DE69813234T2

DE69813234T2 - Verfahren zum stimulieren der natürlichen abwehrfunktion bei pflanzen

Info

Publication number: DE69813234T2
Application number: DE69813234T
Authority: DE
Inventors: Jean-Claude Yvin; Florence Cruz; Jean-Marie Joubert; Bernard Cloarec; Christophe Richard; Bertrand Plesse; Marguerite Kopp; Bernard Fritig
Original assignee: Laboratoires Goemar SA
Current assignee: Laboratoires Goemar SA
Priority date: 1997-07-18
Filing date: 1998-07-20
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2018-07-21
Also published as: AU8813598A; EP1001678A1; WO1999003346A1; DE69813234D1; ES2197496T3; US6387847B1; FR2766059B1; FR2766059A1; CA2296752C; EP1001678B1; CA2296752A1; PT1001678E

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Potenzierung und Stimulation natürlicher Abwehrsysteme landwirtschaftlicher Nutzpflanzen.
Insbesondere handelt es sich um

– Wein und Obstbäume aus der Gruppe umfassend Apfelbaum, Birnbaum,
– Getreide aus der Gruppe umfassend Weizen, Mais und Reis,
– Ölpflanzen aus der Gruppe umfassend Soja, Sonnenblume und Raps sowie
– Gemüsepflanzen aus der Gruppe umfassend Karotten, Blumenkohl, Tomaten und Kartoffeln.

Die Stimulation natürlicher Abwehrsysteme von Pflanzen ist eines der aktuellsten Probleme und Gegenstand zahlreicher Untersuchungen.
Die Stimulation natürlicher Abwehrsysteme findet bei einer Pflanze, die einen ersten Kontakt mit einem pathogenen Stoff, wie einem Virus, einem Bakterium, einem Pilz oder einem Insekt gehabt hat, Ausdruck in der Ausbildung einer Gesamtheit biologischer Veränderungen, welche der Pflanze eine Präsensibilisierung vermitteln, dank derer die Pflanze wirksamer auf einen neuen Pathogenangriff reagieren kann.
Die oben angesprochenen Untersuchungen konnten zeigen, dass eine Präsensibilisierung durch das Kontaktieren der Pflanze mit bestimmten chemischen Syntheseprodukten erreicht werden kann.
Weiterhin sind so genannte Elizitatoren bekannt, die bei Kontakt mit einer Pflanze die Fähigkeit besitzen, in dieser die folgenden Abwehrreaktionen zu hervorzurufen:

– Anhäufung natürlicher Antibiotika, besser bekannt unter dem Namen Phytoalexine,
– Synthese von Abwehrproteinen wie Chitinasen oder Glucanasen, auch bekannt unter der Bezeichnung PRP (Pathogenesis-related proteins),
– Verstärkung der Zellwände durch die Synthese von Lignin oder vernetzender Proteine,
– Synthese sekundärer Botenstoffe wie Ethylen, Wasserstoffperoxid oder Salicylsäure.

