JPH07177895A - ビオチンの製造法 - Google Patents
ビオチンの製造法Info
- Publication number
- JPH07177895A JPH07177895A JP32379293A JP32379293A JPH07177895A JP H07177895 A JPH07177895 A JP H07177895A JP 32379293 A JP32379293 A JP 32379293A JP 32379293 A JP32379293 A JP 32379293A JP H07177895 A JPH07177895 A JP H07177895A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- biotin
- pimelic acid
- medium
- coryneform bacterium
- producing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 効率的なビオチン製造法の提供
【構成】 ピメリン酸からビオチンを産生する能力を有
するコリネ型細菌に属する微生物をピメリン酸を含有す
る栄養培地で培養し培地中にビオチンを生成せしめるに
際し、有機窒素源を窒素原子重量に換算して少なくとも
０．００３重量％以上になるように添加した培地を用い
て該コリネ型細菌に属する微生物を培養し、培養物から
ビオチンを採取するビオチンの製造法。 【効果】 本発明の方法によれば、ピメリン酸からビオ
チンを効率的に著量産生することができる。
するコリネ型細菌に属する微生物をピメリン酸を含有す
る栄養培地で培養し培地中にビオチンを生成せしめるに
際し、有機窒素源を窒素原子重量に換算して少なくとも
０．００３重量％以上になるように添加した培地を用い
て該コリネ型細菌に属する微生物を培養し、培養物から
ビオチンを採取するビオチンの製造法。 【効果】 本発明の方法によれば、ピメリン酸からビオ
チンを効率的に著量産生することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はコリネ型細菌に属する微
生物を用いるビオチンの製造法に関する。ビオチンはヒ
ト、動物、植物及びある種の微生物の生育に必要とされ
るビタミンの１種であり、特に皮膚代謝の調整剤とし
て、あるいはヒトの脱毛防止養毛剤として、あるいは家
畜飼料の添加剤として用いられる有用な物質である。
生物を用いるビオチンの製造法に関する。ビオチンはヒ
ト、動物、植物及びある種の微生物の生育に必要とされ
るビタミンの１種であり、特に皮膚代謝の調整剤とし
て、あるいはヒトの脱毛防止養毛剤として、あるいは家
畜飼料の添加剤として用いられる有用な物質である。
【０００２】
【従来の技術】ビオチンは卵黄から分離され、またビー
ル酵母、穀類、様々な動物の器官等の中に遊離型もしく
は蛋白質に結合した型で見出されている。微生物を用い
たビオチンの製造法としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）
属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）属、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属等の微生物を
用いる方法が知られている。
ル酵母、穀類、様々な動物の器官等の中に遊離型もしく
は蛋白質に結合した型で見出されている。微生物を用い
たビオチンの製造法としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）
属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）属、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属等の微生物を
用いる方法が知られている。
【０００３】また、工業的利用上多くの利点及びアミノ
酸、核酸発酵などに実績のあるコリネ型細菌のある種の
菌株はビオチンを生産しないが、本発明者らは先に、こ
のビオチン要求性コリネ型細菌に、エシェリヒア・コリ
由来のビオチン生合成酵素遺伝子群を含有するプラスミ
ドを導入し、この菌株を用いてビオチンを著量産生させ
ることに成功し、提案した（特開平３−２４０４８
９）。
酸、核酸発酵などに実績のあるコリネ型細菌のある種の
菌株はビオチンを生産しないが、本発明者らは先に、こ
のビオチン要求性コリネ型細菌に、エシェリヒア・コリ
由来のビオチン生合成酵素遺伝子群を含有するプラスミ
ドを導入し、この菌株を用いてビオチンを著量産生させ
ることに成功し、提案した（特開平３−２４０４８
９）。
【０００４】しかしながら、これら微生物を用いるビオ
チンの製造法において、その生成量は必ずしも満足しう
るものではなく、より効率的な製造法が求められてい
る。一方、ビオチン生合成酵素遺伝子としてｂｉｏＡ、
ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＨ、
ｂｉｏＷ、ｂｉｏＸ、ｂｉｏＹ等が各種の微生物から単
離されている。このうち、ｂｉｏＡは７，８−ジアミノ
ペラルゴン酸アミノトランスフェラーゼ、ｂｉｏＢはデ
スチオビオチンからビオチンへの変換に関与する酵素、
ｂｉｏＤはデスチオビオチンシンテターゼ、ｂｉｏＦは
７−ケト−８−アミノペラルゴン酸シンテターゼ、ｂｉ
ｏＷはピメリルＣｏＡシンテターゼをコードすることが
知られているが、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＨ、ｂｉｏＸ、ｂｉ
ｏＹについて、その働きはいまだ明らかとなっていな
い。また、大腸菌（エシェリヒア・コリ）においては、
これらビオチン生合成酵素遺伝子群のうち、ｂｉｏＡ、
ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦ遺伝子はｂｉ
ｏＡＢＦＣＤなるオペロンを形成している。これらビオ
チン生合成酵素遺伝子群の詳細は、次の文献に開示され
ている。Ａ．Ｊ．Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，ｐ１９５７７−１９５８
５（１９８８）、特開平２−２７９８０、Ｏ．Ｐｌｏｕ
ｘｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８７，ｐ６
８５−６９０（１９９２）、Ｒ．Ｇｌｏｅｃｋｌｅｒ
ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８７（１９９０）、特開平４
−３３０２８４、特開平４−２７８０８８等。
チンの製造法において、その生成量は必ずしも満足しう
るものではなく、より効率的な製造法が求められてい
る。一方、ビオチン生合成酵素遺伝子としてｂｉｏＡ、
ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＨ、
ｂｉｏＷ、ｂｉｏＸ、ｂｉｏＹ等が各種の微生物から単
離されている。このうち、ｂｉｏＡは７，８−ジアミノ
ペラルゴン酸アミノトランスフェラーゼ、ｂｉｏＢはデ
スチオビオチンからビオチンへの変換に関与する酵素、
ｂｉｏＤはデスチオビオチンシンテターゼ、ｂｉｏＦは
７−ケト−８−アミノペラルゴン酸シンテターゼ、ｂｉ
ｏＷはピメリルＣｏＡシンテターゼをコードすることが
知られているが、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＨ、ｂｉｏＸ、ｂｉ
ｏＹについて、その働きはいまだ明らかとなっていな
い。また、大腸菌（エシェリヒア・コリ）においては、
これらビオチン生合成酵素遺伝子群のうち、ｂｉｏＡ、
ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦ遺伝子はｂｉ
ｏＡＢＦＣＤなるオペロンを形成している。これらビオ
チン生合成酵素遺伝子群の詳細は、次の文献に開示され
ている。Ａ．Ｊ．Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，ｐ１９５７７−１９５８
５（１９８８）、特開平２−２７９８０、Ｏ．Ｐｌｏｕ
ｘｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８７，ｐ６
８５−６９０（１９９２）、Ｒ．Ｇｌｏｅｃｋｌｅｒ
ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８７（１９９０）、特開平４
−３３０２８４、特開平４−２７８０８８等。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ビオチ
