DE2216113A1 - Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinen - Google Patents

Description

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DK.-SNG. VON KRElSLHR DR.-ING. SCHÖN WALD

DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES Dl PL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL-CKEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH DIPL.-ING. SELTING

5 KÖLN 1, DIiICHMANNHAUS

27. März 1972 Kl/Ax

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27, Doshomachi 2-choine, Higashl-ku, Osaka (Japan).

Verfahren zur Herstellung von Cephalosporincn

Die Erfindung betrifft ein neues, großtechnisch vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinen.

Gemäß der Erfindung werden Cephalosporine der Formel

KH^

- COIiH -

I I

, ² /S^

R-CH- COIiH - CH- CH CH_?

COOH

in der R ein sechsgliedriger cyclischer Kohlcnwaseerstoffrest oder ein fünfgliedriger heterocyclischer Rest ist und R^f für ein Wasserstoffatom oder einen organischen Rest steht, dessen angedeutete Bindung sich zwischen dem Methylenkohlenstoffatorn und einem Sauerstoffatom, Schwefelatom oder Stickstoffatom be findet, die den organischen Rest bilden, durch Kondensation zwischen 1) einer α-substituierten a-Arninosäure der Formel

R - CH - COOII (TI)

in der R die obengenannte Bedeutung hat, oder ihrem reaktionsfähigen Derivat und 2) einer V'-Aminocepheinverbinduns der Formel

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221611

H₂N - CH—CH

COOH

in der R' die obengenannte Bedeutung hat, unter Verwendung von Mikroorganismen, die eine enzymatisehe Aktivität eines neuartigen Typs aufv.'eisen, hergestellt.

Bisher erfolgte die Herstellung von Cephalosporinen durch die Kondensationsreaktion zwischen α-substituierten α-Aminosäuren und 7-Aininocephemverbindungen mit Hilfe chemischer Reaktionen. Bei diesen bekannten Verfahren ist es jedoch zur Vermeidung unerwünschter Nebenreaktionen erforderlich, entweder die Ami.nogruppe der Aminosäuren vorher zu schützen oder .sie vorher in ein Radikal, z.B. die Azidgruppe (N_v) umzuwandeln, die wieder in eine Aminogruppe umgewandelt v/erden kann. Es ist somit nach der KondensationsreaRtion notwendig, entweder die Schutzgruppe von der Aminogruppe zu entfernen oder das Radikal wieder in eine Aminogruppe umzuwandeln. Diese Nebenstufen des Verfahrens müssen unter milden Bedingungen durchgeführt werden, um keine anderen Komponenten als die an diesen Reaktionen beteiligten zu beeinflussen, insbesondere um nicht den Cephemkern oder die Säureaniidbindung in der Seitenkette an ihrer 7-Stellung abzuspalten. Diese Nebenstufen des Verfahrens führen zwangsläufig zur einer Verschlechterung der Ausbeute an gewünschten Cephalosporinen.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß unter den Mikroorganismen der Gattungen Mycoplana, Protaminobactei·, Acetobacter (einschließlich der Gattung Gluconobacter, Acetobacter gemäß "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7. Auflage, 19^7)* Xanthomonas, Pseuciomonas, Aeromonas, Escherichia, Staphylococcus, Arthrobacter, Proteus, Corytiebacterium, Flavobacterium, Clostridium, Spirillum und Bacillus häufig Mikro-

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Organismen vorkommen, die eine neuartige enzymatisch^ Aktivität aufweisen, d.h. in der Lage sind, ein Cephalosporin (l) aus einer α-substituierten a-Arnlnosäure (Il) oder ihrem reaktionsfähigen Derivat und einer 7-Aminocephemverbindung (III) zu bilden, und daß die Cephalosporine (I) glatt in hohen Ausbeuten hergestellt werden können, indem die α-substituierten α-Aminosäuren (Il) oder ihre reaktionsfähigen Derivate und die 7-AmJ.-nocephernverbindungen (III) der enzymatischem Wirkung dieser Mikroorganismen unterworfen werden. Die unter Verwendung von Mikroorganismen durchgeführte Kondensationsreaktion zwischen einer organischen Säure oder ihrem reaktionsfähigen Derivat und einer 7-Aminocephemverbindung zur Herstellung von Cephalosporinen ist, soweit der Anmelderin bekannt ist, bisher unbekannt und wird hier erstmals vorgeschlagen.

Hauptgegenstand der Erfindung ist demgemäß ein unter Verwendung von I-iikroorganismen durchgeführtes Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinen (I) aus α-substituierten α-Aminosäuren (II) oder ihren reaktionsfähigen Derivaten und den 7-Aminocephemverbindungen (III). Dieses Verfahren ist bei weitem vorteilhafter als die bekannten chemischen Verfahren.

In der vorstehenden Formel (I) ist R ein sechsgliedriger cyclischer Kohlenwasserstoffrest oder ein fünfgliedriger Heteroeyclus. Geeignet als sechsgliedrige cyclische Kohlenwasserstoffreste sind beispielsweise Phenylreste, Cyclohexenylreste (z.B. 1-Cyclohexenyl, 2-Cyclohexenyl und 3-Cyclohexenyl), Cyclohexadienylreste (z.B. 1,3-Cyclohexadienyl, 1,4-Cyclohexadienyl, 1,5-Cyclohexadienyl und 2,5-Cyclohexadienyl) und Cyclohexylreste. Als Beispiele geeigneter fünfgliedriger Heterocyclen sind Thienylreste (2-Thienyl oder J-Thienyl) und Furylreste (2-Furyl oder 2-Furyl) zu nennen. Alle diese Kohlenwasserstoffreste und Heterocyclen können einen oder mehrere Substituenten an Ring enthalten. Beispielsweise kommen die folgenden Substituenten in Frage: Hydroxylgruppen, Ik-.logenatonie (z.B. Brom und Chlor), Alkylreste (z.B. Methyl, A'thyl, Isopropyl, Allyl und

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Octyl), Alkoxyreste (z.B. Methoxy, Ä'thoxy, Isopropoxy, Al IyI-oxy und Hexoxy), Carboxylgruppen, Mercaptogruppen, Cyangruppen, Nitrogruppen, Sulfogruppen, Aminogruppen, SuIfaminogruppen und Carboxyalkylreste (z.B. Carboxymethyl und Carboxyäthyl) In der Formel (1) steht R¹ für ein Wasserstoffatom oder einen organischen Rest, dessen angedeutete Bindung sich zwischen dem Hethylenkohlenstoffatom in der 3-Stellung und einem Sauerstoffatom, Schwefelatom oder Stickstoffatom, die den organischen Rest bilden, befindet. Als Beispiele organischer Reste sind zu nennen: Alkoxyreste (z.B. Methoxy, Ätho.xy, Isopropoxy, Allyloxy und Hexoxy), Alkoxycarbonylgruppen (z.B. Methoxycarbonyl, Ä'thoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl und Hexoxycarbonyl), Pyridylreste (2-Pyridyl und jJ-Pyridyl), Pyridiniogruppen (z.B. J

rid-2-yl, Methylthjocarboxy, Dimefhyldithiocarbamyl, Trimethylamino, Azido und Benzyloxycarbonylamino.

In der Formel (II) steht R für einen der obengenannten Kohlenwasserstoffreste oder Heterocyclen. Beispiele geeigneter asubstituierter α-Aminosäuren (II) sind Phenylglycin, Cyclohexadienylglycin, Cyclohexenylglycin, Cyclohexylglycin, 2-Thienylglycin, 2-Furylglycin, p-Hydroxyphenylglycin, p-Mercaptophenylglycin, p-Carboxyphenylglycin, p-Sulfophenylglycin, p-Aminophenylglycin, m-Aminopheny!glycin, p-llitrophenylglycin, p-Chlorphenylglycin, o-Chlorpheny!glycin, p-Brornphenylglycin, p-Methylphenylglycin, p-Äthylphenylglycin, p-Metnoxyphenylglycin, p-Cyanphenylglycin, m-Cyanophenylglycin und p-Sulfaminophenylglycin. Die α-substituierten α-Aminosäuren (II) mit 2 oder mehr gleichen oder verschiedenen Substituenten an ihren Ringen sind ebenfalls geeignet. Als Substituenten an den Ringen kommen in diesem Fall beliebige Kombinationen der vorstehend genannten verschiedenen oiibst j tuenten in Frage. Unter diesen α-substituierten a-Aminosauren (II) befinden sich einjge neue Verbindungen, jedoch können sie leicht bei spielsweir.e durch die Strecker-Reaktion aus Aldehyden, die die entsprc-

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eilenden Reste R enthalten,· hergestellt werden.

Als reaktionsfähige Derivate dieser α-substituierten a-Arninosäuren (il) eignen sich beliebige an ihrer Carboxylkomponente substituierte Derivate, die die α-substituierten α-Aminosäuren (II) ergeben, wenn sie in einem wäßrigen Medium durch die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorgar·.Ismen hydrolysiert werden. A]s typische Beispiele der reaktionsfähigen Derivate sind zu nennen: Allylester (z.B. Methylester, A'thylester, Isopropylester und Octy!ester), Aralkylester (z.B. Benzylester und Phenyläthylester), Thioester (z.B. Thioglykolester), Amide und Dipeptide dieser α-substituierten Aminosäuren mit einer anderen Aminosäure (z.B. N-(Phenylglycyl)-glycin). Die α-substituierte α-Aminosäure (II) und ihre reaktionsfähigen Derivate werden nachstehend mit dem Sammelbegriff "α-substituierte α-Aminosäureverbindungen" bezeichnet.

Die α-substituierten α-Aminosäureverbindungen können als optische Isomere vorliegen. Vom Standpunkt der antibakteriellen Wirksamkeit der hergestellten Cephalosporine (i) ist es zweckmäßig, die D-Formen oder DL-Formen bezüglich des a-Kohlenstoffatoms dieser Verbindungen zu verwenden.

Die α-substituierten α-Aminosäureverbindnngen können als freie Säuren oder als Salze, z.B. als Hydrocblorid, Jtfatriumsalz oder Kaliumsalz, verwendet werden»

In der Formel (III) ist R' ein Wasserstoffatom oder einer der oben genannten organischen Reste. Als typische Beispiele von 7-Aminocephemverbindungen .(III) sind zu nennen! 7-Aminocephalosporansäure, 7-Araino-;5-äeacetoxycephaloöporanoäure, 7-Amino-3-niethoxymethyl-3-cephem-4-carbon~ säure, 7-Amino-3-(1-oxidopyrid-2-yl-thiomethyl)-;5-cepb.em-4-carbonsäure, N-(7-Amino~3-cephem-3-ylmethyl)pyridineum-4-carboxylat, lT--(7-Arnino-3-oephcm-3-ylmethyl)-4-carbo>:-

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amidopyridinium-4-carboxylat, 7-Amino-3-methylthiocarboxymethyl-5-cephera-4-carbon3äure, 7-Amino-3-trimethylarriinüraethyl-3-cephem-4-carbon3äure, 7-Amino-3-dimetbyldithi o~ carbamylmethyl-3-cephern-4--carbonsäure, 7-Araino-3-azidomethyl-3-cephem-4-carbonsäure und 7-Araino-3-benzyloxycarbonylaminomethyl-3-cephem-4-carbonsäure. Diese 7-Aninocephemverbindungen sind bekannt und können nach bekannton Verfahren hergestellt werden, z.B. nach den Verfahren, die in "Advances in Applied Microbiology" V3_ (1970), Seite bis 236, herausgegeben von Academic Press, Inc., New York und London, beschrieben werden. Alle diese 7-Arninocephemverbinduneen (III) können in Form der freien Säure oder als Salz, z.B. als Hydrochlorid, Natrium- oder Kaliurasalz, verwendet werden.

