏの作製及びコリネ型細菌への導入 ビオチン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子とし
ては、特開平３−２４０４８９の実施例１に記載の方法
で調製されたプラスミドｐＨＳＧ３９８−ｂｉｏに含有
されるエシェリヒア・コリ由来のビオチンオペロン（ｂ
ｉｏＡＢＦＣＤ）ＤＮＡ断片を用い、コリネ型細菌細胞
内で複製増殖能を有するＤＮＡ断片及びプラスミド安定
化機能を有するＤＮＡ断片としては、特開平３−２４０
４８９の実施例２に記載の方法で調製されたプラスミド
ベクターｐＣＲＹ３０を用いた。
【００２７】プラスミドｐＨＳＧ３９８−ｂｉｏ ５μ
ｇ及びプラスミドベクターｐＣＲＹ３０ １μｇを各々
制限酵素ＥｃｏＲＩ ５ｕｎｉｔｓを用い、３７℃で１
時間反応させ分解した。両分解ＤＮＡを混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼにて結合させ、常法に従いエシェリヒア・
コリＣＶ５３０Ｃ Ｇａｌ−ＵｖｒＢ３株〔Ｆ- ：ｌｅ
ｕＡ３７１ δ（ｌａｃ−ｐｒｏ） ｔｈｉ δ（ｇａ
ｌ−ｂｉｏ−ＵｖｒＢ）；国立遺伝学研究所遺伝実験生
物保存センターより分譲〕を形質転換し、カナマイシン
５０ｍｇを含む選択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ０．１ｇ、カザミノ酸１０ｇ、グルコース２ｇ及び
寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解〕に塗沫した。
ｇ及びプラスミドベクターｐＣＲＹ３０ １μｇを各々
制限酵素ＥｃｏＲＩ ５ｕｎｉｔｓを用い、３７℃で１
時間反応させ分解した。両分解ＤＮＡを混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼにて結合させ、常法に従いエシェリヒア・
コリＣＶ５３０Ｃ Ｇａｌ−ＵｖｒＢ３株〔Ｆ- ：ｌｅ
ｕＡ３７１ δ（ｌａｃ−ｐｒｏ） ｔｈｉ δ（ｇａ
ｌ−ｂｉｏ−ＵｖｒＢ）；国立遺伝学研究所遺伝実験生
物保存センターより分譲〕を形質転換し、カナマイシン
５０ｍｇを含む選択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ０．１ｇ、カザミノ酸１０ｇ、グルコース２ｇ及び
寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解〕に塗沫した。
【００２８】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドベクターｐＣＲＹ３０
の長さ８．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ６．０ｋｂ
の挿入ＤＮＡ断片が認められた。上記の如く調製された
プラスミドＤＮＡを、コリネ型細菌へ形質転換した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドベクターｐＣＲＹ３０
の長さ８．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ６．０ｋｂ
の挿入ＤＮＡ断片が認められた。上記の如く調製された
プラスミドＤＮＡを、コリネ型細菌へ形質転換した。
【００２９】形質転換は、電気パルス法を用いて行っ
た。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０２除去株
を１００ｍｌの半合成Ａ培地（尿素２ｇ／１、硫安７ｇ
／１、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５ｇ／１、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５
ｇ／１、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．５ｇ／１、ＦｅＳＯ
4 ・７Ｈ2 Ｏ６ｍｇ／１、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2 Ｏ６
ｍｇ／１、塩酸チアミン１００μｇ／１、ビオチン２０
０μｇ／１、カザミノ酸１ｇ／１、酵母エキス１ｇ／
１；ＮａＯＨにてｐＨを７．２に調節）で対数増殖期初
期まで培養し、ペニシリンＧを１ユニット／ｍｌになる
ように添加して、さらに２時間振盪培養し、遠心分離に
より菌体を集め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液（２７
２ｍＭ Ｓｕｃｒｏｓｅ、７ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 、１ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 ：ｐＨ７．４）にて洗浄した。さらに菌
体を遠心分離して集め、５ｍｌのパルス用溶液に懸濁
し、０．７５ｍｌの細胞と、前記で得られたプラスミド
ＤＮＡ溶液５０μｌとを混合し、水中にて２０分間静置
した。ジーンパルサー（バイオラド社製）を用いて、２
５００ボルト、２５μＦＤに設定し、パルスを印加後氷
中に２０分間静置した。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に移
し３０℃にて１時間培養後、カナマイシン１５μｇ／ｍ
ｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に植菌し３０℃で
２〜３日間培養した。出現したカナマイシン耐性株よ
り、アルカリ−ＳＤＳ法〔Ｓａｔｏｈ，Ｙ．ｅｔａ
ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，１５９（１９９０）〕
によりプラスミドを得た。このプラスミドを各種制限酵
素で切断し、切断片の大きさをアガロースゲル電気永動
