DE1517836B - Verfahren zur Herstellung von 5 Punnnucleotiden - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von 5 PunnnucleotidenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden, wie 5'-Inosinsäure, Adenosin-5'-triphosphat
und 5'-Guanylsäure, durch aerobes Züchten einer 5'-Purinnucleotide produzierenden Mikroorganismus
in einem hierfür üblichen Nährmedium bei einer Temperatur von etwa 25 bis 37° C und einem
pH-Wert von etwa 5,5 bis 8,0. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium
mindestens ein oberflächenaktives Mittel zusetzt. Nichtionische, kationische, anionische und amphotere
oberflächenaktive Mittel, wie Polyoxyäthylensorbit-Derivate, Polyoxyäthylenalkylamine, Polyoxyäthylenalkyläther
und Polyoxyäthylenalkylallyläther, können verwendet werden.
Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden durch Fermentation, wobei Mikroorganismen in Gegenwart
von Purinbasen oder Purinnucleosiden gezüchtet werden, sind bekannt (vgl. die japanischen Patentanmeldungen
12136/1963, 17 615/1963, 28 753/ 1963, 47 841/1963, 57 520/1963, 63 229/1963, 3 377/
und 3 798/1965).
Aufgabe der Erfindung war die Entwicklung eines in industriellem Maßstab auf wirksame und einfache
Weise durchführbaren Verfahrens zur biotechnischen Herstellung von 5'-Purinnucleotiden, welches bei
niedrigen Kosten mit hoher Produktausbeute abläuft und damit gegenüber den bisherigen Verfahren mit
unbefriedigend niedriger Ausbeute verbessert ist. Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß sie 5'-Purinnucleotide
in erheblichen Mengen und beschleunigt mittels eines Fermentationsverfahrens herstellen lassen,
wenn dem Züchtungsmedium, welches die 5'-Purinnucleotid-produzierenden Mikroorganismen enthält,
oberflächenaktive Mittel zugesetzt werden.
Ein Vergleich mit bekannten Fermentationsverfahren zeigt, daß sich erfindungsgemäß größere Ausbeuten
an 5'-Inosinsäure (belgische Patentschrift 646 342, französische Patentschrift 1 395 940), 5'-Guanylsäure
und 5'-Adenylsäure (belgische Patentschrift 646 342), Adenosin-5'-triphosphat und Guanosin-5'-triphosphat
(belgische Patentschrift 655 014 und französische Patentschrift 1 372 054) und Adenosin-5'-diphosphat
(belgische Patentschrift 655 014 und französische Patentschrift 1 372 054) erzielen lassen.
Anwendbare oberflächenaktive Mittel sind alle bekannte nichtionische,, kationische, anionische oder
amphotere oberflächenaktive Mittel. Besonders wirksam sind die Polyoxyäthylensorbitfettsäureester (C12-C18),
Alkylaminsalze (C18-C18), die Polyoxyäthylenalkylamine
(C12-C18), die Polyoxyäthylenalkyläther
(C12-C18), die Polyoxyäthylenalkylallyläther (C8-C18),
die Alkyltrimethylammoniumhalogenide (C12-C18), die
Alkylbenzyldimethylammoniumhalogenide (C12-C18),
die Alkylpyridiniumhalogenide (C12-C18), die Alkylbetaine
(C12-C18) u. ä.
Der Zeitpunkt, zu welchem das oberflächenaktive Mittel dem Nährmedium zugesetzt wird, variiert in
Abhängigkeit von dem speziellen angewendeten oberflächenaktiven Mittel. Der größte Effekt wird jedoch
festgestellt, wenn das oberflächenaktive Mittel gleichzeitig mit dem Einimpfen des Mikroorganismus in das
Nährmedium oder während des Anfangsstadiums der Züchtung zugegeben wird. Es versteht sich, daß eine
Mischung zweier oder mehrerer oberflächenaktiver Mittel zum Nährmedium gegeben werden kann, wenn
dies erwünscht ist.
Die günstigerweise zuzusetzende Menge des oberflächenaktiven Mittels kann innerhalb weiter Grenzen
variiert werden, darf aber natürlich das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus nicht behindern.
Die Menge hängt von dem besonderen Typ des oberflächenaktiven Mittels und des zur Fermentation
verwendeten Mirkoorganismus ab. Die optimale Menge liegt bei 50 bis 2000 μ-g auf 1 ml Kulturlösung.
