DE1915687C2 - Pharmazeutisches Präparat mit Antitumorwirkung - Google Patents

Pharmazeutisches Präparat mit Antitumorwirkung

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DE1915687C2
DE1915687C2 DE19691915687 DE1915687A DE1915687C2 DE 1915687 C2 DE1915687 C2 DE 1915687C2 DE 19691915687 DE19691915687 DE 19691915687 DE 1915687 A DE1915687 A DE 1915687A DE 1915687 C2 DE1915687 C2 DE 1915687C2
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Syoichi Kikumoto
Keitaro Kimura
Nobuhiko Komatsu
Yoshio Momoki
Sumio Sakai
Junichi Kurume-Machi Sugayama
Shoichi Kawaguchi Takada
Toshiyuki Tokyo Yamamoto
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Taito Co Ltd
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Description

in dieAscomyceten:
Familie Pyrenophoraceae der Ordnung Sphaeria-Ies;
Familien Bulgariaceae, Helvellaceae und Pezizaceae der Ordnung Pezizales;
-, die Basisdiomyceten — Unterklasse Homobasidiae:
Familien Tricholomataceae, Agaricaceae, Boletaceae, Russulaceae der Ordnung Agaricales;
Familien Clavariaceae, Cantharellace.*-?, Corticia-
ceae und Polyporaceae der Ordnung Aphyllopho-'Ii rales;
der Ordnung Phallales;
der Ordnung Lycoperdales;
der Familien Tremellaceae und Auriculariaceae der
Unterklasse Heterobasidiae;
2-) die Fungi imperfekti:
Dematiaceae der Ordnung Moniliales.
Die Polysaccharide mit der Antitumorwirkung werden bei der Kultivierung der oben angegebenen
«ι Fungi in einem üblichen Kulturmedium, das einen Kohlenstofflieferanten, einen Stickstofflieferanten, geringe Mengen an anorganischen Salzen sowie Hefeextrakt, Pepton oder Thiamin enthält, bei einem pH-Wert von 3—6 bei einer Temperatur im Bereich von
π 25—300C gebildet. Das verwendete Kulturmedium kann als Kohlenstofflieferanten Glucose und Saccharose, als Stickstofflieferanten anorganische Stickstoffverbindungen, wie Natriumnitrat, Ammoniumsulfat, -phosphat sowie -chloiid, oder organische Stickstoffverbindüngen, wie Harnstoff und Aminosäuren, und als anorganische Salze Magnesiumsalze und Phosphate enthalten. Die Kultivierungsdauer hängt von der Art des eingesetzten Fungus ab und nimmt gewöhnlich etwa 3 Tage bis 3 Wochen in Anspruch.
-, Zur Gewinnung der Polysaccharide kann
entweder das nach Beendigung der Kultivierung erhaltene Kulturmedium, aus dem das Mycel durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt worden ist, das sogenannte Kulturfilttat,
in oder das nach der Extraktion der K/ycelien und/oder Fruchtkörper der Fungi und nach Entfernung der Festsubstanzen erhaltene Extraktfiltrat verwendet werden.
Die Extraktion der Mycelien und/oder Fruchtkörper
-,-, wird bei normaler oder erhöhter Temperatur entweder mit Wasser oder mit bis zu 5 η Natron- oder Kalilauge unter gründlichem Rühren durchgeführt. Falls notwendig, können die Fungiteile vermählen oder homogenisiert werden, um eine wirksame Extraktion zu
ho ermöglichen. Nach Beendigung der Extraktion wird der erhaltene Extrakt Von den Festsubstänzen, z. B. Mycel etc., befreit, woran sich bei den so erhaltenen alkalischen Extrakten eine Neutralisation mit Entfernung des dabei gebildeten Niederschlags schließen kann.
h-, Die so erhaltenen Kultur- und Extraktfiltrate werden zur Isolierung des gewünschten Polysaccharide mit einem mit Wasser mischbaren Ci-Cj-Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol, oder Aceton
bis zu einer Konzentration von 20 bis 60 Vol.-% vermischt, um das Polysaccharid zu fällen, das dann abgetrennt wird.
Falls gewünscht, können die in der oben angegebenen Weise erhaltenen Kulturfiltrate oder Extraktfiltrate vor der Polysaccharidfällung zur Reinigung und/oder Konzentrierung einer oder mehrerer der nachfolgend angegebenen Behandlungen, wie Dialyse gegen fließendes Wasser, Entsalzung durch Ionenaustauscherbehandlung, Entfernung der Proteine durch Zusatz organischer Säuren, wie Essig-, Ameisen-, Bernstein- oder Trichloressigsäure, oder anorganischer Säuren, wie Salz-, Schwefel- oder Phosphorsäure, bis zu pH 1—4 und Entfernung des ausgefallenen Niederschlags, Entfärbung mit Aktivkohle sowie Konzentrierung im Vakuum in beliebiger Reihenfolge unterworfen werden, um geringe Mengen anorganischer Ionen und anderer Verunreinigungen zu entfernen. Bei Wiederholung dieser Maßnahmen erhält man ein Polysaccharid mit höherem Reinheitsgrad.