で測定した。その結果を下記の表１に示す。
た。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０２除去株
を１００ｍｌの半合成Ａ培地（尿素２ｇ／１、硫安７ｇ
／１、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５ｇ／１、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５
ｇ／１、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．５ｇ／１、ＦｅＳＯ
4 ・７Ｈ2 Ｏ６ｍｇ／１、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2 Ｏ６
ｍｇ／１、塩酸チアミン１００μｇ／１、ビオチン２０
０μｇ／１、カザミノ酸１ｇ／１、酵母エキス１ｇ／
１；ＮａＯＨにてｐＨを７．２に調節）で対数増殖期初
期まで培養し、ペニシリンＧを１ユニット／ｍｌになる
ように添加して、さらに２時間振盪培養し、遠心分離に
より菌体を集め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液（２７
２ｍＭ Ｓｕｃｒｏｓｅ、７ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 、１ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 ：ｐＨ７．４）にて洗浄した。さらに菌
体を遠心分離して集め、５ｍｌのパルス用溶液に懸濁
し、０．７５ｍｌの細胞と、前記で得られたプラスミド
ＤＮＡ溶液５０μｌとを混合し、水中にて２０分間静置
した。ジーンパルサー（バイオラド社製）を用いて、２
５００ボルト、２５μＦＤに設定し、パルスを印加後氷
中に２０分間静置した。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に移
し３０℃にて１時間培養後、カナマイシン１５μｇ／ｍ
ｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に植菌し３０℃で
２〜３日間培養した。出現したカナマイシン耐性株よ
り、アルカリ−ＳＤＳ法〔Ｓａｔｏｈ，Ｙ．ｅｔａ
ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，１５９（１９９０）〕
によりプラスミドを得た。このプラスミドを各種制限酵
素で切断し、切断片の大きさをアガロースゲル電気永動
で測定した。その結果を下記の表１に示す。
【００３０】
【表１】 表 １ 制限酵素 認識部位数 切断片の大きさ（ｋｂ） ＥｃｏＲＩ ２ ８．６，６．０ Ｋｐｎ Ｉ １ １４．６ Ｓａｌ Ｉ ２ １４．４，０．２ 上記制限酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＣＲ
Ｙ３０−ＢＩＯと命名した。
Ｙ３０−ＢＩＯと命名した。
【００３１】なお、プラスミドｐＣＲＹ３０−ＢＩＯに
より形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
２３３−ＢＩＯは、茨城県つくば市東１丁目１番３号の
工業技術院生命工学工業技術研究所に、平成５年７月２
７日付で受託番号：ＦＥＲＭＰ−１３７６５として寄託
されている。
より形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
２３３−ＢＩＯは、茨城県つくば市東１丁目１番３号の
工業技術院生命工学工業技術研究所に、平成５年７月２
７日付で受託番号：ＦＥＲＭＰ−１３７６５として寄託
されている。
【００３２】実施例１ ピメリン酸／グルコース最小培
地生育速度増大株の選択 前記半合成Ａ培地１００ｍｌを容量５００ｍｌの振盪フ
ラスコに入れ１２０℃で１５分間殺菌した。この培地に
５ｍｇ／ｍｌカナマイシン１ｍｌ及び滅菌した５０％グ
ルコース４ｍｌを添加した後、ブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ２３３−ＢＩＯ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６
５）を１白金耳量植菌し、３３℃で２日間振盪培養し
た。
地生育速度増大株の選択 前記半合成Ａ培地１００ｍｌを容量５００ｍｌの振盪フ
ラスコに入れ１２０℃で１５分間殺菌した。この培地に
５ｍｇ／ｍｌカナマイシン１ｍｌ及び滅菌した５０％グ
ルコース４ｍｌを添加した後、ブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ２３３−ＢＩＯ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６
５）を１白金耳量植菌し、３３℃で２日間振盪培養し
た。
【００３３】遠心分離により培養物から菌体を回収し、
この菌体を前記半合成Ａ培地からカザミノ酸および酵母
エキスを除いた培地にて２回洗浄したのち、カナマイシ
ン５０μｇ／ｍｌを含むピメリン酸／グルコース最小培
地（尿素２ｇ／ｌ、硫安７ｇ／ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５
ｇ／ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／
ｌ、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／ｌ、チアミン
塩酸１００μｇ／ｌ、ピメリン酸０．１ｇ／ｌ、グルコ
ース２０ｇ／ｌ；ＮａＯＨにてｐＨを７．２に調節）に
寒天を加えた平板培地上に塗沫した。３３℃で３日間培
養することにより出現した生育の速いコロニー（大きな
コロニー）を白金耳で釣り上げ、再度ピメリン酸／グル