Beim Verfahren gemäß der Erfind.ung werden Mikroorganismen verwendet, die zu den Gattungen Mycoplana, Protaminobacter, Acetobacter, Xanthomonas, Pseudoraonas, Aeromonas, Escherichia, Staphylococcus, Arthrobacter, Proteus, Cprynebacterium, Flavobacterium, Clostridium,- Spirillum oder Bacillus gehören und ein Cephalosporin der Formel (I) aus einer α-substituierten α-Aminosäureverbindung und einer 7-Aminocephemverbindung (III) zu bilden vermögen. Diese Mikroorganismen können aus den bekannten Kulturen ausgewählt werden, die bei den Hinterlegungsstellen für Mikroorganismen vorrätig sind. Sie können ferner aus der Natur, z.B. aus dem Boden, Abwasser, aus dem Meer, Flüssen, Früchten und aus der Atmosphäre isoliert werden.

Die Auswahl der Mikroorganismen, die das Cephalosporin (I) zu bilden vermögen, kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden: Man suspendiert jeden zu untersuchenden Mikroorganirjmus in einer wässrigen lösung (p„ 6,0), die pro Milliliter 10 mg D-Phenylglycinrnethylester und 5 mg 7-Amino-3-deacetoxycephalosporansäure enthält, bebrütot die Suspension 30 Minuten bei 37°C unter Schütteln und prüft die angehäufte 7-(a-Arn.lno-D-phenylacetarnidc)-

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3-deacetoxyeephalo3poransäure im Reaktionsgernisch durch Bioautographie und den nachstehend beschriebenen Biotest. Von den auf diese V/eise ausgewählten Mikroorganismen werden am vorteilhaftesten solche verwendet, die 7-(a-Amino-D-phenylacetamido)-3-deacetoxycephalosporansäure in einer Menge von wenigstens 1 mg/ml im Reaktionsgemisch bei dem beschriebenen Auswahlverfahren bilden.

Wenn ein in der oben beschriebenen Weise ausgewählter Mikroorganismus unerwünschte Enzyme, z.B. ß-Lactamase II (Cephalosporinase) oder Esterasen, bildet, die auf die gewünschten Cephalosporine (I) einwirken und sie umwandeln, können Mutanten, die diese unerwünschten Enzyme nicht bilden, gewonnen werden, indem der Mikroorganismus einer Mutation nach üblichen Verfahren, z.B. durch Einwirkung von Röntgenstrahlen oder UltravJLolettlicht oder durch Behandlung mit Stickstofflost, unterworfen werden.

Alle Mutanten, die von den in der beschriebenen Weise ausgewählten Mikroorganismen nach üblichen Methoden gewonnen werden und eine erhöhte Aktivität zur Bildung von Cephalosporinen haben, können natürlich vorteilhaft beim Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden.

Nachstehend sind Beispiele bekannter Kulturen genannt, die beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan, hinterlegt und für das Verfahren gemäß der Erfindung geeignet sind (die IFO-Mummern bedeuten die Hinterlegungsnummern der Mikroorganismen bei diesem Institut): Acetobacter acetosus IFO-3296, Acetobacter albidus IFO-3251, Acetobacter aurantium IFO-3245, IFO-3249, Acetobacter cerinus IFO-3262, Acetobacter industries IFO-3260, Acetobacter dioxyacetonicua IFO-3272, Acetobacter gluconicus IFO-3171, Acetobacter liquefaciens IFO-12388, Acetobacter melanegenus IFO-3293, Acetobaoter oxydans IFO-3189, Acetobacter pasteurianus IFO-3223, Acetobacter suboxydssns IFO-3130, Acetobacter turbidans IFO-3225, Acetobacter xylinum IFO-3IM, 1VO-J5P88, Xanthomonas citri

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3ÖP9, Xantlioiiionns pruni IFO-TfBo, Xanthomonan oryziio 1F.0-3995, IPO-3827, IFO-382Ö, IFO-3510, Pseudpmonas aeruginosa 1FO-3454» Pseudomonas maltophila IFO-12690, Poeudomonas raelanogenum IFO-12020, Pseudomonaa vendrelli IFO-3899, Aeroinonaa hydrophila IFO-3820, Arthrobacter simplex IFO-12069, Arthrobacter cocydann IFO-12138, Proteusrnirabilis IFO-3849, Proteus morganii IFO-3848, Corynebacteriura tritici IFO-12164, Flavobacterium capsulatum IFO-12533, Clostridium butyricura IFO-3847» Clostridium acetobutyricum IFO-3346, Staphylococcus aureus IFO-3O6O, Spirillum metamorphum IFO-12012, Bacillus subtilis IFO-3035, Bacillus sphaericus IFO-3526, Bacillus firmus IFO-3330, Bacillus purailus IFO-12090, Escherichia coli IFO-3543 und Escherichia coli var, cornmunior IFO-3550.

Als Beispiele von Stämmen, die aus der Natur isoliert worden sind, sind Myooplana dimorpha IFO-13213_f IFO-13240, Mycoplana bullata IFO-15267, Protarainobacter alborflavus IFO-13221 und Acetobacter sp. IFO-13209 zu nennen.

Mikroorganismen, die ein Cephalosporin (I) aus einer α-substituierten α-Aminosäureverbindung und einer 7-Arainocephemverbindung (III) zu bilden vermögen, sind unter den oben genannten fünfzehn Gattungen zu finden» Mikroorganismen, mit denen gute Ergebnisse erhalten werden, kommen insbesondere sehr häufig unter den Gattungen Mycoplana, Protaminobacter, Acetobacter, Xanthomonas, Pseudomonas und Aerorr.onas vor. Diese sechs Gattungen gehören zur Familie Pseudomonadaceae. Gute Ergebnisse werden auch mit der Gattung Escherichia erzielt.

Um eine α-substituierte a-Aminosäureverbindung und eine 7-Aminocephemverbindung der enzymatischen V/irkung eines Mikroorganismus zu unterwerfen, der Cephalosporine zu bilden vermag, kann dieser Mikroorganismus in einem Nähr- · medium kultiviert werden, das 1) eine α-substituierte a-Aminosäureverbindung und 2) eine 7-Aminocephemverbindung enthält, jedoch ist es im allgemeinen zweckmäßig, ~iesen Mikroorganismus vorher .in einem gewöhnlichen Röhr-

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medium zu kultivieren und das erhaltene Fermentationsmedium oder sein verarbeitetes Material zu verwenden.

Die Kultivierung der Mikroorganismen kann unter Belüftung und Bewegung, unter Schütteln oder ohne Bewegung durchgeführt werden. Im allgemeinen ist die Kultivierung unter aeroben Bedingungen vorteilhafte

Geeignet sind Nährmedien, die Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Caseinhydrolysate, Maisquellwasser allein oder in Kombination und andere natürliche Substanzen enthalten, die im allgemeinen für die Kultivierung verwendet werden. Diese Medien können v/ahlweise durch Kohlenstoffquellen, z.B. Zucker, organische Säuren, η-Paraffine, anorganische oder organische Stickstoffverbindungen, die Aminostickstoff und/oder Nitratstickstoff enthalten, Phosphate, Mangansalze, Natriumchlorid, andere ionische Metalle und/ oder Vitamine ergänzt werden. Diese Medien werden vorzugsweise auf einen Pp-Wert von 6 bis 8 eingestellt. Vorteilhaft sind Kultivierungsfcemperaturen von 20° bis 40⁰C-, insbesondere von 28 bis 37 C. Die Kultivierungszeit variiert mit der Fermentationsvorrichtung, der Zusammensetzung des Nährmediums, der Kultivierungstemperatur u« dgl., jedoch ist es zweckmäßig, die Kultivierung zwischen der spaten Stufe der logarithmischen V/ach^s turns phase und der frühen Stufe der stationären Phase zu dem Zeitpunkt abzubrechen, zu dem die Aktivität zur Bildung der Cephalosporine das Maximum erreicht» Im allgemeinen werden mit einer Kultivierungsdauer von 8 bis 30 Stunden gute Ergebnisse erhalten.

Die in dieser V/eise erhaltenen Ferrnentationsmedian oder ihre verarbeiteten Materialien eignen sich für die enzymatische Synthese der Cephalosporine (i) beim Verfahren gemäß der Erfindung. Der hier gebrauchte Ausdruck "verarbeitete Materialien der Fermentationsrnedien" bezeichnet alle Materialien, die erhalten werden, wenn die Fermenfcationsmedien einer oder mehreren geeigneten

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Behandlungen unterworfen werden, durch die die Aktivität für die Bildung von Cephaloaporinen gesteigert und die Fermentationsmedien in eine für die enzymatisch^ Reaktion vorteilhafte Form überführt werden. V/enn beispielsweise die Aktivität zur Synthetisierung der Cephalosporine intrazellulär vorliegt, sind beispielsweise die folgenden verarbeiteten Materialien geeignet: Die vom Fermentationsmedium abgetrennten Zellen, der zellenfreie Extrakt, der durch Behandlung der Zellen nach einem bekannten Verfahren erhältlich ist, ein teilweise oder vollständig gereinigtes Enzympräparat, das die Cephalosporine zu bilden vermag und durch eine in bekannter Weise durchgeführte Reinigung des zellenfreien Extrakts erhältlich ist, und das durch Kombination des teilweise oder vollständig gereinigten Enzyms zu einer wasserunlöslichen, hochmulekularen Substanz auf physikalischem oder chemischem Wege erhaltene Material, das die Cephalosporine zu bilden vermag. Wenn die Aktivität zur Synthetisierung der Cephalosporine extrazellulär vorliegt, kommen als verarbeitete Materialien beispielsweise die überstehende Flüssigkeit, die durch Entfernung der Zellen vom Ferinentationsmediura erhältlich ist, das teilweise oder vollständig gereinigte Enzym, das die Aktivität zur Synthetisierung der Cephalosporine besitzt und durch Behandlung der überstehenden Flüssigkeit nach einem bekannten Enzymreinigungsverfahren erhältlich ist, und das die Aktivität zur Synthetisierung von Cephaloaporinen aufweisende Material, das durch Kombination des teilweise oder vollständig gereinigten Enzyms zu einer wasserunlöslichen hochmolekularen Substanz auf physikalischem oder chemischem V/ege erhältlich ist, in Frage.

