JPH0673461B2 - 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は発酵法によるＬ−スレオニンの製造法に関する
ものである。

［従来の技術］ プロビデンシア属に属する微生物を用いる発酵法による
Ｌ−スレオニンの製造法としては、メチオニン代謝拮抗
物質に耐性を有し、かつスレオニン生産性を有する微生
物を用いる方法（特開昭60−180597号公報）が知られて
いる。

［発明が解決しようとする問題点］ しかし、この方法によるＬ−スレオニンの生成蓄積濃
度、または、糖などの原料からのＬ−スレオニン生成収
率は十分に満足できるものではなかった。

［問題点を解決するための手段および作用］ 本発明者らは、さらに生産性の高いＬ−スレオニンの製
造方法について鋭意研究した結果、プロビデンシア属に
属しＬ−スレオニン生産能を有する微生物にイソロイシ
ン代謝拮抗物質に対する耐性およびアスパラギン酸代謝
拮抗物質に対する耐性を付与することにより、Ｌ−スレ
オニン生産性が向上すること、または、副生アミノ酸が
減少することを見出し本発明に到達した。

すなわち、本発明は、プロビデンシア属に属しイソロイ
シン代謝拮抗物質に対する耐性およびアスパラギン酸代
謝拮抗物質に対する耐性を有し、かつＬ−スレオニン生
産能を有する微生物を培養して培養液中にＬ−スレオニ
ンを蓄積せしめ、該培養液よりＬ−スレオニンを採取す
ることを特徴とする発酵法によるＬ−スレオニンの製造
法である。

ここで、イソロイシン代謝拮抗物質とは、プロビデンシ
ア属に属する微生物の１）生育を阻害し、その生育阻害
がＬ−イソロイシンの添加により回復する物質、また
は、２）Ｌ−イソロイシン生合成系に関与する酵素の抑
制作用および、阻害作用を示す物質のことである。イソ
ロイシン代謝拮抗物質としては、例えばチアイソロイシ
ン、Ｏ−メチルスレオニン、イソロイシンヒドロキサメ
ート等が挙げられる。

また、アスパラギン酸代謝拮抗物質とは、プロビデンシ
ア属に属する微生物の１）生育を阻害し、その生育阻害
がＬ−アスパラギン酸の添加により回復する物質または
２）Ｌ−アスパラギン酸生合成系に関与する酵素の抑制
作用および阻害作用を示し、その抑制あるいは阻害がＬ
−アスパラギン酸の添加により回復する物質のことであ
る。

アスパラギン酸代謝拮抗物質としては、例えばアスパラ
ギン酸ヒドロキサメート、α−メチルアスパラギン酸、
β−メチルアスパラギン酸、システインスルフイン酸、
ジフルオロコハク酸、ハダシジン等が挙げられる。

本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属に属し
（バージーのマニユアル・オブ・システマテイク・バク
テリオロジー第一巻（1984）、第495〜496頁に従う）、
イソロイシン代謝拮抗物質ならびにアスパラギン酸代謝
拮抗物質に耐性を有する微生物である。かかる性質を有
していれば、他の栄養要求性、他の薬剤抵抗性を持つも
ので本発明の範囲に含まれる。また、Ｌ−イソロイシン
要求性、Ｌ−ロイシン要求性、α−アミノ−β−ヒドロ
キシ吉草酸等スレオニン代謝拮抗物質に対する耐性およ
びエチオニン等メチオニン代謝拮抗物質に対する耐性
は、Ｌ−スレオニン生成能に有効に作用するので、これ
らのいくつかの特性ないしはすべての特性をあわせ持つ
微生物が親株としてより好ましく用いられる。また、こ
れらの特性は通常の変異誘導操作により付与することが
可能である。ここでいう栄養要求性とは広義の意味であ
り、不完全欠失型（いわゆるleaky型）も含むものであ
る。さらに、その要求物質の生合成前駆物質で要求性が
満足される場合も含むものである。

本発明で用いられる変異株の代表なものとしては例えば
以下のものがある。プロビデンシア・レトゲリ AXR 2
G−10（FERMBP−1138）。プロビデンシア・レトゲリTP7
−55（FERM BP−1137）。

これらの変異株は、それぞれ、プロビデンシア・レトゲ
リ TP3−105（α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐
性、Ｌ−イソロイシン要求性、Ｌ−エチオニン耐性、Ｌ
−ロイシン要求性）を親株として、通常の変異処理方法
によって得られたもので、チアイソロイシンおよびアス
パラギン酸ヒドロキサメートに耐性を有する変異株であ
る。