コース最小平板培地に塗沫し、３３℃で培養した結果、
得られた菌株はピメリン酸／グルコース最小培地上での
生育速度が上昇していることが確認された。
この菌体を前記半合成Ａ培地からカザミノ酸および酵母
エキスを除いた培地にて２回洗浄したのち、カナマイシ
ン５０μｇ／ｍｌを含むピメリン酸／グルコース最小培
地（尿素２ｇ／ｌ、硫安７ｇ／ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５
ｇ／ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／
ｌ、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／ｌ、チアミン
塩酸１００μｇ／ｌ、ピメリン酸０．１ｇ／ｌ、グルコ
ース２０ｇ／ｌ；ＮａＯＨにてｐＨを７．２に調節）に
寒天を加えた平板培地上に塗沫した。３３℃で３日間培
養することにより出現した生育の速いコロニー（大きな
コロニー）を白金耳で釣り上げ、再度ピメリン酸／グル
コース最小平板培地に塗沫し、３３℃で培養した結果、
得られた菌株はピメリン酸／グルコース最小培地上での
生育速度が上昇していることが確認された。
【００３４】該菌株をブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−７０９と命名した。該菌株は、茨城県つくば
市東１丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究
所に、平成５年７月２７日付で受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ
−１３７６４として寄託されている。
Ｊ２３３−７０９と命名した。該菌株は、茨城県つくば
市東１丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究
所に、平成５年７月２７日付で受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ
−１３７６４として寄託されている。
【００３５】実施例２ ピメリン酸／コハク酸最小培地
生育速度増大株の選択 前記半合成Ａ培地１００ｍｌを容量５００ｍｌの振盪フ
ラスコに入れ１２０℃で１５分間殺菌した。この培地に
５ｍｇ／ｍｌカナマイシン１ｍｌ及び滅菌した５０％コ
ハク酸ナトリウム４ｍｌを添加した後、実施例１で得ら
れたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−７０９
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６４）を１白金耳量植菌し、３
３℃で２日間振盪培養した。
生育速度増大株の選択 前記半合成Ａ培地１００ｍｌを容量５００ｍｌの振盪フ
ラスコに入れ１２０℃で１５分間殺菌した。この培地に
５ｍｇ／ｍｌカナマイシン１ｍｌ及び滅菌した５０％コ
ハク酸ナトリウム４ｍｌを添加した後、実施例１で得ら
れたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−７０９
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６４）を１白金耳量植菌し、３
３℃で２日間振盪培養した。
【００３６】遠心分離により培養物から菌体を回収し、
この菌体を前記半合成Ａ培地からカザミノ酸および酵母
エキスを除いた培地にて２回洗浄したのち、カナマイシ
ン５０μｇ／ｍｌを含むピメリン酸／コハク酸最小培地
（尿素２ｇ／ｌ、硫安７ｇ／ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５ｇ
／ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ 2
Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／
ｌ、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／ｌ、チアミン
塩酸１００μｇ／ｌ、ピメリン酸０．１ｇ／ｌ、コハク
酸ナトリウム２０ｇ／ｌ；ＮａＯＨにてｐＨを７．２に
調節）に寒天を加えた平板培地上に塗沫した。３３℃で
３日間培養することにより出現した生育の速いコロニー
を白金耳で釣り上げ、再度ピメリン酸／コハク酸最小平
板培地に塗沫し、３３℃で培養した結果、得られた菌株
はピメリン酸／コハク酸最小培地上で生育速度が上昇し
ていることが確認された。
この菌体を前記半合成Ａ培地からカザミノ酸および酵母
エキスを除いた培地にて２回洗浄したのち、カナマイシ
ン５０μｇ／ｍｌを含むピメリン酸／コハク酸最小培地
（尿素２ｇ／ｌ、硫安７ｇ／ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５ｇ
／ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ 2
Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／
ｌ、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／ｌ、チアミン
塩酸１００μｇ／ｌ、ピメリン酸０．１ｇ／ｌ、コハク
酸ナトリウム２０ｇ／ｌ；ＮａＯＨにてｐＨを７．２に
調節）に寒天を加えた平板培地上に塗沫した。３３℃で
３日間培養することにより出現した生育の速いコロニー
を白金耳で釣り上げ、再度ピメリン酸／コハク酸最小平
板培地に塗沫し、３３℃で培養した結果、得られた菌株
はピメリン酸／コハク酸最小培地上で生育速度が上昇し
ていることが確認された。
【００３７】該菌株をブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ＳＬ２と命名した。該菌株は、茨城県つくば