Die Kondensationsreaktion zwischen der α-substituierten α-Aminosäureverbindun.f' und der 7-Aminocephemverb.indung zur Bildung eines entsprechenden Cephalosporins (I) verläuft glatt durch Zusammenführen dieser beiden Verbin-

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düngen mit dem oben genannten Ferrnentationsmedium oder seinem verarbeiteten Material in einem wässrigen Medium. Unter dem hier gebrauchten Ausdruck "wässriges Medium" ist ein "hauptsächlich aus V/asser bestehendes Medium" zu verstehen. Das wässrige Medium kann somit ein mit Wasser mischbares -organisches Lösungsmittel, z»B. einen niederen Alkohol, beispielsweise Methanol, Äthanol oder Isoprorjanol, oder Aceton enthalten. Die Konzentration dieses organischen Lösungsmittels beträgt vorzugsweise weniger als etwa 4-0 Vol.-^, insbesondere weniger als etwa 20 Vol.-?o, bezogen auf das Gesamtvolumen des endgültigen Mediums_o Es ist im allgemeinen zweckmäßig, das wässrige Medium auf einen p-.-Wert von etwa 4 bis 8, vorzugsweise etwa 5 bis einzustellen. Die Reaktionszeit ist verschieden in Abhängigkeit von der Substratkonzentration, dem Grad der Aktivität des Fermentationsmediu.v· oder des verwendeten verarbeiteten Materials zur Synthetisierung der Cephalosporine, der Reaktionstemperatur usw., jedoch liegt sie im allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis 300 Minuten« Die Reaktionstemperatur liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 5 bis 50 C. Besonders bevorzugt wird eine Temperatur von etwa 20° bis 40^cC„ Die Substratkonzentration wird hauptsächlich in Abhängigkeit vom Grad der Aktivität für die Synthetisierung der Cephalosporine gewählt. Im allgemeinen liegt die Konzentration der 7-Aminocephemverbindung (III) im Bereich von etwa 0,1 bis 10$ (Gew./Vol.), bezogen auf das gesamte wässrige Medium, während die Konzentration der α-substituierten oc-Aminosäureverbindung aus einem Bereich von etwa 0,1 bis 20$ (Gew./Vol.) gewählt wird. Vorteilhaft wird die α-substituierte a-Aminosäureverbindung in einer wenigstens äquimolaren Konzentration von zweckmäßig.nicht weniger als 2 Mol, bezogen auf die verwendete 7-Aminocephemverbindunß, verwendet.

Wenn ein wasserunlösliches verarbeitetes Material des Fermentationsmediums verwendet wird, kann die Reaktion

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in Suspension durchgeführt werden, oder man kann eine wässrige Lösung, die die α-substituierte a-Aminosäureverbinöun£ und die 7-Aininocephemverbindung (III) enthält, durch eine Kolonne führen, die mit dem in V/asser unlöslichen Material, das die Aktivität zur Synthetisierung der Cephalosporine aufweist, gefüllt ist.

Bei der vorstehend beschriebenen enzymatischen Reaktion wird das Cephalosporin (I) im Reaktionsgemisch gebildet. Wenn die α-substituierte a-Aminosäureverbindung in der DL-Form verwendet wird, ist im allgemeinen die Neigung festzustellen, daß die D-Form der α-substituierten α-Aminosäureverbindung überwiegend in das Cephalosporin (I) eingeführt wird. Die Bezeichnung der Cephalosporine" (I) als D- oder L-Cephalosporin bedeutet die D-Form bzw. L-Forrn in Be^ug auf das a-Kohlenstoffatom in der Seitenkette an der 7-Stellung dieser Verbindungen (I).

Das in der beschriebenen Weise gebildete Cephalosporin (I) läßt sich nach bekannten Verfahren aus dem Reaktionsgemisch isolieren und unter milden Bedingungen reinigen, z.B. durch Chromatographie oder mit Hilfe einer organischen Säure, die ein wasserunlösliches Salz mit dem Cephalosporin (I) zu bilden vermag. Unter den in der beschriebenen Weise hergestellten Cephalosporinen (i) befinden sich einige neue Verbindungen. Hierbei handelt es sich um die Cephalosporine, in deren Formel (i) der Rest R ein Cyclohexenylrest (1-Cyclohexenyl, 2-Cyclohexenyl oder 3-Cyclohexenyl) ist, z.B. 7-(a-Amino-1'-cyclohexenylacetamido)-3-deacetoxy-cephalosporansäure, 7-(a-Amino~ 1'-cyclohexenyl-acetamido)-cephalosporansäure und 7-(a~ Amino-1 '-cyclohexenylacetamido)-3-methoxyrnethyl-3-cephem-4-carbonsäure. Diese neuen Cephalosporine zeichnen sich durch ihre ausgezeichnete antibakterielle Wirkung sowie ihre Stabilität aus.

Die Cephalosporine (i) haben eine starke antibakterielle V/irkung gegen grarnpositive Bakterien und gramnegative

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Bakterien. Sic werden bei oraler Verabreichung leicht vom Dünndarm resorbiert. Sie durchdringen bei parenteraler Verabreichung schnell die Gewebe und haben eine gute Affinität zu den Geweben. Die Cephalosporine (i) sind daher wertvolle antibakterielle Mittel.

Die Cephalosporine (I) sowie, ihre pharmazeutisch unbedenklichen Säureadditionssalze (z₀B. die Natrium- und Kaliumsalze) sowie ihre Hydrate können oral oder parenteral als solche oder in geeigneten Formen, z.B„ als Pulver, Granulat, Tabletten oder Injektionslösungen in Mischung mit pharmazeutisch unbedenklichen Trägern, Verdünnungsmitteln oder Adjuvantien verabreicht werden. Sie sind wirksam gegen fast die gleichen Krankheiten, die durch a-Aminobenzylpenicillin geheilt werden können, sowie gegen Krankheiten, die durch Escberichia coli o.dgl. verursacht werden.

Die zu verabreichende Dosis der Verbindungen (I) ist verschieden in Abhängigkeit von der Art der Verbindung,, der Schwere der Krankheit usw., jedoch liegt, sie im allgemeinen im Bereich von 5 bis 500 mg, vorzugsweise 10 bis 200 mg/kg/Tag ο

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen beschrieben. Unter der Überschrift "Versuche" werden die typischen Verfahren zur Herstellung des I-Cyclohexenylglycinmethylesters, einer neuen Verbindung, die als eine der in den Beispielen verwendeten α-substituierten a-Aminosäureverbindungen verwendet wird, beschrieben.

In den Beispielen beziehen sich die Prozensätze auf Gewicht/Volumen, d.h. sie bedeuten g/dl, falls nicht anders angegeben.

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In. allen Beispielen wurden die Aufnahme des Bioautogranms sowie der Biotest der hergestellten Cephalosporine nach der für Cephalosporine üblichen l'iethode unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 durchgeführt, wie in "Journal of Bacteriology" 50, 701-709(1945) beschrieben. Der Enzymtest der hergestellten Cephalosporine wurde durchgeführt, indem das Reaktionsgemisch, das das gewünschte Cephalosporin enthielt, der Einwirkung der durch Aerobacter cloaceae gebildeten ß-Lactamase ausgesetzt (dieses Enzym spaltet das Lactam von Cephaloyporinen (i), vermag jedoch nicht das Lactam der eingesetzten 7-Aminocephemverbindungen zu spalten) und der Unterschied zwischen den Extinktionswerten bei 260 mu vor und nach der Enzymbehandlung bestimmt wurde.

Die bei den in den Beispielen, beschriebenen Versuchen verwendeten Medien I bis IV hatten die folgende Zusammensetzung;

Medium I;

Nährmedium "Bacto-Nutrient Broth",
dehydratisiert (im Handel erhältlich, Hersteller Difco Laboratories, USA)

Glucose NaCl

Medium II:

	7,	O	ο,	8$
		1,	0$
		ο,	5$
Pk

Mononatriumglutamat 0,5$

Phenylessigsäure 0,3^

Harnstoff 0,2$

Kaliumdihydrogenphosphat 0,05$

Dikaliumhydrogenpihosphat 0,05$

MgSO₄ ο7H₂O 0,1$

P_H 7,3

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Medium IXIf

Mononatriumglutarnat " 0,2/

Hefeextrakt 0,2/

Pepton 0,5$

Dikaliumhydrogenphoaphat 0,2/

Magnesiumchlorid 0,1/

Saccharose 2,0/

P_H 7,2

Medium IV;

Fleischextrakt 1,0/

Pepton 1,0/

NaGl 0,5/

P_H 7,0

Versuche

Herstellung von DL-1-Cyclohexenylglycin

Eine Lösung von 4,4 g 1-Cyclohexen-i-aläehyä in 8 g Methanol wird zu einer Lösung von 2 g Natriumcyanid und 2,j56 g Ammoniumchlorid in 8 ml V/asser gegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf 20 ml V/asser zugesetzt werden. Die erhaltene AminonitrilverMnäung wird mit 20 ml Benzol extrahiert. Die Bensolscbicht v/ird dreimal mit je 10 ml 6n-Salzsäure extrahiert. Die wässrige Schicht v/ird 2 Stunden am Rückfluß erhitzt. Das harzartige Material wird mit Aktivkohle entfernt. Das Filtrat wird auf etwa 15 ml eingeengt und mit konzentriertem wässrigem Ammoniak (28/ig) auf einen p-j-Wert von etwa 5,0 eingestellt, wobei sich rohe Kristalle von DL-1-Cyclohexenylglycin abscheiden. Die Kristalle werden abfiltriert und in einer wässrigen In-Katriurnhydroxydlösung gelöst. Zur Lösung wird Aktivkohle gegeben. Das Gemisch wird filtriert. Dem Filtrat wird Äthanol in einer dem halben Volumen des Filtrats entsprechenden Menge zugesetzt. Das Gemisch wird gekocht und mit Salzsäure auf einen p„~Wert von etwa 5,0 ^inpestellt, wobei 1,1 g DL-1-Cyclohexenyl-

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ßlycjn in Perm von farblosen Flocken vom Schmelzpunkt 242 bis 243°C erhalten werden.

Infrarotspektrum (KBr, era"¹): 31GO, 2960, 1605, 1490, l'tOO, 1345, 1274, 1145, 720.

