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Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure und zur Herstellung
der dabei verwendeten Penicillinamidase. Die Erfindung betrifft ein verbessertes
Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch den enzymatischen Abbau
eines Penicillins. Die Erfindung betrifft auch ein verbessertes Verfahren zur Herstellung
eines Enzympräparates, das Penicilline, besonders Benzylpenicillin, enzymatisch
hydrolysieren kann. In der belgischen Patentschrift 569 728 und in der wissenschaftlichen
Literatur, besonders in einer Veröffentlichung von Batchelor et a1. in Nature 183,
Seiten 257 bis 258, (1959) werden verschiedene Verfahren zur Herstellung
und Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure, die die folgende Strukturformel hat
beschrieben. Hei diesen Verfahren wird ein Penicillin erzeugender Schimmel in einem
Nährmedium gezüchtet und die 6-Aminopenicillansäure oder eines ihrer Salze wird
aus der erhaltenen Gärflüssigkeit abgetrennt. Die wissenschaftliche Literatur beschreibt
auch gewisse Verfahren zur Herstellung von Enzympräparaten, die zahlreiche Penicilline
zur 6-Amiiiopenicillansäure enzymatisch abbauen können und die hier "Penicillin-Amidase"
genannt werden; siehe US-Patentschriften 3 014 845 und 3 014 846; Nature
187 , 236-238, (196o); J.Am.Chem.Soc., $2, 3790 bis 3791, (1960). Alle
diese bekannten Verfahren erreichen eine Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure aus
Benzylpenicillin, die bedeutend niedriger als die theoretische Ausbeute ist. Ein.
verbessertes Verfahren, das höhere tatsächliche Ausbeuten an 6-Aminopenicillansäure
ergibt, ist deshalb theoretisch möglich, obwohl es bisher unbekannt war. Ein solches
Verfahren ist äußerst wünschenswert, damit die Herstellungskosten der 6-Aminopenicillansäure
herabgesetzt werden können, was bei der Herstellung und Verwendung synthetischer
Penicilline von großer Bedeutung ist.
Gegenstand der Erfindung ist
deshalb ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure, das
die enzymatische Aufspaltung eines Panicillins einschließt. Ein weiterer Gegenstand
der Erfindung ist die Herstellung wässriger Lösungen von Penicillinamidase mit erhöhter
Wirksamkeit und Nützlichkeit. Das Verfahren nach der Erfindung zur Herstellung von
6-Amino -epnicillansäure besteht darin, daß Escherichia coli zur Herstellung einer
Penicillinamidase enthaltenden Gärbrühe fermentiert wird, die Brühe mit einer Metallverbindung
des nachstehend beschriebenen Typs und einem quartären Ammoniumsalz des nachstehend
beschriebenen Typs behandelt wird, die festen Substanzen nach der Behandlung aus
der Brühe abgetrennt werden, die in oder auf diesen festen Substanzen enthaltene
Penicillinamidase in Wasser zu einer wässrigen Lösung der Penicillinamidase aufgelöst
wird, die zurückbleibenden festen Substanzen aus der wässrigen Lösung der Penicillinamidase
entfernt werden, die entstehende gereinigte wässrige Lösung der Penicillinamidase
mit einem Absorbierungsmittel, wie Aktivkohle, in Berührung gebracht wird und anschließend
alle festen Substanzen aus dieser wässrigen Lösung entfernt werden und die entstehende
wässrige Lösung der Penicillinamidase mit einem Penicillin in Berührung gebracht
wird, wodurch dieses Penicillin zu 6-Aminopenicillansäure enzymatisch hydrolysiert
wird.
Ein bevorzugtes Verfahren der Erfindung zur Herstellung einer
wässrigen Lösung der Penicillinamidase mit erhöhter Wirksamkeit besteht darin, daß
eine Penicillinam idas enthaltende Gärbrühe mit (1) einer Metallverbindung-und (2)
einem quartären Ammoniumsalz wie nachstehend beschrieben
behandelt. wird,
die festen Substanzen aus der Brühe nach der Behandlung abgetrennt werden, die in
oder auf diesen festen Substanzen enthaltene Penicillinamidase in Wasser aufgelöst
wird, die zurückbleibenden festen Substanzen aus der wässrigen Lösung der Penicillinamidaseentfernt
werden, die entstehende wässrige Lösung der Penicillinamidase mit Aktivkohle in
Berührung gebracht wird, und anschließend alle ungelösten festen Substanzen aus
dieser wässrigen Lösung entfernt werden. Bei der Herstellung einer Penicillinam
idase enthaltenden Brühe können die in der Technik bekannten Verfahren verwendet
werden. Diese Verfahren schließen auch das Züchten von Escherichia coli in einem
geeigneten Nährmedium ein. Die so hergestellte Gärbrühe enthält zusätzlich zur Penicillinamidase
und dem Rückstand des Nährmediums die Stoffwechselprodukte des Mikroorganismus,
ebenso die vegetative Züchtung des Mikroorganismus und dem Nährmedium zur Steigerung
der Penicillinamidaseerzeugung zugesetzte Substanzen.