ンの生成・蓄積量が多くより効率的な微生物を用いるビ
オチンの製造法を開発すべく鋭意検討を行った。その結
果、ピメリン酸からビオチンを産生する能力を有するコ
リネ型細菌に属する微生物を、特定濃度の有機窒素源を
含有する栄養培地で培養すれば効率的に著量のビオチン
が製造可能であることを見い出し、本発明を完成するに
至った。
ンの生成・蓄積量が多くより効率的な微生物を用いるビ
オチンの製造法を開発すべく鋭意検討を行った。その結
果、ピメリン酸からビオチンを産生する能力を有するコ
リネ型細菌に属する微生物を、特定濃度の有機窒素源を
含有する栄養培地で培養すれば効率的に著量のビオチン
が製造可能であることを見い出し、本発明を完成するに
至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】かくして、本発明によれ
ば、ピメリン酸からビオチンを産生する能力を有するコ
リネ型細菌に属する微生物をピメリン酸を含有する栄養
培地で培養し培地中にビオチンを生成せしめるに際し、
有機窒素源を窒素原子重量に換算して少くとも０．００
３重量％以上になるように添加した培地を用いて該コリ
ネ型細菌に属する微生物を培養することを特徴とするビ
オチンの製造法が提供される。
ば、ピメリン酸からビオチンを産生する能力を有するコ
リネ型細菌に属する微生物をピメリン酸を含有する栄養
培地で培養し培地中にビオチンを生成せしめるに際し、
有機窒素源を窒素原子重量に換算して少くとも０．００
３重量％以上になるように添加した培地を用いて該コリ
ネ型細菌に属する微生物を培養することを特徴とするビ
オチンの製造法が提供される。
【０００７】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。本発明において用いられるピメリン酸からビオチン
を産生する能力を有するコリネ型細菌に属する微生物
（以下これを「ピメリン酸要求性コリネ型細菌」という
ことがある。）とは、コリネ型細菌に属し、ピメリン酸
からビオチンを産生する能力を有する微生物であれば特
に制限はないが、通常、宿主ビオチン要求性のコリネ型
細菌に前記したビオチン生合成に関与する酵素をコード
する遺伝子群の少くとも１つの遺伝子を含有するプラス
ミドが導入された菌株であって、該プラスミドの導入に
よりピメリン酸からビオチンの産生能が付与された菌株
を意味する。
る。本発明において用いられるピメリン酸からビオチン
を産生する能力を有するコリネ型細菌に属する微生物
（以下これを「ピメリン酸要求性コリネ型細菌」という
ことがある。）とは、コリネ型細菌に属し、ピメリン酸
からビオチンを産生する能力を有する微生物であれば特
に制限はないが、通常、宿主ビオチン要求性のコリネ型
細菌に前記したビオチン生合成に関与する酵素をコード
する遺伝子群の少くとも１つの遺伝子を含有するプラス
ミドが導入された菌株であって、該プラスミドの導入に
よりピメリン酸からビオチンの産生能が付与された菌株
を意味する。
【０００８】ここで、宿主ビオチン要求性コリネ型細菌
としては、例えば、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏ
ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバク
テリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３０並び
にブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）およびその由来株を挙げることができ
る。また、ビオチン生合成に関与する酵素をコードする
遺伝子群の少くとも１つの遺伝子が導入されたプラスミ
ドとしては、例えば、エシェリヒア・コリ由来のビオチ
ンオペロン（ｂｉｏＡＢＦＣＤ）ＤＮＡ断片、エシェリ
ヒア・コリ由来のｂｉｏＨを含有するＤＮＡ断片、コリ
ネ型細菌細胞内で複製増殖能を有するＤＮＡ断片及びプ
ラスミド安定化機能を有するＤＮＡ断片を保有するプラ
スミドｐＣＲＹ３０−ＢＩＯ１（特開平３−２４０４８
９）およびエシェリヒア・コリ由来のビオチンオペロン
（ｂｉｏＡＢＦＣＤ）ＤＮＡ断片、コリネ型細菌細胞内
で複製増殖能を有するＤＮＡ断片及びプラスミド安定化
機能を有するＤＮＡ断片を保有するプラスミドｐＣＲＹ
３０−ＢＩＯ（特開平３−２４０４８９）を挙げること
ができる。
としては、例えば、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏ
ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバク
テリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３０並び
にブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）およびその由来株を挙げることができ
る。また、ビオチン生合成に関与する酵素をコードする
遺伝子群の少くとも１つの遺伝子が導入されたプラスミ
ドとしては、例えば、エシェリヒア・コリ由来のビオチ
ンオペロン（ｂｉｏＡＢＦＣＤ）ＤＮＡ断片、エシェリ
ヒア・コリ由来のｂｉｏＨを含有するＤＮＡ断片、コリ
ネ型細菌細胞内で複製増殖能を有するＤＮＡ断片及びプ
ラスミド安定化機能を有するＤＮＡ断片を保有するプラ
スミドｐＣＲＹ３０−ＢＩＯ１（特開平３−２４０４８
９）およびエシェリヒア・コリ由来のビオチンオペロン
（ｂｉｏＡＢＦＣＤ）ＤＮＡ断片、コリネ型細菌細胞内
で複製増殖能を有するＤＮＡ断片及びプラスミド安定化
機能を有するＤＮＡ断片を保有するプラスミドｐＣＲＹ
３０−ＢＩＯ（特開平３−２４０４８９）を挙げること
ができる。
【０００９】上記した本発明で用いるピメリン酸要求性
コリネ型細菌としては、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３
０−ＢＩＯ１を保持するブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ２３３−ＢＩＯ１（ＦＥＲＭ Ｐ−１１１２１）お
よびプラスミドｐＣＲＹ３０−ＢＩＯを保持するブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＢＩＯ（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３７６５）を挙げることができる。
コリネ型細菌としては、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３
０−ＢＩＯ１を保持するブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ２３３−ＢＩＯ１（ＦＥＲＭ Ｐ−１１１２１）お
よびプラスミドｐＣＲＹ３０−ＢＩＯを保持するブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＢＩＯ（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３７６５）を挙げることができる。
【００１０】さらに好適には、ビオチン生合成酵素遺伝
子群を含有するプラスミドで形質転換されたピメリン酸
からビオチン産生能を有するコリネ型細菌、例えばブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＢＩＯ（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３７６５）をグルコースを単一炭素源として
含有し且つピメリン酸を含有したビオチンを含有しない
平板培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの大
きさによって選別して得られるビオチン高産生能コリネ
型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３
３−７０９（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６４）およびかくし
て得られたビオチン高産生能コリネ型細菌を、さらに有
機酸を単一炭素源として含有し且つピメリン酸を含有し
ビオチンを含有しない寒天培地上で培養し、該培地上に
生育したコロニーの大きさによって選別して得られるビ
オチン高産生能コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ２３３−ＳＬ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３
７９１）等を挙げることができる。
子群を含有するプラスミドで形質転換されたピメリン酸