NMR (Lösungsmittel: In-KaOD):

1,5 - 2,4 (Multiplett, 8H)

3,81 (Singlett, 1H, -CH - COOH) 5,84 (Multiplett, 1H, -CH = C-)

Herstellung von DL-I-Cyclohexenylflycinmethylester:

10 g DL-I-Cyclohexenylglycin werden in 100 ml Methanol suspendiert. Während die erhaltene Suspension auf etwa -15⁰C gekühlt wird, werden 80g Thionylchlorid zugetropft * Nach erfolgtem Zusatz v.'ird das Geraisch 3 Tage bei 4⁰C stehen gelassen. Es wird dann unter vermindertem Druck eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird aus 20 ml eines Gemisches von Methanol und Diäthyläther (Volumenverhältnis 1:1) kristallisiert, wobei etwa 10 g DL-1-Cyclohexenyl- £lycinmethyle3ter erhalten werden.

NKR (in D₉O), ii(mmp): 1,7^B (4 Protonen an den C-4- und C-5-Kohlenstoffatomen des Ringes), 2,05 (4 Protonen an den C-2- und C-6-Kohlenstoffatomen des Ringes), 3,92 (3 Protonen dee Methylrestea), 4,64 (1 Proton am oc-Kohlenstoffatom), 6,21 (1 Proton am olefinischen Kohlenstoffatom des Ringes).

S = Singlett; B = breit

Herstellung von D-1-Cyclohexenylnlyclnmothylgster

Zu einer mit 2n-Iiatriumhydroxyä auf p„ 7,2 eingestellten

ß von 10 £ DL-I-Cyclohexenylglycinmathylesterhycirochlorid in 1000 ml \7aa:;er wird 1 g handclsüblicheu Chymotrypsin ("a-Chymotrypsin", Hersteller Sigma Chemical Company, Missouri, USA; Chymotrypoin-Aktivität 50 Einheiten/mg) gegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden be'i 23°C bebrütet, v/oboi der p„~Wert durcli Zuuatz von 1 n-N

2098Λ2/1223

hydroxid bei 7,2 gehalten wird,,

Nach Einstellung auf ρ,, 8,0 durch Zusatz von 5n-Natriumhydroxyd wird das Reaktionsgemisch fünfmal mit je 1300 ml Diäthyläther extrahiert. Die erhaltene Diäthylätherschicht wird bei 25 G unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei ein brauner öliger Rückstand erhalten wird. Zu diesem Rückstand werden 100 ml Methanol, das mit HCl gesättigt ist, gegeben. Da« Geaiisöh wirfl enter vermindertem Druck eingeengt. Dem erhaltenen Rückstand werden 30 ml Diäthyläther zugetropft_o Das Gemisch wird eingeengt, wobei 3,5 ml D-1-0yclohexenylgl3^rcinmethylester erhalten werden. Dieser Ester hat eine spezifische Drehung von /ä_7^⁵= -115° (0=0,5, 0,In-HCl). Sein kernmagnetischea Resonanzspektrum ist identisch mit dem des DL-1 -CyclohexenylglycinmethylesLters«

Beispiel 1

Dreitage -Schrägkulturen der in Tabelle 1 genannten Mikroorganismen wurden in 3 Kolben geimpft, die je 30 ml des Mediums I enthielten, und 20 Stunden unter Schütteln bei 2O⁰C kultiviert« Wach dieser Zeit wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Zellen wurden mit 30 ml einer 0,05-molaren Phosphatpufferlösung von p_H 6,0 gewaschen und in 3 ml dieser Pufferlösung suspendiert« Zu jeder Suspension wurden 3 ml einer wässrigen 0,In-K₂HPO,-LÖsung gegeben, die 4$ Phenylglycinraethylester (1) und 2⁽/o 7-Aminocephalosporansäure (a) oder 7-Amino-3-deacetoxycephalosporansäure (b) oder 7-Araino-3-methoxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure (c) enthielt und mit 2n-HCl auf p™ 6,0 eingestellt war. Jedes Gemisch wurde 40 Minuten unter Schütteln bei 37°C bebrütet. Das in jedem Reaktionsgewisch angehäufte Cephalosporin wurde durch Bioautographie identifiziert und durch den Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tubelle 1 genannt=

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Tabelle 1

Mikroorganismus

Menge des angehäuften
Cephalosporins, m

A B

Mycopl-na
Mycoplana ]i
Prqtaininobacter alhoflavur;
Acetobacter acj?tg3us Acetobacter alMdus
Acetobacter aurantium Acetobacter aurantiuy Acetobacter cerinus Acetobacter industrius Aceftpbacter dipxyacetopj.cus ^lycpnicua

Acetobacter liquefaciens

Acetobacter melano/^enus Acetobacter oyydatis

Acotobacter pas Acetobacter suboxydans Acetobacter turbidans Acetobacter xylinum Acetobacter xylinum Xanthomonas citri

Xanthomonas pruni

Xanthoinonac oryjiae

Pseudoniqnas Pfjeudomonas
Psoudomonas

aeru^inosa
maltpphila

IFO-13215

IFO-13267

IFC-13221

ΙίΌ-3296

IPO-3251

IPO-3245

IFO-3249

IFO-3262

IPO-3260

IPO-3272

IPO-3171

IFO-I2388

IFO-3293

IFO-3189

IFO-3223

IFO-3130

IFO-3225

IFO-3144

IFO-3288

IFO-3835 IP0-3780 IFO-3995 ΙίΌ-3454 IFO-I2690 IFO-L 2020

2.1	1.8
0,6	0.1
6.5	2.3
1.3	0.1
0.4	0.4
6.8	0.8
7.4	1.2
0.9	0.4
0.5	0.4
0.6	0.4
0.3	0.2
0.5	0.2
2.2	1.1
1.0	1.1
8.2	4.1
1.8	1.0
6.5	5.2
8.2	4.5
8.0	4.0
6.8	2.9
4.8	2.5
8.0	8.2
0. 2	0.4
2,0	1.0
3.1	0.4

1.5 0.2 3.6 1.1 0.1 3.5 2.5 0.3 0.2 0.2 0.1

0.4 0.8 0.5 4.0 0.5 4.8 2.8 4.0 2.2 2.4 3.0 0.5 1.2 1.0

209842/1223

Pseudomonas vendrelli

- 1	9 —	0,	2	221	6	1	1	3
IFO	•-'3899	0,	1	0,4			0	,3
IFO	-3820		0,1			0	,1

Aei'omonas hydropbila

A = 7-(a-Aminophenylacetamido)cephalosporansäure, gebildet aus (1) und (a)»

B = 7-(a-Aniinophenylacetamido)-3-deaeetoxycepbalosporansäure, gebildet aus (1) und (b).

0 = 7-(a-Afcinophenylacetamido)-3-raethox;yraethyl~3-cephera-4-carbonsäure, gebildet aus (1) und (c).

Beispiel 2

Eine Impfnadelmenge der Dreitage-Sehrägkulturen der in Tabelle 2 genannten Mikroorganismen wurde in 20 ml des in Tabelle 2 genannten Mediums geimpft und 1 Tag unter Schütteln bei 28⁰C kultiviert. Die erhaltenen Kulturen wurden in je 500 ml der gleichen Medien geimpft und 20 Stunden unter Schütteln bei 28⁰C bebrütet. Nach dieser Zeit wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 500 ml einer 0,05-raolaren Phosphatpufferlösung von Pu 6,0 gewaschen und in 50 ral der Pufferlösung suspendiert« Zu jeder Suspension wurden 50 ml einer wässrigen 0,In-K₂HPO.-Lösung gegeben, die 4$ Phenylglycinmetbylester (1) und 2$£ 7-Aminocephalosporansäure (a) enthielt und mit 2n-HCl auf p« 6 eingestellt worden war. Jedes Gemisch wurde 30 Minuten bei 37°C unter Schütteln bebrütet, Die in jedem Reaktionsgemisch angehäufte 7-(a-Aminophenylacetamido)cephalosporansäure (A) wurde durch Bioautographie identifisiert und durch den Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 2 genannt-

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Tabelle 2

Mikroorganismus Medium für Angehäufte

die Kultivie- Menge von rung des Mikro- (Λ), mg/ml

orpanismus

Xanthomonas oryzae IFO-3995 Medium I 8,8 Escherichia coli IFO-3543 Medium II 3,5 Escherichia coli var.

communior IFO-3550 Medium III 4,3 Staphylococcus aureus

IFO-3060 Medium I 1,5

Beispiel 3

Eine Impfnadelmenge einer Dreitage-Schrägkultur von Acetobacter pasteurianus IFO-3223 wurde in 20 ml des Mediums I geimpft und 1 Tag bei 28°C unter Schütteln bebrütet. Die erhaltene Kultur wurde in 500 ml des Mediums I geimpft und 20 Stunden bei 28⁰C unter Schütteln kultiviert« Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt und mit 500 ml einer 0,05-molaren Phosphatpufferlösung von p_fi 6,0 gewaschen. Die gev/aschenen Zellen wurden in 50 ml der Pufferlösung s spendiert. Zur Suspension wurden 50 ml einer wässrigen 0,1 n-K^HPO,-Lösung gegeben, die A'/° Phenylglycinäthylester (2) und 2$ T-Ainino^-deacetoxycephalosporansäure (b) enthielt und mit 2n-HCT auf ρ_Η 6,0 eingestellt war. Das Gemisch wurde 30 Minuten unter Schütteln bei 37⁰C bebrütet.

Die Identifizierung durch Bioautographie und die Bestimmung durch den Biotest ergab, daß 6,8 mg 7-(a-Aminophenylacetamido)-3-deacetoxycephalosporansäure (B) pro ml im Reaktionsgemisch angehäuft worden war,

Beispiel 4

Eine Impi'nadelnenge der Dreitage-Schrägkulturen von Acetobacter turbidans IFO-3225 und Acetobacter aurantium IFO-3245 wurde in 20 ml des Mediums I geimpft und 1 Tag bei 28°C unter Schütteln kultiviert. Die Kulturen wurden

209842/1223

in. 500 ml des Mediums I geimpft und 20 Stunden bei 20 C unter Schütteln "bebrütet» Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt und mit 500 ml einer 0,05-molaren Phosphatpufferlösun» von p_H 6,0 gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in 50 ml dieser Pufferlösung suspendierte Zu den Suspensionen wurden je 50 ml einer wässrigen 0,1p-KpHPO,-Lösung gegeben, die 4$ des in Tabelle 3 genannten Phenylglyeinalkylesters und 2$ 7-Amino-3-methoxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure enthielt und mit 2n~HCl auf p™ 6,0

ö eingestellt war. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37 C unter Schütteln bebrütet. Die in den Reaktionsgemischen angehäufte 7-(a-Aminophenylacetamido)-3-methoxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure (C) wurde durch Bioautographie identifiziert und durch den Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 3 genannt.