Gemäß der
Erfindung wird einer solchen Gärbrühe eine wassere
lösliche Metallverbindung
des nachstehend beschriebenen
Typs in Mengen zugesetzt, die zwischen ungefähr
1 bis ungefähr 20 Gramm pro Liter der Brühe liegen. Es werden unge-
fähr
2 bis 5 Gramm der Metallverbindung pro Liter der Brühe vorzugsweise
verwendet. Der Brühe wird auch ein quartäres Ammoniumsalz
des nachstehend beschriebenen Typs in Mengen
zugesetzt, die zwischen
ungefähr 0,025 zu 0,15 Volumen-;6 der ursprünglichen Brühe (d.h.
ungefähr 0,25 g bis 1,5 g
pro Liter der ursprünglichen Brühe),
vorzugsweise zwischen
ungefähr 0,05 und 0,10 Volumen-% der ursprünglichen
Brühe (d.h. ungefähr 0,5 g bis 1,0 g pro Liter der ursprünglichen
Brühe),
liegen. Es ist wünschenswert, jedoch nicht erfor-
derlich, der
Brühe von ungefähr 2 ml bis ungefähr 20 ml
Toluol
pro Liter der Brühe, vorzugsweise ungefähr 5 ml bis ungefähr
10 ml pro Liter der Brühe, zuzusetzen. Die
Metallverbindung,
das quartäre Ammoniumsalz und Toluol können der Brühe getrennt zugesetzt
und dann sorgfältig vermischt werden. Das Toluol und quartgre Ammoniumsalz
können jedoch zuerst miteinander vermischt und anschließend
der Brühe zugesetzt und mit.ihr vermischt werden. Vorzugs-
weise
wird zuerst die Metallverbindung der Brühe zugesetzt.
Die
nach dem Verfahren der Erfindung verwendbaren wasser-
löslichen Metallverbindungen
sind die Hydroxyde und Me-
tallsalze, die ein zweiwertiges Metallkation
enthalten,
das die Penicillinamidase nicht zerstört
oder hemmt und
das vorzugsweise keine schädliche Wirkung auf Penicillin
ausübt.
Demnach sind Metallkationen wie Quecksilber, Eisen
und Kupfer zu vermeiden.
Eine bevorzugte Gruppe der beim
Verfahren gemäß der Erfindung nützlichen Metallverbin-
dungen
sind die Metallverbindungen der Formel MX2, worin
M ein Metallkation
aus der Gruppe der Kalzium-, Barium-und Magnesiumkationen und X ein Anion
aus der Gruppe der
Hydroxyl-, Chlorid-, Nitrat-, Bromid-,
Acetat- und Pro-
pionatanionen ist. Die bevorzugte Metallverbindung ist
Kalziumnitrat,
das vorzugsweise in Mengen von ungefähr 2,5 g pro Liter der Ausgangsgärbrühe
verwendet wird. Diese
Metallverbindungen oder deren metallisches
Kation ermög-
lichen es offensichtlich, daB Penicillinamidase
aus der
Brühe mit den festen Substanzen gewonnen wird, sie ver-
hindern
jedoch eine nachfolgende Solubilisation dieser
Penicillinamidase
in Wasser nicht.
Die nach dem Verfahren der Erfindung
nützlichen quartären Ammoniumsalze sind die Monoalkyltrimethylammoniumchloride
und -bromide, worin die Alkylgruppe von 12 bis 18 Kohlen-
stoffatome
besitzt. Diese quartären Ammoniumsalze haben
die Formeln R-N(CH
) C1 und R-N(CH ) Br, worin R zu der
Gruppe der aliphatischen
Kohlenwasserstoffradikale mit
einschließlich 12 bis 18 Kohlenstoffatomen
gehört. Sö kann R Dodecyl, Tetradecyl, Hexadecyl, Octdecyl, Octadecenyl
und Octdecadienyl und deren Gemische sein.