Alle Mikroorganismen, die imstande sind, 5'-Purin-
nucleotide zu produzieren, können erfindungsgemäl:
verwendet werden. Entweder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedium ist dafür geeignet, so
lange es nur die für das Wachstum des angewendeter Mikroorganismenstammes notwendigen Nährstoffe
enthält. Als Kohlenstoffquelle dienen einzeln oder ir Kombination Kohlenhydrate, wie Glukose, Fruktose
Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Me lasse usw., oder andere Quellen, wie Glycerin, Mannit
Sorbit usw. Als Stickstoffquelle dienen einzeln ode: in Kombination verschiedene anorganische oder or
ganische Verbindungen wie Harnstoff oder Ammo niumsalze (Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Am
moniumnitrat, Ammoniumphosphat usw.) oder Ami nosäuren oder stickstoffhaltige natürliche Substanzei
wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Per ton, Fischmehl, Caseinhydrolysate, Casaminosäur
Fischpreßsäfte, Reiskleieextrakte usw. Als anorganische Salze dienen einzeln oder in Kombination
Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat,
Eisensulfat oder andere Eisensalze, Manganchlorid, Calciumchlorid usw. Alle speziellen, zum Wachstum
des bestimmten Mikroorganismus erforderlichen Nährstoffe sollten dem Nährmedium ebenfalls in geeigneten
Mengen zugesetzt werden.
Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wie aerobes Schütteln der Kultur, oder
durch aerobes Rühren einer Submerskultur, bei einer Temperatur von etwa 25 bis 37° C und einem
pH von etwa 5,5 bis 8,0. Nach etwa 3 bis 7 Tagen der Züchtung unter diesen Bedingungen werden im Züchtungsmedium
bemerkenswert große Mengen an 5'-Purinnucleotiden gefunden.
Nach beendeter Züchtung können die 5'-Purinnucleotide
vom Fermentationsfiltrat mit den üblichen Mitteln abgetrennt werden, beispielsweise also durch
Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, durch Extraktion mit Lösungsmitteln, durch Ausfällung mit
Metallsalzen, durch Chormatographie oder ähnliche Methoden.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Wenn nicht anders vermerkt,
sind die angegebenen Prozentgehalte Gewichtsprozente.
Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 19 183 wird als Einsaatstamm verwendet. 20 ml-Teile eines Einsaatzüchtungsmediums,
bestehend aus 3,3"% Glukose, 1% Hefeextrakt, 1% Pepton, 0,25% NaCl und 0,2%
Harnstoff, werden in konische 250-ml-Flaschen gegossen.
Nach Sterilisation der Flaschen mit dem Einsaatzüchtungsmedium wird der Einsaatstamm unter aerobem
Schütteln 24 Stunden lang bei 28° C gezüchtet.
Ein Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung wird hergestellt:
12% Glukose,
1% K2HPO4,
1% KH2PO4,
1 % Bouillon,
1% MgSO4-7H2O,
0,01% CaCl2 -2H2O,
1 mg ZnSO4 · 7H2O, pro Liter,
20 mg FeSO4 · 7H2O pro Liter,
20 mg L-Cystin pro Liter,
30 μg Biotin pro Liter,
15 mg /S-Alanin pro Liter,
20 mg FeSO4 · 7H2O pro Liter,
20 mg L-Cystin pro Liter,
30 μg Biotin pro Liter,
15 mg /S-Alanin pro Liter,
0,5 mg Thiamin-hydrochlorid pro Liter,
50 mg Adenin pro Liter,
50 mg Guanin pro Liter,
50 mg Adenin pro Liter,
50 mg Guanin pro Liter,
0,7% Harnstoff.
40 ml-Teile dieses Fermentationsmediums werden in einzelne Sagakuchi-Kolben gegossen. Nach ihrer
Sterilisation durch Hitze werden 4 ml-Teile der obenerwähnten Einsaatkultur in die Sagakuchi-Kolben
mit den Fermentationsmedien gegeben, unter gleichzeitiger Zugabe verschiedener Konzentrationen an
Polyoxyätyhlensorbitfettsäureestern (Tween) mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen als oberflächenaktiven Mitteln.
Die oberflächenaktiven Mittel werden vor der Zugabe zu dem Züchtungsmedium getrennt sterilisiert.
Das bestimmte verschiedenen Kolben zugesetzte oberflächenaktive Mittel und die angereicherten Mengen
5'-Inosinsäure, die nach 7 Tage langer Züchtung unter aeroben Bedingungen bei 31° C in der Kulturflüssigkeit
gefunden wurden, sind in Tabelle 1 gezeigt.
30
| Zugesetztes oberflächenaktives Mittel |
Menge an zugesetztem oberflächenaktivem Mittel |
Menge an produzierter 5'-Inosinsäure |
| ^g/ml) | (mg/ml) | |
| Tween 20 | 500 1000 1500 2000 |
- '17,1 17,9 19,5 20,0 |
| Tween 40 | 1000 1500 2000 |
18,5 19,8 20,5 |
| Tween 60 | 1000 1500 2000 |
19,8 25,1 24,5 |
| Tween 80 | 500 1000 1500 |
20,1 21,3 21,2 |
| Tween 85 * |
1000 1500 2000 |
20,0 20,1 21,3 |
| Kein Zusatz (Kontrolle) |
— | 15,5 |
35
40
Die Züchtung wird mit demselben Mikroorganismus und unter den gleichen Bedingungen und Verfahren
wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die nach 7 Tage langem Züchten in der Fermentationsflüssigkeit angereicherten Mengen 5'-Inosinsäure bei
Zugabe von Stearylaminacetat und Alkalaminsalz in verschiedenen Konzentrationen und zu verschiedenen
Zeiten der Zugabe sind in Tabelle 2 aufgeführt.