Hier sind insbesondere die Oligo-β-1-3-Glucane zu nennen, die bei verschiedenartigen landwirtschaftlichen Nutzpflanzen die angesprochenen Abwehrreaktionen hervorrufen; die maximalen Reaktionen werden im allgemeinen erreicht, wenn die Oligo-β-1-3-Glucane entweder in Form flüssiger Zusammensetzungen, die diese in Konzentrationen der Größenordnung von 200 mg/l enthalten und sich auf einem vergleichbaren Niveau bis zu Konzentrationen von 4 g/l halten, oder in Mengen von 4 bis 200 g pro Hektar eingesetzt werden.
Diese Verfahrensweise, die zum Auftreten von Abwehrreaktionen in Abwesenheit jeglicher pathogener Stoffe führt, weist eine Anzahl von Nachteilen auf, von denen ein für die Pflanze nicht zu vernachlässigender Energieverbrauch zu nennen ist.
Der derzeitige Stand der Technik kann durch folgende Dokumente veranschaulicht werden:
Das Dokument FR-A-2693454 beschreibt die Verwendung Lamarin enthaltender Zusammensetzungen mit dem Ziel, die pflanzlichen Abwehrreaktionen durch Elizitation zu erhöhen.
Das Dokument Biosis, AN:78-167923 1978 beschreibt die elizitorischen Eigenschaften von β-1-3-Glucanen.
Die Dokumente CROPU: 95-84943, Rouhier et al. (1995) und CA: 117-147017, Heinkel et al. (1992) beschreiben die Behandlung von Nicotiana tabacum mit Mi schungen pilzlicher β-D-Glucane und einer Inokulierung mit dem Tabakmosaikvirus zum ersten, respektive Mischungen von Mykolaminaran und einer Inokulierung mit dem Tabakmosaikvirus zum zweiten.
Es ist daher insbesondere die Aufgabe der Erfindung, neuartige Hilfsmittel zur Verfügung zu stellen, die es ermöglichen, dass die Stimulation natürlicher Abwehrsysteme der Pflanze sich nur im Bedarfsfall ausbildet, mit anderen Worten, zum Zeitpunkt des Angriffs der Pflanze durch einen pathogenen Stoff, wobei diese Hilfsmittel der Pflanze folglich die erworbene systemische Widerstandsfähigkeit vermitteln, mit anderen Worten eine Immunität gegen pathogene Stoffe.
Es ist weiterhin der Verdienst der Anmelderin nach gründlichen Untersuchungen gefunden zu haben, dass, in vollkommen überraschender und unerwarteter Weise, nicht nur dieses Ergebnis erhalten werden konnte, sondern sich sogar eine Potenzierung natürlicher Abwehrsysteme einstellt, sobald einer solchen Pflanze eine Zusammensetzung verabreicht wird, die ein oder mehrere β-1-3-Glucane bestehend aus 3 bis 250, vorzugsweise 3 bis 50 und besonders bevorzugt 3 bis 30 Saccharoseeinheiten enthält, deren Molekulargewicht somit 540 bis 45000 Dalton beträgt, wobei die Konzentrationen der Oligo-β-1-3-Glucane in der Zusammensetzung geringer ist, als die Konzentration, bei der eine direkte Abwehrreaktion induziert wird, wobei diese Konzentrationen eine Größe von 1 bis 20 mg/l, vorzugsweise im Falle von Weizen und Tabak 2-10 mg/l aufweisen, was einem Einsatz einer Menge von 1 bis 200 g, vorzugsweise von 4 bis 80 g der Oligo-β-1-3-Glucane pro Kulturhektar entspricht.
Es konnte in der Tat gezeigt werden, dass, wenn die Oligo-β-1-3-Glucane in Zusammensetzungen verwendet werden, in denen diese im Falle von Weizen und Tabak in begrenzten Konzentrationen von 1 bis 20 mg/1 beinhaltet sind, weiches einem Einsatz pro Kulturhektar in den angegebenen Mengen entspricht, diese einen potenzierenden Effekt auf die natürlichen Abwehrsysteme der behandelten Pflanzen aus üben, welche nur von dem Moment an ausgelöst werden, wenn tatsächlich ein Angriff eines pathogenen Stoffs erfolgt.
Ein diesbezüglicher Vorteil besteht darin, dass der Stoffwechsel der Pflanze nicht zu einem Zeitpunkt auf die Bereitstellung von Abwehrreaktionen umgeleitet wird, an dem diese Bereitstellung nicht von Nutzen ist; der Stoffwechsel wird in Alarmbereitschaft versetzt und nur dann, wenn die Pflanze Ziel eines Pathogenangriffs wird, mobilisiert sie ihre Abwehrsysteme, und zwar bedeutend stärker als in Abwesenheit der Behandlung.
Hieraus ergibt sich, dass das Verfahren zur Stimulation natürlicher Abwehrsysteme landwirtschaftlicher Nutzpflanzen dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Behandlung, vornehmlich der Blätter der Pflanzen, insbesondere derer der oben beschriebenen Gruppen, mit einer wirksamen Menge wenigstens eines Oligo-β-1-3-Glucans umfasst, wobei die Menge der Oligo-β-1-3-Glucane in der Zusammensetzung geringer ist, als die bei der eine direkte Abwehrreaktion induziert wird.
Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzten Oligo-β-1-3-Glucane bestehen aus 3 bis 250, vorzugsweise 3 bis 50 und besonders bevorzugt 3 bis 30 Saccharoseinheiten, wobei ihr Molekulargewicht folglich zwischen 540 und 45000 Dalton beträgt.
Die "wirksame Menge" wird definiert durch eine Menge wenigstens eines Oligo-β-1-3-Glucans, die pro Hektar zu behandelnder Kultur geeignet ist, den Pflanzen der Kultur die erfindungsgemäße systemisch erworbene Widerstandsfähigkeit zu verleihen.
Sie ist im Falle von Weizen 1 bis 200 g, vorzugsweise 4 bis 80 g.
In anderen Worten ist der Gegenstand der Erfindung die Verwendung einer Pflanzenschutzverbindung, die ein oder mehrere Oligo-β-1-3-Glucane zusammengesetzt aus 3 bis 250, vorzugsweise 3 bis 50 und besonders bevorzugt 3 bis 30 Saccharoseeinheiten beinhaltet, zur Potenzierung und Stimulation natürlicher Abwehrsysteme von landwirtschaftlichen Nutzpflanzen, wobei die Konzentration der Oligo-β-1-3-Glucane und die Einsatzmenge der Verbindung so gewählt werden, dass pro Kul-turhektar eine Menge von Oligo-β-1-3-Glucanen Anwendung findet, wobei die Menge der Oligo-β-1-3-Glucane in der Zusammensetzung geringer ist, als die bei der eine direkte Abwehrreaktion induziert wird, was in der Praxis einer Menge von 1 bis 200 g, vorzugsweise 4 bis 80 g pro Hektar bei Getreiden, insbesondere im Falle von Weizen, entspricht.
Der Einsatz erfolgt durch ein oder zweimaliges Ausbringen der Verbindung in einem frühzeitigen Vegetationsstadium, insbesondere im Zweiblattstadium, vorzugsweise durch Besprühen der Blätter.
Der genaue Zeitpunkt des ein- oder mehrmaligen Aufbringens wird in Abhängigkeit von der behandelten Pflanze und deren Vegetationsstadium bestimmt.
Zum Auftragen auf das Blatt wird im allgemeinen eine wässrige Verbindung eingesetzt, welche nicht nur die aktive Substanz bestehend aus dem oder den Oligo-β-1-3-Glucanen enthält, sondern weiterhin für solche Verbindungen typische Grundbestandteile, wobei die Konzentration der aktiven Substanz in der Verbindung 0,0001 bis 0,02 g/l, vorzugsweise im Falle von Getreiden 0,002 bis 0,01 g/l beträgt.
Zur Herstellung der Verbindung kann anstelle von Wasser ein Trägerstoff, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Mineralöle und pflanzliche Öle, flüssige Fette und Alkohole, insbesondere Propylenglykol und Glycerol, verwendet werden.
Typische Grundbestandteile der Verbindungen werden, in Abhängigkeit von den zu behandelnden Pflanzen, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Lösungsmittel, Tenside, Dispergiermittel und Feststoffe.
Das Volumen der eingesetzten Verbindung pro Hektar beträgt 10 bis 1000 Liter, im Allgemeinen eine Größenordnung von 500 Litern.
In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet die Pflanzenschutzverbindung, in Verbindung mit den Oligo-β-1-3-Glucanen, wenigstens ein anderes Pflanzenschutzmittel ausgewählt aus der Gruppe umfassend Fungizide und Insektizide.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Konzentrat in flüssiger, Pulvriger oder granulärer Form, welches durch Lösung in einer geeigneten Menge von Lösungsmittel, insbesondere von Wasser, zur erfindungsgemäß angewandten Verbindung wird.
Zur Herstellung der Oligo-ß-1-3-Glucane können β-1-3-Glucane, welche Polysaccharide mit einem Molekulargewicht zwischen 60000 und mehr als 1 Million Dalton sind, hydrolysiert werden, wobei die Polysaccharide grundsätzlich aus D-Glukose Einheiten bestehen, die durch β-glykosidische Bindungen zwischen dem Kohlenstoff 1 der ersten Glukoseeinheit und dem Kohlenstoff 3 der zweiten Glukoseeinheit, folglich durch β (1–3) Bindungen verbunden sind, wobei es sich um lineare Polysaccharide aus bis zu 10000 Saccharoseeinheiten pro Molekül handelt, die β-1-6 Verzweigungen enthalten können.
Die β-1-3-Glucane sind unterschiedlicher Herkunft.
Sie können extrahiert sein