からビオチン産生能を有するコリネ型細菌、例えばブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＢＩＯ（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３７６５）をグルコースを単一炭素源として
含有し且つピメリン酸を含有したビオチンを含有しない
平板培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの大
きさによって選別して得られるビオチン高産生能コリネ
型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３
３−７０９（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６４）およびかくし
て得られたビオチン高産生能コリネ型細菌を、さらに有
機酸を単一炭素源として含有し且つピメリン酸を含有し
ビオチンを含有しない寒天培地上で培養し、該培地上に
生育したコロニーの大きさによって選別して得られるビ
オチン高産生能コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ２３３−ＳＬ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３
７９１）等を挙げることができる。
【００１１】上記したビオチン高産生能コリネ型細菌は
次のとおり育種することができる。先ず、前記ピメリン
酸要求性コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ２３３−ＢＩＯ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６
５）を、窒素源、無機塩、ビタミンを含み、単一炭素源
としてグルコースを含み、且つピメリン酸を含みビオチ
ンを含まない培地（以下これを「ピメリン酸／グルコー
ス最小培地」ということがある。）に寒天を加えた平板
培地上に塗沫して培養する。培養後、コロニーの大きさ
を指標として生育の速いコロニー（大きなコロニー）を
採取し、各々のコロニーから得られた菌体を再度ピメリ
ン酸／グルコース最小培地（平板培地あるいは液体培
地）で培養し、生育速度が速く、且つビオチン産生能の
増加した菌株を採取する。次に、このようにして得られ
る生育速度が速く、ビオチン産生能の増大した菌株を、
窒素源、無機塩、ビタミンを含み、単一炭素源として有
機酸のみを含み、且つピメリン酸を含みビオチンを含ま
ない培地（以下これを「ピメリン酸／有機酸最小培地」
ということがある。）に寒天を加えた平板培地上に塗沫
し培養する。培養後、コロニーの大きさを指標として生
育の速いコロニー（大きなコロニー）を採取し、各々の
コロニーから得られた菌体を再度ピメリン酸／有機酸最
小培地（平板培地あるいは液体培地）で培養し、生育速
度が速く、且つビオチン産生能の増加した菌株を採取す
る。
次のとおり育種することができる。先ず、前記ピメリン
酸要求性コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ２３３−ＢＩＯ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６
５）を、窒素源、無機塩、ビタミンを含み、単一炭素源
としてグルコースを含み、且つピメリン酸を含みビオチ
ンを含まない培地（以下これを「ピメリン酸／グルコー
ス最小培地」ということがある。）に寒天を加えた平板
培地上に塗沫して培養する。培養後、コロニーの大きさ
を指標として生育の速いコロニー（大きなコロニー）を
採取し、各々のコロニーから得られた菌体を再度ピメリ
ン酸／グルコース最小培地（平板培地あるいは液体培
地）で培養し、生育速度が速く、且つビオチン産生能の
増加した菌株を採取する。次に、このようにして得られ
る生育速度が速く、ビオチン産生能の増大した菌株を、
窒素源、無機塩、ビタミンを含み、単一炭素源として有
機酸のみを含み、且つピメリン酸を含みビオチンを含ま
ない培地（以下これを「ピメリン酸／有機酸最小培地」
ということがある。）に寒天を加えた平板培地上に塗沫
し培養する。培養後、コロニーの大きさを指標として生
育の速いコロニー（大きなコロニー）を採取し、各々の
コロニーから得られた菌体を再度ピメリン酸／有機酸最
小培地（平板培地あるいは液体培地）で培養し、生育速
度が速く、且つビオチン産生能の増加した菌株を採取す
る。
【００１２】育種に用いるピメリン酸／グルコース最小
培地およびピメリン酸／有機酸最小培地の窒素源として
は、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独もし
くは混合して用いられる。また無機塩としては、例えば
リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マ
グネシウム等が単独もしくは混合して用いられ、ビタミ
ンとしては、チアミンが用いられる。
培地およびピメリン酸／有機酸最小培地の窒素源として
は、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独もし
くは混合して用いられる。また無機塩としては、例えば
リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マ
グネシウム等が単独もしくは混合して用いられ、ビタミ
ンとしては、チアミンが用いられる。
【００１３】また、炭素源として用いる有機酸として
は、例えばコハク酸もしくはそのナトリウム塩、リンゴ
酸もしくはそのナトリウム塩、クエン酸もしくはそのナ
トリウム塩等が挙げられるが、それらの中でコハク酸ナ
トリウムを用いるのが最も好ましい。前記最小培地中の
これら窒素源、無機塩、ビタミン、炭素源の濃度に特別
な制限はなく、微生物の培養に通常用いる濃度を用いる
ことができる。
は、例えばコハク酸もしくはそのナトリウム塩、リンゴ
酸もしくはそのナトリウム塩、クエン酸もしくはそのナ
トリウム塩等が挙げられるが、それらの中でコハク酸ナ
トリウムを用いるのが最も好ましい。前記最小培地中の
これら窒素源、無機塩、ビタミン、炭素源の濃度に特別
な制限はなく、微生物の培養に通常用いる濃度を用いる
ことができる。
【００１４】最小培地中のピメリン酸濃度にも特別な制
限はなく、通常０．１ｍｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ、好ましく
は１０ｍｇ／ｌ〜１ｇ／ｌが適当である。平板培地上で
の培養は、通常、約１〜１０日間、温度約２０〜４０℃
で行うことができ、また必要に応じて液体培地で培養す
る場合は、通常、通気撹拌、振盪等の好気的条件下に、
温度約２０〜４０℃、約１〜５日間行うことができる。
限はなく、通常０．１ｍｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ、好ましく
は１０ｍｇ／ｌ〜１ｇ／ｌが適当である。平板培地上で
の培養は、通常、約１〜１０日間、温度約２０〜４０℃
で行うことができ、また必要に応じて液体培地で培養す
る場合は、通常、通気撹拌、振盪等の好気的条件下に、
温度約２０〜４０℃、約１〜５日間行うことができる。
【００１５】液体培養における菌体の生育速度は濁度
計、例えばスペクトロニック２０Ａ（島津製作所社製）
を用いて濁度を測定して求めることができ、培養物中の
ビオチンは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ７
７５４による微生物定量法（ビタミン学実験法〔II〕、
日本ビタミン学会（１９８５）ｐ４８６−４９２）で測
定することができる。
計、例えばスペクトロニック２０Ａ（島津製作所社製）
を用いて濁度を測定して求めることができ、培養物中の
ビオチンは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ７
７５４による微生物定量法（ビタミン学実験法〔II〕、
日本ビタミン学会（１９８５）ｐ４８６−４９２）で測
定することができる。
【００１６】これらビオチン高産生能変異株の菌学的性
質は、ピメリン酸／グルコース最小培地又はピメリン酸
／有機酸最小培地での生育速度の増加およびビオチン産
生能のちがいを除いては、プラスミドｐＣＲＹ３０−Ｂ
ＩＯ導入の宿主として用いたブレビバクテリウムフラバ
ムＭＪ２３３と同様であった（菌学的性質の詳細につい
ては、特開昭５１−１３０５９２参照）。
質は、ピメリン酸／グルコース最小培地又はピメリン酸
／有機酸最小培地での生育速度の増加およびビオチン産
生能のちがいを除いては、プラスミドｐＣＲＹ３０−Ｂ
ＩＯ導入の宿主として用いたブレビバクテリウムフラバ
ムＭＪ２３３と同様であった（菌学的性質の詳細につい