変異株の誘導は、親株を紫外線照射するか、あるいは、
変異誘発剤（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸等）で処
理した後、親株が生育できないような濃度のイソロイシ
ン代謝拮抗物質を含む固体培地で生育可能な菌株を取得
すればよい。さらに、得られた変異株を変異処理し、親
株が生育できないような濃度のアスパラギン酸代謝拮抗
物質を含む固体培地で生育可能な菌株を取得すればよ
い。また、先に、アスパラギン酸代謝拮抗物質に対する
耐性株を分離したのちに、イソロイシン代謝拮抗物質に
対する耐性株を分離することもでき、この変異株も本発
明において、用いることができる。

本発明におけるイソロイシン代謝拮抗物質耐性株とは、
その親株より強い耐性を有する菌株のことであり、好ま
しくは、親株の24時間後の相対生育度が40％以下になる
ような濃度のイソロイシン代謝拮抗物質を含む培地で培
養した場合の相対生育度が50％以上を示すようなものを
言う。

例えば、チアイソロイシン耐性株の場合は、チアイソロ
イシン5mMとなるように添加した培地で培養した時の24
時間後の生育度が、無添加の場合の50％以上のものをチ
アイソロイシン耐性株という。

また、アスパラギン酸代謝拮抗物質耐性変異株とは親株
よりアスパラギン酸代謝拮抗物質に強い耐性を有する株
のことであり、好ましくは親株の相対生育度が30％以下
を示すアスパラギン酸代謝拮抗物質の濃度範囲において
60％以上の相対生育度を示す変異株のことである。ここ
で、相対生育度は培養液の660nmにおける吸光度を測定
し、各菌株のイソロイシン代謝拮抗物質、また、アスパ
ラギン酸代謝拮抗物質を添加していない培養液の吸光度
を100％として表わした場合の相対吸光度で示す。本発
明において用いる菌株とその親株のチアイソロイシンお
よびDL−アスパラギン酸ヒドロキサメートに対する耐性
を検定した結果を実施例２に示す。

本発明におけるＬ−スレオニン生産用の培地は、炭素
源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有
機微量成分を含有する通常の培地である。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、でん粉お
よびセルロースの加水分解物、糖蜜糖の糖類、フマール
酸、クエン酸、コハク酸等の如き有機酸、グリセロール
の如きアルコール類等を２〜15％、窒素源として、酢酸
アンモニウムの如き有機アンモニウム塩、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウムの如き無機アンモニウム塩、アンモニアガ
ス、アンモニア水、尿素等を0.5〜4.0％、有機微量栄養
素としては、Ｌ−イソロイシン等の被要求物質が0.001
〜0.4％、または必要に応じてコーンスティープリカ
ー、ペプトン、酵母エキス等０〜４％をそれぞれ適当量
含有する培地が好適に用いられる。これらの他リン酸カ
リウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄７水和物、硫酸
マンガン４−６水和物等が微量成分として少量添加され
る。

培養は、好気的条件で行なう。培養の間、培地のpHは５
から９に、温度は24〜37℃に調節し、48〜120時間振と
うまたは通気培養すれば好ましい結果が得られる。

培養液よりＬ−スレオニンを採取するには、通常の方法
を用いることができる。例えば、菌体を除去した培養
液をpH2に塩酸で調製したのち、強酸性カチオンイオン
交換樹脂に通液後、希アンモニア水で吸着成分を溶出
し、脱アンモニア後、濃縮する。これにアルコールを添
加し、冷却保存下で生成した結晶を集め、Ｌ−スレオニ
ンを得ることができる。