– aus Bakterien, insbesondere aus Alcaligenes faecalis, das so genannte Curdlan,
– aus Pilzen, insbesondere aus Schizophyllum commune (Extrakt Schizophyllan), Sclerotium glucanium (Extrakt Scleroglucan), andere pilzliche Extrakte wie Pachyman, Lichenan (Extrakt aus Cetraria islandica), Paramylon und Lentinan (Extrakt aus Lentinus edodes),
– aus Hefen, insbesondere aus Saccharomyces cerevisiae, aus denen "Yeast glucan" und Zymosan erhalten werden, sowie
– aus verschiedenen Pflanzen, insbesondere aus Algen und Getreiden, aus denen jeweils die so genannten Extrakte "Meeresalgen β-Glucane" und "Getreide β-Glucane" erhalten werden, sowie als weiteres Extrakt die Kallose (beispielsweise extrahiert aus Pollenkörnern von Gramineen).

Die Hydrolyse der β-1-3-Glucane kann auf enzymatische oder saure Weise erfolgen.
Die enzymatische Degradation der β-1-3-Glucane kann mittels Einsatz von β-Glucanasen aus Hefen des Typs Saccharomyces cerevisiae oder aus Mollusken ausgeführt werden.
Von diesen β-Glucanasen seien EC 3.2.1.21 oder EC 3.2.1.6 genannt.
Aus dem auf diese Weise erhaltenen Hydrolysat wird die gesuchte Oligosaccharidfraktion durch Ultrafiltration isoliert.
Es wird darauf hingewiesen, dass die erfindungsgemäßen β-1-3-Glucane ebenso durch chemische Synthese unter Einsatz der Koenig und Knorr Reaktion hergestellt werden können.
Ein erster Schritt dieser Reaktion besteht aus der unter Erwärmung durchgeführten Acetylierung von β-D-Glucose in Natriumacetat (CH₃COONa).
In einem zweiten Schritt wird das auf diese Weise erhaltene β-D-Glucopentaacetat der Koenig und Knorr Reaktion unterworfen.
Die folgenden, nicht limitierenden Beispiele stellen eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 1
Herstellung eines aus dem Hydrosylat H13 bestehenden β-1-3-Glucans
Als Ausgangsmaterial wird Curdlan, ein aus dem Bakterium Alcaligenes faecalis extrahiertes β-1-3-Glucan verwendet; Curdlan ist ein Produkt der Firma SIGMA Chemie unter der Referenznummer C 7821.
Es werden 20 g Curdlan in 2 Litern demineralisiertem Wasser gelöst.
Die Lösung wird auf 40°C erwärmt und 80 Einheiten Enzym zugegeben.
Die Lösung wird 2 Stunden 45 Minuten bei 40°C inkubiert.
Die erhaltene Lösung wird in der Folge mittels eines Pellicon Querstromfilters der Firma MILLIPORE mit einer Durchlässigkeitsgrenze von 5000 Dalton ultrafiltriert.
Der Ausgangsdruck beträgt 3 bar.
Das zur Ultrafiltration eingesetzte Volumen wird dabei durch Zugabe von 3 Litern demineralisiertem Wasser bei einem Volumen von 2 Litern konstant gehalten.
Die dadurch gewonnenen 4 Liter Ultrafiltrat enthalten β-1-3-Glucane eines Molekulargewichts von unter 5000 Dalton, wobei, ausgehend von einem ungefähren Molekulargewicht einer Saccharoseeinheit von 180, die erhaltenen Oligo-β-1-3-Glucane aus mehr als 30 Saccharoseeinheiten bestehen. Die Lösung wird in der Folge durch Verdampfung in einem Gerät der Marke ROTAVAPOR bei 80°C auf 50 ml eingeengt und anschließend lyophilisiert.
Es werden 16 g eines cremfarbenen Pulvers des Hydrolysats H13 erhalten.
Mittels einer ionenchromatographischen elektrochemischen Messanalyse unter Verwendung eines DIONEX Ionenaustauschers der Firma DIONEX Chemical Corp. konnte nachgewiesen werden, dass das Pulver aus Oligo-β-1-3-Glucanen von in der Tat 2 bis 30 Saccharoseeinheiten besteht, wobei der mittlere Polymerisationsgrad 3 bis 15 beträgt.
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 2
Herstellung eines aus dem Hydrosylat H11 bestehenden β-1-3-Glucans
Als Ausgangsmaterial wird die Meeresalge Laminaria digitata verwendet.
300 g Frischalgen der Gattung Laminaria digitata in frischer oder getrockneter Form, die im Monat August geerntet wurden, wird schrittweise 1 10,3%ige Schwefelsäure zugegeben.
Der Vorgang wird bei etwa 70°C während 2 Stunden 30 Minuten in einem Wasserbad unter Rühren durchgeführt.
Der Vorgang wird zweimal wiederholt.
Der erhaltene Extrakt wird mittels Filtration durch einen 1,2 μm Filter gereinigt.
Die daraus entstehende Lösung wird einer Querstromultrafiltration durch eine Membran mit einer Durchlässigkeitsgrenze von 5000 Dalton unterworfen.
Die Ultrafiltration wird unter Beibehaltung eines Drucks von 1 bar durchgeführt.
Es wird auf diese Weise ein Ultrafiltrat mit pH 5,5 und einem Volumen von etwa 0,8 Litern erhalten. Das Ultrafiltrat wird einer Dialyse durch eine 500 Dalton Zelluloseestermembran unterworfen.
Das erhaltene Dialysat wird mittels eines Geräts der Marke ROTOVAPOR bei 80 °C auf ein Volumen von 100 ml eingeengt und anschließend lyophilisiert.