Die oben
beschriebenen quartären Ammoniumsalze sind im allgemeinen im Handel erhältlich;
ein solches Salz, das im Handel nicht erhalten werden kann, läßt sich nach den in
der technischen Literatur, beschriebenen Verfahren herstellen. Die quartären Ammoniumsalze
und deren Gemische sind manchmal in Beimischung mit Wasser, Isopropanol oder anderen
Lösungsmitteln und einer geringen Menge Natriumchlorid erhältlich; solche
Gemische können als :Duelle für die gewünschten quartären Ammoniumsalze verwendet
werden. Das bevorzugte quartäre Ammoniumsalz ist Hexadecyltrimethylammoniumchlorid.
Sogleich nach der Vermischung der Metallverbindung und dem quartären Ammoniumsalz
und Toluol, falls dieses verwendet wird, mit der Brühe werden die festen Substanzen
und die überstehende Flüssigkeit abgetrennt, z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren
und die überstehende Flüssigkeit, die gewöhnlich weniger als 10 % der ursprünglich
in der Brühe vorliegenden Penicillinamidase enthält, wird abgesetzt.
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Da sich Penicillinamidase allmählich in der überstehenden Flüssigkeit
löst, ist es erwünscht, die festen Substanzen schnell von der überstehenden Flüssigkeit
zu trennen, um den Verlust an Penicillinamidase in der überstehenden Flüssigkeit
so gering wie möglich zu halten. Der größere Teil der ursprünglich in der
Brühe vorliegenden Penicillinamidase, im allgemeinen über 90 %, ist in oder auf
den aus der
überstehenden Flüssigkeit entfernten festen Substanzen
enthalten. Die mit den festen Substanzen gewonnene Penicillinamidase wird in Wasser
gelöst, vorzugsweise indem die festen Substanzen in Wasser vermischt werden. Es
ist wünschenswert, die Lösung der Penicillinamidase in dieser Stufe durchzuführen,
indem eine Menge Wasser verwendet wird, die ungefähr 10 ;6 bis 200 % des ursprünglichen
Volumens der Brühe entspricht. Werden weniger als gleiche Volumen Wasser verwendet,
so wird die Penicillinamidaselösung konzentriert. Erneute Suspension in einer Menge
Wasser, die ungefähr 1/5 bis 1/2 der ursprünglichen Brühe entspricht, wird vorgezogen.
Die festen Substanzen werden so lange in Berührung mit dem Wasser gehalten, bis
die Penicillinamidase in Lösung übergegangen ist. In einem bevorzugten Verfahren
wird die wässrige Suspension der festen Substanzen ungefähr 1 bis ungefähr 24 Stunden
lang gerührt, währenddessen die Penicillinamidase, die in oder auf diesen festen
Substanzen enthalten ist, in Lösung übergeht. Wenn der Brühe zuvor Toluol zugesetzt
wurde, beträgt die Zeit, in der die Penicillinamidase in Lösung übergeht, etwa 2
bis 4 Stunden, d.h. in einer kürzeren Zeit als ohne Zugabe von Toluol. Wenn
die Penicillinamidase gelöst ist, werden die festen Substanzen aus der
wässrigen
Suspension z.B. durch Filtrieren oder Zentri-
fugieren entfernt. Die
so gesammelten festen Substanzen
werden dann mit Wasser gewaschen und
abgesetzt und das
Waschwasser wird der überstehenden Flüssigkeit zugesetzt.
Es
ist wünschenswert, die festen Substanzen durch Fil-
trieren zu sammeln
und die gesammelten festen Substanzen
mit Wasser in einer
so berechneten Menge zu waschen, daB die Konzentration der Penioillinamidase
der im Verfahren
der Hydrolyse von Benzylpenicillin gewünschen
Konzen-
tration angepaßt ist. Im allgemeinen ist es wünschenswert,
die
gesammelte überstehende Flüssigkeit auf ungefähr 1/3
des Volumens
der ursprünglichen Brühe zu bringen.
