DE1271661B - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 5'-Inoinsaeure - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND DEUTSCHES -007W^ PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

Deutsche Kl.:

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

C12d

C07d

6b-16/03

12 ρ-7/10

P 12 71 661.9-41 (K 57477)

25. Oktober 1965

4. Juli 1968

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 5'-Inosinsäure durch Züchten von Mikroorganismen in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen und unter Zusatz von Hypoxanthin, Adenin oder Mischungen dieser Verbindungen.

5'-Inosinsäure, die eine Hypoxanthinribosid-5-phosphorsäure darstellt, ist eine bekannte Verbindung. 5'-Inosinsäure wurde bisher aus Fleischextrakt, aus Muskeln durch enzymatische Desaminierung der Muskeladenylsäure, durch Hydrolyse von Inosintriphosphat und durch Züchten von 5'-Inosinsäure bildenden Mikroorganismen hergestellt.

Aus den USA.-Patentschriften 3118 820 und 3 152 966 ist es bereits bekannt, 5'-Inosinsäure durch Züchten von Mikroorganismen in Adenin bzw. Hypoxanthin enthaltenden Medien herzustellen.

Die in den beiden genannten Literaturstellen beschriebenen Verfahren unterscheiden sich insofern erheblich von dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von S'-Inosinsäure, als die gemäß den USA.-Patentschriften verwendeten Stämme Adenin oder Hypoxanthin erfordernde Stämme sind, so daß diese Stämme nicht wachsen können, sofern nicht diese Substanzen dem Züchtungsmedium zugesetzt werden. Demgegenüber wird dem erfindungsgemäß verwendeten Stamm Aspergillus sojae Adenin oder Hypoxanthin als Vorläufer und nicht als Nährmittel zugegeben. Daher kann der erfindungsgemäß verwendete Stamm ohne vorherige Zugabe von Adenin oder Hypoxanthin zu dem Züchtungsmedium wachsen.

Die 5'-Inosinsäure ist in Wasser und Ameisensäure leicht und in Alkohol und Äther wenig löslich. Beim Kochen mit Säure wird die 5'-Inosinsäure hydrolysiert, wobei 1 Mol Phosphorsäure, 1 Mol Hypoxanthin und 1 Mol D-Ribose anfällt.

Das erfmdungsgemäße Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 5'-Inosinsäure durch Züchten von Mikroorganismen in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen und unter Zusatz von Hypoxanthin, Adenin oder Mischungen davon besteht darin, daß man als Mikroorganismus Aspergillus sojae ATCC 16 320 einsetzt.

Für Hypoxanthin oder Adenin kann man auch einen natürlichen Hypoxanthin oder Adenin enthaltenden Stoff und als solchen eine Kulturflüssigkeit von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15 510 verwenden.

Dieses Verfahren läßt sich gegenüber den bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von S'-Inosinsäure in einfacher und billiger Weise in industriellem Maßstab durchführen, wobei das erhaltene Endpro-Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung
von 5'-Inoinsäure

Anmelder:

Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokio

Vertreter:

Dr.-Ing. H. Ruschke

und Dipl.-Ing. H. Agular, Patentanwälte,

8000 München 27, Pienzenauer Str. 2

Als Erfinder benannt:
Takashi Nara, Tokio;
Masanaru Misawa, Kawasaki-shi;
Toshio Komuro, Tokio (Japan)

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 26. Oktober 1964 (60 433)

dukt, das in hohen Ausbeuten anfällt, von hoher Reinheit ist.

