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Verfahren zur Abtrennung der Zellsubstanzen aus Fermentationsflüssigkeiten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Fennentationsbrühen durch
Abtrennung dei Zellsubstanzen und anderer Verunreinigungen aus denselben.
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Bei der Gewinnung von organischen Substanzen auf fermentativem Wege
fällt am Ende der Fermentation im allgemeinen eine sogenannte Fermentationsbrühe
an, welche außer den zu gewinnenden Endstoffen verschiedene feste oder halbfeste
Stoffe, wie die Zellsubstanzen der zur Ferinentation verwendeten Mikroorganismen,
restliche Ausgangsstoffe und andere zufällige Verunreinigungen in wäßriger Suspension
bzw. Lösung enthält. Das Fermentationsprodukt bleibt im allgemeinen in Lösung und
kann, nachdem die Feststoffe und halbfesten Stoffe einmal abgetrennt sind, in bekannter
Weise, wie z. B. durch Kristallisation, Extraktion, Fällung u. dgl., gewonnen werden.
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Die Abtrennung der Zellsubstanzen vor der weiteren Verarbeitung der
Ferinentationsbrühe ist im allgemeinen unumgänglich. Verbleiben die Zellsubstanzen
in der Fermentationsbrühe, so ist eine direkte Isolierung der zu gewinnenden Substanzen
regelmäßig sehr schwierig. So wirken die Zellsubstanzen beispielsweise kristallisationshemmend.
Ebenso ist eine Isolierung der Fermentationsprodukte mittels Ionenaustauschern unmöglich,
da die Zellsubstanzen den Austauscher in kurzer Zeit verstopfen. Die Ab-
trennung
der Zellsubstanzen durch einfache Filtration ist wegen der geringen Größe der Zellen
industriell selten durchführbar. Desgleichen führt eine Zentrifugation der Fermentationsbrühe
selten zum Ziel.
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Es wurde nun gefunden, daß diese Zellsubstanzen leicht dadurch aus
der Fennentationsbrühe abgetrennt werden können, daß man die Fermentationsflüssigkeiten
mit Calciumhydroxyd oder gebranntem Kalk in einer Menge versetzt, bis der Calciumgehalt,
berechnet als Ca0, 0,1 bis 10 Gewichtsprozent beträgt, die Mischung
5 bis 40 Minuten, vorzugsweise 10 bis 20 Minuten, bei Temperaturen
von 70 bis 90' C, vorzugsweise 75 bis 85' C, hält, danach
das Calcium als Calciumkarbonat ausfällt und anschließend die unlöslichen Substanzen
von der Flüssigkeit abtrennt.
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Der gebrannte Kalk wird vorzugsweise in fein gemahlener Form zugegeben.
Im Falle der Verwendung von gebranntem Kalk tritt eine Erwärmung der Fermentationsbrühe
von selbst ein.
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An und für sich ist die sogenannte Kalkreinigung in der Zuckerindustrie
seit langem ein bequemes Verfahren zur Reinigung von Zuckersäften, doch war es in
hohem Maße überraschend und nicht vorauszusehen, daß auf analoge Weise lebende oder
vor kurzem abgetötete Mikroorganismenzellen aus Fermentationsbrühen abgetrennt werden
können.
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Es wird angenommen, daß sich dabei folgende Vorgänge abspielen.
Unter der Einwirkung des Calciumhydroxyds denaturiert das vorwiegend aus Eiweißstoffen
bestehende Zellgerüst, schrumpft zusammen und lädt sich gleichzeitig negativ auf.
Bei der Überführung des Calciumhydroxyds in Calciumkarbonat bildet sich in statu
naseendi Caleiumkarbonat mit einer positiven Ladung. Dieses adsorbiert sofort die
Zellsubstanzen wie auch eventuell vorhandene Farbstoffe und wird dadurch negativ
geladen. Wenn vorher ausgefällte Calciumkarbonatteilchen anwesend sind, welche durch
Adsorption von Zellsubstanzen oder anderen Verunreinigungen eine negative Ladung
angenommen haben, bilden die frisch gefällten positiv geladenen mit den älteren
negativ geladenen Teilchen Agglomerate. Dadurch wird eine einfache und schnelle
Abtrennung des Niederschlags ermöglicht, beispielsweise durch Filtration, Zentrifugation,
Dekantierung od. dgl.
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Die Ausfällung des Calciums kann bei Raumtemperatur oder bei erhöhter
Temperatur erfolgen. Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens besteht darin,
daß man die Überführung des Caleiumhydroxyds in Caleiumkarbonat in zwei Stufen bei
verschiedenen
pH-Werten durchführt und sowohl nach der ersten als auch nach der zweiten Stufe
das ausgefällte Calciumkarbonat zusammen mit den mitgefällten Zellsubstanzen abtrennt,
beispielsweise durch Filtration. Dabei wird die erste Stufe der überführung so durchgeführt,
daß man Kohlendioxyd in die Fermentationsbrühe einleitet, bis ein pH-Wert von etwa
9,4 bis 9,5 erreicht ist. Die Ferinentationsbrühe kann dann ohne Schwierigkeiten
filtriert werden. Die filtrierte Brühe wird darauf erneut mit Kohlendioxyd behandelt,
bis ein pH-Wert von etwa 7,7 erreicht ist, und dann wiederum filtriert.