Das in der angegebenen Weise erhaltene Polysaccharid steiit ein weißes bis grau-weißes nicht hygroskopisches Pulver dar. Es ist eine hochmolekulare Substanz, die nicht durch eine semipermeable Membran hindurchgeht, die sich in Wasser langsam löst, in organischen Lösungsmitteln unlöslich ist, deren wäßrige Lösung neutral ist und Säure, Alkali sowi« Hitze gegenüber verhältnismäßig beständig ist Die saure Hydrolyse des in der angegebenen Weise erhaltenen Polysaccharids mit nachfolgender papierchromatographischer Untersuchung ergab, daß das Polysaccharid hauptsächlich aus
Tabelle I
Glucose besteht, also im wesentlichen ein Glucan darstellt, jedoch in Abhängigkeit von den verwendeten Spezies eine kleine Menge Xylose, Mannose und Galactose enthält Das Polysaccharid gibt positive Molisch-, Bial-, Dubois-, Disch-, Tryptophan-Schwefelsäure und Anthronreaktionen und eine negative Ninhydrin-Reaktion, Desgleichen ist die Fehling'sche Reaktion und die Jod-Stärke-Reaktion negativ.
Die so erhaltenen Polysaccharide liefen! bei der
ίο enzymatischen Hydrolyse mit 0-(l,3)-Glucanasf: (vgl. Reese und Mandel, Can. J. Microbiol. 5, 173 [1959]) D-GIucose und Gentiobiose. Danach ist anzunehmen, daß es sich bei diesen Polysacchariden um ein Glucan handelt, das im wesentlichen aus D-GIucoseresten mit £-(l,3)-Bindungen in der Hauptkette und D-Glucoseeinhtiten mit /?-(l,6)-Bindungen als Seitenketten besteht
In der nachfolgenden Tabelle I ist für die aus den verschiedenen, in den Beispielen 1 — 16 benutzten Fungi bzw. deren Kultur- oder Extraktfiltraten erhaltenen Polysacchariden der bei der enzymatischen Hydrolyse mit j3-(13)-Glucanase erhaltene Zersetzungsgrad (%) und das Molverhältnis von D-Glucose/Gentiobiose angegeben. Da das Enzym /?-(l3)-GIucanase nur auf die in /?-(l,3)-Bindung vorliegenden D-Glucoseeinheiten im Polysaccharid einwirkt entspricht der in % angegebene Zersetzungsgrad dem Gehalt des Polymers an D-Glucoseeinheiten mit /J-(13)-Bindungen. Das Molverhältnis von D-GIucose zu dem Disaccharid Gentiobiose gibt Aufschluß über die Häufigkeit von Seitenketten im
jo Verhältnis zu den D-Glucoseeinheiten der Hauptkette.
Bei Fungus Genus Lieferant Zersetzung durch Molverhältnis
spiel y?-l,3-GIucanase D-GIucose/
(%) Gentiobiose
1 Sclerotinia sclerotiorum Sclerotiniaceae Kulturfiltrat 51 1/0,46
2,3 desgl. desgl. Mycel 48 1/0,51
4 Cochliobolus saiivus Pyrenophoraceae Kulturfiltrat 52 1/0,41
5 desgl. desgl. Mycel 41
6 Pholiota nameko Strophariaceae Kulturfiltrat 40 1/0,48
8 desgl. desgl. Mycel 36 1/0,53
10, 12, desgl. desgl. Fruchtkörper 57 1/0,52
7 Lentinus edodes Tricholomataceae Kulturfiltrat 45 1/0,41
7 Flammulina velutipes desgl. desgl. 40 1/0,50
11, 14,
17		 desgl. desgl. Fruchtkörper 52 1/0,46
9 Cladosporium flavum Dematiaceae Mycel 57 1/0,45
15 Bulgaria inquinans Bulgariaceae Kulturnitrat 41
15 desgl. desgl. Mycel 37
16 desgl. desgl. Fruchtkörper 39
15 Morchella esculenta Helvellaceae Kulturfiltrat 43 1/0,45
15 desgl. desgl. Mycel 47 1/0,42
16 desgl. desgl. Fruchtkörper 43 1/0,48
15 Plcurntus ostrcatus Trichlolomataceae Kulturfiltrat 35 1/0,47
15 desgl. desgl. Mycel 32 1/0,52
15 Agaricus bisporus Agaricaceac Kullurfiltrat 16 1/0,49