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus Aspergillus sojae ATCC 16 320 ist ein neuer Mutantenstamm, der durch Behandlung des Grundstammes Aspergillus sojae mit UV-Strahlung erhalten wurde. Der Mutantenstamm unterscheidet sich von dem Grundstamm dadurch, daß zu seinem Wachstum Histidin erforderlich ist. Außerdem sind die Sporen des Mutantenstammes weiß, während die Sporen des Grundstammes schwarz sind. Daher sollte dem Züchtungsmedium L-Histidin oder eine natürliche Substanz, die Histidin enthält, zugesetzt werden. Zur Züchtung des erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismus kann jedes Züchtungsmedium, das zur Züchtung von Stämmen, die zur Gattung Aspergillus gehören, verwendbar ist, eingesetzt werden, beispielsweise das synthetische Czapek-Dox-Synthese-Züchtungsmedium oder irgendein anderes geeignetes Züchtungsmedium.

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Die Eigenschaften des erfindungsgemäß verwende- dem Nährmedium in geeigneten Mengen zugegeben ten neuen Stammes Aspergillus sojae ATCC 16 320 werden,
sind folgende: Große Mengen an 5'-Inosinsäure sammeln sich an,

Aspergillus sojae gehört zu den gelbgrünen Kojo- falls Kaliumphosphat und Magnesiumsulfat in verHefen und ähnelt Aspergillus oryzae mit Ausnahme 5 hältnismäß hohen Konzentrationen als anorganische der folgenden zwei Punkte: Verbindungen verwendet werden, beispielsweise

0,8 Gewichtsprozent Kaliumdihydrogenphosphat,

1. Die Oberfläche der Konidien ist etwas gerauht 0,8 Gewichtsprozent Dikaliumhydrogenphosphat oder oder stachelig, und 0,8 Gewichtsprozent Magnesiumsulfat.

2. die Oberfläche des Konidiophorums ist glatt ¹⁰ Wie vorstehend bereits erwähnt, kann die Fermen-(Kinichiro Sakaguchi und Koichi Yamada tierung gemäß der Erfindung auch unter Verwendung

■ in »Journal of Agricultural Chemical Society«, eines rein synthetischen Nährmediums ausgeführt Japan, 20, 72, 141 [1944]). werden. In diesem Fall ist die Zugabe einer ausrei

chenden Menge Histidin zusätzlich zu einer assimi-

Wie bereits erwähnt, werden erfindungsgemäß dem 15 lierbaren Kohlenstoffquelle, einer anorganischen Medium, in welchem der Stamm Aspergillus sojae Stickstoffquelle und anorganischen Substanzen we-ATCC 16 320 gezüchtet wird, Purinbasen, wie Hypo- sentlich, und weiterhin ist der Zusatz einer geringen xanthin oder Adenin, zugesetzt. In einem Hypoxan- Menge einer Quelle für Aminosäuren, beispielsweise thin enthaltenden Züchtungsmedium bildet Aspergil- ein Gemisch von Aminosäuren in Lösung, Casaminolus sojae ATCC 16 320 die 5'-Inosinsäure als ent- 20 säuren u. dgl., günstig. Wie üblich, können wachssprechendes 5'-Purinnucleotid. In einem Adenin ent- tumsbegünstigende Mittel, wie Biotin oder Aminohaltenden Züchtungsmedium wird 5'-Inosinsäure an säuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure, dem Stelle von 5'-Adenylsäure als entsprechendes 5'-Pu- Medium zugesetzt werden.

rinnucleotid angereichert. Falls Adenin dem Züch- Die Züchtung kann auch ausgeführt werden, indem

tungsmedium zugesetzt wird, erfolgt bei Beginn der 25 eine ausreichende Menge einer Kohlenstoffquelle, Züchtung die Bildung von Hypoxanthin aus dem einer Stickstoffquelle, anorganischer Substanzen, Hi-Adenin. Man nimmt an, daß Hypoxanthin durch distin u. dgl., einer Kulturflüssigkeit zugesetzt wird, enzymatische Desaminierung von Adenin gebildet die aus einer Fermentierung zur Erzeugung einer wird, worauf sich die Bildung der 5'-Inosinsäure aus Purinbase oder eines Purinnucleosids als Quelle für dem Hypoxanthin anschließt. 30 Purinbasen wie Hypoxanthin oder Adenin stammt,