In der nächsten Stufe wird der
Penicillinamidase enthal-
tenden überstehenden Flüssigkeit Aktivkohle
in einer Menge
zugesetzt, die ungefähr 0,2 g bis 2,0 g pro Liter
der ur-
sprünglichen Gärbrühe entspricht; vorzugsweise werden 0,5
g
bis 1,5 g Aktivkohle pro Liter der ursprünglichen Brühe
und im allgemeinen ungefähr 1,0 g pro Liter der ursprüng-
lichen
Brühe verwendet. Andere Absorbiermittel, wie Alu-
miniummagnesium-Silikat,
alkalische Erden und andere
schwache Adsorbiermittel,
können anstelle der Aktivkohle
verwendet werden, diese anderen Mittel
sind im allgemeinen
aber weniger wirksam als Aktivkohle. Es ist also
wünschenswert, jedoch nicht unbedingt erforderlich, an dieser
Stellle
der überstehenden Fldssiakeit ein auartäres
Ammoniumsalz
des oben beschriebenen Typs in einer Menge
zuzusetzen, die ungefähr
0,2 bis 10,0 g pro Liter der
überstehenden Flüssigkeit entspricht; ungefähr
1 bis 3 g pro Liter des quartären Ammoniumsalzes auf der Grundlage
des Volumens
der überstehenden Flüssigkeit werden bevorzugt verwendet und im allgemeinen
werden ungefähr 2 g pro Liter verwendet. Die Verwendung des quartären Ammoniumsalzes
ist
in diesem Zeitpunkt für das Verfahren wünschenswert,
wenn
die wässrige Lösung trübe ist. Es ist dann erforderlich,
das
Gemisch zu vermischen, damit eine vollständige Disper-
sion der Aktivkohle
und des quartären Ammoniumsalzes (falls
ein Salz verwendet wird) in
der überstehenden Flüssigkeit
entsteht und Adsorbiersubstanzen
auf der Aktivkohle ad-
sorbiert werden können. Die Aktivkohle und alle
anderen festen Substanzen in der überstehenden Flüssigkeit werden
dann
aus dieser z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren
entfernt.
Es ergibt sich eine Flüssigkeit, die im wesent-
liehen eine reine wässrige
Lösung von Penicillinamidase ist, die bei der Hydrolyse von Benzylpenicillin
verwendet
werden kann. In der Hydrolysenstufe wird ein natürliches
oder biosyn-
thetisches Penicillin, vorzugsweise Benzylpenicillin,
der
Penicillinamidaselösung zugesetzt und das entstehende
Hydrolysereaktionsgemisch
wird auf eine Temperatur von 20o bis 450 C, vorzugsweise 300 bis
409C, und einen pH von 6,5 bis 9,0, vorzugsweise einen pH
von ungefähr 8,
eingestellt und ungefähr 1 bis 30
Stunden unter diesen Bedingungen gehalten. Da der pH während der Hydrolysereaktion
dazu neigt, zu fallen, ist es erforderlich, während des Verlaufes der Hydrolysereaktion
geeignete pH-Wertregulierungen vorzunehmen. Die nach dem Verfahren der Erfindung
verwendbaren Penicilline sind natürliche Penicilline, z.B. Penicillin K und
die biosynthetischen Penicilline mit einer -,C-Methylengruppe in der Acylseitenkette.
Die äußerst nützlichen biosynthetischen Penicilline werden hergestellt, indem ein
Penicillinvorläufer einer Penicillingärbrühe zugesetzt wird. Die bevorzugten Penicilline
sind Benzylpenicillin und Phenoxymethylpenicillin. Nach Beendigung der enzymatischen
Hydrolyse kann die 6-Aminopenicillansäure aus dem Hydrolysat nach bekannten Arbeitsweisen
gewonnen werden. Nach einer für die Abtrennung und Gewinnung der 6-Aminopenicillansäure
bevorzugten Arbeitsweise wird das Hydrolysat auf ungefähr pH 2 gesäuert und gefiltert
und alles nicht umgesetzte Penicillin und die während der Reaktion abgespaltete
Phenylessigsäure wird aus dem Filtrat entfernt, indem mit einem organischen Lösungsmittel,
a.B. Methylisobutylketon, n-Butanol under Butylacetat, bei einem sauren pH, z.B.
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pH 2 bis 3, extrahiert wird. Die 6-Aminopenicillansäure kann anschließend
wie in der US-Patentschrift 2 941 995 beschrieben ausgefällt oder
oder
aus der gereinigten Lösung wie in der U8-Patentschrift 3 008 956 beschrieben entfernt
werden. Es ist wünschenswert, daß die Gärbrühe nach der Gewinnung auf weniger als
ungefähr 400C abgekühlt wird und daß alle Lösungen, Suspensionen und Substanzen
des Verfahrens auf weniger als 400C während aller nachfolgenden Schritte vor der
Verwendung der Penicillinamidase in den Hydrolysiervorgängen gehalten werden. Vorzugsweise
wird die Temperatur aller Lösungen und Substanzen des Verfahrens auf ungefähr 50C
bis ungefähr 200C gehalten. Die Penicillinamidase enthaltende Gärbrühe bei der Gewinnung
hat im allgemeinen einen pH von ungefähr 9. Es ist wünschenswert, daß die Brühe,
die aus der Brühe erhaltenen festen Substanzen, die wässrigen Suspensionen der aus
der Brühe erhaltenen festen Substanzen und die aus der Brühe erhaltenen wässrigen
Suspensionen auf einem pH von weniger als 6 und nicht mehr als 10 gehalten werden.