ては、特開昭５１−１３０５９２参照）。
【００１７】前記した３種のビオチン要求性コリネ型細
菌は同様にピメリルＣｏＡの合成に関与する酵素をコー
ドする遺伝子（ｂｉｏＨ、ｂｉｏＣ等）および７−ケト
−８−アミノペラルゴン酸シンテターゼをコードする遺
伝子（ｂｉｏＦ）が欠損あるいはその発現が欠如してお
り、また少くとも７，８−ジアミノペラルゴン酸アミノ
トランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ）、
デスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝子（ｂ
ｉｏＤ）およびデスチオビオチンからビオチンへの変換
に関与する酵素をコードする遺伝子（ｂｉｏＢ）を保有
しており（特開平４−２７８０８８参照）、前記したブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバク
テリウム・グルタミカムに前記プラスミド、例えばｐＣ
ＲＹ３０−ＢＩＯが導入された菌株もまたピメリン酸要
求性コリネ型細菌として用いることができる。
菌は同様にピメリルＣｏＡの合成に関与する酵素をコー
ドする遺伝子（ｂｉｏＨ、ｂｉｏＣ等）および７−ケト
−８−アミノペラルゴン酸シンテターゼをコードする遺
伝子（ｂｉｏＦ）が欠損あるいはその発現が欠如してお
り、また少くとも７，８−ジアミノペラルゴン酸アミノ
トランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ）、
デスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝子（ｂ
ｉｏＤ）およびデスチオビオチンからビオチンへの変換
に関与する酵素をコードする遺伝子（ｂｉｏＢ）を保有
しており（特開平４−２７８０８８参照）、前記したブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバク
テリウム・グルタミカムに前記プラスミド、例えばｐＣ
ＲＹ３０−ＢＩＯが導入された菌株もまたピメリン酸要
求性コリネ型細菌として用いることができる。
【００１８】これらビオチン高産生能コリネ型細菌の育
種法の詳細は特願平５−１９９３９１号明細書に開示さ
れている。かくして得られるビオチン高産生能コリネ型
細菌は、ピメリン酸からビオチンを高産生する能力を有
しており、以下に述べる本発明のビオチン製造法に好適
に用いることができる。
種法の詳細は特願平５−１９９３９１号明細書に開示さ
れている。かくして得られるビオチン高産生能コリネ型
細菌は、ピメリン酸からビオチンを高産生する能力を有
しており、以下に述べる本発明のビオチン製造法に好適
に用いることができる。
【００１９】本発明の方法においては、栄養培地とし
て、合成培地（最小栄養培地）と異なり、有機窒素源を
多量に含有する、いわゆる天然培地を使用する。すなわ
ち、本発明では有機窒素源を窒素原子重量に換算して、
通常少くとも０．００３重量％、好ましくは０．００６
〜０．０３０重量％になるように添加した栄養培地を使
用する。かかる栄養培地における有機窒素源としては、
従来からコリネ型細菌に属する微生物の培養のために使
用されている栄養培地において窒素源として配合されて
いるものが同様に用いられ、例えば、ポリペプトン、ト
リプトン、ペプトンなどのペプトン類、肉エキス、酵母
エキス、麦芽エキス、コーンステイープリカー、カザミ
ノ酸等の有機窒素化合物（アミノ酸、ペプチド、ビタミ
ン、未知生育促進因子など）をそれぞれ単独で又は２種
もしくはそれ以上混合して用いることができる。本発明
の方法に使用する培地には、窒素源として上記の有機窒
素源に加えて、無機窒素源、例えば、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ
4 、ＮＨ4 Ｃｌ、（ＮＨ4 ）2 ＰＯ4 、（ＮＨ4 ）ＮＯ
3 等を含ませることも可能である。
て、合成培地（最小栄養培地）と異なり、有機窒素源を
多量に含有する、いわゆる天然培地を使用する。すなわ
ち、本発明では有機窒素源を窒素原子重量に換算して、
通常少くとも０．００３重量％、好ましくは０．００６
〜０．０３０重量％になるように添加した栄養培地を使
用する。かかる栄養培地における有機窒素源としては、
従来からコリネ型細菌に属する微生物の培養のために使
用されている栄養培地において窒素源として配合されて
いるものが同様に用いられ、例えば、ポリペプトン、ト
リプトン、ペプトンなどのペプトン類、肉エキス、酵母
エキス、麦芽エキス、コーンステイープリカー、カザミ
ノ酸等の有機窒素化合物（アミノ酸、ペプチド、ビタミ
ン、未知生育促進因子など）をそれぞれ単独で又は２種
もしくはそれ以上混合して用いることができる。本発明
の方法に使用する培地には、窒素源として上記の有機窒
素源に加えて、無機窒素源、例えば、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ
4 、ＮＨ4 Ｃｌ、（ＮＨ4 ）2 ＰＯ4 、（ＮＨ4 ）ＮＯ
3 等を含ませることも可能である。
【００２０】また、本発明の方法に使用する培地は、栄
養源として、上記の窒素源の他に、炭素源、ミネラル
分、ビタミン等を含有することができる。炭素源として
は、例えば、グルコース、グリセロール、フルクトー
ス、シュクロース、廃糖蜜などの種々の炭水化物を利用
できる。本発明の方法においては、上記した培地にピメ
リン酸を適量添加して培養することにより、効率的にビ
オチンを製造することができる。
養源として、上記の窒素源の他に、炭素源、ミネラル
分、ビタミン等を含有することができる。炭素源として
は、例えば、グルコース、グリセロール、フルクトー
ス、シュクロース、廃糖蜜などの種々の炭水化物を利用
できる。本発明の方法においては、上記した培地にピメ
リン酸を適量添加して培養することにより、効率的にビ
オチンを製造することができる。
【００２１】培地中に添加するピメリン酸濃度に特に制
限はないが、通常１０ｍｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌ、好ましく
は１００ｍｇ／ｌ〜５ｇ／ｌが適当である。培養は、通
常、通気撹拌、振盪等の好気的条件下に、約２０〜４０
℃、好ましくは２５〜３５℃の温度で行うことができ
る。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近
で行い、培養中のｐＨの調整は酸又はアルカリを添加し
て行うことができる。
限はないが、通常１０ｍｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌ、好ましく
は１００ｍｇ／ｌ〜５ｇ／ｌが適当である。培養は、通
常、通気撹拌、振盪等の好気的条件下に、約２０〜４０
℃、好ましくは２５〜３５℃の温度で行うことができ
る。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近
で行い、培養中のｐＨの調整は酸又はアルカリを添加し
て行うことができる。
【００２２】培養開始時の炭素源濃度に特に制限はない
が、好ましくは１〜５容量％、更に好ましくは２〜３容
量％である。また、培養期間は通常１〜７日間とするこ
とができ、最適期間は３日間である。培養を終了した
後、培養液からのビオチンの抽出精製にあたっては、ビ
オチンの諸性質を利用して、一般の天然物からの抽出精
製法が応用できる。すなわち、培養物から菌体を除き活
性炭に吸着させ、その後溶出させ、イオン交換樹脂で精
製するか、あるいは培養濾液を直接イオン交換樹脂で処
理して精製し、水またはアルコールより再結晶すること
により、ビオチンを取得することができる。
が、好ましくは１〜５容量％、更に好ましくは２〜３容
量％である。また、培養期間は通常１〜７日間とするこ
とができ、最適期間は３日間である。培養を終了した
後、培養液からのビオチンの抽出精製にあたっては、ビ
オチンの諸性質を利用して、一般の天然物からの抽出精
製法が応用できる。すなわち、培養物から菌体を除き活
性炭に吸着させ、その後溶出させ、イオン交換樹脂で精
製するか、あるいは培養濾液を直接イオン交換樹脂で処
理して精製し、水またはアルコールより再結晶すること
により、ビオチンを取得することができる。
【００２３】
【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、実施
例は本発明の具体的に認識を得る一助とみなすべきもの
であり、本発明の範囲を限定するためのものではない。
例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、実施
例は本発明の具体的に認識を得る一助とみなすべきもの
であり、本発明の範囲を限定するためのものではない。
