HU209842B - Process for producing of l-lysine and l-threonine amino acid - Google Patents

Description

A jelen találmány aminosavak, úgymint L-treonin és L-lizin fermentációval történő' előállítására szolgáló eljárás vonatkozik. Az aminosavakat a gyógyszerek, élelmiszerek, takarmányok, stb. területén széles körben használják.

Ami az aminosavaknak metanolból való előállítását illeti (amely metanol a fermentációnak olcsó és nagy mennyiségben rendelkezésre álló kiindulási anyaga), ismeretesek olyan eljárások, amelyekben különböző nemzetségekhez tartozó mikroorganizmusokat alkalmaztak; például az Achromobacter nemzetséghez és a Pseudomonas nemzetséghez (25 273/70 számú nyilvánosságra hozott vizsgált japán szabadalmi bejelentés), a Protaminobacter nemzetséghez (125 590/74 számú nyilvánosságra hozott, nem vizsgált japán szabadalmi bejelentés), a Protaminobacter és a Methanomonas nemzetségbe (25 790/75 számú nyilvánosságra hozott, nem vizsgált japán szabadalmi bejelentés) és a Microcyclus nemzetséghez (18 886/77 számú, nyilvánosságra hozott, nem vizsgált japán szabadalmi bejelentés) tartozó mikroorganizmusokat. Az ezen ismert eljárásokkal előállított aminosavak mennyisége azonban kevés és nem kielégítő.

A találmány szerinti eljárással aminosavakat, úgymint L-treonint és L-lizint állíthatunk elő magas hozammal és alacsony költséggel úgy, hogy egy fő szénforrásként metanolt tartalmazó közegben egy olyan, a Methylobacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmust tenyésztünk, amely képes aminosav(ak)at termelni, és rezisztens legalább egy, kiválasztott tagjára annak a csoportnak, amely L-treoninból, L-lizinből és egy aminosav analógból áll, és az említett mikroorganizmust egy olyan szülő törzs mutációjával nyerjük, amely a Methylobacillus nemzetségbe tartozik, és amely fokozottan érzékeny egy antibiotikumra és egy aminosav analógra; az aminosav(ak)at hagyjuk feldúsulni a tenyészetben; majd az aminosav(ak)at kinyerjük onnan.

A találmány szerinti eljárásban bármilyen mikroorganizmust fel lehet használni, ha az a következő tulajdonságokkal rendelkezik: (1) a Methylobacillus nemzetséghez tartozik; (2) egy olyan szülő törzs mutációjával nyerték, amely a Methylobacillus nemzetséghez tartozik és fokozottan érzékeny legalább egy antibiotikumra és legalább egy aminosav analógra; (3) rezisztens legalább egy kiválasztott tagjára annak a csoportnak, amely l-treoninból (a továbbiakban L-Thr), L-lizinből (a továbbiakban L-Lys) és egy aminosav analógból áll; (4) fő szénforrásként metanolt tartalmazó közegben képes a növekedésre; és (5) képes aminosavakat, speciálisan L-Thr-t vagy L-Lys-t termelni. Egy ilyen tulajdonságokkal rendelkező mutánst úgy lehet előállítani, hogy az anyatörzset valamilyen hagyományos mutációs kezelésnek vetjük alá, mint például ultraibolya fénnyel való besugárzásnak, N-metil-N'-nitroN-nitrozo-guanidinnel (NTG) való kezelésnek vagy valami hasonlónak.

Példák az antibiotikumra a következő: kanamicin, ampicillin és sztreptomicin.

Példák az aminosav analógra a következők: a-amiηο-β-hidroxi-valeriánsav (a továbbiakban AHV), S-2(amino-etil)-L-cisztein (a továbbiakban AEC) és DL4,5-transzdehidrolizin (a továbbiakban DHL).

A jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazott mikroorganizmusok jellemző példáit az 1. táblázatban mutatjuk be.