Wenn Kalziumnitrat in der ersten Stufe verwendet wird, ist eine pH-Regulierung im
allgemeinen nicht erforderlich. Falls das metallische Ion, das in der ersten Stufe
verwendet wird, in einer basischen Form, z.B. als eine Base, wie ein Metallhydroxyd,
eingeführt wird, kann es erforderlich sein, ein Säureungsmittel, z.B. verdünnte
wässrige Salzsäure, zuzusetzen, um den pH herabzusetzen. Wenn solch ein metallasches
Ion
in einer sauren Form, z.B. als ein Salz, wie ein Metallchlorid, eingeführt wird,
kann es erforderlich sein, den pH anzuheben durch Zugabe einer Base, z.B. verdünntes
wässriges Natriumhydroxyd, zu der Brühe. Durch Zugabe von Toluol zu der ganzen Brühe
in der Stufe, in der Kalziumnitrat der ganzen Brühe zugesetzt wird, wird die Zeit
verringert, die erforderlich ist, um die Penicillinamidase aus der Masse
zu lösen. Während es wünschenswert ist, von ungefähr 2 bis ungefähr 20 ml
Toluol pro Liter der Brühe in dieser Stufe zu verwenden, wie oben ausgeführt wurde,
kann auch mehr Toluol verwendet werden, was jedoch keinen Nutzen mit sich bringt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1
Escherichia coli
wird unter submersen aeroben Bedingungen fermentiert und ergibt 71,5 Galionen (ungefähr
271 Liter) der gesamten Gärbrühe mit 2500 Penicillinamidaseeinheiten pro ml. Eine
"Penicillinamidaseeinheit" ist die Menge Penicillinamidase, die 1 meg. 6-Aminopenicillansäure
in drei Stunden bei 350C durch Hydrolyse von Kaliumbenzylpenicillin in einer wässrigen
Lösung mit 3 Gew.-% Kaliumbenzylpenicillin erzeugt. Dieser gesamten Brühe werden
3 369 ml einer
25 %-igen wässrigen Lösung von Kalziumnitrat (enthält
3,4 lbs Kalziumnitrat pro Gallon), 280 g Orthobenzylparachlorphenol, 2t30 g Cetyltrimethylammoniumbromid
(0,967 g pro Liter der Brühe; ungefähr 0,1 Volumen-% der Brühe) und 946 ml Toluol
zugesetzt. Die Brühe mit den zugesetzten Substanzen wird 15 Minuten lang
gerührt, gefiltert und die festen Substanzen werden mit 75 Liter Wasser gewaschen.
Die gewonnene feste und feuchte Masse wiegt 9988 g und eine Probe ergibt, daß sie
ungefähr 54 % Wasser enthält. Beispiel 2
Ein 100 g Teil der nach Beispiel
1 erhaltenen feuchten Masse wird in 200 ml einer 2 %-igen Kaliumphosphatpufferlösung
bei einem pH von 7,5 suspendiert. Dieser Suspension werden
6 g Kaliumbenzylpenicillin
zugesetzt. Das entstehende Gemisch wird 17 Stunden lang bei 35°C gerührt, gefiltert
und mit Wasser gewaschen, bis das Filtrat 630 ml beträgt. Der Gehalt an 6-Aminopenicillansäureim
Filtrat wird bestimmt und es wird festgestellt, dap die wirkliche Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure
aus Kaliumbenzylpenicillin ungefähr 67 % der theoretischen Ausbeute beträgt.