【００２４】参考例１ プラスミドｐＣＲＹ３０−ＢＩ
Ｏの作製及びコリネ型細菌への導入 ビオチン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子とし
ては、特開平３−２４０４８９の実施例１に記載の方法
で調製されたプラスミドｐＨＳＧ３９８−ｂｉｏに含有
されるエシェリヒア・コリ由来のビオチンオペロン（ｂ
ｉｏＡＢＦＣＤ）ＤＮＡ断片を用い、コリネ型細菌細胞
内で複製増殖能を有するＤＮＡ断片及びプラスミド安定
化機能を有するＤＮＡ断片としては、特開平３−２４０
４８９の実施例２に記載の方法で調製されたプラスミド
ベクターｐＣＲＹ３０を用いた。
Ｏの作製及びコリネ型細菌への導入 ビオチン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子とし
ては、特開平３−２４０４８９の実施例１に記載の方法
で調製されたプラスミドｐＨＳＧ３９８−ｂｉｏに含有
されるエシェリヒア・コリ由来のビオチンオペロン（ｂ
ｉｏＡＢＦＣＤ）ＤＮＡ断片を用い、コリネ型細菌細胞
内で複製増殖能を有するＤＮＡ断片及びプラスミド安定
化機能を有するＤＮＡ断片としては、特開平３−２４０
４８９の実施例２に記載の方法で調製されたプラスミド
ベクターｐＣＲＹ３０を用いた。
【００２５】プラスミドｐＨＳＧ３９８−ｂｉｏ ５μ
ｇ及びプラスミドベクターｐＣＲＹ３０ １μｇを各々
制限酵素ＥｃｏＲＩ ５ｕｎｉｔｓを用い、３７℃で１
時間反応させ分解した。両分解ＤＮＡを混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼにて結合させ、常法に従いエシェリヒア・
コリＣＶ５３０Ｃ Ｇａｌ−ＵｖｒＢ３株〔Ｆ- ：ｌｅ
ｕＡ３７１ Δ（ｌａｃ−ｐｒｏ） ｔｈｉ Δ（ｇａ
ｌ−ｂｉｏ−ｕｖｒＢ）；国立遺伝学研究所遺伝実験生
物保存センターより分譲〕を形質転換し、カナマイシン
５０ｍｇを含む選択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ ０．１ｇ、カザミノ酸１０ｇ、グルコース２ｇ及
び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解〕に塗沫した。
ｇ及びプラスミドベクターｐＣＲＹ３０ １μｇを各々
制限酵素ＥｃｏＲＩ ５ｕｎｉｔｓを用い、３７℃で１
時間反応させ分解した。両分解ＤＮＡを混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼにて結合させ、常法に従いエシェリヒア・
コリＣＶ５３０Ｃ Ｇａｌ−ＵｖｒＢ３株〔Ｆ- ：ｌｅ
ｕＡ３７１ Δ（ｌａｃ−ｐｒｏ） ｔｈｉ Δ（ｇａ
ｌ−ｂｉｏ−ｕｖｒＢ）；国立遺伝学研究所遺伝実験生
物保存センターより分譲〕を形質転換し、カナマイシン
５０ｍｇを含む選択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ ０．１ｇ、カザミノ酸１０ｇ、グルコース２ｇ及
び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解〕に塗沫した。
【００２６】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドベクターｐＣＲＹ３０
の長さ８．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ６．０ｋｂ
の挿入ＤＮＡ断片が認められた。上記の如く調製された
プラスミドＤＮＡを、コリネ型細菌へ形質転換した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドベクターｐＣＲＹ３０
の長さ８．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ６．０ｋｂ
の挿入ＤＮＡ断片が認められた。上記の如く調製された
プラスミドＤＮＡを、コリネ型細菌へ形質転換した。
【００２７】形質転換は、電気パルス法を用いて行っ
た。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０２除去株
を１００ｍｌの半合成Ａ培地（尿素２ｇ／ｌ、硫安７ｇ
／ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５
ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳ
Ｏ4 ・７Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2
Ｏ ６ｍｇ／ｌ、塩酸チアミン１００μｇ／ｌ、ビオチ
ン２００μｇ／ｌ、カザミノ酸１ｇ／ｌ、酵母エキス１
ｇ／ｌ；ＮａＯＨにてｐＨを７．２に調節）で対数増殖
期初期まで培養し、ペニシリンＧを１ユニット／ｍｌに
なるように添加して、さらに２時間振盪培養し、遠心分
離により菌体を集め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液
（２７２ｍＭＳｕｃｒｏｓｅ、７ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 、
１ｍＭ ＭｇＣｌ2 ：ｐＨ７．４）にて洗浄した。さら
に菌体を遠心分離して集め、５ｍｌのパルス用溶液に懸
濁し、０．７５ｍｌの細胞と、前記で得られたプラスミ
ドＤＮＡ溶液５０μｌとを混合し、水中にて２０分間静
置した。ジーンパルサー（バイオラド社製）を用いて、
２５００ボルト、２５μＦＤに設定し、パルスを印加後
氷中に２０分間静置した。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に
移し３０℃にて１時間培養後、カナマイシン１５μｇ／
ｍｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に植菌し３０℃
で２〜３日間培養した。出現したカナマイシン耐性株よ
り、アルカリ−ＳＤＳ法〔Ｓａｔｏｈ，Ｙ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，１５９（１９９０）〕
によりプラスミドを得た。このプラスミドを各種制限酵
素で切断し、切断片の大きさをアガロースゲル電気泳動
で測定した。その結果を下記の表１に示す。
た。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０２除去株
を１００ｍｌの半合成Ａ培地（尿素２ｇ／ｌ、硫安７ｇ
／ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５
ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳ
Ｏ4 ・７Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2
Ｏ ６ｍｇ／ｌ、塩酸チアミン１００μｇ／ｌ、ビオチ
ン２００μｇ／ｌ、カザミノ酸１ｇ／ｌ、酵母エキス１
ｇ／ｌ；ＮａＯＨにてｐＨを７．２に調節）で対数増殖
期初期まで培養し、ペニシリンＧを１ユニット／ｍｌに
なるように添加して、さらに２時間振盪培養し、遠心分
離により菌体を集め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液
（２７２ｍＭＳｕｃｒｏｓｅ、７ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 、
１ｍＭ ＭｇＣｌ2 ：ｐＨ７．４）にて洗浄した。さら
に菌体を遠心分離して集め、５ｍｌのパルス用溶液に懸
濁し、０．７５ｍｌの細胞と、前記で得られたプラスミ
ドＤＮＡ溶液５０μｌとを混合し、水中にて２０分間静
置した。ジーンパルサー（バイオラド社製）を用いて、
２５００ボルト、２５μＦＤに設定し、パルスを印加後
氷中に２０分間静置した。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に
移し３０℃にて１時間培養後、カナマイシン１５μｇ／
ｍｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に植菌し３０℃
で２〜３日間培養した。出現したカナマイシン耐性株よ
り、アルカリ−ＳＤＳ法〔Ｓａｔｏｈ，Ｙ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，１５９（１９９０）〕
によりプラスミドを得た。このプラスミドを各種制限酵
素で切断し、切断片の大きさをアガロースゲル電気泳動
で測定した。その結果を下記の表１に示す。
【００２８】