| Zugesetztes oberflächenaktives Mittel | Zeitpunkt des Zusatzes (nach Züchtungsstunden) |
Menge an zugesetztem oberflächenaktivem Mittel (Hg/ml) |
Menge an produzierter 5'-Inosinsäure (mg/ml) |
| Stearylaminacetat | 0 | 100 200 |
20,0 24,1 |
Fortsetzung
| Zugesetztes oberflächenaktives Mittel | Zeitpunkt des Zusatzes (nach Züchtungsstunden) |
-- | Menge an zugesetztem oberflächenak tivem Mittel |
Menge an produzierter 5'-Inosinsäure |
| 24 '_ | (ng/ml) | (mg/ml) | ||
| Stearylaminacetat | 500 | 25,0 | ||
| 24 | 250 | 18,2 | ||
| 500 | 20,3 | |||
| 1000 | 24,0 | |||
| Acetamine 86 (Alkylaminsalz) | O | 100 | 20,5 | |
| 200 | 24,4 | |||
| 500 | 24,9 | |||
| C17H33C ON(CH3)C2H4S O3Na | O | 100 | 20,2 | |
| 150 | 24,6 | |||
| 200 | 22,3 | |||
| 250 | 18,5 | |||
| 500 | 19,0 | |||
| 1000' | 22,1 | |||
| Kein Zusatz (Kontrolle) | — | . · 16,0 |
Micrococcus glutamicus ATCC Nr. 14 305 wird als Einsaatstamm in die Kolben eingeimpt. Die Züchtung
Einsaatstamm verwendet. Ein Einsaatzüchtungsme- 30 wird 24 Stunden lang unter aerobem Schütteln bei
28°
dium aus 2% Glukose, 1% Pepton und 0,8% Hefeextrakt wird in 300-ml-Anteilen in konische 2-1-Kolben
gegossen. Nach deren Sterilisation mit Hitze wird der 3 C durchgeführt. 3 1 eines Fermentationsmediums
mit den folgenden Bestandteilen werden in ein 5-1-Fermentationsgefaß
gefüllt:
10% Glukose,
0,6% K2HPO4,
0,6% KH2PO4,
0,6% K2HPO4,
0,6% KH2PO4,
0,2% MgSO4-7H2O,
0,004% MnSO4-4H2O,
1% Natrium-Citrat,
0,1% Harnstoff,
u,± /ο nainsiuii,
100 μg Biotin pro Liter,
100 μg Adenin pro Liter.
100 μg Biotin pro Liter,
100 μg Adenin pro Liter.
Nach Sterilisation des Fermentationsmediums durch Hitze werden 300 ml des obigen Einsaatzüchtungsmediums
in den Fermenter eingeimpft. Die Züchtung wird 3 Tage lang bei 32° C unter Belüftung und Rühren
durchgeführt. Der pH-Wert des Züchtungsmediums wird während der Züchtung mit Ammoniaklösung
auf 6,8 gehalten.
Oberflächenaktive Mittel werden dem Züchtungsmedium in verschiedenen Konzentrationen nach
24stündiger Züchtung zugesetzt. Die nach beendeter Züchtung angereicherten Mengen 5'-Inosh&äure sind
in Tabelle 3 aufgeführt.
| Zugesetztes oberflächenaktives Mittel |
Menge an zugesetztem oberflächenaktivem Mittel fcg/ml) |
Menge an produzierter 5'-Inosinsäure (mg/ml) |
| Tween 60 Tween 80 |
1000 1500 2000 1000 1500 2000 |
7,0 7,7 7,1 7,3 8,0 7,0 |
| Zugesetztes oberflächenak tives Mittel |
Menge an zugesetztem oberflächenaktivem Mitte! |
Menge an produzierter 5'-Inosinsäure (mg/ml) |
| Stearylaminacetat Kein Zusatz (Kontrolle) |
100 300 500 |
7,1 7,8 8,2 - 5,2 |
Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 wird als Einsaatstamm verwendet. Man bereitet eine
Einsaatkultur, indem man diesen Stamm 24 Stunden lang bei 30° C in einem wäßrigen Nährmedium aus
3% Glukose, 1% Bouillon, 1% Pepton und 0,25% NaCl züchtet.
Die Fermentation wird in der gleichen Weise, wie im Beispiel 3 beschrieben, in dem Züchtungsmedium
mit der folgenden Zusammensetzung durchgeführt:
10% Glukose,
1,0% KH2PO4,
1,0% K2HPO4,
1,0% MgSO4-7H7O,
1,0% K2HPO4,
1,0% MgSO4-7H7O,
10 mg ZnSO4 · 7H2O pro Liter,
0,01% CaCl2-2H2O,
0,001% FeSO4-7H2O,
20 mg L-Cystin pro Liter,
15 mg ^-Alanin pro Liter,
30 μg Biotin pro Liter,
20 mg L-Cystin pro Liter,
15 mg ^-Alanin pro Liter,
30 μg Biotin pro Liter,
0,5 mg Tiiiamin-Hydrochlorid pro Liter,
0,2% Harnstoff.