Es werden 7 g eines cremfarbenen Pulvers des Hydrolysats H11 erhalten.
Mittels einer ionenchromatographischen elektrochemischen Messanalyse unter Verwendung eines Dionex Ionenaustauschers der Firma DIONEX konnte nachgewiesen werden, dass das Pulver aus Oligo-β-1-3-Glucanen von in der Tat 3 bis 30 Saccharoseeinheiten besteht, wobei der mittlere Polymerisationsgrad 20 bis 30 beträgt.
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 3
Herstellung eines aus dem Hydrosylat H14 bestehenden β-1-3-Glucans
Als Ausgangsmaterial wird Zymosan verwendet.
Es werden 20 g Zymosan, ein aus Saccharomyces cerevisiae extrahiertes β-1-3-Glucan der Firma SIGMA Chemie unter der Referenznummer Z 4250, in 2 Litern demineralisiertem Wasser gelöst.
Dieser Lösung werden 20,4 g einer konzentrierten 96%igen Schwefelsäurelösung so zugegeben, dass eine Endkonzentration an SO₄H₂ von 0,1 M erhalten wird.
Die Mischung wird 6 Stunden bei 75–80°C inkubiert.
Durch Zugabe einer 50%igen Natronlaugelösung wird anschließend ein neutraler pH von 6 eingestellt.
Es wird eine Querstromultrafiltration mittels des in Ausführungsbeispiel 1 verwendeten 5000 Dalton Filters durchgeführt, wobei der Ausgangsdruck 3 bar beträgt und dieser während der Ultrafiltration beibehalten wird, was den Durchtritt von Molekülen eines Molekulargewichts leicht oberhalb der Durchlässigkeitsgrenze des 5000 Dalton Filters erlaubt, und wonach das Ultrafiltrat einer zusätzlichen Ultrafiltration durch dieselbe Vorrichtung ausgestattet mit einem 500 Dalton Filter unterworfen wird, wodurch die Lösung entsalzt wird.
Das hierbei gewonnene Filtrat wird durch Verdampfung bei 80°C mittels des in Ausführungsbeispiel 1 verwendeten Geräts der Marke ROTAVAPOR auf ein Volumen von 50 ml eingeengt und anschließend lyophilisiert.
Es werden auf diese Weise 15 g eines cremfarbenen Pulvers bestehend aus Oligo-β-1-3-Glucanen mit einem Molekulargewicht von 500 bis 5400 Dalton, was 3 bis 30 Saccharoseeinheiten entspricht, erhalten, wobei dieses Pulver das Hydrolysat H14 darstellt.
Die Ausbeute beträgt 60–75% bezogen auf das Ausgangsmaterial.
Mittels einer ionenchromatographischen elektrochemischen Messanalyse unter Verwendung eines Dionex Ionenaustauschers der Firma DIONEX Chemical Corp. konnte nachgewiesen werden, dass das Pulver aus Oligo-β-1-3-Glucanen von tatsächlich 3 bis 30 Saccharoseeinheiten besteht, wobei der mittlere Polymerisationsgrad 4 bis 10 beträgt.
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 4
Herstellung eines aus dem Hydrosylat H30 bestehenden β-1-3-Glucans
Als Ausgangsmaterial wird Lichenan, ein aus dem Pilz Cetraria islandica extrahiertes β-1-3-Glucan der Firma SIGMA Chemie unter der Referenznummer L6133, verwendet.
Als Enzym wird CEREFLO, ein β-Glucanase Präparat der Firma NOVO, das durch Fermentation eines Bakterienstamms der Gattung Bacillus subtilis erhalten wird, eingesetzt.
Es werden 10 g Lichenan in 2 Litern demineralisiertem Wasser gelöst.
Der auf 30°C erwärmten Lösung werden 100 Einheiten des Enzyms beigefügt.
Die Lösung wird für 2 Stunden bei 30°C inkubiert.
Die Lösung wird in der Folge mittels eines Pellicon Querstromultrafiltrationssystems der Firma MILLIPORE mit einem Filter der Durchlässigkeitsgrenze von 10000 Dalton ultrafiltriert.
Während der Ultrafiltration wird das zur Ultrafiltration eingesetzte Volumen mit einem Anteil von 2 Litern demineralisiertem Wasser gespült.
Die dadurch gewonnenen 4 Liter Ultrafiltrat enthalten β-1-3-Glucane eines Molekulargewichts von unter 10000 Dalton, wobei, ausgehend von einem ungefähren Molekulargewicht einer Saccharoseeinheit von 180, die erhaltenen Oligo-β-1-3-Glucane aus mehr als 50 Saccharoseeinheiten bestehen.
Die Lösung wird in der Folge durch Verdampfung bei 80°C mittels eines Geräts der Marke ROTAVAPOR auf ein Volumen von 50 ml eingeengt und anschließend lyophilisiert.
Es werden 8 g eines cremfarbenen Pulvers des Hydrolysats H30 erhalten.
Mittels einer ionenchromatographischen elektrochemischen Messanalyse unter Verwendung eines Dionex Ionenaustauschers der Firma DIONEX Chemical Corp. konnte nachgewiesen werden, dass das Pulver aus Oligo-β-1-3-Glucanen von tatsächlich 3 bis 50 Saccharoseinheiten besteht, wobei der mittlere Polymerisationsgrad 10 bis 40 beträgt.
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 5
Wässriges Konzentrat auf Grundlage des Extrakts H11
Das Konzentrat umfasst im Wesentlichen die folgenden Bestandteile:

Extrakt H11 200 g

Tensid Tween 80 5 g

Konservierungsmittel (Natriummethylparaben) 5 g

Wasser 790 g

1.000 g
Das, bezogen auf das Gewicht der aktiven Substanz, 20%ige Konzentrat kann zum Einsatz mit einer angemessenen Menge Wasser verdünnt werden, so dass eine Konzentration des aktiven Bestandteils in der Endmischung von 0,01 g/1 erhalten wird.
Die so erhaltene, verwendungsfertige Zusammensetzung kann zum Besprühen der Blätter der zu behandelnden Pflanzen eingesetzt werden.
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 6
Pulvrige Zusammensetzung auf Grundlage des Hydrolysats H13
Es handelt sich um eine wasserlösliche Zusammensetzung in Form eines Pulvers, welche sowohl die aktive Substanz als auch typische Grundbestandteile enthält.
Die Zusammensetzung ist wie folgt:

Hydrolysat H13 200 g

Kaolin als mineralischer Füllstoff 500 g

Konservierungsmittel (Natriummethylparaben) 5 g

Aufgereinigte Stärke als Anti-Backmittel 295 g

1.000 g
Das, bezogen auf das Gewicht der aktiven Substanz, 20%ige Pulver kann für den Sprüheinsatz zu 10 g in 1000 ml Wasser gelöst werden.
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 7
Wässriges Konzentrat auf Grundlage des Hydrolysats H14
Das Konzentrat umfasst im Wesentlichen die folgenden Bestandteile:

Hydrolysat H14 200 g

Tensid Tween 80 5 g

Konservierungsmittel (Natriummethylparaben) 5 g

Wasser 790 g

1.000 g
Das, bezogen auf das Gewicht der aktiven Substanz, 20%ige Konzentrat kann zum Einsatz mit einer angemessenen Menge Wasser verdünnt werden, so dass eine Konzentration des aktiven Bestandteils in der Endmischung von 0,01 g/1 erhalten wird.
Die so erhaltene, verwendungsfertige Zusammensetzung kann zum Besprühen der Blätter der zu behandelnden Pflanzen eingesetzt werden.
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 8
Pulvrige Zusammensetzung auf Grundlage des Hydrolysats H30
Es handelt sich um eine wasserlösliche Zusammensetzung in Form eines Pulvers, welche sowohl die aktive Substanz als auch typische Grundbestandteile enthält.
Die Zusammensetzung ist wie folgt:

Hydrolysat H30 200 g

Kaolin als mineralischer Füllstoff 500 g

Konservierungsmittel (Natriummethylparaben) 5 g

Aufgereinigte Stärke als Anti-Backmittel 295 g

1.000 g
Das, bezogen auf das Gewicht der aktiven Substanz, 20%ige Pulver kann für den Sprüheinsatz zu 10 g in 1000 ml Wasser gelöst werden.
Die Wirksamkeit der β-1-3-Glucane der Hydrolysats H13 und des Extrakts H11 wurden bei mit Septoriose infizierten Weizenpflanzen nachgewiesen, wobei außerdem die Potenzierung der natürlichen Abwehrsysteme durch das Extrakt H11 und das Hydrolysat H13 bei Zellkulturen des Tabaks gezeigt werden konnte.
Die entsprechenden Versuche sind in den Ausführungsbeispielen 9 bis 12 beschrieben.
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 9
Wirksamkeitsstudie des Hydrolysats H13 bei mit Septoria tritici infiziertem Weizen
Zu dieser Studie werden 200 Pflänzchen nicht-winterharten Weizens der Sorte "Tendral" eingesetzt, welcher bekanntermaßen sensibel gegenüber Septoria tritici ist.
Die Pflänzchen werden in 20 Schalen von je 10 Pflänzchen aufgezogen.
Es werden 5 Einheiten gebildet, bezeichnet als A, B, C, D und E und jeweils bestehend aus 4 Schalen, mit anderen Worten 4 Ansätze zu je 10 Pflänzchen.
In jeder Einheit werden

– der erste und zweite Ansatz, die die Kontrollen darstellen, durch Besprühen der Blätter im vegetativen Zweiblattstadium (GS 12 entsprechend der Zadocks Leiter) mit destilliertem Wasser, 0,1% TWEEN 20, behandelt,
– der dritte und vierte Ansatz durch Besprühen der Blätter im vegetativen Zweiblattstadium (GS 12 entsprechend der Zadocks Leiter) mit 5 ml einer ersten erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die als aktive Substanz das Hydrolysat H13 umfasst, behandelt.

Diese Zusammensetzung beinhaltet in mit TWEEN 20 versetztem destillierem Wasser:

– im Versuchsansatz A, 1 mg/l Hydrolysat H13,
– im Versuchsansatz B, 2 mg/l Hydrolysat H13,
– im Versuchsansatz C, 10 mg/l Hydrolysat H13,
– im Versuchsansatz D, 100 mg/l Hydrolysat H13,
– im Versuchsansatz E, 1000 mg/l Hydrolysat H13.