Beispiel 3
Ein 3,455 kg Teil der nach Beispiel 1 erhaltenen feuchten
Masse
wird in Wasser (ungefähr 3,8 Liter) 24 Stunden lang aufgeschwämmt und anschließend
gefiltert. Teil A : Einem 500 ml Teil des Filtrates werden 15
g Kaliumbenzylpenlcillin zugesetzt und das entstehende Gemisch wird 6 Stunden
lang bei 35°C und einem pH von 7,5 bis 8,5,
wobei der pH durch periodische
Zugabe von 10 %-igem wässrigem Natriumhydroxyd aufrechterhalten wird, gerührt. Nach
einer Hydrolyse von 6 Stunden wird der Gehalt an 6-Aminopenicillansäure im Hydrolysenreaktionsgemisch
gemessen und es wird festgestellt, daß die Ausbeute von 6-Aminopenicillansäure von
Fenicillin G 74 % der theoretischen Ausbeute beträgt. Teil B: Einem zweiten
500 ml Teil des Filtrates werden 5 g Aktivkohle (Darco KB) zugesetzt und das entstehende
Gemisch wird 15 Minuten lang gerührt und anschließend gefiltert. 6 g Kaliumbenzylpenicillin
werden einem 200 ml Teil des entstehenden farblosen Filtrates zugesetzt, wobei ein
Hydrolysenreaktionsgemisch gebildet wird, das bei einem pH von 7,5 bis 8,0 6 Stunden
lang bei 350C gehalten wird, wobei der pH durch periodischen Zusatz zum Reaktionsgemisch
von 10 96-igem wässrigem Natriumhydroxyd aufrechterhalten wird. Nach einer Hydrolyse
von 6 Stunden wird der Gehalt an 6-Aminopenicillansäure im Hydrolysenreaktionsgemisch
gemessen und es wird festgestellt, daß
die Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure
von Penicillin G 90 % der theoretischen Ausbeute beträgt. ,Teil C: Man arbeitet
wie in Teil B beschrieben, verwendet jedoch 4 g Kaliumbenzylpenicillin anstelle
von 6 g. Die Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure von Kaliumpenicillin G beträgt 90
% der theoretischen Ausbeute. Beispiel Eine Gärbrühe wird durch die Fermentierung
von Escherichia coli unter submersen aeroben Bedingungen nach den üblichen
Verfahren hergestellt und enthält 5 270 Penicillinamidaseeinheiten pro ml. Die folgenden
Versuche zeigen die Wirkung, wenn man verschiedene Mengen quartäres Ammoniumsalz
verwendet. Teil A: Eine Lösung von 2,5 g Kalziumnitratdihydrat, das in 6
ml Wasser gelöst ist, wird zu 1 L_ter dieser Gärbrühe zugesetzt. Nach dem Vermischen
wird die Brühe gefiltert und die gefilterte Masse wird mit 150 ml Wasser gewaschen.
Die gefilterte Masse wird nun in 200 ml Wasser suspendiert, 5 ml Toluol zugesetzt
und die Suspension wird 3 Stunden lang gerührt. Nach dem Rühren wird die Suspension
gefiltert und die gesammelten festen Substanzen werden mit 100 m1 Wasser gewaschen.
Das Filtrat wird mit 1 g Aktivkohle
(Dareo KB) und 1,2 ml "quartäres
Ammoniumsalz- . gemisch Nr. I" gerührt. "Quartäres Ammoniumsalzgemisch Nr. I" ist
im Handel von der Firma Armour & Company, Chicago, Illinois, unter
dem Warenzeichen "Arquad 16-50" erhältlich und ist ein flüssiges quartäres
Ammoniumsalzgemisch, das ungefähr 45 Gew.-% Hexadecyltrimethylammoniumchlorid, ungefähr
3 Gew.-% Octadecyltrimethylammoniumchlorid, ungefähr 2 Gew.-% Octadecenyltrimethylammoniumchlorid,
ungefähr 35 Gew.-% Isopropanol, ungefähr 14 Gew.-% Wasser und ungefähr 1 Gew.-%
Natriumchlorid enthält. Nach sorgfältigem Vermischen werden alle festen Substanzen
aus dem Gemisch durch Filtrieren entfernt und man erhält 280 ml einer im
wesentlichen reinen wässrigen Lösung von Penicillinamidase, die bei einer Probe
1950 Penicillinamidaseeinheiten pro ml enthält, ungefähr 10 % der ursprünglichen
in der Brühe vorhandenen Penicillinamidase. Teil B: Einem 1 Liter Teil dieser
Gärbrühe werden eine Lösung von 2,5 g in 6 ml Wasser gelöstem Kalziumnitratdihydrat
und 3 ml einer Lösung mit 10 ml Toluol und 4 ml quartäres Ammoniumsalzgemisch Nr.
I zugesetzt. Nach dem Vermischen wird die Brühe gefiltert und die gefilterte Masse
mit 150 ml Wasser gewaschen. Die gefilterte Masse wird dann in 200 ml Wasser,
dem 5 ml Toluol zugesetzt
werden, suspendiert und die Suspension wird
drei Stunden
lang gerührt. Nach dem Rühren wird die Suspension
gefiltert und die gesammelten festen Substanzen mit 100 ml Wasser gewaschen. Das
Filtrat wird mit 1 g Aktivkohle (Darco KB) und 1,2 ml quartäres Ammoniumsalzgemisch
Nr. I gerührt. Nach sorgfältigem Vermischen werden alle festen Substanzen aus dem
Gemisch durch Filtrieren entfernt und man erhält 350 ml einer im wesentlichen reinen
wässriger Lösung von Penicillinamidase, die bei einer Probe 9590 Penicillinamidaseeinheiten
pro ml enthält, ungefähr 64 % der ursprünglichen in der Brühe vorhandenen Penicillinamidase.