1. táblázat

Törzs	Rezisztencia
Methylobacillus sp. TA-47	L-Thr
Methylobacillus sp. DA-19	L-Lys + AHV
Methylobacillus sp. DA-35	DHL
Methylobacillus sp. AL-76	L-Lys + AHV
Methylobacillus sp. TR-26	L-Thr
Methylobacillus sp. ATR-89	L-Thr + AEC

Ezen törzsek előállítására szolgáló eljárásokat az alábbiakban mutatjuk be.

A Methylobacillus nemzetséghez tartozó baktériumok vad törzseinek alacsony az érzékenységük egy aminosav analógra, így nehezen lehet az aminosav analógra vonatkozó rezisztenciát bevinni a vad törzsekbe, majd elkülöníteni azokat a mutánsokat, amelyek a metabolikus szabályozás során keletkeznek. Az ok, ami miatt ezen törzseknek alacsony az aminosav analógra való érzékenységük, vélhetőleg az, hogy számos vegyületre gyenge a membrán-permeabilitásuk. Ezért az aminosavat kibocsájtó mutánsokat indukáljuk vad törzsek közül, és az így kinyert mutánsok közül egy törzset, amely számos vegyületre fokozott érzékenységet és a vegyületekre jó permeabilitást mutat, szülő törzsként kiválasztunk.

Szülő törzsként ki lehet választani egy olyan törzset, amely a Methylobacillus nemzetséghez tartozik és fokozottan érzékeny legalább egy antibiotikumra a kanamicin, ampicillin és sztreptomicin közül és az aminosav analógokra mint például AHC-ra és AEC-re. Például, a már ismert törzseken kívül lehet használni az olyan vad törzsek mutánsait, mint például Achromobacter methanolophia ATCC 21 452, Pseudomonas insueta ATCC 21 276, Protaminobacter thiaminophagus ATCC 21 371 és Methanomonas methylovora ATCC 21 369, amelyek fokozott érzékenységgel rendelkeznek a fenti vegyszerekkel szemben. Példák a már ismert törzsekre a következők: Pseudomonas insueta K015 (ATCC 21 966), Pseudomonas insueta K-038 (ATCC 21 967) és Protaminobacter triaminophagus K-224 (ATCC 21 967).

Az International J. Systematic Bacteriology 27, 247-255 (1977) és 34, 188-201 (1984)-ben leírják, hogy az ATCC 21 452, ATCC 21 276, ATCC 21 371, ATCC 21 316, ATCC 21 966, ATCC 21 967 és ATCC 21 969 törzsek jelenleg a Methylobacillus nemzetségbe vannak sorolva.

Ennek megfelelően az ATCC 21 452 törzsre, az

ATCC 21 276 törzsre, az ATCC 21 371 törzsre, az

ATCC 21 369 törzsre, az ATCC 21 966 törzsre, az

ATCC 21 967 törzsre és az ATCC 21 969 törzsre ez2

HU 209 842 Β után úgy fogunk hivatkozni, mint Methylobacillus sp. 1001-re, Methylobacillus sp. 1016-ra, Methylobacillus sp. 1006-ra, Methylobacillus sp. 1003-ra, Methylobacillus sp. Κ-015-re, Methylobacillus sp. K-O38-ra, illetve Methylobacillus sp. Κ-224-re.

Azért, hogy a Methylobacillus sp. 1001-nek, a Methylobacillus sp. 1011-nek, a Methylobacillus sp. 1006-nak és a Methylobacillus sp. 1003-nak a vegyszerekkel szembeni érzékenységét fokozzuk, ezeket a vad törzseket hagyományos mutációs kezelésnek vetjük alá, például NTG-vel való kezeléssel. A kapott mutánsra jellemző példa a Methylobacillus sp. iAl 11. Az iAl 11 törzs előállításának folyamatát az alábbiakban mutatjuk be.