市東１丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究
所に、平成５年８月６日付で受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−
１３７９１として寄託されている。
Ｊ２３３−ＳＬ２と命名した。該菌株は、茨城県つくば
市東１丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究
所に、平成５年８月６日付で受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−
１３７９１として寄託されている。
【００３８】実施例３ ビオチンの製造 合成ＣＰ培地（尿素２ｇ／ｌ、硫安７ｇ／ｌ、ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 ０．５ｇ／ｌ、Ｋ 2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳ
Ｏ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
６ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／
ｌ、チアミン塩酸塩１００μｇ／ｌ、ピメリン酸１ｇ／
ｌ；ＮａＯＨにてｐＨを７．２に調節）５ｍｌを直径１
８ｍｍの試験管に分注し１２０℃で１５分間殺菌した。
この培地に５ｍｇ／ｍｌカナマイシン０．０５ｍｌと滅
菌した５０％グルコース０．２ｍｌを添加した後、ブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−７０９（ＦＥＲ
ＭＰ−１３７６４）、ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ＳＬ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７９１）、また
対照としてブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−
ＢＩＯ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６５）を１白金耳量それ
ぞれ植菌し、３３℃で２４時間振盪培養した。
Ｏ4 ０．５ｇ／ｌ、Ｋ 2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳ
Ｏ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
６ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／
ｌ、チアミン塩酸塩１００μｇ／ｌ、ピメリン酸１ｇ／
ｌ；ＮａＯＨにてｐＨを７．２に調節）５ｍｌを直径１
８ｍｍの試験管に分注し１２０℃で１５分間殺菌した。
この培地に５ｍｇ／ｍｌカナマイシン０．０５ｍｌと滅
菌した５０％グルコース０．２ｍｌを添加した後、ブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−７０９（ＦＥＲ
ＭＰ−１３７６４）、ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ＳＬ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７９１）、また
対照としてブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−
ＢＩＯ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６５）を１白金耳量それ
ぞれ植菌し、３３℃で２４時間振盪培養した。
【００３９】次に、上記ＣＰ培地１００ｍｌを容量５０
０ｍｌの振盪フラスコに入れ１２０℃で１５分間殺菌し
た。この培地に５ｍｇ／ｍｌカナマイシン１．０ｍｌと
滅菌した５０％グルコース４ｍｌを添加した後、上記の
前培養物１ｍｌをそれぞれ植菌し、３３℃で３日間振盪
培養した。培養終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１
５分間、４℃）にて培養物から菌体を除去し、上清中の
ビオチンを定量した。その結果を表２に示す。
０ｍｌの振盪フラスコに入れ１２０℃で１５分間殺菌し
た。この培地に５ｍｇ／ｍｌカナマイシン１．０ｍｌと
滅菌した５０％グルコース４ｍｌを添加した後、上記の
前培養物１ｍｌをそれぞれ植菌し、３３℃で３日間振盪
培養した。培養終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１
５分間、４℃）にて培養物から菌体を除去し、上清中の
ビオチンを定量した。その結果を表２に示す。
【００４０】なお、表中ビオチン生成量は、サッカロミ
セス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ７７５４による微生物定量
法（ビタミン学実験法〔II〕日本ビタミン学会（１９８
５）ｐ４８６−４９２）により定量した値である。
セス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ７７５４による微生物定量
法（ビタミン学実験法〔II〕日本ビタミン学会（１９８
５）ｐ４８６−４９２）により定量した値である。
【００４１】
【表２】表 ２ 菌 株 ビオチン生成量 ＭＪ２３３−７０９ １５μｇ／ｌ ＭＪ２３３−ＳＬ２ ５０μｇ／ｌＭＪ２３３−ＢＩＯ ５μｇ／ｌ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 ビオチン生合成に関与する酵素をコード
する遺伝子群の少なくとも一つの遺伝子が導入されたプ