Tabelle 3

Mikroorganismus Phenylglycin- Angehäufte

alkylester Menge von . (0), mg/ml

Acetobacter turbidans ΙΙΌ-3225 Methylester 5,8 Acetobacter aurantium ΙΙΌ-3245 Äthylester 4,8

Beispiel 5

Dreitage-Schrägkulturen der in Tabelle 4^genannten Mikroorganismen wurden in 3 Kolben geimpft, die je 30 ml des Mediums I enthielten, und 20 Stunden "bei 28⁰G unter Schütteln bebrütet» Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 30 ml einer 0,05-molaren Phosphatpufferlösung von Prr 6,0 gewaschen und in 3 ml dieser Pufferlösung suspendiert» Zu den Suspensionen wurden je 3 ml einer wässrigen Ό,In-KpHPO.-Lösung gegeben, die 4$ 4-Hydroxyphenylglycinmetbylester (3) und 2^cß> 7-Aminocephalosporansäure (a) oder 7-Amino-3-de·acetoxycephalosporansäure (b) oder 7-Amino-3-metho:xymethyl-3~cephem-4-carbonsäure (c) enthielt und mit 2n-HCl auf p_H 6,0 eingestellt war. Jedes Gemisch wurde 30 Minuten bei 37 C unter

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Schütteln bebrütet. Das in jedem Reaktionogemiseh angehäufte Cephalosporin wurde durch Bioautographie identifiziert und durch den Biotest bestimmt. Die .Bri:ebnisse sind nachstehend in Tabelle 4 genannt.

Tabelle 4	Mikroorganismus	Angehäuftes mg/ul	Ceph	alosporiri,
	D	E	F
Acetobaeter pasteurianus lFO-3223	0,8	0,5	0,6
Acetobaeter turbiöans IFO-3225	0,7	0,7	0,6
Xanthoinonas citri lFO-3835	1,2	1,4	1,0
Mycoplana dimorpha
IFO-13240	0,9	0,5	0,8
Pseudomonas maltophila IFO-12690	0,7	0,4	0,6

D ₌ 7-/a-Amino~a-(4--hydrcxyphenyl)acetamid£7cephalo3poransäure, gebildet aus (3) und (a).

E = 7-/ö^-Araino-a-(4-hydroxyphenyl)acetamido7-3-deacetoxycephalosporansäure, gebildet aus (3) und (b).

F = 7-/a-Arnino-a-(4-hydroxyphenyl)acetamid£7-3-niethoxyraethyl-3-cpphem~4-carbonsäure, gebildet aus (3) und (c).

Beispiel 6

Dreitage-Sehrägkulturen der in Tabelle 5 genannten Mikroorganismen wurden in 3 Kolben geimpft, die je 30 ml des Mediums 1 enthielten, und 20 Stunden bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet. Nach dieser Zeit wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, mit je 30 ml einer 0,05-rnolaren Phosphatpufferlösung von p„ 6,0 gewaschen und in 3 ml diesel· Pufferlösung suspendiert. Zu jeder Suspension wurden 3 ml einer wässrigen 0,1 η-Κ,,ΗΡΟ,-Lösung gegeben, die 4> 3,5-Dichlor-4-hydroj>:yphenylglyeinmeth;yl-

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Angehäuftes	ffi^/m"	Cephalos-	L	I
_ joonri,.	H	0,1
G	0,1	0,1
0,1	0,1	0,2
0,1	0,1	0,1
.,2	0,1
0,1

ester· (4) und 2$ 7-Aminocephalosporansäure (a) oder 7-AiriiKj-3-de&cetoxyceijhalosporansäure (b) oder 7-Amino-3-methoxyinethyl--3-cephem~4-carbonsäure (c) enthielt und mit 2n-HCl auf p„ 6,0 eingestellt war. Jedes Gemisch wurde 40 Minuten bei 37°C unter Schütteln bebrütet. Das in jedem Reaktionsgernisch angehäufte Cephalosporin wurde durch Bioautographie identifχ?Λ ert und durch den Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 5 genannt.

Tabelle 5
Mikroorganismus

Acetobacter xylinum IFO-3144
Acetobacter aurantium IFO-3245
Xanthomonas orysae IPO-3995 '
Mycoplana dimorpha ΙΙΌ-13240

G = 7-/a-Amino-a-(3,5-dichlor-4-hydroxyphenyl)-acetaraid£7-cephalosporansäure, gebildet aus (4) und (a).

H = 7-/α-Amino-α-(3,5-dichlor-4-hydroxyphenyl)acetamid£7-3-deacetoxycephalosporansäure, gebildet aus (4) und (b).

I = 7-/ä-Amino-a-(3,5-dichlor-4-hydrox3^phenyl)-acetamid£7-3-methoxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure, gebildet aus (4) und (c).

Beispiel 7

Dreitage-Schrägkulturen der nachstehend in Tabelle 6 genannten Mikroorganismen wurden in 3 Kolben geimpft, die je 30 ml des Mediums I enthielten, und 20 Stunden bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet<, Hach dieser Zeit wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 30 ml einer' 0, Oij-molaron l'hosphatpufferlöoung von p_H 6,0 gewaschen und in 3 ml einer wässrigen 0,1n-K^KPO,-Lösung suspendiert, die 4'/' 1-CycicLexenylglycinmethylester (5) und 2>£ 7-Aminocephalosporansäure (a) oder 7~Amino-3-deacetoxycephalo5-

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poransäure (b) oder 7-Amino-3-methoxymethyl-3.-cepbom-4-carbonsäure (c) enthielt und mit 2n-HCl auf p_H 6,0 eingestellt war. Jedes Gemisch wurde 30 Minuten bei 37°C unter Schütteln bebrütet. Das in jedem Reaktionsgemisch angehäufte Cephalosporin wurde durch Bioautographie identifiziert und durch den Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 6 genannt.

Tabelle 6

Mikroorganismus

Angehäuftes Cephalo3-porin, mg/ml

J KI

Acetobacter xylinum IPO

Acetobacter pas te uriartus,., IPO

Acetobacter turbidana IPO·

Acetobacter aurantium IFO-;

Pseudomonas melanogenum IFO-

PsGudomonaG maltophila IFO-

Xanthomonas oryzae IFO-

Mycoplana dimorpha IFO-

3288	1.3	1.6
3223	6.8	4.6
3225	7.2	4.4
3245	2.1	0.8
12020	2.3	2.5
12690	0.9	1.2
3995	7.5	7.2
13213	1.4	2.0

0.8 5.2 4.0 1.1 1.5 0.7 7.0 1.2

J = 7-(oc-Amino-1 '-cyclohexenylacetamido )cephalosporan-

säure, gebildet aua (5) und (a). K =s 7-(oc-Amino-1 ·-cyclohexenylacetamido)-3-deacetoxy-

cephalosporansäure, gebildet aus (5) und (b). L = 7-(a-Amino-1 '-cyclohexenylacetamido )-3-methoxyraethyl-^:

3-cephem-4-carbonsäure, gebildet aus (5) und (c).,

Beispiel 8

Eine Impfnadelmeni?e einer Dreitage-Schrägkultur von Acetobacter pasteurianus IFO-3223 v/urde in 20 ml des Mediums I geimpft und 1 Tag bei 28°C unter Schütteln bebrütet. Die erhaltene Kultur wurde in 500 ml des Mediums I

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geimpft und 20 Stunden bei 28⁰C unter'Schütteln bebrütet» Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 500 ml einer 0,05-molaren Phosphatpufferlösung von p„ 6,0 gewaschen und in 50 ml dieser Pufferlösung suspendiert. Zur Suspension wurden 50 ml einer wässrigen 0,1 n-KpHPO,-· Lösung gegeben, die 4$ I-Cyclohexenylglycinmethylester (5) und 'I⁰Jo 7-Aminocephalosporansäure (a) enthielt und mit 2n-HCl auf p™ 6,0 eingestellt war. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37°C unter Schütteln bebrütet» Die Identifizierung durch Bioautographie und die Bestimmung durch den Biotest ergaben, daß 8,5 mg 7-(a-Amino-1'-cyclohexenylacetaraido)cephalosporansäure (J) pro ml im Reaktionsgemisch angehäuft waren» Das Produkt J ergibt auf einer Dünnschicht von Kieselgel bei Entwicklung mit einer 7Obigen wässrigen Äthanollösung einen Rf-Wert von 0,83.

Beispiel 9

Sine Impfnadelmenge einer Dreitage-Schrägkultur von Xanthomonas citri ΙΙΌ-3835 wurde in 20 ml des Mediums I geimpft und 1 Tag bei 28⁰C bebrütet. Die. erhaltene Kultur wurde in 200 ml des Mediums I geimpft und 20 Stunden bei 28⁰C kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 200 ml einer 0,05-molaren Phosphatpufferlösung von Pj₁ 6,0 gewaschen und in 100 ml dieser Pufferlösung suspendiert. Zur Suspension wurden 100 ml einer wässrigen O, in-KpHPO.-lösung gegeben, die A°/o 1-Cyclohexenylglycinthioglykolester (6) und 2$ 7-Aminocephalosporansäure (a) enthielt und mit 2n-HCl auf Ρττ 6,0 eingestellt war» Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37 C unter Schütteln bebrütet. Die Identifizierung durch Bioautographie und die Bestimmung durch den Bioter.t ergaben, daß 6,6 mg 7-(a-Amino-1'-cyclohexenylacetmidojcephalosporansäure (J) pro ml im Reaktionagemisch angehäuft worden waren.

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Beispiel 10

Eine Impfnadelmenge von Dreitage-Schrägkulturen von Pseudoraonas melanogenum IFO-12020 und Acetobacter turbidans IPO-3225 wurde in 20 ml des Medium3 I geimpft und 1 Tag bei 2O⁰G unter Schütteln bebrütet. Die Kulturen wurden in je 500 ml des Mediums I geimpft und 20 Stunden bei 28⁰C unter Schütteln kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 500 ml einer 0,05-molaren Phosphatpufferlösung von p„ 6,0 gewaschen und in 50 ml dieser Pufferlösung suspendiert. Zu den erhaltenen Suspensionen wurden je 50 ml einer wässrigen 0,1n-KpHPO.-Lösung gegeben, die 4# des nachstehend in Tabelle genannten I-Cyclohexenylglycinalkylesters und 2fi 7-Amino-3-deacetoxycephalosporansäure (b) enthielt und mit 2n-HCl auf Ptt 6,0 eingestellt war. Die Gemische wurden 30 Minuten bei 37°C unter Schütteln bebrütet. Die in den Reaktionsgemischen angehäufte 7-(a-Amino-1'-cyclohexenylacetamido)-3-deacetoxycephalosporansäure (K) wurde durch Bioautographie identifiziert und durch den Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 7 genannt.

Tabelle 7

Mikroorganismus 1-Cyclohexenyl- Angehäufte

glycinalkyl- Menge von ester (K),mg/ml

Paeudomonaa melanogenum

IFO-12020	Athylester	5,5
Acetobacter turbidans
IFO-3225	Methylester	4,2

Das Produkt K ergibt auf einer Kieselgel-Dünnschicht bei Entwicklung mit einer 70#igen wässrigen Äthanollösung einen Rf-Wert von 0,77.