15 desgl. desgl. Mycel 9 1/0,39
16 desgl. desgl. Fruchtkörper 18 1/0,44
Fortsetzung Fungus 19 15 Genus 687 6 I-Gluciimise Molverhiiltnis
Bei D-Glucose/
spiel Zersetzung durch Gentiobiose
5 Boletus edulis Boletaceae Liefe πι η I ./1-1,3 1/0,58
15 desgl. desgl. (%) 1/0,48
15 desgl. desgl. 43 1/0,55
16 Russula emetiea Russulaceae Kulturllltrat 25 1/0,53
15 desgl. desgl. Mycel 53 1/0,53
15 desgl. desgl. Fruchtkörper 43 1/0,46
16 Ciavaria purpurea Clavariaceae Kulturfiltrat 32 1/0,56
15 desgl. desgl. Mycel 70 1/0,58
15 Cantharellus cibariiis Cantharellaceae Fruchtkörper 43 1/0,42
15 desgl. desgl. Kulturfiltrat 28 1/0,48
15 desgl. desgl. Mycel 40 1/0,44
16 Stereum spectabile Corticiaceae Kulturfiltrat 23 1/0,60
15 desgl. desgl. Mycel 56 1/0,51
15 desgl. desgl. Fruchtkörper 33 1/0,53
16 Coriolus versicolor Poiyporaceae Kultumltrat 21 1/0.51
15 desgl. desgl. Mycel 48 1/0,42
15 desgl. desgl. Fruchtkörper 43 1/0,43
16 Phallus impudicus Phallales Kulturfiltrat 18 1/0,32
15 desgl. desgl. Mycel 28 1/0,41
15 desgl. desgl. Fruchtkörper 7 1/0,49
16 Lycoperdon gemmatum Lycoperdales Kulturfiltrat 19 1/0,46
15 desgl. desgl. Mycel 11 1/0,44
15 desgl. desgl. Fruchtkörper 43 1/0,48
16 Tremella fuciformis Tremellaceae Kulturfiltrat 28
15 desgl. desgl. Mycel 43
15 desgl. desgl. Fruchtkörper 41
16 Auricularia polytricha Auriculariaceae Kulturfiltrat 45
15 desgl. desgl. Mycel 39
15 desgl. desgl. Fruchtkörper 38 1/0,47
16 Cladosporium flavum Dematiaceae Kulturfiltrat 47
15 desgl. desgl. Mycel 8
15 desgl. desgl. Fruchtkörper 55
16 Pyrenophosa teres Pyrenophoraceae Kulturfiltrat 41
16 Ramaria aurea Clavariaceae Mycel 39
16 Fruchtkörper 39
desgl. 32
desgl.
Diese Tabelle zei^t, daß alle Fungi Polysaccharide liefern, die sich bei der enzymatischen Hydrolyse mit ß-(1,3) Glucanase zersetzen und daß in den erhaltenen Polysaccharidhydrolysaten das Molverhältnis von D-Glucose/Gentiobiose etwa 1/0,4—0,6 beträgt.
Polysaccharide, deren Hauptkette aus D-Glucoseeinheiten in 0-( 1,3)-Bindung besteht und die einzelne D-Glucosereste in 0-(l,6)-Bindung als Seitenketten aufweisen, sind bekannt. Sie sind aus den Sclerotien von Sclerotinia libertiana (Journal of the Agricultural Society of Japan 35,468/474 und 474/478 [1961]) und bei der Fermentation von Plectania occidental und Helotium sp. (Applied Microbiology 13, 267/271 und 272/278 [1965]), von Claviceps purpurea (Canadian journal of Chemistry 41. 2278/2282 [1963]), von einem nicht identifiziertem Stamm der Fungi imperfecti (Chemistry anu Industry 18, 820/822 [1963]), von Pullularia pullulan? (Acta Chemica Scandinavia 17,
1351/1356 [1963]) und von den Fungi des Genus Sclerotium (US-PS 33 01848) gewonnen und als Additive in der Papierindustrie oder als Gelierungsmittel in der Nahrungsmittel-, bei der Farben- und Obsrzugsherstellung verwendet worden (US-PS 33 01 848),
Die in der oben angegebenen Webe erhältlichen Polysaccharide zeichnen sich durch eine überraschend hohe Antitumorwirkung aus, in der sie den bekannten Antitumorp/äDaraten, wie Mitomycin C, 5-Fluoroui-acil, 6-Mercaptopurin, Cytosinarabinosid und Bleomycin überlegen sind, wie die in Tabelle Il zusammengestellten Vergleichsversuchsergebnisse zeigen.