Die Züchtung wird 1 Tag lang unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Dann werden 3 mg Adenin
pro Milliliter und verschiedene Konzentrationen oberflächenaktiver Mittel, wie in Tabelle 4 angegeben,
zugefügt und die Züchtung über weitere 2 Tage durchgeführt. Die als Ergebnis dieses Verfahrens angereicherten
Mengen Adenosin-5'-triphosphat sind in Tabelle 4 gezeigt.
| Menge an | Menge an | |
| Zugesetztes | zugesetztem | produziertem |
| oberflächenaktives | oberflächenaktivem | Adenosin- |
| Mittel | Mittel | 5'-triphosphat |
| (μ&ΊηΙ) | . (mg/ml) | |
| Tween | 500 | 9,5 |
| 1000 | 10,6 | |
| . 1500 | 9,9 | |
| Tween 40 | 500. | 9,8 |
| 1000 | 10,1 | |
| 1500 | 10,3 | |
| Acetamüie 86 | 100 | 9,5 |
| (Alkylaminsalz) | 300 | 9,7 |
| 500 | 10,6 | |
| Kein Zusatz | —. | 6,2 |
| (Kontrolle) |
. Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 wird als Einsaatstamm verwendet. Dieses Bacterium
wird 24 Stunden lang unter aerobem Schütteln bei 300C in einem Züchtungsmedium aus 3% Glukose,'
0,5% Pepton, 0,1% K2HPO4, 0,1% MgSO4-7H2O,
0,01 % CaCl2 ■ 7H2O, 0,001 % FeSO4 · 7H2O, 0,001 %
ZnSO4-7H2O, 20 mg L-Cystin pro Liter, 15 mg
ß-Alanin pro Liter, 50 mg Natriumglutamat pro Liter,
μg Biotin pro Liter, 0,5 mg Thiaminhydrochlorid pro Liter, 0,0002% MnSO4-4H2O und 0,2% Harnstoffgezüchtet.
Die Fermentation wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 3 beschrieben ausgeführt. Das verwendete
Züchtungsmedium hat folgende Zusammensetzung:
10,0% Glukose,
0,4% Bouillon,
1,4% KH2PO4,
1,4% K2HPO4,
1,4% MgSO4 -7H2O,
0,01% CaCl2-2H2O,
0,005% ZnSO4-7H2O,
0,002% FeSO4 · 7H2O,
20 mg L-Cystin pro Liter,
15 mg ^-Alanin pro Liter,
30 μg Biotin pro Liter,
20 mg L-Cystin pro Liter,
15 mg ^-Alanin pro Liter,
30 μg Biotin pro Liter,
0,5 mg Thiamin-Hydrochlorid pro Liter,
0,2% Harnstoff.
Nach 24 Stunden der Züchtung unter aeroben Bedingungen werden dem Züchtungsmedium verschiedene
Konzentrationen oberflächenaktiver Mittel zugesetzt. Nach 48 Stunden weiterer Züchtung werden
4 mg Guanin pro Milliliter zugesetzt. Die nach weiteren 6 Stunden der Züchtung (nach Zugabe des
Guanins) angereicherten Mengen 5'-Guanylsäure sind in Tabelle 5 angegeben.
| Zugesetztes | Menge an | Menge an | |
| oberflächenaktives Mittel |
zugesetztem | produzierter | |
| 15 | oberflächenaktivem Mittel |
5'-Guanylsäure | |
| Tween 60 | fcg/ml) | (mg/ml) | |
| 500 | 6,4 | ||
| - | 1000 | 7,1 | |
| 20 | Tween 85 | 1500 | 6,8 |
| 500 | 6,3 | ||
| 1000 | 7,0 | ||
| 25" | Stearylaminacetat | 1500 | 6,7 |
| 100 | 6,9 | ||
| 300 | 7,0 | ||
| Kein Zusatz | 500 | 7,5 | |
| 30 | (Kontrolle) | — | 3,8 |
Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872, derselbe Mikroorganismus wie im Beispiel 5, wird als
Einsaatstamm verwendet. Eine Einsaatkultur davon erhält man auf die gleiche Weise und in demselben
Medium, wie im Beispiel 5 beschrieben.
Die Züchtung wird entsprechend dem im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren in folgendem Fermentationsmedium durchgeführt:
15% Glukose,
0,4% Bouillon,
1,0% KH2PO4,
1,0% K2HPO4,
1,0% MgSO4 · 7H2O,
0,01% CaCl2-2H2O, .