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Beispiel 11

Eine Impfnadelmenge der Dreitage-Schrägkulturen von Acetobacter aurantium IFO-3245 und Xanthomonas oryzac IFO-3995 wurde in 20 ml des Mediums I geimpft und 1 Tag bei 28°C unter Schütteln "bebrütet. Die Kulturen wurden in je 500 ml des Mediums I geimpft und 20 Stunden bei 28⁰C unter Schütteln kultiviert» Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 500 ml einer 0,05-molaren Phosphatpufferlösung von p„ 6,0 gewaschen und in 50 ml dieser Pufferlösung suspendiert. Zu den erhaltenen Suspensionen wurden je 50 ml einer wässrigen 0,In-KpHPO.-Lösung gegeben, die 4$ I-Cyclohexenylglycinmethylester (5) und 2$ 7-Amino-3-methoxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure (c) enthielt und mit 2n-HCl auf p™ 6,ü eingestellt war. Die Gemische wurden 50 Minuten bei 37⁰C unter Schütteln bebrütet. Die in den Reaktionsgemischen angehäufte 7-(a-Amino-1'-cyclohexenylacetamidoj^-methoxymethyl^- cephem-4-carbonsäure (L) wurde durch Bioautographie identifiziert und durch den Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 8 genannt.

Tabelle 8

Mikroorganismus Angehäufte Menge von (IQ _f mg/ml Acetobacter aurantium IFO-3245 ·* 3,8 Xanthomonas oryzae IFO-3995 8,2

Das Produkt L ergibt auf einer Kieselgel-Dünnschicht bei Entwicklung mit einer 70^igen wässrigen Äthanollösung einen Rf-Wert von 0,85.

Beispiel 12

Die Dreitage-Schrägkulturen der nachstehend in Tabelle 9 genannten Mikroorganismen wurden in 3 Kolben geimpft, die je 30 ml des Mediums I enthielten, und 20 Stunden bei 28°C unter Schütteln bebrütet. Nach dieser Zeit wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 30 ml einer 0,05-molaren Phosphatpufferlösung von p„ 6,0 gewaschen

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und in 3 ml einer wässrigen O,In-K₂HPO,-Lösung suspendiert, die Mo Cyclohexylßlycinäthylester (7) und 2^ 7-Aminocephalosporansäure (a) oder 7-Amino-3-deacetoxycephalosporansäure (b) oder 7-Amino-3-methoxyniethyl-3-cephem-4-carbonsäure (c) enthielt und mit 2n-HCl auf p„ 6,0 eingestellt war. Die Gemische wurden 30 Minuten bei 37⁰C unter Schütteln bebrütet. Das in jedem Reaktionsgemisch angehäufte Cephalosporin wurde durch Bioautographie identifiziert und durch den Biotest bestimmt<> Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 9 genannt«

Tabelle 9

Mikroorganismus

Angehäuftes Cepha-

Inspnrin, mg/ml

Acetobacter xylinum Acetobacter turbidans Acetobacter pasteurianurj Pseudomonas raelano^onvun Pseudomonas maltophila Xanthomonas ci.tri XanthomonaG oryzac Mycoplana dimorpha

IFO-3144 IFO-3225 ΙΓΌ-3223 IFO-I2020 IFO-I2690 IFO-3835 IFO-3995 IFO-13213

1.8	0.7
2.5	2.2
2.8	2.1
0.9	0.8
0.5	0.4
1.8	0.3
4.6	3.5
1.0'	0.3

1.1 1.5 1.8 1.0 0.8 0.9 4.2 0.8

M s= 7-(a-Anjinocyclohexylacetamido)cephalosporansäure, gebildet aus (7) und (a).

N = 7-(a-Aminocyclohexylacetamido)-3-deacetoxycephalosporansäure, gebildet aus (7) und (b).

0 = 7-(a-Aminocyclohexylacetamido)-3-methoxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure, gebildet aus (7) und (c).

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Beispiel 13

Eine Impfnade!menge dor Dreitage-Schrägkulturen der in Tabelle 10 genannten Mikroorganismen wurde in 20 ml des Mediums I geimpft und einen Tag bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet. Die erhaltenen Kulturen wurden jeweils in 500 ml des tiediums I geimpft und 20 Stunden bei 28 C unter Schütteln bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 500 ml einer 0,05-molaren Pufferlösung von Pjt 6,0 gewaschen und in 50 ml dieser Pufferlösung suspendiert. Zu jeder erhaltenen Suspension wurden 50 ml einer wässrigen 0,In-K₂HPO,-Lösung gegeben, die 4$ des in Tabelle 10 genannten Cyclohexylglycinalkylesters und 2$ der in Tabelle 10 genannten 7-Aminoeephemverbinüung enthielt. Die Lösung war mit 2n-HCl auf p„ 6,0 eingestellt worden» Die Gemische wurden 30 Minuten bei 37°C unter Schütteln bebrütet. Das in den Reaktionsgeroischen angehäufte Cephalosporin wurde durch Bioautogrpahie identifiziert und durch den Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 10 genannt.

Tabelle 10

Mikroorganismus

Cyclohexyl- 7-Aminoglycinalkyl- cephemester verbindung

Angehäuftes Cephalosporin

Acetobacter turbidans IPO-3225

Xanthomonas oryzae
ΙΙΌ-3995

Pseudomonas melanogenura lPO-12020

Äthylester (a)

Methylester (b) Methylester (c)

3,4 mg M/ml

5,2 mg N/ml 1,8 mg O/ml

(a) = 7~Aminocephalosporansäure

(b) .= 7-Amino-3-deacetoxycephalosporansäure

(c) = 7-Amino-3-methoxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure

M = 7-(a-Aminocyclohexylacetamido)cephalosporansäure

H = 7-(a-Arninocyclohexylacetamido)-3-deacetoxycephalosporansäure

0 = 7-(a-Aninocyclohcxylacetamido)-3~methoxymethyl-3-cephem-4-carbonüüure-

209842/1223

Beispiel 14

Eine Impfnadelmenge der Dreitage-Schrägkulturen der in Tabelle 11 genannten Mikroorganismen wurde in je 30 ral des Mediums I geimpft _und 20 Stunden bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 30 ml einer 0,05-molaren Phosphatpuffürlösung von Pu 6,0 gewaschen und in 3 ml dieser Pufferlösung suspendiert. Zu den Suspensionen wurden je 3 ml einer wässrigen O,In-KpHPO.-Lösung gegeben, die mit 2n-HCl auf Pu 6,0 eingestellt war und 0,45^ Phenylglycinmethylester (1) und 0,2% 7-Aminocephalosporansäure (a) enthielt. Die Gemische wurden ?0 Minuten bei 37°C unter Schütteln bebrütet. Die in den Reaktionsgemischen angehäufte 7-(a-Aminophenylacetamido)cephalosporansäure (A) wurde durch Bioautographie identifiziert und durch den Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind" nachstehend in Tabelle genannt.

Tabelle 11

Mikroorganismus	209842/1	IFO-I2069	Angehäufte Menge von A, mg/ml
Arthrobacter simplex		IFO-I2138	0.03
Arthrobacter oxydans	IFO-3849	0.02
Proteus mirabilis	IFO-3048	0.02
Proteus morp;anii	IFO-12164	0.02
Corynebacterium tritici	IFO-12533	0.03
Flavobacterium capsulatum	IFO-3847	0.04
Clostridium butyricuin	IFO-3346 IPO-12012 IFÜ-3035 11Ό-35Ρ6	0.05
Clostridium acetobutyricum Spirillum irurbamorphum Bacillus subtilis	Ϊ1Ό-333Ο	0.04 0.03 0.03 0.0Λ
Bacillus £?pb.'ioricus	223	0.02
Baoillun f.irmun

Bacillus pumilis IFO-12090 · 0,04

Beispiel 15

Eine Impfnadelmenge der Dreitage-Schrägkulturen der in Tabelle 12 genannten Mikroorganismen wurde in 30 ml des Mediums I geimpft und 20 Stunden bei 28 C unter Schütteln bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 500 ml einer 0,05-molaren Phoaphatpufferlösung von Pj, 6,0 gewaschen und in 15 ml dieser Pufferlösung suspendiert. Zu den Suspensionen wurden 3^e 15 ml einer wässrigen 0,In-K₂HPO.-Lösung gegeben, die mit 2n-HCl auf P_H 6,0 eingestellt war und 4$ Phenylglycinmethylester (1) und 2°jo 7-Amino-3-(i-oxidopyrid-2-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure (d) enthielt. Die Gemische wurden 30 Minuten bei 37°C unter Schütteln bebrütet. Die in den Reaktionsgemischen angehäufte 7-(a-Aminophenylacetamido)-3-(1-oxidopyrid-2-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure (P) wurde durch Bioautographie identifiziert und durch den Biote3t bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 12 genannt.

Tabelle	Mikroorganismus	12	Angehäufte Menge von P, mg/ml
Acetobacter pasteurianus		4.4
Acetobacter turbidans	IFO-3223	3.5
Acetobacter aurantium '	IFO-3225	2.4
Pseuclomonas maltophila	IFO-3245	5.4
Pseudomonas iiielanoßenum	IFO-I2690	8.8
Xanthomonas citri	IFO-I2020	7.9
Xaivfchomomn ory sae	IFO-3829	• 8.6
Frotariiiiobactor alboflsvus	IFO-3827	5.5
Mvcoianna dimorrfia	IFO-13221	2.1
IFO-13213

209842/1223

Beispiel 16

Eine Impf nadelmen.de der Dreitage-Schrägkulturen von Pseuclorconas melanogenum IFO-12020 und Protarninobacter alboflavus IFO-13221 wurde in 20 ml des Mediums I geimpft und einen Tar. bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet. Die erhaltenen Kulturen wurden in je 500 ml des Mediums I geimpft und 20 Stunden bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 500 ml einer O,05-molaren Phosphatpufferlösung von p„ 6,0 gewaschen und in je 50 ml dieser Pufferlösung suspendiert. Zu den Suspensionen wurden je 50 ml einer mit 2n-HCl auf ρ,, 6,0 eingestellten wässrigen 0,1 n-KoHPO^-Lösung gegeben, die 2-io Phenylglycinmethylester (1) und 4$ 7--Amino-3-(1-oxidopyrid-2-ylthioraethyl)-3-cephem-4-carbonsäure (d) enthielt. Die Gemische wurden 30 Minuten bei 37°C unter Schütteln bebrütet. Die in den Reaktionsgemischen angehäufte 7-(a-Aminophenyl-acetamido)~3-(i-oxidopyrid-2-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsaure (P) v;urde durch Bioautographie identifiziert und durch den Bioiest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 13 genannt.