Die Antitumoraktivität der verschiedenen Verbindungen wurde an der festen Form von Sarkoma-180 bei Mäusen getestet. Für die Durchführung der Versuche wurden je 2 Gruppen von Mäusen von je etwa 20 g benutzt. Jede Gruppe bestand aus 10 Mäusen. Eine
Gruppe diente als Kontrollgrtippe. die unbehandelt blieb. Bei den Tieren aller Gruppen wurden Transplantationen mit 5 χ ΙΟ* Zellen von Sarkoma-180 subkutan in der rechten Leiste vorgenommen.
24 Stunden nach der Transplantation wurde die Behandlung intraperitoneal. einen Tag um den anderen
Tabelle Il
insgesamt lOmal vorgenommen. Nach 25 Tagen wurden die Tumore herausgenommen, ihr durchschnittliches Gewicht, die ClUiChSCtInKtIiClIe Änderung (Zunahme) des Körpergewichts, der Verhältniswert der Tumorhemiming. die Zahl der zurückgegangenen Tumore sowie die Mortaliiät^/iihl der Tiere bestimmt.
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kontrolle ο/ρ, 3.61 14.1
M:lnm>cinC -ι i'/lo 5.T9 44.2 Il 52 -
5-[-IuOrOUUiCiI I o'ir 3.89 64.9 Il 100 -
6-Niercaptopurin 0/10 - "S 6!.5 0 -
Cytosin-arabinosid 0/iO 0 -
0/! 0 v;5 94." 0 -
Cochliohoius -.iir-u- 3.05 9S.4
Kulturfiltrat 0/10 hfl 1/0.41
Kultu rfiltrü 0/) 0 65 1/0.41
Bei in-vitro-Inkubationen von Tumorzelien für etwa 3 die klinisch angewendet werden und die die Tumore
Stunden in hochkonzentrierter wäßriger Lösung der direkt zerstören. Es wird daher angenommen, daß sie
gemäß Erfindung erhältlichen PoK saccharide findet - - durch ein Organ des Gasttieres irgendeine Substanz
keine Zerstörung der Turnorzeii-sn ststi. Hierin produzieren, die spezifisch die Widerstandsfähigkeit des
unterscheiden sich die Polysaccharide der Erfindung Gasitieres gegen den Tumor erhöht. Die Polysaccharide
von den sogenannten cyiotoxischen Antltümormitteln der Erfindung zeichnen sich durch so extrem niedrige
Toxizitat aus. daß dies als uesentlu Η<·% Merkmal der Polysaccharide der Erfindung angesehen werden kann.
So wurde bei intraperitonealcr Applikation von sogar 1000 mg/kg bei Mausen keines der Tiere getötet. Line ti gliche intraperitoneale Applikation von 1. 5 oder 2 ) mg/kg der Polysaccharide der F.rfindung hatte weder e ne sichtbare Abnahme des Körpergewichts pech eine letale Wirkung zur Folge. Mit anderen Worten: Die Polysaccharide der F.rfindung weisen bei extrem η edriger Toxizität eine durch das f iasttier vermittelte A ntitumorwirkung in einer Dosis auf. die der der ν irbckannien nur klinisih benut/ier> cymtoxisch und a itagonistisch w irkenden Anlitumormitteln gleich ist.
Die Gewinnung von Polysacchariden mit Antitumor ν irkiing durch Heißwasserextraktion der Oramitieae ( iambus und Rambusgras ausgenommen) ist bereits aus der bekanntgemachten japanischen Patentanmeldung 2* 791/1965 bekannt und tlie durch Heißwasserextrakt Uli der Blätter und/oder Stengel von Rambus und I ambusgräsern ist bereits aus der japanischen Patentanmeldung 2 918/1967 bekannt. In keiner der beiden \ eröffentlichungen sind Angaben über die Struktur der e'haltenen Polysaccharide enthalten. Die effektive Dosis der gemäß der |P PS 24 79 M 965 erhaltenen Polysaccharide liegt bei iOnig'kg (Maus) und der g:mäßder JP-PA 2 918/1967 erhaltenen Polysaccharide bei 40 mg/kg (Maus). Demgegenüber beträgt die e iektive Dosis bei dem z. B. aus C'ochliobolus sativus e'haltenen Polysaccharide der I rfindung nur 2 mg/kg (Maus).
Beispiel 1
Mit Sclcrolinia sclerotiorum wurde ein flüssiges Nedium, das 3% Saccharose, 0.1% Hefeextrakt. 0 3% Natriumnitrat. 0,1% KHiPO1, 0.05% Magnesiumsulfat u id 0.05% Kaliumchlorid enthielt, beimpft und die \ ischung in einem Schüttelkolben der Kultivierung υ iterworfen. wobei man 300 ecm Saatkultur erhielt. Diese Saatkultur goß man in 15 Liter des gleichen : V ediums und führte die Kultivierung bei 28 C 160 S unden unter Belüftung mit einer Luftzuführung von Ml/Min, und unter Rühren bei 300 U/Min, durch. Danach zentrifugierte man das Mycel ab. versetzte das ethaltene Kulturfiltrat mit der gleichen Vol-Menge ;. Vethanol, sammelte den gebildeten Niederschlag und löste ihn in Wasser. Diese wäßrige Lösung versetzte rran zur Umfällung erneut mit Methanol. Man erhielt lfi.5 g eines weißen Pulvers.
