ES2197496T3 - Procedimiento para la estimulacion de las defensas naturales de plantas. - Google Patents
Procedimiento para la estimulacion de las defensas naturales de plantas.Info
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Abstract
La invención se refiere a un procedimiento para potenciar y estimular el sistema natural de control de plantas que se utilizan en la agricultura, que utiliza una composición fitosanitaria que contiene uno o varios oligo-{be}-1-3-glucanos que consiste en 3 a 250, preferiblemente 3 a 50 y más preferiblemente 3 a 30 unidades carbohidrato. Las características de concentración del oligo-{be}-1-3-glucano y la utilización de esta composición se seleccionan de manera que da una cantidad de oligo-{be}-1-3-glucano por hectárea cultivada menor de la cantidad que induce directamente las reacciones de control natural, dicha cantidad, en la práctica, está en el intervalo de 1 a 200 g, preferiblemente de 4 a 80 g por hectárea en el caso de cereales y en particular de trigo.
Description
Procedimiento para la estimulación de las
defensas naturales de plantas.
La presente invención tiene por objeto un
procedimiento para la potenciación y estimulación de las defensas
naturales de plantas de tipo agronómicamente útil.
La invención hace referencia en particular a:
- viña y árboles frutales del grupo que comprende
el manzano y peral
- cereales del grupo que comprende trigo, maíz y
arroz
- oleaginosas del grupo que comprende soja,
tornasol y colza y
- plantas leguminosas del grupo que comprenden
las zanahorias, coliflor, tomates y patatas.
La estimulación de las defensas naturales de las
plantas es un problema muy actual y es objeto de numerosas
investigaciones.
La estimulación de las defensas naturales se
traduce en el caso de una planta que ha tenido un primer contacto
con un agente patógeno tal como un virus, una bacteria, un hongo o
un insecto, en el desarrollo de un conjunto de modificaciones
biológicas que confieren a esta planta una presensibilización
gracias a la cual resulta capaz de reaccionar más eficazmente a un
nuevo ataque.
Las investigaciones que se indicarán más adelante
han permitido demostrar que la presensibilización puede ser obtenida
poniendo la planta en contacto con ciertos productos químicos de
síntesis.
Se conocen, por otra parte, productos llamados
elicitadores que, puestos en contacto con la planta, son capaces de
estimular en ésta reacciones de defensa del tipo siguiente:
- acumulación de antibióticos naturales más
conocidos bajo el nombre de fitoalexinas
- síntesis de proteínas de defensa tales como las
quitinasas o las glucanasas, igualmente conocidas bajo el nombre de
PRP (Pathogenesis-related proteins(``proteínas
relacionadas con la patogénesis''))
- endurecimiento de las paredes celulares con
síntesis de legnina o de proteínas de reticulación
- síntesis de mensajeros secundarios tales como
etileno, peróxido de hidrógeno o ácido salicílico.
Entre estos productos se pueden citar en especial
los \beta 1-3 glucanos que elicitan en diferentes
plantas agronómicamente útiles las reacciones de defensa indicadas,
alcanzándose generalmente las respuestas máximas cuando los óligo
\beta 1-3 glucanos se utilizan en forma de
compuestos líquidos que los contienen en concentraciones de 200mg/l
y se mantienen a un nivel comparable hasta concentraciones del orden
de 4 g/l, es decir, en cantidades por hectárea de 4 a 200 g.
Esta forma de proceder que consigue provocar
reacciones de defensa en ausencia de cualquier agente patógeno,
presenta un cierto número de inconvenientes entre los que se pueden
citar un consumo energético no despreciable para la planta.
El estado de la técnica está ilustrado por los
documentos anteriores siguientes:
documento
FR-A-2693454 que describe la
utilización de compuestos que contienen laminarina con el objeto de
aumentar las reacciones de defensa de las plantas por
elicitación.
Documento Biosis, AN:78-167923
1978 que describe las propiedades de elicitación de los \beta
1-3 glucanos.