Teil C: Man arbeitet wie in Teil B beschrieben, verwendet jedoch 9 ml anstelle
von 3 ml Toluol-quartäre Ammoniumsalzlösung; die 9 ml enthalten ungefähr 1,3 g quartäres
Ammoniumsalz. Das Verfahren ergibt 300 ml einer im wesentlichen reinen wässrigen
Lösung von Periic i11 inam idase, die 500 Penicillinamidaseeinheiten pro ml oder
ungefähr 2,9 Penicillinamidase, die in dem ursprünglicher. Liter der Gärbrühe enthalten
war, aufweist. Teil D: Man arbeitet wie in Teil B beschrieben, verwendet
jedoch 6 ml anstelle von 3 ml der Toluol-quartären Ammoniumsalzlösung. Das Verfahren
ergibt 298 ml einer im wesentlichen reinen wässrigen Lösung von Penicillinamidase,
die
10 470 Penicillinamidaseeinheiten pro ml oder ungefähr 59 % Penicillinamidase, die
in dem ursprünglichen Liter der Gärbrühe enthalten war, aufweist.
Teil E: Man arbeitet wie in Teil ß beschrieben, verwendet jedoch 7 ml anstelle
von 3 ml der Toluol-quartären Ammoniumsalzlösung. Das Verfahren ergibt 318 ml einer
im wesentlichen reinen wässrigen Lösung von Penicillinamidase, die 9900 Penicillinamidaseeinheiten
pro ml oder ungefähr 59,7 % Penicillinamidase, die in dem ursprünglichen Liter der
Gärbrühe enthalten war, aufweist. Teil F: Man arbeitet wie in Teil ß beschrieben,
verwendet jedoch 7 ml anstelle von 3 ml der Toluol-quartären Ammoniumsalzlösung,
die der wässrigen Suspension der gesamten Masse und nicht der Brühe vor der Filtrierstufe,
in der die Masse aus der Gärbrühe erhalten wird, zugesetzt wird. Das Verfahren ergibt
310 ml einer im wesentlichen reinen wässrigen Lösung von Penicillinamidase, die
5390 Penicillinamidaseeinheiten pro ml oder ungefähr 32 % Penicillinamidase, die
in dem ursprünglichen Liter der Gärbrühe enthalten war, aufweist. Beispiel
5
Eine Gärbrühe wird durch die Fermentierung von Escherichia coli unter submersen
aeroben Bedingungen nach den üblichen
Verfahren hergestellt und
enthält 6 690 Penicillinamidaseeinheiten pro ml. Teil A: Einem 1 Liter Teil dieser
Gärbrühe werden eine Lösung von 2,5 g Kalziumnitratdihydrat, das in 6 ml
Wasser gelöst ist, und 2 ml eines quartären Ammoniumsalzgemisches Nr. I zugesetzt.
Nach dem Vermischen wird die Brühe gefiltert und die gefilterte Masse wird mit 150
ml Wasser gewaschen. Die gefilterte Masse wird anschließend unter Rühren in 250
ml Wasser drei Stunden lang suspendiert.
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Die Suspension wird nun gefiltert und die gefilterte Masse mit 200
ml Wasser gewaschen. Das Filtrat wird mit 1 g Aktivkohle (Darco KB) und 1,8 ml quartärem
Ammoniumsalzgemisch Nr. I gerührt. Nach sorgfältigem Vermischen werden alle festen
Substanzen aus dem Gemisch durch Filtrieren entfernt und man erhält 440 ml einer
im wesentlichen reinen wässrigen Lösung von Penicillinamidase mit 2 940 Penicillinamidaseeinheiten
pro ml, was ungefähr 19 % der Penicillinamidase, die in dem ursprünglichen Liter
der Gärbrühe enthalten war, entspricht.
Teil B: Man arbeitet wie in Teil
A beschrieben, setzt jedoch 5 ml Toluol der gesamten Brühe dann zu, wenn das Kalziumnitratdihydrat
zugesetzt wird. Das Verfahren ergibt 430 ml einer im wesentlichen reinen wässrigen
Lösung von Penicillinamidase, die 6 730 Penicillinamidaseeinheften
pro
ml oder ungefähr 43 % der Penicillinamidase, die in dem ursprünglichen Liter der
Gärbrühe enthalten war, aufweist.
Teil C: Man arbeitet wie in Teil B beschrieben,
läßt jedoch die 2 ml quartäres Ammoniumsalzgemisch Nr. I weg. Das Verfahren ergibt
400 ml einer im wesentlichen reinen wässrigen Penicillinamidaselösung, die 1 610
Penicillinamidaseeiriheiten pro ml oder ungefähr 10 $ der Penicillinamidase, die
in
dem ursprünglichen Liter der Gärbrühe vorhanden war, enthält.