Beispiel 2
280 g des nach dem Verfahren von Beispiel I erhaltenen feuchten Mycels von Sclerotinia sclerotiorum wurden in 500 ecm 2 η Natronlauge gegeben, die 5; Mischung gründlich gerührt, in einer Homogenisierungsvorrichtung behandelt und 25 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach entfernte m «1 das Mycel. stellte das Filtrat mit Essigsäure auf pH 2 ein und filtrierte vom ausgefällten ungelösten *n N ederscnlag ab. Das Filtrat dialysierte man 3 Tage gegen fließendes Wasser. Die nicht-dialysierbare Losung engte man unter vermindertem Druck ein, versetzte sie dann mit der gleichen Vol-Menge Methanol und sammelte den gebildeten Niederschlag, ,.5 den mar, danach in Wasser löste und mit Methanol erneut fällte. Man erhielt 25 g eines weißen amorphen Pulvers.
Beispiel 5
U)Og feuchtes Mycel von Sclerotinia sclerotiorum. das nach dem Verfahren des Beispiels 1 enalten worden war. gab man in 400 ecm 1 η Kalilauge und erhitzte die Mischung /ur Extraktion JO Minuten auf 60 C. Danach filtrierte man das Mycel ab. stellte das Fillrat mit Salzsäure auf pH 2 ein, filtrierte von der ausgefällten festen Substanz ab. dialysierte das Filtrat 4 Tage gegen fließendes Wasser, engte die nicht-dialysierbiire Lösung auf 250 ecm ein und versetzte sie mi: 250 ecm Isopropanol. Den gebildeten Niederschlag sammelte man, loste ihn in Wasser und führte mit Isopropanol erneut die Fällung herbei Man erhielt 1.2 g grau-weißliches, amorphes Pulver.
Ii e 1 s ρ 1 e I 4
/ur Herstellung von 500 ecm Saatki Ihir beimpfte man ein Kulturmedium der in Beispie. I benutzten Zusammensetzung mit C ocniiouoiiis «liiiivuv fviti ilci erhaltenen Saatkultur beimpfte man 15 des gleichen Mediums und führte die Kultivierung unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen durch. Danach zentrifugierte man das Mycel ab, engte d e überstehende Flüssigkeit unter vermindertem Druck ein. versetzte sie mit dem gleichen Volumen Aethanol. sammelte den gebildeten Niederschlag, löste ihn in Wasser, erwärmte die l.ösuni' mit Aktivkohle und versetzte sie nach dem Filtrieren mit Aethanol. wobei man einen Niederschlag von 9.5 g eines leicht grau-weißlichen Pulver·" erhielt
Beispiel 5
Fine Mischung von 370 g feuchten Mycels von C'ochliobolus sativus. das in der ir Beispiel 4 angegebenen Weise erhalten worden war in 1 I Wasser, rührte man gründlich in einer Homogenisierungsvorrichtung und hielt sie dann 2 Stunden unter Rühren auf 100"C. Das Mycel filtrierte man ab. stellte das Filtrat mit Essigsäure auf pH 3 ein und filtrierte den gebildeten Niederschlag ab. Danach engte man das Filtrat unter vermindertem Druck ein, gab es in einen Cellophanb^utel und dialysierte es 24 Stunden gegen fließendes Wasser. Die nicht-dialysierbare Lösung in dem Beutel versetzte man mit dem gleichen Volumen Methanol, wobei man 3.1 g eines grau-weißlichen Pulvers erhielt.
Beispiel 6
500 ecm eines Kulturmediums, das 3.0% Glucose. 0.3% Natriumnitrat, 0,1% KH2POi. 0.05% Magnesiumsulfat. 0,5% Kaliumchlorid. 0,1% Hefeextrakt und 0.005% Ferrisulfat enthielt, wurden 15 Minuten bei 120° C sterilisiert und mit dem Mycel Pholiota nameko beimpft. Die Mischung wurde kultiviert, das Mycel entfernt, das Kulturfiltrat unter vermindertem Druck auf 200 ecm eingeengt, die erhaltene Lösung mit 120 ecm Methanol versetzt, der gebildete Niederschlag gesammelt und in Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung gab man in einen Cellophanbeutel, dialysierte sie 3 Tage gegen fließendes Wasser, engte die nicht-dialysierbare Lösung in dem Beutel unter vermindertem Druck ein, setzte Methanol zur Fällung hinzu, sammelte den erhaltenen Niederschlag und wusch ihn in wasserfreiem Methanol. Der Niederschlag ergab nach dem Trocknen 03 g eines amorphen, weißen Pulvers.