0,4% Bouillon,
1,0% KH2PO4,
1,0% K2HPO4,
1,0% MgSO4 · 7H2O,
0,01% CaCl2-2H2O, .
20 mg FeSO4 · 7H2O pro Liter,
10 mg ZnSO4 · 7H2O pro Liter,
40 μg MnSO4 · 4H2O pro Liter,
15 mg jS-Alanin pro Liter,
20 mg L-Cystin pro Liter,
30 μg Biotin pro Liter,
5 μg Thiamin-Hydrochlorid pro Liter,
0,2% Harnstoff.
10 mg ZnSO4 · 7H2O pro Liter,
40 μg MnSO4 · 4H2O pro Liter,
15 mg jS-Alanin pro Liter,
20 mg L-Cystin pro Liter,
30 μg Biotin pro Liter,
5 μg Thiamin-Hydrochlorid pro Liter,
0,2% Harnstoff.
Nach 24 Stunden Züchtung werden dem Züchtungsmedium verschiedene oberflächenaktive Mittel in
verschiedenen Konzentrationen zugesetzt, wie in Tabelle 6 angegeben. 30 Stunden nach Beginn der
Züchtung werden dem Züchtungsmedium 6 mg Hypoxanthin pro Milliliter zugesetzt. Die nach 3 Tagen
langer Züchtung unter aeroben Bedingungen angereicherten Mengen 5'-Inosinsäure sind in Tabelle 6
verzeichnet.
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10 1/
| Zugesetztes oberflächenaktives Mittel |
Menge an zugesetztem oberflächen aktivem Mittel fcg/ml) |
Menge an produzierter 5'-Inosinsäure (mg/ml) |
| Tween '60 Stearylaminacetat Kein Zusatz (Kontrolle) |
' 500 1000 1500 100 300 500 |
19,8 21,6 20,9 19,8 20,6 21,7 17,0 |
Die Fermentation wird mit demselben Stamm, Züchtungsmedium und Verfahren wie im Beispiel 1
durchgeführt, außer der Zugabe von'40 mg MnSO4. ■-.
4H2O pro Liter. Nach 3 Tagen langer Züchtung werden
dem Züchtungsmedium verschiedene oberflächenaktive Mittel der Nymeen-Reihe, in verschiedenen
Konzentrationen zugesetzt. Die nach 7 Tage langer Züchtung in der Kulturflüssigkeit angereicherten
Mengen 5'-Inosinsäure sind in Tabelle 7 aufgezeigt.
| Zugesetztes oberflächenaktives; : Mittel ; |
Menge an zugesetztem Oberflächen- , aktivem Mittel |
Menge an J produzierter , 5'-Inosinsäure (mg/mll ! |
| Nymeen S-204 (PoIy- oxyäthylenstearylamin- äthylenoxid, 4 IVJoI) Nymeen S-210 (PoIy- oxyä thylenstearylamin- äthylenoxid, 4" Mol) Nymeen S-215 (Poly oxyä thylenstearylamin- äthylenoxid, 4 Mol) Kein Zusatz (Kontrolle) |
250 500 , 750 250 500 1000 250 500 1000 |
23,8 26,7 27,1 23,4 28,6 29,2 24,7 28,6 30,2 15,2 |
' Die Fermentation wird mit demselben Stamm und Züchtungsmedium und unter den gleichen Bedingungen
und dem gleichen Verfahren wie im Beispiel! durchgeführt. Nach 24 Stunden langer Züchtung werden
dem Züchtungsmedium verschiedene Konzentrationen der oberflächenaktiven Mittel Polyoxyäthylenoleyläther,
Polyoxyäthylencetyläther, PoIyoxyäthylenoctylallyläther
und Polyoxyäthylennonylallyläther zugesetzt. Die nach 7tägiger Züchtung^
in der KTflturfiüssigkeit angereicherten Mengen
5'-Inosinsäure sind in Tabelle 8 angegeben.
Zugesetztes
oberflächenaktives
Mittel.
Nissan nonion E-208
(Polyoxyä thylenoleyläther)
(Polyoxyä thylenoleyläther)
Nissan nonion P-208
(Polyoxyäthylencetyläther)
(Polyoxyäthylencetyläther)
Nissan nonion HS-204,5
(Polyoxyä thylenoctylallyläther)
(Polyoxyä thylenoctylallyläther)
Nissan nonion HS-206
(Polyoxyäthylenoctylallyläther)
(Polyoxyäthylenoctylallyläther)
Nissan nonion NS-210
(Polyoxyä thylennonylally lather)
(Polyoxyä thylennonylally lather)
Nissan nonion NS-212
(Polyoxyä thylennonyl)-allyläther)
(Polyoxyä thylennonyl)-allyläther)
Kein Zusatz (Kontrolle)
Menge an zugesetztem oberflächenaktivem Mittel
500 1000
500 1000
1000 1500
1000 1500
1000 1500
1000 1500
Menge an
produzierter
5'-Inosinsäure
(mg/ml)
19,5 18,9
19,4 16,2
19,7 18,6
19,1
19,0
21,3 20,0
17,6 19,8
14,9
Die Fermentation wird mit demselben Stamm, Züchtungsmedium und Verfahren wie im Beispiel 1
durchgeführt. Nach 3 Tage langem Züchten werden dem Züchtungsmedium verschiedene Konzentrationen
verschiedener oberflächenaktiver Mittel der Alkyl-_ trimethylammoniumhalogenid-.Alkylbenzyldimethylammoniumhalogenid-,
Alkylpyridiniumhalogenid- und Alkylbetainreihe zugesetzt. Die nach 7 Tage langer Züchtung in der Kulturflüssigkeit angereicherten
Mengen an 5'-Inosinsäure sind in Tabelle 9 verzeichnet.