A Methylobacillus sp. 1011-et az alábbi összetételű Ml-es tápoldatban tenyésztettük 30 °C-on, 24 órán keresztül. A kitenyésztett sejteket NTG-vel való kezelésnek vetettük alá (500 mg/1; 30 °C; 30 perc), hagyományos módon, majd olyan Ml-es agar-agar táptalajon (Ml közeg + 1,5 t/tf% agar-agar) szélesztettük, amely 0,1 t/tf% Casamino-savat (a Difco Laboratories gyártmánya) és 20 mg/1 L-triptofánt tartalmazott. 30 °C-on történő 3-14 napos tenyésztés után a képződött telepeket kiemeltük, és elkülönítettük. Az így nyert mutánsokat egy kémcsőben lévő 3 ml szaporító tápoldatba oldottuk be, majd ezt követően 30 °C-on, 18 órán keresztül tenyésztettük. Ezután a kapott tenyészkultúrának 1 ml-ét egy nagy, 50 ml-es kémcsőben lévő 10 ml fermentációs tápoldatba oldottuk be, amelyet 2 t/tf%-nyi metanollal egészítettünk ki. A tenyésztést 30 °C-on végeztük 48 órán keresztül úgy, hogy a tenyésztés kezdetétől számított első 24 óra elteltével újabb 2 t/tf% metanollal egészítettük ki a táptalajt. Mindegyik, előzőekben leírt tenyésztést rázással végeztünk.

A tenyésztő tápoldatok összetételét az alábbiakban mutatjuk be.

Az Ml-es tápoldat összetétele:

0,5 t/tf% metanol, 0,2 t/tf% ammónium-szulfát, 0,1 t/tf% kálium-dihidrogén-foszfát, 0,7 t/tf% dikálium-hidrogén-foszfát, 0,01 t/tf% nátrium-klorid, 0,01 t/tf% tiokarbamid, 0,0 t/tf% magnézium-szulfát, 10 mg/1 vas(II)-szulfát, 8 mg/1 mangán-szulfát, 1 mg/1 tiamin, 0,01 mg/1 biotin; pH = 7,0.

Az oltó táptalaj összetétele [a továbbiakban (a) oltó táptalaj]:

t/tf% pepton (Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd., gyártmánya), 0,5 t/tf% élesztőkivonat S (Saigo Pharmaceutical Co., Ltd. gyártmánya), 1 t/tf% metanol; pH = 7,0.

A fermentációs táptalaj összetétele [a továbbiakban (b) fermentációs táptalaj]:

0,8 t/tf% ammónium-szulfát, 0,1 t/tf% kálium-dihidrogén-foszfát, 0,7 t/tf% dikálium-hidrogén-foszfát, 0,1 t/tf% nátrium-klorid, 0,04 t/tf% magnézium-szulfát, 10 mg/1 vas(II)-szulfát, 10 mg/1 mangán-szulfát, 0,05 mg/1 biotin, 0,2 mg/1 tiamin, 0,5 mg/1 kalcium-pantotenát, 0,5 mg/1 nikotinsav, 0,3 t/tf% kukoricalekvár, 0,05 t/tf% Casamino-sav, 2 t/tf% kalcium-karbonát; pH = 7,0.

A pH-t nátrium-hidroxiddal vagy sósavval állítjuk be. A fenti tápoldat előállításakor a metanolon kívüli összetevőket feloldjuk és az oldatot 120 °C-on 15 percig gőzzel sterilizáljuk. Ezután az előzőleg már sterilizálás céljából membránszűrőn (Millipore Co. gyártmányú, 0,45 pm pórusátmérőjű) átszűrt metanolt a megadott mennyiségben az oldathoz adjuk.

A tenyésztés befejeztével a sejteket és a kalciumkarbonátot a tenyészetből centrifugálással választottuk el. A tenyészetet felülúszó részében levő aminosavakat egy aminosav-analizátorral elemeztük (Nippon Bunkó Co., Ltd. gyártmányú, nagyteljesítményű folyadékkromatográfiás aminosav analízis rendszer). Azt a törzset, amelynek a tenyészetének felülúszója aminosavakat, mint például glutaminsavat, aszparaginsavat, valint és alanint tartalmazott különválasztottuk, mint egy aminosav kibocsájtó mutánst.