Beispiel 7
Lentinus edodes und Flammulina velutipes der Familie Tricholomataceae wurden in der in Beispiel 6
Il
beschriebenen Weise behandelt. Man erhielt 0,2 g bzw. 0.9 g eines amorphen, weißen Pulvers.
Beispiel 8
Das Mycel von Pholiota nameko. das nach der in Beispiel 6 beschriebenen Kultivierung erhalten worden war, wurde in 100 ecm 2 n Natronlauge gegeben, die Mischung in einer Homogenisierungsvorrichtung bei Raumtempcralii! etwa I Stunde gerührt, danach 20 Stunden stehen gelassen, das Mycel abfiltriert und das Filtrat mit Essigsäure auf pH 3 eingestellt. Den gebildeten unlöslichen Niederschlag filtrierte man ab. gab das Filtrat in einen Cellophanbeiitel. dialysierte es 2 Tage gegen fließendes Wasser, führte die nicht-dialysierbare Lösung durch Kolonnen mit stark sauren und stark basischen lonenaustauscherharzen. IR-120 und IRA-410. engte die austretende Flüssigkeit unter vermindertem Druck ein. versetzte das erhaltene Konzentrat mit dem gleichen Volumen Methanol und %;ϊί7ΐ!"ο!ϊ£ den "ebüdeieii Ni?'!**rc'jh!iiiT P'-i;v*''h lös1.'1 man ihn in Wasser und führte mit Methanol die Umfällung durch. Man erhielt 350 mg eines amorphen, weißen Pulvers.
Beispiel 9
21 des in Beispiel 6 beschriebenen Mediums sterilisierte man 15 Minuten bei 1200C. beimpfte es mit Cladosporium flaviim und führte die Kultivierung bei 28" C 5 Tage in einem Kolben unter Schütteln durch. Das hierbei erhaltene Mycel gab man in 500 ecm 2 η Natronlauge, rührte die Mischung gründlich in einer Homogenisierungsvorrichtung, ließ sie dann 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen, um sie gründlich /u extrahieren, filtrierte das Mycel ab und stellte das Filtrat mit Essigsäure auf pH 4 ein. Die dabei ausgefallene unlösliche Substanz filtrierte man ab, engte das Filtrat unter vermindertem Druck ein. versetzte es mit dem gleichen Volumen Methanol, filtrier'e den gebildeten Niederschlag ab. löste ihn sodann in Wasser und führte die Lösung durch Kolonnen mit stark sauren und stark basischen lonenaustauscherharzen (Amberlite IR-120 und IRA-410). Die abfließende Flüssigkeit versetzte man zur Fällung wieder ηνC Methanol. Man erhielt 2,5 g eines grauen amorphen Pulvers.
Beispie! 10
Eine Mischung von 500 g von im Handel erhältlichen Pholiota nameko in 3,5 Liter 1 η Natronlauge wurde in einer Homogenisierungsvorrichtung gerührt und dann 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach weiterer Aufarbeitung der Mischung in der in Beispiel 8 beschriebenen Weise erhielt man 4 g eines amorphen Pulvers.
Beispiel Π
300 g der im Handel erhältlichen Fruchtkörper von Flammulina velutipes wurden mit 3 Liter Wasser versetzt, in einer Homogenisierungsvorrichtung gerührt und die erhaltene Mischung 3 Stunden auf 80 bis 1000C erhitzt Danach ließ man sie abkühlen, filtrierte sie, versetzte den Rückstand mit 13 1 Wasser und wiederholte die Extraktion. Die vereinigten Filtrate engte man auf 1 I ein, fügte 1,5 1 Methanol zu, sammelte den gebildeten Niederschlag, löste ihn in Wasser, gab zu der Lösung Aktivkohle, erwärmte und filtrierte die Lösung. Mit erneuter Methanolzugabe zu dem Fiitrat führte man die Fällung durch. Es wurden 14? weißes, amorphes Pulver erhalten.
Be spiel 12
/u dem in Bespiel IO erhaltenen Extraktionsrückstand gab man 400 ecm 3 η Kalilauge und rührte die Mischung 24 Stunden bei Raumtemperatur. Die nach filtrieren erhaltene Extraktionslösung neutralisierte man mit Salzsäure, filtrierte den gebildeten Niederschlag ab und dialysierte das Filtrat in einem Cellophanbeuiel 3 Tage gegen fließendes Wasser. Die nicht-dialysierbare Lösung stellte man mit Essigsäure auf pH 3.5 ein, ließ sie über Nacht stehen und filtrierte den gebildeten Niederschlag ab. Das Filtrat engte man auf 200 ecm ein und führte mit Methanol die Fällung durch. Man erhielt 0.7 g amorphes, weißes l'iih er.