Zugesetztes
oberflächenaktives
Mittel
Stearyltrimethylammoniumchlorid
Myristyldimethylbenzylammoniumchlorid
Cetylpyridiniumchlorid
Alkylbetain
Kein Zusatz
Menge an .. zugesetztem oberflächenaktivem Mittel
250 500 750
250 500 750
250 500 750
750 1000 1500
5'-Inosinsäur«
(mg/ml)
17,8 22,1 19,6
18,6 23,4 20,1
20,4 22,8 17,8
15,9 18,4 20,1
13,8
1 Ö17 Ö36
Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 wird als Einsaatstamm verwendet. Eine Einsaatkultur
erhält man, indem man diesen Stamm 24 Stunden lang bei 300C in einem wäßrigen Nährmedium aus 3%
Glukose, 1% Bouillon, 1% Pepton und 0,25% NaCl züchtet.
Die Fermentation wird nach der im Beispiel 3 beschriebenen Weise in folgendem Züchtungsmedium
durchgeführt:
10% Glukose,
1,0% KH2PO4,
1,0% K2HPO4, 1,0% MgSO4-7H2O,
10 mg ZnSO4 · 7H2O pro Liter,
10 mg ZnSO4 · 7H2O pro Liter,
0,01% CaCl2-2H2O,
0,001% FeSO4-7H2O,
20 mg L-Cystin pro Liter, 15 mg ^-Alanin pro Liter,
30 μg Biotin pro Liter,
30 μg Biotin pro Liter,
0,5 mg Thiamin-Hydrochlorid pro Liter,
0,2% Harnstoff.
1 Tag lang wird unter aeroben Bedingungen gezüchtet. Dann werden 3 mg Adenin pro Milliliter und
verschiedene Konzentrationen oberflächenaktiver Mittel, wie in Tabelle 10 angegeben, dem Züchtungsmedium zugesetzt, und die Züchtung weitere 2 Tage
durchgeführt. Die als Ergebnis dieses Verfahrens erhaltenen Mengen angereicherten Adenosin-5'-triphosphats
sind in Tabelle 10 verzeichnet.
| Zugesetztes oberflächenaktives Mittel |
Menge an zugesetztem oberflächen aktivem Mittel (μδ/πιΐ) |
Adenosin- 5'-triphosphat (mg/ml) |
| Nymeen S-215 (PoIy- oxyäthylenstearylamin- äthylenoxid, 4 Mol) Myristyldimethyl- benzylammoniumchlorid Cetylpyridiniumchlorid Kein Zusatz |
250 500 1000 250 500 750 250 500 750 |
6,0 6,4 6,8 6,2 7,8 7,2 6,8 7,7 6,9 5,6 |
Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 wird als Einsaatstamm verwendet. Dieses Bacterium
wird 24 Stunden lang unter aerobem Schütteln bei 300C in einem Züchtungsmedium aus 3% Glukose,
0,5% Pepton, 0,1% K2HPO4, 0,1% KH2PO4, 0,1%
MgSO4 ■ 7H20,0,01% CaCl2 · 7H20,0,001% FeSO4 ·
7H2O, 0,001% ZnSO4-7H2O, 20 mg L-Cystin pro
Liter, 15 mg /S-Alanin pro Liter, 50 mg Natriumglutamat
pro Liter, 30 μg Biotin pro Liter, 0,5 mg Thiaminhydrochlorid
pro Liter, 0,0002% MnSO4-4H2O
und 0,2% Harnstoff gezüchtet.
Die Fermentation wird in derselben Weise, wie im Beispiel 3 beschrieben, ausgeführt. Das hierfür verwendete
Züchtungsmedium hat folgende Zusammensetzung :
10,0% Glukose,
0,4% Bouillon,
1,4% KH2PO4,
1,4% K2HPO4,
1,4% MgSO4-7H2O,
0,01% CaCl2-2H2O,
0,005% ZnSO4-7H2O,
0,002% FeSO2-7H2O,
20 mg L-Cystin pro Liter,
15 mg /S-Alanin pro Liter,
30 μg Biotin pro Liter,
20 mg L-Cystin pro Liter,
15 mg /S-Alanin pro Liter,
30 μg Biotin pro Liter,
0,5 mg Thiamin-Hydrochlorid pro Liter, 0,2% Harnstoff.