Az így kapott aminosavat kibocsájtó mutánsok vegyszerérzékenységét a következő módon vizsgáltuk meg. Az aminosavat kibocsájtó mutánst olyan Ml-es agar-agar táptalaj lemezre oltottuk, amely kanamicinszulfátot [Km] (Meiji Seika Co. Ltd. gyártmánya), ampicillint [Ap] (a Sigma Co., Ltd. gyármtánya), AHV-t (a Sigma Co. Ltd. gyártmánya) és AEC-t (a Sigma Co. Ltd. gyártmánya) tartalmazott különböző koncentrációkban. A kitenyésztést 30 °C-on végeztük 2-5 napig, hogy megvizsgáljuk a telepek növekedését, és kiválasztottunk egy törzset, amelynek a szülő törzzsel öszszehasonlítva fokozott vegyszerérzékenysége volt.

Az egyik törzset, amelynek nagyobb vegyszerzérzékenysége volt, mint a szülő törzsnek, a Methylobacillus sp. 1011-nek, elneveztük Methylobacillus sp. iAl 11-nek.

Az egyes vegyszereknek az a minimális koncentrációja (minimális gátló koncentráció), amelynél a megfelelő törzs növekedése már gátolt, a 2. táblázatban látható. A K-224 törzs esetében a minimális gátló koncentrációt olyan Ml-es agar-agar táptalaj segítségével határoztuk meg, amely 50 mg/1 fenilalanint tartalmazott.

2. táblázat

Különböző vegyszerek minimális gátló koncentrációja (mg/l)

Törzs	Km	Ap	Sm	AHV	AEC
1011 Törzs	100	200	200	>3000	>3000
iAl 11 Törzs	20	20	50	1000	1000
K-015 Törzs	20	50	50	1000	1000
K-038 Törzs	20	20	50	1000	500
1006 Törzs	200	200	500	>3000	>3000
K-224 Törzs	20	50	50	1000	1000

A találmány szerint eljárásban használt mikroorganizmusok nyerésére szolgáló módszert az alábbiakban írjuk le.

A jelen találmányban alkalmazott mikroorganizmusok azok a mutánsok, amelyeket úgy kaptuk, hogy rezisztenssé tettük az előbb leírt Methylobacillus nemzetségbe tartozó törzseket legalább egy kiválasztott tagjára annak a csoportnak, amely L-Thr-ből, L-Lysből, és aminosav analógból áll. Ezeket a mutánsokat úgy lehet előállítani, hogy a szülő törzseket hagyományos mutációs kezelésnek vetjük alá, mint például NTG-vel való kezelésnek, majd ezután elkülönítjük

HU 209 842 Β azokat a törzseket, amelyek képesek növekedni egy olyan táptalajon, illetve tápoldatban, amelyik legalább egy kiválasztott tagját tartalmazza annak a csoportnak, amely L-Thr-ből, L-Lys-ből és aminosav analógból áll, mégpedig olyan koncentrációban, amelynél a szülő 5 törzs már nem képes növekedni.

A találmány szerint mutánsok előállítására szolgáló eljárásokat az alábbiakban illusztráljuk.

(1) Methylobacillus sp. TA-47 előállítására szolgáló módszer: 10

A Methylobacillus sp. iA 111-et olyan M-l-es tápoldatban tenyésztjük 30 °C-on és 24 órán keresztül, amely 0,1 t/tf% Casamino-savat és 20 mg/1 L-triptofánt tartalmaz. Az így kapott sejteket hagyományos módon történő NTG kezelésnek vetjük alá (500 mg/1, 30 °C, 15 30 perc). A kezelt sejteket azután egy olyan M-l-es agar-agar táptalajon szélesztjük, amely 5000 mg/1 LThr-t tartalmaz, és 30 °C-on 3-14 napig tenyésztjük, hogy olyan L-Thr rezisztens mutáns törzseket kapjunk, amelyek képesek a L-Thr-on növekedni. A telepeket 20 azután elkülönítjük, és megvizsgáljuk azokat L-Thr és L-Lys termelés szempontjából. Egy olyan mutánst, amelynek nagyobb L-Thr és L-Lys termelése volt, mint a szülő törzsnek, különválasztottunk, és azt MethylobaciiLs sp. ΤΑ-47-nek neveztük el. 25 (2) Methylobacillus ps. DA-19 előállítására szolgáló módszer:

Ugyanazt a módszert ismételjük meg, mint az (1) esetben kivéve, hogy az Ml-es agar-agar táptalajhoz 1000 mg/1 L-Lys-t és 1000 mg/1 AHV-t adunk az 30 5000 mg/l-es L-Thr koncentráció helyett, és így L-Lysre és AHV-ra rezisztens mutánsokat kapunk. Egy olyan mutánst, amelynek nagyobb L-Thr termelése volt, mint a szülő törzsnek, különválasztottunk, és azt Methylobacillus sp. DA-19-nek neveztük el. 35 (3) Methylobacillus sp. DA-35 előállítására szolgáló módszer:

Ugyanazt a módszert ismételjük meg, mint az (1) esetben, kivéve, hogy az Ml-es agar-agar táptalajhoz 5000 mg/1 DHL-t adunk 5000 mg/1 L-Thr helyett, és 40 így DHL rezisztens mutánsokat kapunk. Egy olyan mutánst, amelynek nagyobb L-Lys termelése volt, mint a szülő törzsnek, különválasztottunk, és azt Methylobacillus sp. DA-35-nek neveztük el.

A DHL-t azon módszer szerint szintetizáltuk, ame- 45 lyet a Journal of Biochemistry, 100, 21-25 (1986)-ban írnak le, hivatkozással a Journal of American Chemical Society 83, 2279-2281 (1961) leírásra, és a termék tisztasága, tisztítás után 97% fölötti volt.

(4) Methylobacillus sp. AL-76 előállítására szolgá- 50 ló módszer:

Ugyanazt a módszert ismételjük meg, mint az (1) esetben, kivéve, hogy az Ml-es agar-agar táptalajhoz 2000 mg/1 AHV-t és 5000 mg/1 L-Lys-t adunk az 5000 mg/1 L-Thr koncentráció helyett, és így AHV-ra és L-Lys-re rezisztens mutánsokat kapunk. Egy olyan mutánst, amelynek nagyobb L-Lys termelése nagyobb volt, mint a szülő törzsnek, különválasztottunk és a Methylobacillus sp. AL-76-nak neveztük el.

(5) Methylobacillus sp. ATR-89 előállítására szolgáló módszer: Ugyanazt a módszert ismételjük meg, mint az (1) esetben, kivéve hogy Κ-224-es törzset használunk szülő törzsként az iA111-es törzs helyett és az 50 mg/1 fenilalanint tartalmazó Ml-es agar-agar táptalajhoz 1000 mg/1 L-Thr-t adunk 5000 mg/1 L-Thr helyett, és így L-Thr rezisztens mutánsokat kapunk. Egy olyan mutánst, amelynek L-Thr termelése nagyobb volt, mint a szülő törzsnek különválasztottunk, és azt Methylobacillus sp. TR-26-nak neveztük el.

(6) Methylobacillus sp. ATR-89 előállítására szolgáló módszer:

Ugyanazt a módszert ismételjük meg, mint az (1) esetben, kivéve, hogy a K-224 törzset használunk szülő törzsként az iAlll-es törzs helyett, és az 50 mg/1 fenilalanint tartalmazó Ml-es agar-agar táptalajhoz 1000 mg/1 L-Thr-t és 1000 mg/1 AEC-t adunk 5000 mg/1 L-Thr helyett, és így L-Thr és ACE rezisztens mutánsokat kapunk. Egy olyan mutánst, amelynek L-Thr és L-Lys termelése nagyobb volt, mint a szülő törzsnek, különválasztottunk és azt Methylobacillus sp. ATR-89-nek neveztük el. A kapott mutánsokat a Japán Ipari Tudományos és Technológiai Hivatal fermentációs Kutató Intézetében (Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japán) helyeztük el 1990. június 22-én a Budapesti Egyezmény értelmében. Az illető törzsek katalógusszáma a 3. táblázatban található.