Nach dem Besprühen werden die 4 Ansätze jeder Einheit 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, um Produkttröpfchen auf der Oberfläche der Blätter trocknen zu lassen. Sie werden anschließend in eine Klimakammer bei 19°C Tagestemperatur und 17°C Nachtemperatur, unter einem photoperiodischen Wechsel von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit bei einer relativen Feuchtigkeit von 65%, überführt.
48 Stunden nach dieser Behandlung werden die ersten und dritten Ansätze jeder Einheit mittels Besprühung mit einer 0,1% TWEEN 20 enthaltenden, wässrigen Suspension von 10⁵ Pycnosporen pro ml eines Stammes von Septoria tritici inkubiert.
Die zweiten und vierten Ansätze jeder Einheit werden derselben Inokulation mit dem pathogenen Stoff 72 Stunden nach der Behandlung mit Hydrolysat H13 unterworfen.
Die Pflänzchen der Kontrollansätze und der mit Septoria tritici inokulierten Ansätze werden in eine Klimakammer bei 19°C Tagestemperatur und 17°C Nachtemperatur, unter einem photoperiodischen Wechsel von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit bei einer während der ersten 96 Stunden relativen Feuchtigkeit von 100 % und anschließend 85%, überführt.
21 Tage nach den ersten beziehungsweise zweiten Inokulationsserien mit Septoria tritici werden die Weizenpflänzchen der fünf Einheiten zu je 4 Ansätzen ausgewertet.
Die Wirksamkeit der Produkte wird einerseits durch den prozentualen Schutz PP, andererseits durch die Infektionsstärke II, beide in Prozent ausgedrückt, beschrieben.
Die beiden Größen werden in Bezug auf die Kontrollansätze definiert.
Der "prozentuale Schutz" wird nach folgender Formel errechnet:
Die "Infektionsstärke" wird nach folgender Formel errechnet:
Die gesamten Ergebnisse dieser Berechnungen werden in Tabelle I zusammengefasst.
TABELLE I
Aus der Auswertung der in Tabelle I zusammengefassten Ergebnisse ergibt sich

– dass die Besprühung mit H13 eine Verringerung der Infektion mit Septoria tritici zur Folge hat,
– dass die Behandlung vor einer eventuellen Infektion mit einem pathogenen Stoff erfolgen sollte; denn die erhaltenen Ergebnisse bei einer Inokulation 72 Stunden nach der Behandlung sind besser als jene, die bei einer Inokulation 48 Stunden nach der Behandlung erzielt wurden,
– dass die Konzentrationen der angewandten Zusammensetzungen vorteilhafterweise ungefähr 2 bis ungefähr 10 mg/l betragen, Werte, bei denen es gemäß dem nachfolgenden Ausführungsbeispiel 12 zu keiner oder praktisch keiner Elizitierung von Abwehrsystemen kommt.

AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 10
Wirksamkeitsstudie des Hydrolysats H11 bei mit Septoria tritici infiziertem Weizen
Zu dieser Studie werden 200 Pflänzchen nicht-winterharten Weizens der Sorte "Tendral" eingesetzt, welcher bekanntermaßen sensibel gegenüber Septoria tritici ist.
Die Pflänzchen werden in 20 Schalen von je 10 Pflänzchen aufgezogen.
Es werden 5 Einheiten gebildet, bezeichnet als A, B, C, D und E und jeweils bestehend aus 4 Schalen, mit anderen Worten 4 Ansätze zu je 10 Pflänzchen.
In jeder Einheit werden

– der erste und zweite Ansatz, die die Kontrollen darstellen, durch Besprühen der Blätter im vegetativen Zweiblattstadium (GS 12 entsprechend der Zadocks Leiter) mit destilliertem Wasser, 0,1% TWEEN 20, behandelt,
– der dritte und vierte Ansatz durch Besprühen der Blätter im vegetativen Zweiblattstadium (GS 12 entsprechend der Zadocks Leiter) mit 5 ml einer ersten erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die als aktive Substanz das Extrakt H11 umfasst behandelt.

Diese Zusammensetzung beinhaltet in mit TWEEN 20 versetztem destilliertem Wasser:

– im Versuchsansatz A, 1 mg/l Extrakt H11,
– im Versuchsansatz B, 2 mg/l Extrakt H11,
– im Versuchsansatz C, 10 mg/l Extrakt H11,
– im Versuchsansatz D, 100 mg/l Extrakt H11,
– im Versuchsansatz E, 1000 mg/l Extrakt H11.

Nach dem Besprühen werden die 4 Ansätze jeder Einheit 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, um Produkttröpfchen auf der Oberfläche der Blätter trocknen zu lassen. Sie werden anschließend in eine Klimakammer bei 19°C Tagestemperatur und 17°C Nachtemperatur, unter einem photoperiodischen Wechsel von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit bei einer relativen Feuchtigkeit von 65%, überführt.
48 Stunden nach dieser Behandlung werden die ersten und dritten Ansätze jeder Einheit mittels Besprühung mit einer 0,1% TWEEN 20 enthaltenden, wässrigen Suspension von 10⁵ Pycnosporen pro ml eines Stammes von Septoria tritici inkubiert.
Die zweiten und vierten Ansätze jeder Einheit werden derselben Inokulation mit dem pathogenen Stoff 72 Stunden nach der Behandlung mit Extrakt H11 unterworfen.
Die Pflänzchen der Kontrollansätze und der mit Septoria tritici inokulierten Ansätze werden in eine Klimakammer bei 19°C Tagestemperatur und 17°C Nachtemperatur, unter einem photoperiodischen Wechsel von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit bei einer während der ersten 96 Stunden relativen Feuchtigkeit von 100 % und anschließend 85%, überführt.
21 Tage nach den ersten beziehungsweise zweiten Inokulationsserien mit Septoria tritici werden die Weizenpflänzchen der fünf Einheiten zu je 4 Ansätzen ausgewertet.
Die Wirksamkeit der Produkte wird einerseits durch den prozentualen Schutz PP, andererseits durch die Infektionsstärke II, beide in Prozent ausgedrückt, beschrieben.
Die beiden Größen werden in Bezug auf die Kontrollansätze definiert.
Der "prozentuale Schutz" wird nach folgender Formel errechnet:
Die "Infektionsstärke" wird nach folgender Formel errechnet:
Die gesamten Ergebnisse dieser Berechnungen werden in Tabelle II zusammengefasst.
TABELLE II
Aus der Auswertung der in Tabelle II zusammengefassten Ergebnisse ergibt sich