Nach 24 Stunden der Züchtung unter aeroben Bedingungen
werden dem Züchtungsmedium verschiedene Konzentrationen oberflächenaktiver Mittel zugesetzt.
Nach weiteren 48 Stunden wird eine Menge von 4 mg Guanidin pro Milliliter zugesetzt. Die nach
weiteren 6 Stunden langer Züchtung (nach Zugabe des Guanidine) angereicherten Mengen 5'-Guanylsäure
sind in Tabelle 11 angegeben.
Zugesetztes
oberflächenaktives
Mittel
Nymeen S-215 (PoIyoxyäthylenstearylaminäthylenoxid, 4 Mol)
Lauryltrimethylamrnoniumchlorid
Lauryldimethylbenzylammoniumchlorid
Cetylpyridiniumchlorid
Kein Zusatz
Menge an zugesetztem oberflächenaktivem Mittel
fcg/ml)
250
500
1000
250 500 750
250 500 750
250 500 750
5'-Guanylsäure
(mg/ml)
5,4 6,8 6,2
6,1 6,9 6,7
6,0' 7,4 6,4
6,2 7,1 6,6
4,0
Die Fermentation wurde in dem gleichen Medium und unter denselben Bedingungen wie im Beispiel 1
durchgeführt, wobei Brevibacterium ammoniagenes ATCC 19 183, Micrococcus glutamicus ATCC 14 305
und Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 als Stämme eingesetzt wurden.
Nach 20 Stunden vom Beginn der Fermentation an wurden Lecithin und S-Dodecyl-isothioharnstoffhydrochlorid
zugegeben. Die in der Fermentationsflüssigkeit angesammelten Mengen an 5'-Inosinsäure,
5'-Guanylsäure und Adenosin-5'-triphosphat sind in Tabelle 12 zusammengefaßt.
| 5'-Purinnucleotid | Menge (y/ml) |
ATCC 19183 (mg/ml) |
5'-Inosinsäure | ATCC 6872 (mg/ml) |
5'-Guanylsäure | Adenosin- 5'-triphosphat |
| Zugegebenes oberflächenaktives Mittel |
500 1000 |
19,6 23,4 |
ATCC 14305 (mg/ml) |
22,6 27,0 |
ATCC 6872 (mg/ml) |
ATCC 6872 (mg/ml) |
| Lecithin | 500 1000 |
21,6 25,0 |
7,1 8,4 |
24,7 26,5 |
5,7 6,8 |
6,8 7,7 |
| S-Dodecylisothioharnstoff- hydrochlorid |
— | 15,2 | 7,7 8,3 |
13,4 | 7,0 6,7 |
7,4 7,2 |
| Kein Zusatz \ | 5,5 | 4,2 | 5,2 | |||
\ Beis
Die Fermentation wurde in dem gleichen Medium und unter denselben Bedingungen wie im Beispiel 1
durchgeführt, wobei Escherichia coli ATCC 14 621, Bacillus subtilis ATCC 14 617, Flavobaceterium harrisonii
ATCC 14 589, Bacillus cereus ATCC 14 603 und Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871 ein-
piel 13
gesetzt wurden. 10 Stunden nach Beginn der Fermentation wurden verschiedene oberflächenaktive Mittel
in verschiedenen Konzentrationen zugefügt. Die in den Fermentationsflüssigkeiten angesammelten Mengen
an 5'-Inosinsäure, 5'-Guanylsäure und Adenosin-5'-triphosphat sind in Tabelle 13 zusammengefaßt.
| 5'-Purinnucleotid zugesetztes oberflächenaktives Mittel |
Menge | 5'-Ino ATCC 14621 |
>insäure · ATCC 14617 |
5'-Guan ATCC 14589 |
ylsäure ATCC 14603 |
Adenosin- 5'-triphosphat ATCC 6871 |
| (y/ml) | (mg/ml) | (mg/ml) | (mg/ml) | (mg/ml) | (mg/ml) | |
| Tween 60 (Polyoxyäthylensorbitfett- säureester) |
1000 500 |
3,1 3,9 |
7,2 8,0 |
7,8 9,2 |
1,1 2,4 |
"■ 3,7 4,2 |
| Nymeen S-215 (Polyoxyäthylenstearyl- aminäthylenoxid, 4 Mol) |
100 250 |
2,6 4,4 |
6,3 8,6 |
6,5 9,0 |
0,8 1,9 |
3,2 5,0 |
| Cetylpyridiniumchlorid | 100 250 |
3,0 4,2 |
6,0 7,5 : |
7,5 10,3 |
1,2 2,0 |
3,5. 4,8 |
| Nissen nonion NS-210 (Polyoxyäthylen- nonylallyläther) |
500 1000 |
2,8 3,9 |
■ 7,0 ': 9,3 |
8,6 10,1. . |
1,1 1,9 |
3,6 5,1 |
| C17H33CON(CH3)C2H4SO3Na | 100 250 |
3,2* 4,6 |
6,5 8,2 |
9,2- 11,4 |
1,3 1,8 |
2,8 5,8 |
| Lecithin | 500 1000 |
2,4 3,5 |
6,4 7,8 |
8,5 10,4 |
1,0 2,1 |
3,4 6,1 |
| S-Docecylisothioharnstoff-hydrochlorid | 500 1000 |
2,7 3,6 |
7,1 8,8 |
8,8 11,2 |
0,9 1,7 .. |
2,9 5,7 |
| fCein Zusatz | — | 1,8 | 4,5 | ' 5,7 | 0,5 | 2,0 ■"'■ |
Beispiel 14 . .