3. táblázat

Törzs	Katalógusszám
TA-47 Törzs	FERM BP-2979
DA-19 Törzs	FERM BP-2981
DA-35 Törzs	FERM BP-2982
AL-76 Törzs	FERM BP-2980
TR-26 Törzs	FERM BP-2983
ATR-89 Törzs	FERM BP-2984

A kapott mutánsokat és szülő törzseiket olyan Mles agar-agar táptalajon tenyésztettük, amely az alább leírt vegyszereket tartalmazta, és ezt 30 °C-on 48 órán keresztül végeztük és a növekedés mértékét feljegyeztük. Az eredmények a 4. táblázatban láthatók.

4. táblázat

Vegyszer	Koncentráció (mg/1)	Törzs
iAlll	TA-47	DA-19	DA-35	AL-76	K-224	TR-26	ATR-89
L-Thr	0	+	+				+	+
1000	+	+				-	+
5000	-	+				-

HU 209 842 Β

L-Lys + AHV	1000+1000	-		+		+
5000+2000	-				+
L-Thr + AEC	0+0						+		+
1000+1000						-		+
DHL	0	+			+
1000	+			+
5000	-			+

+: Kielégítő növekedés -: Nincs növekedés

A találmány szerinti eljárás során alkalmazott mikroorganizmusokat olyan eljárással tenyésztettük, amelyet általánosan használnak metanolt asszimiláló mikroorganizmusok tenyésztésére.

A találmány szerinti aminosav előállítás tápoldataként bármilyen szintetikus vagy természetes tápoldatot használni lehet, ha az tartalmaz szén-, nitrogén-, szervetlen anyag forrásokat, és ha szükséges, szerves nyomvegyületeket.

Szénforrásként főként metanolt használunk, és azt 0,05 és 30 t/tf% közötti koncentrációban adjuk a tápoldathoz. Szerves savakat, így például piroszőlősavat és 2-oxo-glutársavat, valamint természetes szerves komponenseket, így például élesztőkivonatot, peptont és kukoricaszörpöt is lehet a tápoldathoz adni 0,01 és t/tf% közötti koncentrációban, ha az alkalmazott mikroorganizmus növekedését, illetve az L-Thr és LLys termelését ezáltal elő lehet segíteni. Nitrogén forrásként ammónium-szulfátot, ammónium-kloridot, ammónium-acetátot, ammónium-nitrátot, ammóniumfoszfátot, ammónia gázt, ammónium-hidroxid oldatot, karbamidot, stb. lehet a tápoldatba adni 0,1 és 8 t/tf% közötti koncentrációban. Ezen felül általában kis mennyiségű nyomvegyületeket is adagolnak a rendszerbe, például kálium-foszfátot, nátrium-foszfátot, magnézium-foszfátot, vas(H)-szulfátot és mangán(II)szulfátot. A tenyésztést aerob körülmények között végezzük, például a tenyészet rázásával vagy a tenyészoldat levegőztetésével és keverésével, 24 és 37 °C között, és 9 pH között, amikor is az 24 és 120 óra között fejeződik be.

Az aminosavakat, így az L-Thr-t és az L-Lys-t a tenyészetből úgy nyerjük ki, hogy a kiülepedett részt, így a sejteket eltávolítjuk a tenyészetből, és a kapott felülúszó részt hagyományos módszerekkel kezeljük, így ioncserével, bekoncentrálással és kisózással. Például, az L-Thr kinyerése érdekében a sejtmentes tenyészet felülúszó részét sósavval pH 2-re állítjuk be, majd egy erősen savas kationcserélő gyantán (Mitsubishi Kaséi Co., Ltd. gyártmánya) keresztülengedjük. Az adszorbeálódott komponenst hígított, vizes ammónium-hidroxid oldattal eluáljuk, és aztán az ammóniát ledesztilláljuk. Bekoncentrálás után a koncentrátumhoz alkoholt adunk, és a hűtés közbeni állás során képződött kristályokat összegyűjtve megkapjuk az L-Thr-t.