Erfindungsgemäß sind sowohl synthetische als beispielsweise einer Fermentationsflüssigkeit der Ferauch natürliche Züchtungsmedien geeignet, sofern sie mentierung von Hypoxanthin unter Verwendung von die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des Brevibacterium ammoniagenes ATCC15 510. Anders angewandten Stammes enthalten. Derartige Nähr- ausgedrückt, ist es sehr günstig, eine Fermentierungsstoffe sind bekannt, und hierzu gehören Substanzen, 35 flüssigkeit zu verwenden, in der Stämme, die Purinwie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, an- basen wie Hypoxanthin oder Adenin bilden, gezüchorganische Verbindungen u. dgl., die von den Mikro- tet wurden, wenn die entsprechenden Mengen an Organismen verwertet werden, wenn sie in entspre- Nährstoffquellen dazu zugegeben wurden, chenden Mengen eingesetzt werden. So sind z. B. als Die zur Herstellung von 5'-Inosinsäure angewandte

assimilierbare Kohlenstoffquellen Kohlehydrate, wie 40 Fermentierung wird unter aeroben Bedingungen aus-Glucose, Fructose, Maltose, Rohrzucker, Stärke, geführt, beispielsweise durch aerobes Schütteln dei Stärkehydrolysate u. dgl., oder andere assimilierbare Kultur oder durch Rühren einer Submerskultur bei Kohlenstoffquellen, wie Glycerin, Mannit, Sorbit einer Temperatur von etwa 20 bis 40° C und bei einem u. ä., zu nennen. Diese Substanzen können sowohl pH-Wert von etwa 4,0 bis 9,0. Nach etwa 2- bis einzeln als auch in Mischungen von zwei oder mehr 45 lOtägiger Kultivierung unter diesen Bedingungen sind Verbindungen eingesetzt werden. Als assimilierbare bemerkenswert große Mengen an 5'-Inosinsäure in Stickstoffquelle können verschiedene Arten anorgani- dem Kulturmedium vorhanden. Weitere Mengen an scher oder organischer Salze oder Verbindungen ver- 5'-Inosinsäure finden sich auch in den Zellkörpern wendet werden, wie z. B. Harnstoff oder Ammonium- selbst.

salze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Am- 50 Nach der Beendigung der Fermentierung kann die moniumnitrat, Ammoniumphosphat u. ä., oder eine 5'-Inosinsäure aus dem Fermentierungsfiltrat nach oder mehrere Aminosäuren oder natürliche stickstoff- üblichen Maßnahmen abgetrennt werden, z. B. durch haltige Stoffe, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Behandlung mit einem Ionenaustauschharz, Extrak-Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Caseinhydroly- tion mit Lösungsmitteln, Ausfällung mit Metallsalzen, sate, wie NZ-Amine (Warenbezeichnung für eine 55 Chromatographie od. dgl.

Reihe von Caseinhydrolysaten), lösliche Stoffe aus In den folgenden Beispielen sind die Prozentsätze

Fischen, Reisschalenextrakt u. dgl. Auch diese Stoffe auf das Gewicht bezogen, falls nichts anderes angekönnen entweder einzeln oder in Kombination von geben ist.
zwei oder mehr derartigen Substanzen verwendet Beisoiel 1

werden. Zu den anorganischen Verbindungen, die 60 ^

zum Kulturmedium zugesetzt werden können, gehö- Als Impfkultur wurde Aspergillus sojae ATCC

ren Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kalium- 16320 verwendet. Dieser Stamm wurde auf einem dihydrogenphosphat,Kaliummonohydrogenphosphat, festen Kulturmedium, das 8% Rohrzucker, 0,1 % Eisensulfat oder andere Eisensalze und ähnliche Ver- K₂HPO₄, 0,05 «/0 MgSO₁ · 7 H₂O, 0,2% NaNO₃, bindungen. Wie vorstehend ausgeführt, müssen Hi- 65 0,05% KCl, 0,005 «/<> FeSO₄ · 7H₂O, 0,1% L-Hististidin oder natürliche Substanzen, die Histidin ent- din-hydrochlorid und 2% Agar enthielt, kultiviert, halten, da sie für das Wachstum des hier angewand- Die Kultur wurde in einem Roux-Kolben verfestigt, ten Aspergillus sojae ATCC 16 320 erforderlich sind, Nachdem die Sporenfermentierung in ausreichendem