Beispiel Ii
Die Mischung \i?n 500 g im Handel erhältliche:1 Fruchtkörpern von Pholiota nameko in 2 Liter Wasser u.'i_irr}p in einer \ InniMPtMiisifTiinpsx orrichiiin£ ^rundlich zerkleinert, liltrieit und danach der Rückstand mit 1,5 1 Wasser versetzt um eine Extraktion /u bewirken Die vereinigten Filtrate engte man unter vermindertem Druck auf 900 ecm ein. \ersetzte sie mit 600 ecm Aceton und sammelte den dabei gebildeten Niederschlag. Danach löste man ihn in Wasser, gab Aktivkohle zu erwärmte die Mischung, filtrierte die Lösung und führte in dem Filtrat mit Aceton die Fällung durch. Man erhielt 2.3 g eines schwach gra i-weißlichen. amorphen Pulvers.
Beispiel 14
500 g Flammulina velutipes des Handels wurden in einer Homogenisierungsvorrichtung zerkleinert, danach in 4 Liter 2 η Natronlauge gegeben und die Mischung 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt, um die Extraktion zu bewirken. Dannch filtrierte man die Mischung, extrahierte den Rückstand erneut mit 2 1 2 η Natronlauge und vereinigte die beiden Teile des Extraktes miteinander. Den neutralisierten Extrakt gab man in einen Cellophanbeutel und dialysierte ihn 2 Tage gegen fließendes Wasser. Die nicht-dialysierbare Lösung stellte man mit Essigsäure auf pH 3.5 ein, filtrierte den gebildeten Niederschlag ab. engte das Filtrat unter vermindertem Druck auf 1.51 ein und führte in diesem Konzentrat durch Zugabe von 500 ecm Isopropanol die Fällung durch. Den gebildeten Niederschlag sammelte man. löste ihn erneut in Wasser und führte mit Isopropanol die Umfällung durch. Man erhielt 4,1 g weißes, amorphes Pulver.
Beispiel 15 (nachgereicht)
Je 5 1 flüssiges Kulturmedium, das 3.0% Glucose. OJ0Zo Hefeextrakt, 0,15% see. Ammoniumphosphat, 0,1% prim. Kaliumphosphat und 0,05% Magnesiumsulfat enthielt und das mit 2 η Schwefelsäure auf pH 5,0 eingestellt war, wurden mit den in Kolonne (a) der nachfolgenden Tabelle III angegebenen Fungi beimpft *n und 7 Tage der Kultivierung unter Schütteln bei 28° C unterworfen. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Mycelien durch einen Separator abgetrennt wobei man die Filtrate als überstehende Flüssigkeiten erhielt (vgl. Kolonne (b) der Tabelle III). Die so erhaltenen Mengen an überstehender Flüssigkeit wurden jeweils mit dem gleichen Volumen an Methanol versetzt, wobei man einen Niederschlag erhielt, den man trocknete. Die Mengen der auf diese Weise erhaltenen
9 15687
Polysaccharide, die in Form eines weißen Pulvers anfielen, sind in Kolonne (c) der Tabelle III angegeben. Die nach dem Abtrennen der Kultivierungsflüssigkeit durch Zentrifugieren erhaltenen Mycelien (vgl. Kolonne (el) der Tabelle III), wurden mit der doppelten Menge ihres Gewichts an ! η wäßriger Natronlauge versetzt, die erhaltene Mischung gründlich in einer Homogenisierungsvorrichtung gerührt, um die Mycelien zu zerkleinern, und mit der weiter oben angegebenen alkalischen Lösung 24 Stunden bei Raumtemperatur extrahiert. Sodann filtrierte man die Mycelien ab, säuerte die Filtrate mit Essigsäure auf pH 2 an. filtrierte vom ausgefallenen Niederschlag ab und führte die erhaltenen Filtrate durch Kolonnen von stark sauren und stark basischen Ionenaustauscherharze!! (Amberlite IR-1 20 und IRA-IiO). Die so erhaltenen Fluate versetzte man mit den gleichen Volumenmcngen Methanol, filtrierte den ausgefallenen Niederschlag ab und trocknete ihn. wobei man die Polysaccharide in Form eines weißen Pulvers in den in Kolonne (c) der Tabelle III angegebenen Mengen erhielt. (Diese in Form von weißem Pulver erhaltenen Polysaccharide wiesen im
!.»hello III
wesentlichen /J-(1.3)-Hauptketten und ,?-(1.6)-Sei;enketten auf.