【表１】表 １ 制限酵素 認識部位数 切断片の大きさ（ｋｂ） ＥｃｏＲＩ ２ ８．６，６．０ Ｋｐｎ Ｉ １ １４．６Ｓａｌ Ｉ ２ １４．４，０．２ 上記制限酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＣＲ
Ｙ３０−ＢＩＯと命名した。
Ｙ３０−ＢＩＯと命名した。
【００２９】なお、プラスミドｐＣＲＹ３０−ＢＩＯに
より形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
２３３−ＢＩＯは、茨城県つくば市東１丁目１番３号の
工業技術院生命工学工業技術研究所に、平成５年７月２
７日付で受託番号：ＦＥＲＭＰ−１３７６５として寄託
されている。
より形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
２３３−ＢＩＯは、茨城県つくば市東１丁目１番３号の
工業技術院生命工学工業技術研究所に、平成５年７月２
７日付で受託番号：ＦＥＲＭＰ−１３７６５として寄託
されている。
【００３０】参考例２ ピメリン酸／グルコース最小培
地生育速度増大株の選択 前記半合成Ａ培地１００ｍｌを容量５００ｍｌの振盪フ
ラスコに入れ１２０℃で１５分間殺菌した。この培地に
５ｍｇ／ｍｌカナマイシン１ｍｌ及び滅菌した５０％グ
ルコース４ｍｌを添加した後、ブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ２３３−ＢＩＯ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６
５）を１白金耳量植菌し、３３℃で２日間振盪培養し
た。
地生育速度増大株の選択 前記半合成Ａ培地１００ｍｌを容量５００ｍｌの振盪フ
ラスコに入れ１２０℃で１５分間殺菌した。この培地に
５ｍｇ／ｍｌカナマイシン１ｍｌ及び滅菌した５０％グ
ルコース４ｍｌを添加した後、ブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ２３３−ＢＩＯ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６
５）を１白金耳量植菌し、３３℃で２日間振盪培養し
た。
【００３１】遠心分離により培養物から菌体を回収し、
この菌体を前記半合成Ａ培地からカザミノ酸および酵母
エキスを除いた培地にて２回洗浄したのち、カナマイシ
ン５０μｇ／ｍｌを含むピメリン酸／グルコース最小培
地（尿素２ｇ／ｌ、硫安７ｇ／ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５
ｇ／ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／
ｌ、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／ｌ、チアミン
塩酸１００μｇ／ｌ、ピメリン酸０．１ｇ／ｌ、グルコ
ース２０ｇ／ｌ；ＮａＯＨにてｐＨを７．２に調節）に
寒天を加えた平板培地上に塗沫した。３３℃で３日間培
養することにより出現した生育の速いコロニー（大きな
コロニー）を白金耳で釣り上げ、再度ピメリン酸／グル
コース最小平板培地に塗沫し、３３℃で培養した結果、
得られた菌株はピメリン酸／グルコース最小培地上での
生育速度が上昇していることが確認された。
この菌体を前記半合成Ａ培地からカザミノ酸および酵母
エキスを除いた培地にて２回洗浄したのち、カナマイシ
ン５０μｇ／ｍｌを含むピメリン酸／グルコース最小培
地（尿素２ｇ／ｌ、硫安７ｇ／ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５
ｇ／ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／
ｌ、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／ｌ、チアミン
塩酸１００μｇ／ｌ、ピメリン酸０．１ｇ／ｌ、グルコ
ース２０ｇ／ｌ；ＮａＯＨにてｐＨを７．２に調節）に
寒天を加えた平板培地上に塗沫した。３３℃で３日間培
養することにより出現した生育の速いコロニー（大きな
コロニー）を白金耳で釣り上げ、再度ピメリン酸／グル
コース最小平板培地に塗沫し、３３℃で培養した結果、
得られた菌株はピメリン酸／グルコース最小培地上での
生育速度が上昇していることが確認された。
【００３２】該菌株をブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−７０９と命名した。該菌株は、茨城県つくば
市東１丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究
所に、平成５年７月２７日付で受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ
−１３７６４として寄託されている。
Ｊ２３３−７０９と命名した。該菌株は、茨城県つくば
市東１丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究
所に、平成５年７月２７日付で受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ
−１３７６４として寄託されている。
【００３３】参考例３ ピメリン酸／コハク酸最小培地
生育速度増大株の選択 前記半合成Ａ培地１００ｍｌを容量５００ｍｌの振盪フ
ラスコに入れ１２０℃で１５分間殺菌した。この培地に
５ｍｇ／ｍｌカナマイシン１ｍｌ及び滅菌した５０％コ
ハク酸ナトリウム４ｍｌを添加した後、参考例２で得ら
れたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−７０９
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６４）を１白金耳量植菌し、３
３℃で２日間振盪培養した。
生育速度増大株の選択 前記半合成Ａ培地１００ｍｌを容量５００ｍｌの振盪フ
ラスコに入れ１２０℃で１５分間殺菌した。この培地に
５ｍｇ／ｍｌカナマイシン１ｍｌ及び滅菌した５０％コ
ハク酸ナトリウム４ｍｌを添加した後、参考例２で得ら
れたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−７０９
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６４）を１白金耳量植菌し、３
３℃で２日間振盪培養した。
【００３４】遠心分離により培養物から菌体を回収し、
この菌体を前記半合成Ａ培地からカザミノ酸および酵母
エキスを除いた培地にて２回洗浄したのち、カナマイシ
ン５０μｇ／ｍｌを含むピメリン酸／コハク酸最小培地
（尿素２ｇ／ｌ、硫安７ｇ／ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５ｇ
／ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ 2
Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／
ｌ、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／ｌ、チアミン
塩酸１００μｇ／ｌ、ピメリン酸０．１ｇ／ｌ、コハク
酸ナトリウム２０ｇ／ｌ；ＮａＯＨにてｐＨを７．２に
調節）に寒天を加えた平板培地上に塗沫した。３３℃で
３日間培養することにより出現した生育の速いコロニー
を白金耳で釣り上げ、再度ピメリン酸／コハク酸最小平
板培地に塗沫し、３３℃で培養した結果、得られた菌株
はピメリン酸／コハク酸最小培地上での生育速度が上昇
していることが確認された。
この菌体を前記半合成Ａ培地からカザミノ酸および酵母
エキスを除いた培地にて２回洗浄したのち、カナマイシ
ン５０μｇ／ｍｌを含むピメリン酸／コハク酸最小培地
（尿素２ｇ／ｌ、硫安７ｇ／ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５ｇ
／ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ 2
Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／
ｌ、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／ｌ、チアミン
塩酸１００μｇ／ｌ、ピメリン酸０．１ｇ／ｌ、コハク
酸ナトリウム２０ｇ／ｌ；ＮａＯＨにてｐＨを７．２に
調節）に寒天を加えた平板培地上に塗沫した。３３℃で
３日間培養することにより出現した生育の速いコロニー
を白金耳で釣り上げ、再度ピメリン酸／コハク酸最小平
板培地に塗沫し、３３℃で培養した結果、得られた菌株
はピメリン酸／コハク酸最小培地上での生育速度が上昇