Az L-Lys kinyerése érdekében a sejtmentes tenyészet felülúszórészét vizes nátrium-hidroxid oldattal pH 7-re állítjuk be, majd egy kationcserélő gyantán (Mitsubishi Kaséi Co., Ltd. gyártmánya) keresztülengedjük. Az adszorbeálódott komponenst hígított, vizes sósav oldattal eluáljuk, és az L-Lys-nek megfelelő frakciókat összegyűjtjük. Az egyesített frakciókhoz al20 koholt adunk, és a hűtés közbeni állás során képződött kristályokat összegyűjtve megkapjuk az L-Lys-t. A következő példák a jelen találmány további szemléltetésére szolgálnak.

1. példa

L-Treonin (L-Thr) előállítása

Methylobacillus sp. ΤΑ-47-et beoltunk egy kémcsőben levő 3 ml (a) szaporító tápoldatba, és 30 °C-on 18 órán át rázatva tenyésztjük. Ezután a kapott tenyé30 szét 1 ml-ét egy nagy, 50 ml-es kémcsőben levő 10 ml (b) fermentációs tápoldathoz adjuk, amely 2 t/tf% metanolt tartalmaz és 30 °C-on rázatva tenyésztjük. A tenyésztés megkezdésétől számított 24 óra elteltével újabb 2 t/tf% metanolt adunk a rendszerbe, és a te35 nyésztést további 24 órán keresztül folytatjuk.

A tenyésztés befejeztével a sejteket és a kalciumkarbonátot centrifugálással eltávolítjuk, és az eredményként kapott felülúszó rész L-Thr koncentrációját egy aminosav analizátorral (Nippon Bunkó Co., Ltd.

nagyteljesítményű folyadékkromatográfiás aminosav analízis rendszer) meghatározzuk. A fentivel megegyező eljárást megismételjük 1011, 1006, iAlll, K-224, DA-19, TR-26, illetve ATR-89 törzseket használva a TA-47 helyett, és meghatároztuk a felülúszó részben az L-Thr koncentrációját.

Az eredmények az 5. táblázatban láthatók.

5. táblázat

Törzs	Összegyűlt L-Thr mennyisége mg/ml
1011 Törzs	0,01
iAlll Törzs	0,02
TA-47 Törzs	2,0
DA-19 Törzs	1,81
1006 Törzs	<0,01
K-224 Törzs	0,04
TR-26 Törzs	0,43
ATR-89 Törzs	1,34

HU 209 842 Β

2. példa

L-Treonin (L-Thr) kinyerése A Ta-47-es törzset ugyanolyan módon tenyésztjük, mint az 1. példában. Az eredményként kapott tenyészet felülúszóját (800 ml) sósavval pH 2-re állítjuk be, és utána keresztülengedjük egy erős kationcserélő gyantával, DIAION SK IB (H típus) (Mitsubishi Kaséi Co., Ltd. gyártmány) töltött oszlopon. Miután az oszlopot vízzel átmossuk, a gyanta felületén adszorbeált komponenst 2 mólos vizes ammónium-hidroxid oldattal eluáljuk. Az L-Thr-t tartalmazó frakciókat egyesítjük, és vákuumban bekoncentráljuk. A koncentrátumhoz etanolt adunk és az elegyet kristályosítás céljából 4 °C-ra lehűtjük. A kristályokat összegyűjtjük, szántjuk, és 1,25 g kristályos L-Thr-t kapunk legalább 98%-os tisztasággal.

3. példa

L-Lizin (L-Lys) előállítása

Methylobacillus sp. 1011, iAlll, TA-47, DA-35,

Al-76, 1006, K-224 és ATR-89 törzseket ugyanolyan módon tenyésztünk, mint az 1. példában. A tenyésztés befejeztével az eredményként kapott tenyészet felülúszójában az L-Lys koncentrációját aminosav analizátorral meghatároztuk.

Az eredmények a 6. táblázatban láthatók.