Ausmaß erfolgt war, wurden 30 ml sterilisiertes Wasser in den Roux-Kolben gegeben, so daß sich eine einheitliche Sporensuspension ergab.

1 ml dieser Suspension wurde in 250-ml-Erlenmeyer-Kolben eingeimpft, die jeweils 30 ml des Fermentierungsmediums enthielten.

Das angewandte Fermentierungsmedium hatte die folgende Zusammensetzung:

10% Glucose,
0,8% K₁HPO₄,
0,8% KH₂PO₄,
0,8% MgSO₄-7H₂O,
0,01% CaCl₂-2H₂O,
1 % Hefeextrakt,

250 mg/ml L-Histidin-hydrochlorid,
0,2% Hypoxanthin.

Das Fermentiermedium wurde hergestellt durch Auflösen der vorstehenden Bestandteile in destilliertem Wasser und Einstellung des pH-Wertes auf 8,2 mit 5 n-NaOH. Die entsprechende Menge dieser Lösung wurde dann in jeden Kolben eingebracht. Die Kolben wurden bei 120° C in einem Autoklav sterilisiert. Harnstoff wurde getrennt sterilisiert und zu dem Fermentierungsmedium in einer Menge von 0,6% zugesetzt.

Die Fermentierung wurde durch aerobes Schütteln der Sporensuspension in einer Drehschüttelmaschine bei 30° C ausgeführt. Nach 7tägiger Fermentierung fanden sich 6,9 mg/ml Natrium-5'-inosinat in der Fermentierungsflüssigkeit. Dieses Produkt wurde dann aus der Flüssigkeit durch übliche Mittel abgetrennt, z. B. durch Behandlung mit einem Ionenaustauschharz.

Beispiel 2

In der gleichen Weise wie im Beispiel 1 beschrieben, mit derselben Impfkultur wurde das Fermentierungsverfahren durchgeführt. Jedoch enthielt in diesem Fall das Fermentierungsmedium 1,5% NZ-Amin an Stelle von 1% Hefeextrakt. Die anderen Fermentierungsbedingungen waren wie im Beispiel 1. Nach 6tägiger Züchtung unter diesen Bedingungen fanden sich 7,3 mg/ml Natrium-5'-inosinat in der Fermentierungsflüssigkeit.

Beispiel 3

Die im Beispiel 1 beschriebene Impfkultur wurde bei einer Fermentierung verwendet, bei der 10% Rohrzucker an Stelle der 10% Glucose nach Beispiel 1 eingesetzt wurden. Sämtliche anderen Bedingungen waren wie im Beispiel 1. Nach 7tägiger Züchtung unter diesen Bedingungen fanden sich 5,8 mg/ml Natrium-5'-inosinat in der Fermentierungsflüssigkeit.

Beispiel 4

Brevibacterium ammoniagenes ATCC15510 wurde als Impfbakterium verwendet. Eine geringe Menge dieser Kultur wurde in 30 ml eines Impfmediums, das in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben enthalten war, eingeimpft. Das Impfmedium enthielt 2% Glucose, 3% Pepton, 50 mg/1 Adenin, 30 y/1 Biotin, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄-JH₂O und 0,2% Harnstoff. Der pH-Wert des Mediums betrug vor der Sterilisierung 7,3.