Beispiel I6(nachgereicht)
Frische Fruchtkörper (1 kg) der in Tabelle III angegebenen Fungi wurden in 7 1 In Natronlauge gegeben, mit einer Homogenisierungsvorrichtung fein zerteilt und 24 Stunden bei Raumtemperatur ruhen gelassen. Danach filtrierte man die fein zerteilten Fruchtkörper ab und verwarf sie, während man ^ie Filtrate mit Essigsäure auf pH 2 ansäuerte. Die dabei gebildeten Niederschläge filtrierte man ab, und die so erhaltenen Filtrate führte man durch Kolonnen von stark sauren und stark basischen lonenaustauscherharzcn (Amberlite IR-120 und IRA-410). Die so erhaltenen Fluate versetzte man mit den gleichen Volumcnmengen Methanol, filtrierte die gebildeten Niederschlage ab und trocknet sie. wobei man die Polysaccharide in Form von amorphen Pulvern erhielt, deren Mengen in Kolonne (f) der Tabelle III angegeben sind. Diese Polysaccharide wiesen im wesentlichen /J-(1,3)-H au pt ketten und /i-(1,6)-Seitenketten auf.
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21.0 711 7,7 22.8
IX.X 574 4.X 20.0
1.4
4.5
1.9

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Pharmazeutisches Präparat mit Antitumorwirkung, enthaltend als Wirkstoff ein Polysaccharid, das im wesentlichen aus D-Glucoseresten mit £-(13)-Bindungen in der Hauptkette und D-Glucoseeinheiten mit /3-(l,6)-Bindungen als Seitenketten besteht, durch Inkubieren mit£-(13)Glucanase nachweisbar ist und aus den Fungi Cochliobolus sativus, Cladosporium flavum, Corticium centrifugum, Flammulina velutipes, Tricholoma aggregatum, Sclerotinia sclerotiorum oder Pholiota nameko erhältlich ist, indem man in üblicher Verfahrensweise
    a) aus den Kulturfiltraten, die nach der Kultivierung der Fungi in einem Kulturmedium üblicher Zusammensetzung und Entfernen der Mycelien erhalten worden sind, oder
    b) aus den Extraktfiltraten, die bei der Extraktion der Mycelien oder der Fruchtkörper der Fungi bei normaler oder erhöhter Temperatur mit Wasser oder mit bis zu 5n-Natron- oder Kalilauge und Neutralisation nach Entfernen der Festsubstanzen erhalten worden sind,
    durch Zusatz von C1—C3-Alkohol oder Aceton bis zu einer Konzentration von 20—60 Vol.-% die Polysaccharide ausfällt und abtrennt, wobei vor der Polysaccharidfällung die Polysaccharid enthaltende Lösung in beliebiger Reihenfolge einer Dialyse gegen Wasser, Entsalzung durch lonenaustauscherbehandlung, einem Säurezusatz bis zu pH 1 —4 und Abfiltrieren des ausgefallenen Niederschlags, einer Behandlung mit Aktivkohle und/oder einer Konzentrierung im Vakuum unterworfen werden kann.
    Die Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Präparat mit Antitumorwirkung, das als Wirkstoff ein Polysaccharid enthält, das im wesentlichen aus D-Glucoseresten mit £-(l,6)-Bindungen in der Hauptkette und D-Glucoseeinheiten mit £-(1,6)-Bindungen als Seitenketten besteht, durch Inkubieren mit £-(l,3)-Glucanase nachweisbar ist und das aus den Fungi Cochliobolus sativus, Cladosporium flavum, Corticium centrifugum, Flammulina velutipes, Tricholoma aggregatum, Sclerolinia sclerotiorum oder Pholiota nameko erhältlich ist, indem man in üblicher Verfahrensweise
    a) aus den Kulturfiltraten, die nach der Kultivierung der Fungi in einem Kulturmedium üblicher Zusammensetzung und Entfernen der Mycelien erhalten worden sind, oder
    b) aus den Extraktfiltraten, die bei der Extraktion der Mycelien oder der Fruchtkörper der Fungi bei normaler oder erhöhter Temperatur mit Wasser oder mit bis zu 5n-Natron- oder Kalilauge und Neutralisation nach Entfernen der Festsubstanzen erhalten worden sind,
    durch Zusatz von Ci-Ci-Alkohol oder Aceton bis zu einer Konzentration von 20—60 Vol.-% die Polysaccharide ausfällt und abtrennt, wobei man vor der Polysacchardifällung die Polysaixharid enthaltende Lösung in beliebiger Reihenfolge einer Dialyse gegen Wasser, Entsalzung durch lonenaustauscherbehandlung, einem Säurezusatz bis zu pH 1 —4 und Abfiltrieren des ausgefallenen Niederschlags, einer Behandlung mit Aktivkohle und/oder einer Konzentrierung im Vakuum -, unterwerfen kann.
    Lieferanten für Fungi, aus denen die Polysaccharide mit Antitumorwirkung erhältlich sind, sind folgende Klassen und Ordnungen:
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