6. táblázat

Törzs	Összegyűlt L-Lys mennyisége mg/ml
1011 Törzs	>0,01
iAlll Törzs	0,28
TA-35 Törzs	0,28
TA-47 Törzs	0,33
A1^76 Törzs	0,39
1006 Törzs	>0,01
K-224 Törzs	0,02
ATR-89 Törzs	0,15

4. példa

L-Lizin (L-Lys) előállítása

Két oltókacsnyi Methylobacillus sp. AL-76-ot egy 300 ml-es Erlenmeyer lombikban levő 25 ml (a) tenyészoldatba beoltunk, és 30 °C-on rázatva 18 órán keresztül tenyésztjük. Az egész tény észkultúrát ezután átoltjuk egy 2 1-es Erlenmeyer lombikban lévő 225 ml (a) tenyészoldatba. A tenyésztést 30 °C-on rázatva további 18 órán keresztül folytatjuk.

Az eredményként kapott tenyészkultúra egészét (250 ml) átoltjuk egy 5 1-es fermentorban (Mitsuwa Biosystem Co., Ltd. gyártmánya) levő 2,25 1 (b) fermentációs oldatba. A tenyésztést 30 °C-on végeztük kevertetve (600 ford/perc) és levegőztetve (2,5 1/perc). A tenyésztés során a Ph-t automatikusan szabályoztuk 6,8-ra 6 mólos ammónium hidroxid oldat segítségével. A tenyésztés kezdetekor 0,5 t/tf%-os koncentrációban metanolt adtunk a rendszerbe, és azután egy perisztaltikus szivattyú (Ato Co., Ltd. gyártmánya) segítségével folyamatosan olyan mennyiségben folytatjuk az adagolást, hogy a 0,5 t/tf%-os koncentrációt fenntarthassuk.

órás tenyésztés után 3,02 g/1 L-Lys halmozódik fel a tápoldatban.

5. példa

L-Lizin (L-Lys) kinyerése

Az AL-76 törzset ugyanolyan módon tenyésztjük, mint a 4. példában. A centrifugálással kapott tenyészet felülúszót nátrium-hidroxiddal pH 7-re állítjuk be, és utána keresztülengedjük egy erős kationcserélő gyantával (DIAION SK1B [NH^ ciklus); Mitsubishi Kaséi Co., Ltd. gyártmánya) töltött oszlopon. Miután az oszlopot vízzel átmostuk, a gyantán adszorbeált komponenst 1 mólos sósav-oldattal eluáljuk. Az L-Lys-t tartalmazó frakciókat egyesítjük, és vákuumban bekoncentráljuk. A koncentrátumhoz etanolt adunk, és az elegyet kristályosítás céljából 4 °C-ra lehűtjük. Aki Ltályokat összegyűjtjük, szárítjuk, és 1,88 g kristályos L-Lys-t kapunk legalább 96%-os tisztasággal.

Claims (3)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás L-treonin vagy L-lizin aminosav fermentációs úton történő előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, fő szénforrásként metanolt tartalmazó tápoldatban olyan Methylobacillus nemzetséghez tartozó mikroorganizmust tenyésztünk, amely képes L-treonin vagy L-lizin termelésére, és rezisztens L-treoninból, L-lizinből és egy, aminosav-analógokból álló csoport legalább egy tagjára, és amely mikroorganizmust mutációval nyerjük egy, a Methylobacillus nemzetséghez tartozó olyan szülő törzsből, amely fokozottan érzékeny legalább egy antibiotikumra és egy aminosavanalógra, majd a termelődött L-treonin vagy L-lizin aminosavat a fermentléből ismert módon kinyerjük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kanamicinre, ampicillinre vagy sztreptomicinre fokozottan érzékeny szülő törzsből nyert mikroorganizmust tenyésztünk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alfa-amino-béta-hidroxi-valeriánsav, S-2-amino-etil-L-cisztein és DL-4,5-transzdehidrolizin aminosav-analóg valamelyikére fokozottan érzékeny szülő törzsből nyert mikroorganizmust tenyésztünk.