– dass die Besprühung mit H11 eine Verringerung der Infektion mit Septoria tritici zur Folge hat,
– dass die Behandlung vor einer eventuellen Infektion mit einem pathogenen Stoff erfolgen sollte; denn die erhaltenen Ergebnisse bei einer Inokulation 72 Stunden nach der Behandlung sind besser als jene, die bei einer Inokulation 48 Stunden nach der Behandlung erzielt wurden,
– dass die Konzentrationen der angewandten Zusammensetzungen vorteilhafterweise ungefähr 2 bis ungefähr 10 mg/l betragen, Werte, bei denen es gemäß dem nachfolgenden Ausführungsbeispiel 12 zu keiner oder praktisch keiner Elizitierung von Abwehrsystemen kommt.

AUSFÜRUNGSBEISPIEL 11
Studie der landwirtschaftlichen Wirksamkeit des Extrakts H11 im Fall der Septoriose von Weizen
Der die Krankheit auslösende Pilz ist Septoria tritici.
Der Wirkstoff wird in einer Form wie in Ausführungsbeispiel 5 beschrieben eingesetzt.
Der Versuch wird im freien Feld an einer gegenüber Septoriose anfälligen Varietät durchgeführt und erlaubt einen Vergleich mehrerer Dosierungen der aktiven Substanz, und zwar 0,4 g/ha, 4 g/ha, 20 g/ha, 40 g/ha, 60 g/ha und 80 g/ha.
Jede Dosierung wird auf vier Parzellen von 20 m² getestet. Vier weitere Parzellen dienen als Kontrolle.
Die Wirksamkeit wird anhand der Infektionsstärke beurteilt, welche nach folgender Formel errechnet wird:
Die Zusammensetzung wird durch Blattbesprühung im BBCH 30 Stadium mit einem Volumen von 250 l/ha aufgebracht.
Die Infektion erfolgt auf natürliche Weise.
Der Anteil der befallenen Oberfläche der Kontrollparzellen, das heißt nicht behandelter Parzellen, beträgt 17%.
Die Versuche wurden dreifach wiederholt und die Mittelwerte der Ergebnisse in Tabelle III zusammengestellt.
TABELLE III
Die Auswertung der in Tabelle III zusammengefassten Werte zeigt, dass die besten Resultate mit Dosierungen von 20 bis 60 g/ha erzielt wurden.
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 12
Versuche, welche die Potenzierung natürlicher Abwehrsysteme von Pflanzen durch das Extrakt H11 und das Hydrolysat H13 zeigen
Es wurden zwei Versuche durchgeführt.
In einem ersten Versuch wurden, hinsichtlich einer Studie des direkten elizitorischen Effekts der Produkte H11 und H13, Zusammensetzungen mit zunehmender Konzentration an H11 und H13 auf Zellkulturen von Tabak BY aufgebracht, und zwar

– für H11 Zusammensetzungen mit aufeinander folgenden Konzentrationen von 2 mg/l, 10 mg/l, 20 mg/l, 50 mg/l und 200 mg/l,
– für H13 Zusammensetzungen mit aufeinander folgenden Konzentrationen von 2 mg/l, 10 mg/l, 50 mg/l und 200 mg/l.

Für jede Zusammensetzung wurde auf vier Marker von Abwehrreaktionen getestet, und zwar:

– die Aktivität der Phenylammoniumlyase (PAL), ein Schlüsselenzym der Phytoalexinsynthese bei Pflanzen
– die Aktivität der o-Methyltransferase (OMT), ein Enzym der Ligninbiosynthese,
– die Aktivität der Lipoxygenase (LOX), ein Enzym, das an der Herstellung von Methyljasmonat beteiligt ist, das heißt einem Element der Signalkette, die zur Aktivierung von Abwehrgenen führt und
– der Gehalt an Salicylsäure (SA), einem weiteren sekundären Botenstoff pflanzlicher Abwehrreaktionen.

Die Ergebnisse werden in Form eines Induktionsfaktors der untersuchten Marker wiedergegeben, der das Verhältnis der Messwerte in elizitierten Zellen und derer in nicht elizitierten Kontrollzellen darstellt.
Die Ergebnisse dieser Messungen, die 4 bis 48 Stunden nach Beginn der Inkubation erhalten wurden, sind in der nachfolgenden Tabelle IV zusammengefasst.
TABELLE IV
Die Auswertung dieser Ergebnisse zeigt, dass die Produkte H11 und H13 Abwehrreaktionen in den behandelten Zellen elizitieren, wobei sich die Elizitationen in der Anhäufung von Markern äußern, wenn die Produkte in Konzentrationen von 20 bis 200 mg pro Liter verwendet werden; dagegen werden auf der Basis der Marker PAL und SA keine signifikanten Reaktionen induziert, wenn die Konzentration des Elizitators, das heißt der Produkte H11 oder H13, 2 oder 10 mg pro Liter beträgt.
In einem zweiten Versuch werden Kulturen der gleichen Tabak BY Zellen am Tag nach dem Pikieren unter Verwendung von Zusammensetzungen mit Konzentrationen des Extrakts H11 von 2 bis 10 mg pro Liter vorbehandelt.
Sechs Tage danach werden diese Kulturen, ebenso wie nicht vorbehandelte Kontrollkulturen, mit einer Zusammensetzung, die Oligopectine in einer Konzentration von 40 mg pro Liter enthält, behandelt.
Es handelt sich hierbei um eine Situation, die einen Angriff eines pathogenen Stoffs simuliert.
Es wird nun die Kinetik der Akkumulation von Salicylsäure (SA) 4 bis 48 Stunden nach der Behandlung verfolgt.
Die Messungen zeigen, dass die Zellen der Kontrollkulturen SA bis zu einem Gehalt anhäufen, der 300 ng pro Gramm Frischgewicht (FG) nicht übersteigt.
Es zeigt sich ebenso, dass die Vorbehandlung mit H11, in sehr starker und voll-kommen unerwarteter Weise, die Anhäufung von Salicylsäure stimuliert, wenn die Pflanze sechs Tage später mit Oligopectinen elizitiert wird; es wird in der Tat in den so behandelten Tabakzellen eine Anhäufung der SA von 2900 ng pro Gramm FG beobachtet, wenn die Konzentration von H11 zur Zeit der Vorbehandlung 2 mg pro Liter beträgt, und 700 ng pro Gramm FG, wenn die Konzentration zur Zeit der Vorbehandlung 10 mg pro Liter beträgt.
Der die Abwehrreaktion potenzierende Effekt, welcher dank der erfindungsgemäßen Verwendung erhalten wird, ist somit erwiesen.