＜実施例＞ 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例１ A.（チオイソロイシン耐性株の分離） プロビデンシア・レトゲリTP3−105（α−アミノ−β−
ハイドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−イソロイシン要求性ない
しは、Leaky型要求性、Ｌ−エチオニン耐性、Ｌ−ロイ
シン要求性）あるいは、プロビデンシア・レトゲリ AH
XR7665（α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−
イソロイシン要求性ないしは、Leaky型要求性、Ｌ−エ
チオニン耐性、Ｌ−ロイシン要求性、DL−アスパラギン
酸ヒドロキサメート耐性）の菌体に、常法によりＮ−メ
チル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理（30
0μg/ml、30℃で20分）したのち、この細胞を、D,L−チ
アイソロイシン1.5g/、Ｌ−ロイシン2g/、Ｌ−バリ
ン2g/添加した寒天培地（グルコース0.5％、硫安0.1
％、リン酸第１カリウム0.3％、リン酸第２カリウム0.7
％、硫酸マグネシウム７水和物0.01％を含む完全合成培
地）に塗布した。次に30℃にて、５〜７日培養し、生じ
た大きなコロニーを釣菌分離して、チアイソロイシン耐
性株（親株をプロビデンシア・レトゲリ TP3−105とし
たものからはプロビデンシア・レトゲリ TP6−28、親
株をプロビデンシア・レトゲリ AHXR 7665としたもの
からはプロビデンシア・レトゲリTP7−55）を取得し
た。

B.（DL−アスパラギン酸ヒドロキサメート耐性株の分
離） プロビデンシア・レトゲリ TP6−28（α−アミノ−β
−ヒドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−イソロイシン要求性ない
しはLeaky型要求性、Ｌ−エチオニン耐性、Ｌ−ロイシ
ン要求性、チアイソロイシン耐性）あるいはプロビデン
シア・レトゲリ TP3−105（α−アミノ−β−ヒドロキ
シ吉草酸耐性、Ｌ−イソロイシン要求性ないしはLeaky
型要求性、Ｌ−エチオニン耐性、Ｌ−ロイシン要求性）
の菌体に常法によりＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン処理（300μg/ml、30℃で10分）した
後、この細胞をDL−アスパラギン酸ヒドロキサメート2g
/添加した寒天培地（グルコース0.5％、硫安0.1％、
リン酸第１カリウム0.3％、リン酸第２カリウム0.7％、
硫酸マグネシウム７水和物0.01％、Ｌ−イソロイシン0.
005％、Ｌ−ロイシン0.005％を含む最少培地）に塗布し
た。次に30℃にて６〜８日培養し、生じた大きなコロニ
ーを釣菌分離して、DL−アスパラギン酸ヒドロキサメー
ト耐性株（親株をプロビデンシア・レトゲリ TP6−28
としたものからはプロビデンシア・レトゲリ AXR 2G
−10、親株をプロビデンシア・レトゲリ TP3−105とし
たものからはAHXR 7665）を取得した。

最終的に、チアイソロイシン耐性およびDL−アスパラギ
ン酸ヒドロキサメート耐性をもつ、プロビデンシア・レ
トゲリ AXR 2G−10およびプロビデンシア・レトゲリ
TP7−55を取得した。

実施例２ A.（チアイソロイシン耐性株の耐性度） 下記第１表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて30
℃で16時間振とう培養し、生育した菌体を集菌し生理食
塩水でよく洗浄した。この菌体懸濁液を、チアイソロイ
シン０、2.5、5.0、10mMの濃度で含む最少培地（培地組
成：グルコース0.5％、硫安0.1％、リン酸第１カリウム
0.3％、リン酸第２カリウム0.7％、硫酸マグネシウム７
水和物0.01％、Ｌ−イソロイシン0.001％、Ｌ−ロイシ
ン0.05％、Ｌ−バリン0.05％）5mlに植菌して、30℃に
て24時間培養し、各菌株の生育度を調べた。その結果
は、第１表に示すとおりである。ただし、チアイソロイ
シンは、市販のもの（シグマ社製）を用いた。

本発明方法で使用するチアイソロイシン耐性株（AXR 2
G−10および TP7−55）では、親株のプロビデンシア・
レトゲリ TP3−105と比較して、チアイソロイシンによ
って生育が阻害されず、チアイソロイシンに対する耐性
を獲得していることが明らかである。

B.（DL−アスパラギン酸ヒドロキサメート耐性変異株の
耐性度） 下記第２表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて30
℃で16時間振とう培養し、生育した菌体を集菌し生理食
塩水で洗浄した。この菌体懸濁液をDL−アスパラギン酸
ヒドロキサメート０、0.25、0.5、1.0、2.0g/の濃度
で含む最少培地（グルコース0.5％、硫安0.1％、リン酸
第１カリウム0.3％、リン酸第２カリウム0.7％、硫酸マ
グネシウム７水和物0.01％、Ｌ−イソロイシン0.005
％、Ｌ−ロイシン0.005％）5mlに植菌して、30℃にて培
養し各菌株の24時間後の生育度を調べた。その結果は第
２表に示すとおりである。本発明方法で使用するDL−ア
スパラギン酸ヒドロキサメートに耐性な変異株（プロビ
デンシア・レトゲリAXR 2G−10およびTP7−55では、親
株のプロビデンシア・レトゲリ TP3−105と比較して、
高濃度のDL−アスパラギン酸ヒドロキサメートによって
生育が阻害されず、強いDL−アスパラギン酸ヒドロキサ
メート耐性を獲得していることを示している。