- Die Fermentation-wurde in dem gleichen Medium Beginn der Fermentation wurden verschiedene ober-
und unter denselben Bedingungen wie im Beispiel 1 flächenaktive Mittel in verschiedenen Konzentrationen
durchgeführt, wobei Micrococcus glutamicus ATCC 55 zugefügt. Die in den Fermentationsflüssigkeiten ange-
14 620, Bacillus subtilis ATCC 14 618, Streptomyces sammelten Mengen an 5'-Adenylsäure, Adenosin-
sp ATCC 15 131 und Brevibacterium ammoniagenes 5'-diphosphat und Guanosin-5'-triphosphat sind in
ATCC 6872 zum Einsatz kamen. 10 Stunden nach Tabelle 14 zusammengefaßt.
5'-Purinnucleotid
zugegebenes oberflächenaktives Mittel
zugegebenes oberflächenaktives Mittel
Menge
(y/ml)
(y/ml)
5'-Adenylsäure
ATCC 14620
(mg/ml)
(mg/ml)
ATCC 14618
(mg/ml)
(mg/ml)
Adenosin-5'-diphosphat
ATCC 15131
(mg/ml)
Guanosin-5'-triphosphat
ATCC 6872 (mg/ml)
Tween 60 (Polyoxyäthylensorbitfettsäureester)
1000
1500
1500
1,6
2,8
2,8
1,8
3,1
3,1
1,4 2,1
3,2 4,5
i Oi/ öDO
Fortsetzung
| 5'-Purinnucleotid zugegebenes oberflächenaktives Mittel |
• Menge (y/ml) |
5'-Aden ATCC 14620 (rag/ml) |
ylsäure ATCC 14618 (mg/ml) |
Adenosin- 5'-diphosphat ATCC 15131 (mg/ml) |
Guanosin- S'-triphosphat ATCC 6872 (mg/ml) |
| Nymeen S-215 (Polyoxyäthylenstearylamin- äthylenoxid, 4 Mol) |
100 250 |
1,8 2,5 |
2,4 3,6 |
1,4 2,9 |
3,0 4,2 |
| Cetylpyridiniumchlorid | 100 250 |
2,3 4,0 |
1,9 3,7 |
1,8 2,5 |
3,7 4,8 |
| Nissan nonion NS-210 (Polyoxyäthylennonyl- allyläther) |
500 . 1000 |
1,9 3,7 |
2,4 4,0 |
1,4 3,1 |
2,8 . 3,9 |
| C17H33CON(CH3)C2H4SO3Na | 100 250 |
2,2 3,5 |
2,1 3,3 |
1,5 2,7 |
3,2 5,4 |
| Lecithin | 500 1000 |
1,7· - 4,0 |
2,5 3,7 |
1,4 3,0 |
3,1 4,7 |
| S-Docecyl-isothioharnstoff-hydrochlorid | 500 1000 |
^ 2,3 4,1 |
2,4 4,3 |
1,8 3,1 |
4,0 4,9 |
| Kein Zusatz | — | 1,0 | 1,0 ' | 0,8 | 2,0 |
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden durch aerobes Züchten eines 5'-Purinnucleotide
produzierenden Mikroorganismus in einem hierfür üblichen Nährmedium bei einer Temperatur von etwa 25 bis 37° C und einem
pH-Wert von etwa 5,5 bis 8,0, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium
mindestens ein oberflächenaktives Mittel zusetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das oberflächenaktive Mittel
dem Nährmedium zu Beginn der Züchtung zusetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das oberflächenaktive Mittel
in einer Menge von 50 bis 2000 μg pro Milliliter Nährlösung anwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als oberflächenaktives Mittel
einen Polyoxyäthylensorbitfettsäureester mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, ein Alkylaminsalz mit
8 bis 18 Kohlenstoffatomen, ein Polyoxyäthylenalkylamin mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, einen
Polyoxyäthylenalkyläther mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen oder einen Polyoxyäthylenalkylallyläther
mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkylaminsalz mit 8 bis
18 Kohlenstoffatomen Alkyltrimethylammoniumhalogenid mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, Alkylbenzyldimethylammoniumhalogenid
mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, Alkylpyridiniumhalogenid mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen oder Alkylbetain
mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen verwendet.
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