Claims

Verfahren, das in der Lage ist, einer landwirtschaftlichen Nutzpflanze eine erworbene systemische Widerstandsfähigkeit zu verleihen, d. h. eine Immunität gegenüber einem pathogenen Stoff, eine Immunität, die sich zu dem Zeitpunkt, zu dem sich die Pflanze mit diesem pathogenen Stoff in Kontakt befindet, in einer Potenzierung der natürlichen Abwehrsysteme ausdrückt, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze vor einem Kontakt mit dem pathogenen Stoff dadurch behandelt wird, dass insbesondere auf die Blätter eine flüssige Zusammensetzung aufgetragen wird, die eine Oligo-β-1-3-Glucanverbindung von 3 bis 250 Saccharideinheiten umfasst, wobei die Konzentration der flüssigen Zusammensetzung an Oligo-β-1-3-Glucan geringer als die Konzentration ist, bei der das Oligo-β-1-3-Glucan als Elizitator wirkt, d. h. bei der es direkt die Abwehrreaktionen induziert.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass einerseits Oligoβ-1-3-Glucan 3 bis 5, vorzugsweise 3 bis 20 Saccharideinheiten umfasst, und dass andererseits die Konzentration der flüssigen Zusammensetzung an Oligo-β-1-3-Glucan 1 bis 20, vorzugsweise 2 bis 10 mg/l im Falle von Getreide und insbesondere Weizen sowie Tabak beträgt, was dem Einsatz einer Menge von 1 bis 200 g, vorzugsweise von 2 bis 80 g Oligo-β-1-3-Glucan pro Kulturhektar entspricht.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligo-β-1-3-Glucan aus Curdlan gewonnen wird, dass es sich aus 2 bis 30 Saccharideinheiten zusammensetzt und sein durchschnittlicher Polymerisationsgrad 3 bis 15 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligo-β-1-3-Glucan aus Laminaria digitata gewonnen wird, dass es sich aus 3 bis 30 Saccharideinheiten zusammensetzt und sein durchschnittlicher Polymerisationsgrad 20 bis 30 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligo-β-1-3-Glucan aus Zymosan gewonnen wird, dass es sich aus 3 bis 30 Saccharidein heiten zusammensetzt und sein durchschnittlicher Polymerisationsgrad 4 bis 10 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligo-β-1-3-Glucan aus Lichenan gewonnen wird, dass es sich aus 3 bis 50 Saccharideinheiten zusammensetzt und sein durchschnittlicher Polymerisationsgrad 10 bis 40 beträgt.
Verwendung durch Auftragung einer flüssigen Zusammensetzung, die eine Oligo-β-1-3-Glucanverbindung von 3 bis 250 Saccharideinheiten mit einer Konzentration von weniger als jener, bei der direkt die Abwehrreaktionen induziert werden, umfasst, insbesondere auf die Blätter einer landwirtschaftlichen Nutzpflanze vor dem Kontakt mit einem pathogenen Stoff, um dieser Pflanze eine erworbene systemische Widerstandsfähigkeit zu verleihen, d. h. eine Immunität gegenüber einem pathogenen Stoff, eine Immunität, die zu dem Zeitpunkt, zu dem sich die Pflanze im Kontakt mit dem pathogenen Stoff befindet, durch eine Potenzierung der natürlichen Abwehrkräfte zum Ausdruck kommt.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass einerseits Oligo-β-1-3-Glucan 3 bis 50, vorzugsweise 3 bis 30 Saccharideinheiten umfasst, und dass andererseits die Konzentration der flüssigen Zusammensetzung an Oligo-β-1-3-Glucan 1 bis 20, vorzugsweise 2 bis 10 mg/1 beträgt, wobei die Menge an Oligo-β-1-3-Glucan, die pro Kulturhektar eingesetzt wird, 1 bis 200 g, vorzugsweise 4 bis 80 g beträgt.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligo-β-1-3-Glucan aus Curdlan gewonnen wird, dass es sich aus 2 bis 30 Saccharideinheiten zusammensetzt und sein durchschnittlicher Polymerisationsgrad 3 bis 15 beträgt.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligo-β-1-3-Glucan aus Laminaria digitata gewonnen wird, dass es sich aus 3 bis 30 Saccharideinheiten zusammensetzt und sein durchschnittlicher Polymerisationsgrad 20 bis 30 beträgt.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligo-β-1-3-Glucan aus Zymosan gewonnen wird, dass es sich aus 3 bis 30 Sacchari deinheiten zusammensetzt und sein durchschnittlicher Polymerisationsgrad 4 bis 10 beträgt.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligo-β-1-3-Glucan aus Lichenan gewonnen wird, dass es sich aus 3 bis 50 Saccharideinheiten zusammensetzt und sein durchschnittlicher Polymerisationsgrad 10 bis 40 beträgt.