していることが確認された。
【００３５】該菌株をブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ＳＬ２と命名した。該菌株は、茨城県つくば
市東１丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究
所に、平成５年８月６日付で受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−
１３７９１として寄託されている。
Ｊ２３３−ＳＬ２と命名した。該菌株は、茨城県つくば
市東１丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究
所に、平成５年８月６日付で受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−
１３７９１として寄託されている。
【００３６】参考例４ ビオチンの製造 合成ＣＰ培地（尿素２ｇ／ｌ、硫安７ｇ／ｌ、ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 ０．５ｇ／ｌ、Ｋ 2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳ
Ｏ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
６ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／
ｌ、チアミン塩酸塩１００μｇ／ｌ、ピメリン酸１ｇ／
ｌ；ＮａＯＨにてｐＨを７．２に調節）５ｍｌを直径１
８ｍｍの試験管に分注し１２０℃で１５分間殺菌した。
この培地に５ｍｇ／ｍｌカナマイシン０．０５ｍｌと滅
菌した５０％グルコース０．２ｍｌを添加した後、ブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−７０９（ＦＥＲ
ＭＰ−１３７６４）、ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ＳＬ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７９１）、また
対照としてブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−
ＢＩＯ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６５）を１白金耳量それ
ぞれ植菌し、３３℃で２４時間振盪培養した。
Ｏ4 ０．５ｇ／ｌ、Ｋ 2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳ
Ｏ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
６ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ／
ｌ、チアミン塩酸塩１００μｇ／ｌ、ピメリン酸１ｇ／
ｌ；ＮａＯＨにてｐＨを７．２に調節）５ｍｌを直径１
８ｍｍの試験管に分注し１２０℃で１５分間殺菌した。
この培地に５ｍｇ／ｍｌカナマイシン０．０５ｍｌと滅
菌した５０％グルコース０．２ｍｌを添加した後、ブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−７０９（ＦＥＲ
ＭＰ−１３７６４）、ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ＳＬ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７９１）、また
対照としてブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−
ＢＩＯ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６５）を１白金耳量それ
ぞれ植菌し、３３℃で２４時間振盪培養した。
【００３７】次に、上記ＣＰ培地１００ｍｌを容量５０
０ｍｌの振盪フラスコに入れ１２０℃で１５分間殺菌し
た。この培地に５ｍｇ／ｍｌカナマイシン１．０ｍｌと
滅菌した５０％グルコース４ｍｌを添加した後、上記の
前培養物１ｍｌをそれぞれ植菌し、３３℃で３日間振盪
培養した。
０ｍｌの振盪フラスコに入れ１２０℃で１５分間殺菌し
た。この培地に５ｍｇ／ｍｌカナマイシン１．０ｍｌと
滅菌した５０％グルコース４ｍｌを添加した後、上記の
前培養物１ｍｌをそれぞれ植菌し、３３℃で３日間振盪
培養した。
【００３８】培養終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、
１５分間、４℃）にて培養物から菌体を除去し、上清中
のビオチンを定量した。その結果を表２に示す。なお、
表中のビオチン生成量は、サッカロミセス・セレビシエ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）ＡＴＣＣ７７５４による微生物定量法（ビタミン学
実験法〔II〕日本ビタミン学会（１９８５）ｐ４８６−
４９２）により定量した値である。
１５分間、４℃）にて培養物から菌体を除去し、上清中
のビオチンを定量した。その結果を表２に示す。なお、
表中のビオチン生成量は、サッカロミセス・セレビシエ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）ＡＴＣＣ７７５４による微生物定量法（ビタミン学
実験法〔II〕日本ビタミン学会（１９８５）ｐ４８６−
４９２）により定量した値である。
【００３９】
【表２】表 ２ 菌 株 ビオチン生成量 ＭＪ２３３−７０９ １５μｇ／ｌ ＭＪ２３３−ＳＬ２ ５０μｇ／ｌＭＪ２３３−ＢＩＯ ５μｇ／ｌ
【００４０】実施例１ 参考例４の合成ＣＰ培地にブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ２３３−ＳＬ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７９１）を
植菌し、参考例４と同様に振盪培養（前培養）した。
ムＭＪ２３３−ＳＬ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７９１）を
植菌し、参考例４と同様に振盪培養（前培養）した。
【００４１】次に、合成ＣＰ培地１００ｍｌを容量５０
０ｍｌの振盪フラスコに入れ１２０℃で１５分間殺菌し
た培養液に、滅菌した５０％グルコース４ｍｌを添加し
た後、上記の前培養物１ｍｌを植菌し、３３℃で２４時
間振盪培養した。次に、本培養培地〔（ＮＨ4 ）2 ＳＯ
4 ２３ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4
０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ
4 ・７Ｈ 2 Ｏ ２０ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2 Ｏ
２０ｍｇ、チアミン塩酸１００μｇ、ピメリン酸１ｇ、
脱イオン水１Ｌ〕に表１に示した各試験区の有機窒素源
を加えた各組成の培地１．５Ｌを２Ｌ容通気撹拌槽に仕
込み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、滅菌済み５０％
グルコース１００ｍｌと上記培養物の３０ｍｌを添加し
て、回転数１０００ｒｐｍ、温度３３℃、ｐＨ７．７
（２５％アンモニア水にてｐＨを７．２に調節）、通気
量１．０ｖｖｍにて７２時間培養を行った。
０ｍｌの振盪フラスコに入れ１２０℃で１５分間殺菌し
た培養液に、滅菌した５０％グルコース４ｍｌを添加し
た後、上記の前培養物１ｍｌを植菌し、３３℃で２４時
間振盪培養した。次に、本培養培地〔（ＮＨ4 ）2 ＳＯ
4 ２３ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4
０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ
4 ・７Ｈ 2 Ｏ ２０ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ・４〜５Ｈ2 Ｏ
２０ｍｇ、チアミン塩酸１００μｇ、ピメリン酸１ｇ、
脱イオン水１Ｌ〕に表１に示した各試験区の有機窒素源
を加えた各組成の培地１．５Ｌを２Ｌ容通気撹拌槽に仕
込み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、滅菌済み５０％
グルコース１００ｍｌと上記培養物の３０ｍｌを添加し
て、回転数１０００ｒｐｍ、温度３３℃、ｐＨ７．７