Tabelle 13

Mikroorganismus Angehäufte Menge

von Ρ, mg/ml

Pseudomonas raelanogenum IFO-12020 8,5

Protaminobacter alboflavus IFO-13221 6,0

Beispiel 17

Eine Impfnadelmenge einer Dreitage-Schrägkultur von Xanthomonas oryzae IFO-3995 wurde in 20 ml des Mediums 1 geimpft und einen Tag bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet. Die erhaltene Kultur wurde in 500 ml des Mediums I geimpft und 20 Stunden bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 500 ml einer 0,0^c„)-molaren Phosphatpufferlocung von p_H 6,0 gewaschen und in 50 ml dieser Pufferlösung suspendiert«,

209842/1223

Zur erhaltenen Suspension wurden 50 ml einer mit 2n-H01 auf p„ 6,0 eingestellten wässrigen 0,1n-Kr,HP0,-Lösung gegeben, die 2⁽p 2-Thienylglycjnmethylester (8) und 4$ 7-Aminocephalosporansäure (a) enthielt. Da α Gemisch wurde 30 Minuten bei 37°C unter Schütteln bebrütet. Die Identifizierung durch das Bioautogramm und die Bestimmung durch den 'Biotest ergaben, daf3 6,2 mg 7-/ä-Amino-(2-thienyl)~ acetamid£7cephalosporansäure (Q) pro ml im Reaktionsgemisch angehäuft worden waren,

Beispiel 18

Eine Impfnadelmenge einer Dreitage-Schrägkultur von Acetobacter turbidans IFO-3225 wurde in 30 ml des Mediums I geimpft und 20 Stunden bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 30 ml einer 0,05-molaren Phosphatpufferlösung von p„ 6,0 gewaschen und in 3 ml dieser Pufferlösung suspendiert. Zur erhaltenen Suspension wurden 3 ml einer mit 2n-HCl auf P₁₁ 6,0 eingestellten wässrigen 0, In-K^HPO^-Lösung gegegeben, die 2$ 2-Thienylglycinmethylester (8) und 4$ 7-Amino-3-deacetoxycephalosporansäure (b) enthielt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37⁰C unter Schütteln bebrütet. Die Identifizierung durch das Bioautogramm und die Bestimmung durch den Biotest ergaben, daß 5»6 mg 7-/ä-Amino-(2-thienyl)acetamid£7-3-deacet«oxycephalosporansäure (S) pro ml im Reaktionsgemisch angehäuft worden waren.

Beispiel 19

Eine Impfnadelmenge der Dreitage-Schrägkulturen von Xanthomonas oryzae ΙΙΌ-3288 und Acetobacter pasteurianus IFO-3223 wurde in 30 ml des Mediums I geimpft und 20 Stun₇ den bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 30 ml einer 0,05-molaren Phosphatpufferlösung von p„ 6,0 gewaschen und in 3 ml dieser Pufferlösung suspendiert. Zu den erhaltenen Suspensionen wurden je 3 ml einer mit 2n-HCl auf p^ 6,0

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eingestellten wässrigen O, In-KpIIPO.-Lösung gegeben, diu A"/o Phenylßlycinmethylester (1) und 2'/» der in Tabelle 14 genannten 7-Arninoceph.Gmvcrbirjdung enthielt. Die G-emiache wurden 30 Minuten bei 37°C unter Schütteln bebrütet. Jas in den Reaktionageinifichen angehäufte Cephalosporin wurde durch das Bioautogramm identifiziert und durch den Biotoüt bestimmt. Die -^rgebnisr.e sind nachstehend in Tabelle Ί4 genannt»

Tabelle 14

Mikroorganismus 7-Aminocephein- Angehäuftes

verbindung Cephalosporin

Xanthomoas oryzae lFO-3208 (e) 6,8 mg T/ml Acetobacter pasteurianus

IEO-3223 (f) 5,6 mg U/ml

(e) = N-(7-Amino-3-cephem-3-ylinethyl)pyridiniuin-4-carboxy-

lat

(f) = N-Amino-3~cephem-3-ylmethyl)-4-carboxamiuopyridi-

nium-4-carboxylat

T = N-/7-(a-Aminopheny!acetamido)-3-cophem-3-ylmethyl7-pyridinium-4-carboxylat

U = N-/7-(a-Aminophenylacetamido)-3-cephem--3-ylmethyl7-4-carboxyamidopyrioinium-4-carboxylat

Beispiel 20

Eine Impfnadelmenge der Dreitage-Schrägkulturen von Acetobacter xylinum IFO-3144 und Xanthomonas citri IFO-3835 wurde in 30 ml des Mediums I geimpft und 20 Stunden bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 30 ml einer 0,05-molaren Phosphatpufferlösung von p„ 6,0 gewaschen und im Falle von Acetobacter xylinum in 3 ml dieser Pufferlösung und itn Falle von Xanthomonas citri in 75 ml der Pufferlösung suspendiert. Zu den erhaltenen Suspensionen wurde jeweils das gleiche Volumen einer mit 2n-HCl auf p„ 6,0 eingestellten wässrigen 0,In-K₂HPO₄-LOSUHg gegeben, die 0,4$

209842/1223

Pheny!glycin (9) und 0,2$ 7-Aminocephalosporansäure (β) enthielt» Die Gemische wurden 30 Minuten "bei 37°C unter Schütteln bebrütet. Die in den ReaktionsociTiinchen angehäufte 7-(a--Aminophenylacetamido)-cephalo8poran.säure (A) wurde durch das Bioautogramm identifiziert und durch den Biotest "bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 15 genannt.

Tabelle 15

Mi kr ο orä anis	mus	IFO-3144	Angel j ä	uf te	Menge
		IEO-3835	von A,
Acetobacter	xylinum	Beispiel 21	0	,04
Xanthoruonas	citri	0	,06

Eine Irnpfnadelraenge einer 24 Stunden-Schrägkultur von Xanthomonas citri ΙϊΌ-3835 wurde in 30 ml des Mediums III geimpft und 24 Stunden bei 28 G unter Schütteln bebrütet. Die erhaltene Kultur wurde in 500 ml des Mediums III geimpft und 24 Stunden bei 28 0 unter Schütteln bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt und in 20 ml einer 0,2-molaren Trismaleatpufferlösung von p™ 6,5 suspendiert. Zur Suspension wurden 20 ml dieser Pufferlösung, die durch 500 mg Phenylglycinmethylester (1) und 250 mg 7-Amino-3-deacetoxycephalosporansäure (b) ergänzt worden war, und 10 ml Aceton gegeben» Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 25°C unter Schütteln bebrütet«, Die Identifizierung durch das Bioautogramm und die Bestimmung durch den Biotest ergaben, daß 270 mg 7-(a-Aminophenylacetamido)-3-deacetoxyeephalosporansäure (B) im Reaktionsgemisch angehäuft worden waren„

Beispiel 22

Acetobacter sp. ISO-13209 wurde in 200 ml des Mediums IV geimpft und 22 Stunden bei 26 C unter Schütteln bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt und in 20 ml einer 0,1-molaren Phosphatpufferlösung von p„ 6,0 suspendiert. Die Suspension wurde in 8 Teile geteilt»

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Zu jedem Teil der Suspension wurden 2,5 nil einer 0,2-molaren Phosphatpufferlösung von p„ 6,0 gegeben, die 75 mg des in Tabelle 16 genannten Phenylglycinderivats und 25 mg 7-Amino-3~deacetoxycephalosporansäure (b) enthielt. Die Gemische wurden 1 Stunde bei 37 C unter Schütteln bebrütet. Die in den Reaktionügemischen angehäufte 7-(oc-Aminophenylacetamido)-3-deacetoxycephalo3poransäure (B) wurde durch das Bioautogramm identifiziert und durch den Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle genannt*

Tabelle 16

Verwendetes Phenylglycinderivat Angehäufte Menge von B,

mg/ml

Methylester 6,0

Äthylester 6,0

n-Propylester 4,6

Isopropylester 2,2

tert.-Butylester 0,2

Benzylester 4,2

Phenylglycinaraid 0,2

N-(Phenylglycyl)glyoin 0,2

Beispiel 23

Eine Impfnadeinenge einer 24-Stunden-Schrägkultur von Xanthomonas orysae IFO-3510 wurde in 50 ml des Mediums III geimpft und 1 Tag bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet. Die erhaltene Kultur wurde in 350 ml dea Mediums III geimpft und 1 Tag unter Schütteln bei 28⁰C bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren aus 800 ml des in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Fermentationsmediums abcetrennt und in 200 ml einer 0,2-molaren Phosphatpufferlösung von p_H 6,0 suspendiert. Zur Suspension wurden 200 ml einer 0,2-molaren Phosphatpufferlöaung von p_H 6,0 gegeben, die durch 3 g DL-I-Cyclohexenylglycinmethyleoter und 1 g 7-Amino-3-deacetoxycophalosporansäure ergänzt worden war. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37 C unter

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Schütteln bebrütet. Der Enzyrnteat ergab, daß 1,35 £ 7-(α-Amiη0-1 ' -cyclohe:<enylaoetainido)-3~deacetoxyoephaloaporansäure in Realctiona^emisch an/zehäuft worden waren«

Die Zellen wurden durch Zentrifugieren vom Reaktionsgemisch abgetrennt. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Säule geleitet, die mit 800 ml einea im Handel erhältlichen Polystyrolharzes ("Araberlite XAD-2", Hersteller Rohm and Haas Co₀, USA) gefüllt war. Die Säule wurde zuerst mit 2600 rnl Wasser und dann mit 1400 ml eines Gemisches von Wasser und Methanol (Volumenverhältnis 5:1) gewaschen. Dann wurde die Säule mit 2500 ml einer 5Obigen wässrigen Methanollösung eluiertc

Die ersten 800 ml des mit 50$igem Methanol erhaltenen Eluats wurden unter vermindertem Druck bei etwa 35 C zur Trockene eingedampft, wobei 135 mg 7-/a--Amino(L-1'-cyclohexenyl)acetamid£7~5-deacetoxycephalosporansäure in Form von Kristallen erhalten wurden.

UV-Absorption: e]^ bei 260 mu = 205 Spezifische Drehung: JaJ^ = +137°(C=O,5, in H₂O)

Die anschließenden 700 ml des Eluats wurden unter vermindertem Druck bei etwa 35⁰C zur Trockene eingedampft, wobei 850 mg 7-/ä-Amino(D-1^f-cyclohexenyl)acetämid£7~3-deacet~ oxycephalosporansäure in Form von Kristallen erhalten wurde«

UV-Absorption: %fö_nm bei 260 mu = 215 Spezifische Drehung: /ä_7^⁵= +86,2° (C=O,5, in H₂O) NI-IR (ti-Werte in D₂O bei P_H 3): 1,66 (breit, 4H), 2,10 (breit, 4H), 2,20 (Singlett, 3H), 3,54 (AB-Quartett, 2H), 4,63 (Singlett, 1H), 5,19 (Dublett, Vl), 5,72 (Dublett, 1H), 6,18 (breit, 1H).

Die antibiotische Aktivität ergibt sich aus der folgenden Tabelle 17.