Die Kultur wurde aerob 24 Stunden lang geschüttelt. 2 ml des erhaltenen Kulturmediums wurden dann in Kolben eingeimpft, welche 20 ml des folgenden Fermentierungsmediums enthielten:

10% Glucose,

2% Pepton,

1 % Hefeextrakt,
50 mg/ml Adenin,
30 7/I Biotin,

0,05% K₂HPO₄,

0,1% KH₂PO₄,

0,05% MgSO₄-7 H₂O,

0,6% Harnstoff.

Der Harnstoff wurde getrennt sterilisiert und zu dem Fermentiermedium zugegeben. Der pH-Wert des Mediums betrug vor der Sterilisierung 8,2%.

Die Fermentierung wurde unter denselben Bedingungen wie im Beispiel 1 ausgeführt. Nach 72stündiger Züchtung fanden sich 4,3 mg/ml Hypoxanthin in der Fermentierflüssigkeit. Nach Entfernung der Zellkörper aus der Fermentierungsflüssigkeit wurden zu dem verbliebenen Fermentiermedium 7% Glucose, 0,7% K₂HPO₄, 0,7% KH₂PO₄, 0,7% MgSO₄ · 7H₂O und 50 mg/ml L-Histidin zugegeben. 1 ml einer Impfkultur von Aspergillus sojae ATCC 16 320 wurde dann nach Einstellung des pH-Wertes auf 8,2 mit 5 n-NaOH darin inokuliert. Mit der Züchtung wurde dann bei aerobem Schütteln bei 30° C fortgefahren. Nach 6 Tagen fanden sich 9,2 mg/ml Natrium-5'-inosinat in der Fermentierungsflüssigkeit. Dieses wurde durch übliche Maßnahmen daraus gewonnen.

Beispiel 5

Es wurde dieselbe Züchtung und dasselbe Fermentierungsverfahren wie im Beispiel 1 mit Aspergillus sojae ATCC 16 320 mit der Ausnahme durchgeführt, daß 0,2% Adenin zu dem Fermentiermedium an Stelle von 0,2 % Hypoxanthin zugegeben wurde. Die anderen Züchtungsbedingungen sind mit denjenigen vom Beispiel 1 identisch.

Nach 7tägiger Züchtung fanden sich in der Fermentierflüssigkeit 5,8 mg/ml Natrium-5'-inosinat. Gleichzeitig wurde 0,12 mg/ml Hypoxanthin erzeugt.

Beispiel 6

Es wurde dieselbe Impfkultur wie im Beispiel 1 beschrieben für ein Fermentierungsverfahren angewandt, jedoch wurden 0,2 % Adenin zu dem Fermentiermedium des Beispiels 2 an Stelle von 0,2% Hypoxanthin nach 3tägiger Züchtung zugegeben. Die anderen Züchtungsbedingungen waren mit denjenigen des Beispiels 1 identisch.

Nach 6tägiger Züchtung fanden sich 6,2 mg/ml Natrium-5'-inosinat in der Fermentierflüssigkeit. Zusätzlich wurden auch 0,14 mg/ml Hypoxanthin gebildet.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 5'-Inosinsäure durch Züchten von Mikroorganismen in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen und Zusatz von Hy-

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poxanthin, Adenin oder Mischungen davon, da- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gedurch gekennzeichnet, daß man als kennzeichnet, daß man als natürlichen Hypoxan-Mikroorganismus Aspergillus sojae ATCC 16 320 thin oder Adenin enthaltenden Stoff eine Kultureinsetzt, flüssigkeit von Brevibakterium ammoniagenes

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- 5 ATCC 15 510 verwendet.

kennzeichnet, daß man als Zusatz für Hypoxan-

thin oder Adenin einen natürlichen Hypoxanthin In Betracht gezogene Druckschriften:

oder Adenin enthaltenden Stoff verwendet. USA.-Patentschriften Nr. 3 118 820, 3 152 966.

809 568/472 6.68 © Bundesdruckerei Berlin