Teil D: Man arbeitet wie in Teil B, ersetzt jedoch die 2 ml des quartären
Ammoniumsalzgemisches Nr. I durch 2 ml eines quartären Ammoniumsalzgemisches, das
ungefähr 4 Gew.-% Octyltrimethylammoniumchlorid, 4 l,/2 Gew.-% Decyltrimethylammoniumchlorid,
23 1/2 Gew.-% Dodecyltrimethylammoniumchlorid, 9 Gew.-% Tetradecyltrimethylammoniumchlorid,
4 Gew.-% Hexadecyltrimethylammoniuinchlorid, 2 1/2 Gew.-;ö Octadecyltrimethylammoniumchlorid,
2 1/2 Gew.-% Octadeceriyltrimethylammoniumchlorid, 1 Gew.-% Natriumchlorid, 36 Gew.-%
Isopropanol und 13,5 Gew.-% Wasser enthält. Das Verfahren ergibt 320 ml einer im
wesentlichen reinen wässrigen Penicillinamidaselösung, die 6 370 Penicillinamidaseeinheiten
pro ml oder ungefähr 31 % der Penicillinamidase, die in dein ursprünglichen Liter
der Gärbrühe vorhanden war, enthält.
Beispiel
6
Teil A:
Ein 6,91 kg Teil der feuchten nach
Beispiel 1 erhaltenen Masse wird in Wasser
(ungefähr 7,5
Liter)
24 Stunden lang unter Rühren suspendiert und anschließend
gefiltert. Ein 3784 ml Teil des Filtrats wird mit 1 Gew.-% Aktivkohle, bezogen auf
das Filtrat, vermischt und gefiltert. Zu 1348 ml des Filtrats (nach der Kohlebehandlung)
werden 1,9 g Ortobenzylparachlorphenol und 56,8 g Kaliumbenzylpenicillin in 540'
ml Wasser zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 17 Stunden lang bei 950F und einem
pH von 8, wobei der pH auf einem Wert von 8 durch Zugabe von wässrigem Natriumhydroxyd,
wenn erforderlich, gehalten wird, gerührt. Nach der Umsetzungszeit von 17 Stunden
enthält das Reaktionsgemisch 14 920 mcg./ml 6-Aminopenicillansäure (d6 % der theoretischen
Ausbeute) und 5300 Oxfordeinheiten pro ml Benzylpenic.illin (11 des gesamten während
der Reaktion zugesetzter. Penicillins);
| eine Probe des Reaktionsgemisches wird für die im Teil @: |
| beschriebene Verwendung zurückoehalten und die :.ea tion |
| weitere vier Stunden fortgesetzt. Nach beendeter Uu:- |
| setzungszeit von 21 Stunden enthält das ReaktionsgeT!j--. |
15 590 mcg./ml 5-Aminopenicillansäure (89,ö %
der ;'rteoretischen Ausbeute)
und Q270 Oxfordeinheiten Benzyipenicil» lin (6,8 % des gesamten dem Reaktionsgemisch
zugesetzten Penicillins). Ein 200 rnl Teil dieses 21-stündigen Reaktionsmediums
wird mit Schwefelsäure auf einen pH 2 eingestellt,
mit Methylisobutylketon
extrahiert und mit 10 %-igem wässrigem Natriumhydroxyd auf einen pii vor.
-
4 eingestellt. (-Aminopenicillansäure wird über eine Zeit von 4 Stunden
kristallisiert und anschließend durch Filtrieren gesammelt und getrocknet und wiegt
2,05 g. Das Verfahren ergibt eine Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure, die gleich
ist einer Ausbeute von 59 % der theoretischen Ausbeute von Benzylpenicillin zu 6-Aminopenicillansäure.
Teil B: Ein 500 ml Teil des wässrigen Reaktionsgemisches, der nach 17 Stunden
Hydrolyse wie in Teil A beschrieben abgenommen wird, wird mit wässriger Schwefelsäure
auf einen pH von 2 eingestellt und mit Methylisobutylketon extrahiert. Nach dem
Extrahieren wird die wässrige Schicht auf einen pH von 7 eingestellt und auf 100
ml vakuumkonzentriert. Die 100 ml Konzentrat werden auf einen pH von 4 kristallisiert.
Die ausgefällte 6-Aminopenicillansäure wird durch Filtrieren gesammelt, getrocknet
und wiegt 6,30 g und eine Probe ergibt 980 mcg./ml Das Verfahren ergibt eine Ausbeute
an 6-Aminopenicillansäure, die 71 % der theoretischen Ausbeute entspricht.