2098U/1223

Tabelle 17

Tentmikroor^anisraus Hemmende I;Inueu t-

koηζentration, JU£?/rrf

Staphylococcus aureus	209P	>	0,5
Staphylococcus aureus	Kr „ 87	>	2
Bacillus subtilis	PCI 219		0,2
Sartina lutea	PCI 1001	>	0,02
Escherichia coli	NIHJ	>	50
Klebsiella pneumoniae	KbI		50
Proteus vulgaris	Eb51	50
Proteus morganii	Eb53	100
Proteus morganii	Eb 54	100
Proteus mirabilis	Eb59	100
Pseudomonas aeruginosa	PdI	100
Pseudomonas aeruginosa	10490 -	100
	Beispiel 24

Eine Impfnadelmenge einer 24-Stunden-Schrägkultur von Xanthomonas citri IFO-3835 wurde in 50 ml des Mediums III geimpft und 1 Tag bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet. Die erhaltene Kultur wurde in 350 ml des Mediums III geimpft und 1 Tag bei 28°C unter Schütteln bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt und in 100 ml destilliertem V/asser suspendiert. Zur Suspension wurde eine Lösung von 8 g D-Phenylglycinmethylester und 4 g 7-Amino-3-deacetoxycephalosporansäure in 100 ml destilliertem Wasser gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37°C unter Schütteln bebrütet, während sein p^-Wert durch Zusatz von 2n-NaOH bei 6,0 gehalten wurde. Der Enzyrntest ergab, daß 24,7 mg 7-(a~Aminophenylacetaßiido)-3-deacetoxycephalosporansäure pro ml im Reaktionsgemisch angehäuft worden waren.

Das Heaktionsgemisch wurde dem in Beispiel 23 beschriebenen Iüolierverfahren unterworfen, wobei 3,9 g 7-(a-Amino-D-phenylacetamido)-3-deacetoxycephc5losporan3Hure in Form

209842/1223

von Kristallen erhalten wurden.

UV-Absorption: 'EiV^b _nm bei 260 mu = 218 Spezifische Drehung: /ä_7^⁵ = +148° (C=O,5, in H₂O).

Beispiel 25

Eine Impfnadelmenge einer 24-Stunden-Schrägkultur von Xanthomonas citri ΙΙΌ-3835 wurde in 50 ml des Mediums III geimpft und 1 Tag bei 28 C unter Schütteln bebrütet. Die erhaltene Kultur wurde in 450 ml des Mediums III geimpft und 1 Tag bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet. 2,5 1 der in dieser Weise erhaltenen 24-Stunden-Kultur wurden in 100 1 des Mediums III geimpft und 24 Stunden bei 28⁰C unter Belüftung und Bewegung bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, in 5000 ml einer 0,005-molaren Phosphatpufferlösung van pj, 6,0 suspendiert und dann 20 Minuten bei 10 kHz beschallt. Das erhaltene Material wurde der Einv/irkung von Desoxyribonuclease unterworfen, zur Entfernung von Proteinen mit Calciumphosphat und dann mit einer 60$igen gesättigten Ammoniumsulfatlösung behandelt, wobei eine Fällung abgeschieden wurde. Die fällung wurde in einer 0,01-molaren Phosphatpufferlösung von Pjj 6,8 gelöst, über Nacht gegen fliessendes Wasser dialysiert und dann zur Entfernung von unreinen Proteinen mit Diäthylaminoäthylcellulose behandelt. Die hierbei erhaltene Lösung wurde gefriergetrocknet, wobei 15 g eines rohen pulverförmigen Enzyms erhalten wurden.

Zu 1 1 einer wässrigen Lösung, die 20 g D-Phenylglycinmethylester und 10 g 7-Amino-3-deacetoxycephalosporansäure enthielt, wurden 3 g des rohen pulverförmigan Enzyms gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37 C unter Bewegung bebrütet, wobei der p_H-Wert durch Zusatz von 2n-l\aOH bei 6,0 gehalten wurde. Der Enzymtest ergab, daß 11,3 fi 7-(oc-Aminopheny !acetamid ο )-3-deaeetoxycephalosporansäure im Reaktionsgemisch angehäuft worden war_o

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Das ]l>.· a let j. ons g episch wurde α err, in Bei κ pi el 23 beschriebenen Inolierurtgsverfabren unterworfen, wobei 9,2 [\ 7-(a-Araino-D-phenylacetamido)-3-äeacetoxycephaloaporansäure in Form von Kristallen erhalten wurden.

UV-Absorption: ^_0n bei 260 nsu = 218 Spezifische Drehung: /üJJ^⁵ = +148° (0=0,5, in H₂O).

Beispiel 26

Das rohe pulver.förmige Enzym wurde weiterhin der Säulenchromatographie mit Carboxymethylcellulose unterworfen, wobei als Lösungsmittel die 0,03 Mol NaCl enthaltende Phosphatpufferlösung von p_H 6,2 verwendet wurde. Es wurde dann der Gelfiltration unter Verwendung einer Säule unterworfen, die mit Dextran teilchen für die Gelfiltration "Sephadex 0-75" (Hersteller Pharmacia Co., Uppsala, Schweden) gefüllt war, wobei ein gereinigtes Enzym erhalten wurde, das ungefähr die 80-fBche Aktivität des rohen pulverförmiger! Enzyms für die Synthetisierung von Cephalosporin hatte.

Zu 10 ml einer 0,05-molaren Phosphatpufferlösung von p_H 6,0, die 0,4w'j 7-AK.ino-3-deacetoxycephalosppransäure und 0,80$ des in Tabelle 18 genannten D-, L- oder DL-Phenylglycinmethylesters enthielt, wurden, 25 /Jg des gereinigten Enzyms gegeben. Die Gemische wurden 30 Minuten bei 37 C unter Schütteln bebrütet. Die in den Reaktionsgemischen angehäufte Menge der 7-(a-Aminophenylacetamido)-3-deacetoxycephalosporansäure wurde durch den Enzymtest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 18 genannte

Tabelle 18

Phenylglycinrnethylester Angehäufte Produktffienge,

D-Phenylglycinmethylester 1,7

DL-Ph enyIglye i nmethylest er 0,9

L-PheriylglYCinrnuthylester 0,2

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Claims (1)

1. P at e η b an s ρ r ü c h e

   Verfahren zur Herstellung von Cephalosporine!! der Formel

   R-CH-CONH-CiI-CH CII₀ , _x

   I' i ¹^ ' (I)

   C-N. ^CCH₂-R' - . ^V '

   o o'

   COOH

   in der R ein sechsgliedriger cyclischer Kohlenwasserstoffrest oder ein fünfgliedriger heterocyclischer Rest ist und R' für ein Wasserstoffatom oder einen organischen Rast steht, dessen angedeutete Bindung sich zwischen dem Methylenkohlenstoffatom und einem Sauerstoffatom* Schwefelatom oder Stickstoffatom befindet, die den organischen Rest bilden, dadurch gekennzeichnet, daß man eine a-sutstituierte' α-Aminosäure der Formel

   R-CH- COOH (II)

   in der R die oben genannte Bedeutung hat, oder ihr reaktionsfähiges Derivat und eine 7-Aminocephemverbindung der Formel

   H₂N-CH-CH CIU

   O^ ^X _

   COOH

   in der R' die oben genannte Bedeutung hat, der enzymatischen Einwirkung eines Mikroorganismus unterwirft, der ein Cephalosporin der Formel (I) aus einer α-substituiert in a-Arainosäure der Formel (II) oder ihrem reaktionsfähigen Derivat und einer 7-Aminocephemverbindung der Formel (III) zu bilden vermag und zu einer der Gattungen I-iycoplana, I-rotaminobacter, Acetobacter, Xanthouonas, Pseudoiaonas, Aeromonas, Eschcrichia, Staphylococcus, Arthrobacter, Proteus, Corynebactorium, Flavobactorium, Clostridium, Spirillu'.i und Ban ill UR gehört.

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   2) Verfahren nsch Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die α-substituierte α-Aminosäure oder ihr reaktionsfähiges !Derivat und die 7~Arninocephemverbinciut:.^ mit einem Fermentationsnedium des Mikroorganismus oder ■ seinem verarbeiteten Material in einem wässrigen Mod ium zusammenführt.

   5) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch {^kennzeichnet, daß bei einer Temperatur von etwa 5° bis bO C und einem p„~Wert von etwa 4 bis 8 gearbeitet wird.

   4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der 7-Aminocephemvsrbindunß im wässrigen Medium im Bereich von etwa 0,1 bis 10$ (Gewicht/Volumen) und die Konzentration der α-substituierten α-Aminosäure oder ihres reaktionsfähigen Derivats im Bereich von etwa- 0,1 bis 2O'/o (Gew./Vol.) liegt.

   5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als reaktionsfähiges Derivat ein Alkylester, Aralkylester, Thioester, Amid oder ein Dipeptid der α-substituierten α-Aminosäure und einer anderen Aminosäure verwendet wird.

   6) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch cekennzelohnet, daß der organische Rest R' ein Alkoxyrest, Alkoxycarbonylrest, eine Pyridingruppe, eine Carboxamidopyridingruppe oder 2-(l-0xido)pyridylgruppe ist.

   7) Vex'fahren nach Anspruch 1 bis G, dadurch gekennzeichnet, daß R' ein Mcthoxyrest 1st.

   8) Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß R' ein Methoxycarbonylrest ist.

   9) Verfahren nach Anspruch 1 bis V>, dadurch gekennzeichnet, daß der fünf^liedri^o heterocyclische Rest ein Thienylresf ist.

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   BAD ORIGINAL

   _ hj, _

   10) Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch .gekennzeichnet, daß dor nechsgliedrj ^e cyclische Kohlenwasserstoff re-Hi, Hydroxylgruppen und/oder Ralocenatome an sea nein Ri n^ trägt..

   11) Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß R ein Phenylrest ist.

   J2) Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dai?, R ein Phenylrest ist, der Hydroxylgruppen und/oder Halogenatonie an seinem Ring trägt.

   ]j5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß R ein Cyclohexenylrest ist.

   14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß R ein Cyclohexylrest ist.

   15.Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß R ein Cyclohexenylrest und R' ein Wasserstoffatom, ein Methoxyrest oder ein Methoxycarbonylrest ist.

   16. Verfahren nach Anspruch 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Mikroorganismen verwendet werden: Mycoplana dimorpha, Mycoplana bullata,^Protaminobacter alboflavus, Acetobacter acetosus, Acetobacter albidus, Acetobacter aurantium, Acetobacter cerinus, Acetobacter industrius, Acetobacter dioxyacetonicus, Acetobacter gluconjcus, Acetobacter liquefaciens, Acetobacter melano^enus, Acetobacter oxydans, Acetobacter pasteuria.nus, Acetobacter suboxydans, Acetobacter turbidans, Acetobacter xylinum, Xanthomonas citri, Xantliorr.onas pruni, Xanthomonas oryzae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas nialtophila, Pseudornonas melanocenus, Fseudomonas vendrelji, Aeromonas hydro- -phila, Escherichia coli oder F.schcrichia coli var communior. <.

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