実施例３ （Ｌ−レスニオン生産菌の培養およびＬ−スレオニンの
生産） 第３表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン培地で30
℃、16時間振とうして前培養したのち、115℃、10分間
オートクレーブで滅菌した下記組成の発酵培地40mlを含
む１容三角フラスコに接種し、30℃、150rpm、振幅3c
mの条件下で74時間培養した。

発酵用培地 グルコース（別滅菌） ８ ％ （NH₄）₂SO₄ ３ ％ KH₂PO₄ 0.1 ％ MgSO₄・7H₂O 0.04 ％ Fe⁺⁺ ２ ppm Mn⁺⁺ ２ ppm Ｌ−イソロイシン 0.005 ％ Ｌ−ロイシン 0.06 ％ CaCO₃（別滅菌） ４ ％ pH ７（KOHで中和） 培養終了後、培養液から菌体、炭酸カルシウムを除去
し、その液中のＬ−スレオニンを自動アミノ酸分析計
（日本電子JLC.200A）で定量したところ、第３表に示す
結果を得た。

スレオニン生成収率は、消費グルコースに対する生成ス
レオニン重量収率で表わした。

本発明例のプロビデンシア・レトゲリ AXR2G−10、TP7
−55は、それぞれの親株のプロビデンシア・レトゲリTP
3−105と比較して、蓄積量、生成収率とも、顕著に高い
Ｌ−スレオニンを生産した。

実施例４ 第４表に示す各菌株を、液体ブイヨン培地で30℃、16時
間、振とう培養し、これを実施例３の発酵用培地のう
ち、（NH₄）₂SO₄を0.5％、グルコースを4.0％とした以
外は同様の培地800mlを分注したガラス製小型ジャーフ
ァーメンターへ、接種サイズ10％となるように接種し
た。30℃、800rpm、通気量1vvmにて、通気撹拌培養を開
始した。pH調節および窒素源の供給は、25％アンモニア
水で行ない、pHは、6.5〜8.0に維持した。グルコース、
KH₂PO₄、MgSO₄・7H₂O、Ｌ−ロイシンおよびＬ−イソロ
イシンを断続的に添加しながら、64時間培養したところ
第４表に示すような結果を得た。

プロビデンシア・レトゲリTP7−55の培養液より菌体を
除き、その液500mlを強力チオン交換樹脂ダイヤイオ
ンSK−1B（Ｈ型）のカラムを通した。カラムを水洗後、
2Nアンモニア水でカラムの吸着成分を溶出し、脱色後減
圧濃縮した。

これにエタノールを加え、冷却し、生成した結晶を集め
て乾燥した結果、純度96％以上のＬ−スレオニン31.9g
が得られ、安価なＬ−スレオニンの生産が可能となる。

また、本発明法により、バリンの副生を抑制し、高純度
のＬ−スレオニン生産が可能となり、精製工程を簡略化
でき、工業的実用化が有利となる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】プロビデンシア属に属し、イソロイシン代
   謝拮抗物質に対する耐性およびアスパラギン酸代謝拮抗
   物質に対する耐性を有し、かつＬ−スレオニン生産能を
   有する微生物を培養して培養液中にＬ−スレオニンを生
   成蓄積せしめ、前記培養液よりＬ−スレオニンを採取す
   ることを特徴とする発酵法によるＬ−スレオニンの製造
   法。
2. 【請求項２】イソロイシン代謝拮抗物質がチアイソロイ
   シンである特許請求の範囲第１項記載の発酵法によるＬ
   −スレオニンの製造法。
3. 【請求項３】アスパラギン酸代謝拮抗物質がアスパラギ
   ン酸ヒドロキサメートである特許請求の範囲第１項記載
   の発酵法によるＬ−スレオニンの製造法。
4. 【請求項４】微生物がプロビデンシア属レトゲリ種に属
   するものである特許請求の範囲第１項記載の発酵法によ
   るＬ−スレオニンの製造法。