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Erfolgt die Abtrennung der ausgefällten Substanzen durch Filtration,
so wird diese zweckmäßig bei Raumtemperatur oder aber bei 50 bis
60' C durchgeführt.
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Durch die erwähnte Reinigung wird eine Fermentationslösung erhalten,
welche nicht nur frei von Zellsubstanzen und jeglichen kolloidalen Stoffen ist,
sondern auch von allfällig vorhandenen Farbstoffen weitgehend befreit ist, und aus
welcher im allgemeinen die Fermentationssubstanzen direkt und in großer Reinheit
isoliert werden können.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet für die Abtrennung
von Zellsubstanzen aus den bei der ferinentativen Herstellung von Glutaminsäure
anfallenden Fermentationsbrühen, doch ist seine Anwendung keineswegs auf die Behandlung
solcher Fermentationsbrühen beschränkt. Vielmehr kann es auch zur Entfernung der
Zellsubstanzen aus den bei anderen Fermentationsverfahren anfallenden Br#Ühen mit
Vorteil angewendet werden, so z. B. bei der ferinentativen Herstellung anderer Aminosäuren,
wie Alanin, Asparaginsäure, Ornithin, Lysin, Valin, Threonin, Homoserin, Isoleuein,
Diaminopimelinsäure oder deren Salze und Betaine; von Antibiotiea, wie Penicillin,
Aureomycin, Streptomycin, Mitomycin, von Nucleotiden, wie Inosinsäure (Inosin-5'-phosphat),
Xanthosin; und anderer organischer Substanzen, wie Citronensäure, allo-Isoeitronensäure,
Itaconsäure, Apfelsäure, Orotsäure, 5-Ketofractose.
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Bei den in den nachfolgenden Beispielen genannten Mengenangaben handelt
es sich um Gewichtsteile bzw. Gewichtsprozente.
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Beispiel 1
100 Teile einer Fermentationsbrühe, welche
16 % Trock-einnasse, davon 511/o Glutaminsäure und 31/o Bakterienzellen,
enthält, werden auf 80' C erwärmt. Dann werden 10 Teile einer Kalkmüch mit
40% Calciumhydroxydgehalt ün Verlauf von 20 Minuten unter ständigem starkem Rühren
zugegeben. Nach 10 Minuten Einwirkungszeit wird unter ständigem Rühren Kohlensäure
eingeleitet, bis der pH-Wert der Brühe 7,5 erreicht hat. Nach 15 Minuten
Reaktionszeit wird das ausgefällte Calciumkarbonat zusammen mit den mitgefällten
Bakterienzellen abfiltriert. Aus der nunmehr klaren Lösung kann die Glutaminsäure
auf bekannte Weise, z. B. durch Ausfällen am isoelektrischen Punkt bei pH
3,2, isoliert werden.
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Beispiel 2 Zu 100Teilen einer Fermentationsbrühe, welche einen Trockenstoffgehalt
von 10%, davon 2,51/o Betain und 2,5% Zellsubstanz, aufweist, werden 10 Teile
feingemahlenes Caleiumoxyd gegeben. Durch die bei der Umwandlung des Calciumoxyd
in Calciumhydroxyd frei werdende Reaktionswärine erhöht sich die Temperatur der
Fermentationsbrühe von 20 auf 901 C. Nach 30 Minuten werden
19 Teile Natriumkarbonat zugegeben. Nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten
wird das ausgefällte Caleiumkarbonat zusammen mit der mitgefällten Zellsubstanz
abfiltriert. Aus der nimmebr klaren Lösung kann das Betain auf bekannte Weise, z.
B. mittels Ionenaustauschern, isoliert werden. Beispiel 3
3,5 Gewichtsteile
gebrannter Kalk wurden zu 100 Gewichtsteilen einer 5,5 Gewichtsteile
Glutaminsäure enthaltenden Fermentationsbrühe zugegeben. Das pH der Fermentationsbrühe
betrug 12,2 bis 12,4. Die Brühe wurde auf 75 bis 85' C erwärmt und
bei dieser Temperatur unter kräftigem Rühren während 10 bis 20 Minuten gehalten.
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Das pH der Brühe wurde dann durch Durchleiten von Kohlendioxyd auf
9,4 bis 9,5 eingestellt und die Temperatur auf 50 bis 601 C
gesenkt. Die Brühe wurde darauf bei dieser Temperatur ohne Schwierigkeiten filtriert.
Das pH des Filtrats wurde sodann durch Durchleiten von Kohlendioxyd auf
7,7 ein-,gestellt und die Brühe erneut filtriert.
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Aus dem Filtrat vmrde in zwei Kristallisationen die Glutaminsäure
gewonnen. Reinheit des ersten Anfalls: 95 "/o, des zweiten Anfalls:
90 Oio. Ausbeute: 75 bis 80 1/o.