（２５％アンモニア水にてｐＨを７．２に調節）、通気
量１．０ｖｖｍにて７２時間培養を行った。
【００４２】培養終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、
１５分間、４℃）にて除去した上清中のビオチン定量し
た。その結果を表３に示す。なお、表中のビオチン生成
量は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ７７５４
による微生物定量法〔ビタミン学実験法〔II〕日本ビタ
ミン学会（１９８５）ｐ４８６−４９２〕により定量し
た値である。
１５分間、４℃）にて除去した上清中のビオチン定量し
た。その結果を表３に示す。なお、表中のビオチン生成
量は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ７７５４
による微生物定量法〔ビタミン学実験法〔II〕日本ビタ
ミン学会（１９８５）ｐ４８６−４９２〕により定量し
た値である。
【００４３】
【表３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内
Claims (3)
- 【請求項１】 ピメリン酸からビオチンを産生する能力
を有するコリネ型細菌に属する微生物をピメリン酸を含
有する栄養培地で培養し培地中にビオチンを生成せしめ
るに際し、有機窒素源を窒素原子重量に換算して少くと
も０．００３重量％以上になるように添加した培地を用
いて該コリネ型細菌に属する微生物を培養し、培養物か
らビオチンを採取することを特徴とするビオチンの製造
法。 - 【請求項２】 ピメリン酸からビオチンを産生する能力
を有するコリネ型細菌に属する微生物が、ビオチン生合
成に関与する酵素をコードする遺伝子群の少なくとも一
つの遺伝子が導入されたプラスミドで形質転換されたピ
メリン酸からビオチン産生能を有するコリネ型細菌であ
って、該コリネ型細菌をグルコースを単一炭素源として
含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しない平
板培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの大き
さによって選別して得られるビオチン高産生能コリネ型
細菌である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 ピメリン酸からビオチンを産生する能力
を有するコリネ型細菌に属する微生物が、ビオチン生合
成に関与する酵素をコードする遺伝子群の少なくとも一
つの遺伝子が導入されたプラスミドで形質転換されたピ
メリン酸からビオチン産生能を有するコリネ型細菌であ
って、該コリネ型細菌をグルコースを単一炭素源として
含有し且つピメリン酸を含有しビオチンを含有しない平
板培地上で培養し、該培地上に生育したコロニーの大き
さによって選別して得られるビオチン高産生能コリネ型
細菌を、さらに有機酸を単一炭素源として含有し且つピ
メリン酸を含有しビオチンを含有しない寒天培地上で培
養し、該培地上に生育したコロニーの大きさによって選
別して得られるビオチン高産生能コリネ型細菌である請
求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32379293A JPH07177895A (ja) | 1993-12-22 | 1993-12-22 | ビオチンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32379293A JPH07177895A (ja) | 1993-12-22 | 1993-12-22 | ビオチンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07177895A true JPH07177895A (ja) | 1995-07-18 |
Family
ID=18158672
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32379293A Pending JPH07177895A (ja) | 1993-12-22 | 1993-12-22 | ビオチンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07177895A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008054606A (ja) * | 2006-08-31 | 2008-03-13 | Oriental Yeast Co Ltd | ビオチン高含有酵母及びその製造方法 |
| CN112176010A (zh) * | 2019-07-01 | 2021-01-05 | 浙江圣达生物药业股份有限公司 | 一种促进生物素合成的方法、促进生物素合成的重组细胞和基因工程菌 |
-
1993
- 1993-12-22 JP JP32379293A patent/JPH07177895A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008054606A (ja) * | 2006-08-31 | 2008-03-13 | Oriental Yeast Co Ltd | ビオチン高含有酵母及びその製造方法 |
| CN112176010A (zh) * | 2019-07-01 | 2021-01-05 | 浙江圣达生物药业股份有限公司 | 一种促进生物素合成的方法、促进生物素合成的重组细胞和基因工程菌 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3106714B2 (ja) | 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 | |
| CN111433366B (zh) | 具有增加的甘氨酸生产能力的微生物和利用其生产发酵组合物的方法 | |
| JP3369231B2 (ja) | 芳香族アミノ酸の製造法 | |
| JPH09285294A (ja) | 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 | |
| JPH07203980A (ja) | 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 | |
| JPS6279788A (ja) | アミノ酸の製造法 | |
| FR2484448A1 (fr) | Procede pour produire de la l-arginine par fermentation | |
| KR100815041B1 (ko) | 아미노산 생산의 대사 공학 | |
| JP2763119B2 (ja) | 低い酢酸産生能を有する微生物、及びこれを用いる有用物質の製造方法 | |
| CN1367244B (zh) | 通过发酵生产l-精氨酸的微生物和方法 | |
| KR970001238B1 (ko) | L-트립토판의 제조방법 | |
| JPH0732710B2 (ja) | フエニ−ルアラニンの製造法 | |
| CN111286520B (zh) | 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用 | |
| JPH01265892A (ja) | Ｌ−トリプトファンの製造法 | |
| JPS59156292A (ja) | トリプトフアンの製造法 | |
| JP3078312B2 (ja) | 物質の製造法 | |
| JPH06225776A (ja) | リボフラビンの製造法 | |
| KR900004424B1 (ko) | 아미노산의 제조방법 | |
| JPH07177895A (ja) | ビオチンの製造法 | |
| JP2722504B2 (ja) | 新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法 | |
| JPS62186795A (ja) | アミノ酸の製造法 | |
| JPH06277067A (ja) | アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする遺伝子ｄｎａ | |
| JPH0740922B2 (ja) | ビオチン生産性微生物 | |
| JPH0787963A (ja) | ビオチン高産生微生物およびその育種方法 | |
| US5153123A (en) | Method for producing l-threonine, and plasmid and microorganism employed in the same |