ラスミドで形質転換されたピメリン酸からビオチン産生
能を有するコリネ型細菌を、グルコースを単一炭素源と
して含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しな
い平板培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの
大きさによって選別して得られるビオチン高産生能コリ
ネ型細菌。 - 【請求項２】 ビオチン高産生能コリネ型細菌がブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ２３３−７０９（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３７６４）である請求項１記載のビオチン高産
生能コリネ型細菌。 - 【請求項３】 ビオチン生合成に関与する酵素をコード
する遺伝子群の少なくとも一つの遺伝子が導入されたプ
ラスミドで形質転換されたピメリン酸からビオチン産生
能を有するコリネ型細菌を、グルコースを単一炭素源と
して含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しな
い平板培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの
大きさによって選別することを特徴とするビオチン高産
生能コリネ型細菌の育種方法。 - 【請求項４】 ビオチン生合成に関与する酵素をコード
する遺伝子群の少なくとも一つの遺伝子が導入されたプ
ラスミドで形質転換されたピメリン酸からビオチン産生
能を有するコリネ型細菌を、グルコースを単一炭素源と
して含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しな
い平板培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの
大きさによって選別して得られるビオチン高産生能コリ
ネ型細菌を、さらに有機酸を単一炭素源として含有し且
つピメリン酸を含有しビオチンを含有しない寒天培地上
で培養し、該培地上に生育したコロニーの大きさによっ
て選別して得られるビオチン高産生能コリネ型細菌。 - 【請求項５】 ビオチン高産生能コリネ型細菌がブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＳＬ２（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３７９１）である請求項４記載のコリネ型細
菌。 - 【請求項６】 ビオチン生合成に関与する酵素をコード
する遺伝子群の少なくとも一つの遺伝子が導入されたプ
ラスミドで形質転換されたピメリン酸からビオチン産生
能を有するコリネ型細菌を、グルコースを単一炭素源と
して含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しな
い平板培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの
大きさによって選別して得られるビオチン高産生能コリ
ネ型細菌を、さらに有機酸を単一炭素源として含有し且
つピメリン酸を含有しビオチンを含有しない平板培地上
で培養し、該培地上に生育したコロニーの大きさによっ
て選別することを特徴とするビオチン高産生能コリネ型
細菌の育種方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19939193A JPH0787963A (ja) | 1993-08-11 | 1993-08-11 | ビオチン高産生微生物およびその育種方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19939193A JPH0787963A (ja) | 1993-08-11 | 1993-08-11 | ビオチン高産生微生物およびその育種方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0787963A true JPH0787963A (ja) | 1995-04-04 |
Family
ID=16407003
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19939193A Pending JPH0787963A (ja) | 1993-08-11 | 1993-08-11 | ビオチン高産生微生物およびその育種方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0787963A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114015632A (zh) * | 2020-12-01 | 2022-02-08 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 产l-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 |
-
1993
- 1993-08-11 JP JP19939193A patent/JPH0787963A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114015632A (zh) * | 2020-12-01 | 2022-02-08 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 产l-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 |
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