Los documentos CROPU:95-84943,
Rouhier y otros (1995) y CA: 117-147017, Heinkel y
otros (1992) describen respectivamente el tratamiento de Nicotiana
tabacum con mezcla de
\beta-D-glucanos fúngicos y de un
inóculo de virus del mosaico de tabaco, en cuanto al primero, y
mezclas de micolaminarán y de un inóculo de virus del mosaico de
tabaco para el segundo.
Por lo tanto, la presente invención tiene como
objetivo, sobretodo, poner a disposición de los usuarios nuevos
medios que permitan proceder de manera tal que el estímulo de las
defensas naturales de la planta no se produce más que en caso de
necesidad, dicho de otro modo, cuando tiene lugar el ataque de la
planta por un agente patógeno, confiriendo dichos medios, como
consecuencia, a la planta la mencionada resistencia sistémica
adquirida, es decir, una inmunidad contra los agentes patógenos.
La solicitante ha tenido el mérito de descubrir,
como resultado de profundas investigaciones, que de manera
totalmente sorprendente e inesperada, no solamente se conseguía
dicho resultado, sino que se producía incluso una potenciación de
las defensas naturales en el momento de la aplicación a una planta
del tipo en cuestión de un compuesto de uno o varios oligo \beta
1-3 glucanos compuestos de 3 hasta 250,
preferentemente de 3 a 50 y más preferentemente de 3 a 30 unidades
de sacáridos, variando, por lo tanto, sus masas moleculares de 540 a
45000 Daltons, encontrándose presentes estos óligo \beta
1-3 glucanos en el compuesto con concentraciones
inferiores a las que inducen directamente reacciones de defensa,
siendo estas concentraciones del orden de 1 a 20 mg/l,
preferentemente de 2 a 10 mg/l en el caso del trigo y del tabaco, lo
que corresponde a la utilización por hectárea de cultivo de una
cantidad de 1 a 200 g, preferentemente de 4 a 80 g de los antes
mencionados óligo \beta 1-3 glucanos.
La solicitante ha podido demostrar que cuando
dichos óligo \beta 1-3 glucanos son utilizados en
forma de compuestos en los que se encuentran presentes con
concentraciones situadas en un campo estrecho de 1 a 20 mg/l en el
caso del trigo y el tabaco, que corresponde a la utilización por
hectárea de cultivo de cantidades indicadas anteriormente, ejercen
sobre las plantas tratadas un efecto potenciador de las reacciones
de defensa naturales que no se desencadenan más que a partir del
momento en el que el ataque de un agente patógeno se produce de
manera efectiva.
La ventaja conseguida es que el metabolismo de la
planta no queda desviado a la realización de las reacciones de
defensa en un momento en el que esta acción resulta inútil; este
metabolismo es puesto en alerta y, solamente cuando la planta es
objeto de un ataque, moviliza sus defensas y ello de manera mucho
más intensa que en la ausencia de tratamiento.
Se deduce que el procedimiento de estimulación de
las defensas naturales de plantas agronómicamente útiles se
caracteriza por el hecho de comprender la aplicación, especialmente
foliar, a las plantas del tipo mencionado, en especial las del grupo
definido anteriormente, de una cantidad eficaz por lo menos de un
óligo \beta 1-3 glucano, siendo esta cantidad
eficaz inferior a las que inducen directamente reacciones de
defensa.
Los óligo \beta 1-3 glucanos
utilizados dentro del marco de este procedimiento se componen de 3 a
250, preferentemente de 3 a 50 y, más preferentemente todavía de 3 a
30 unidades de sacáridos, estando comprendida su masa molecular,
como consiguiente, entre 540 y 45000 Daltons.
Se define la ``cantidad eficaz'' por la cantidad
de, como mínimo, un óligo \beta 1-3 glucano que
conviene aplicar por hectárea de cultivo a tratar para conferir a
las plantas de este cultivo la resistencia sistémica adquirida que
se ha explicado.
En el caso del trigo es de 1 a 200 g,
preferentemente de 4 a 80 g.
En otros términos, la presente invención tiene
por objeto la utilización para la potenciación y estimulación de las
defensas naturales de las plantas agronómicamente útiles, de un
compuesto fitosanitario que contiene uno o varios óligo \beta
1-3 glucanos compuestos de 3 a 250, preferentemente
de 3 a 50 y, más preferentemente de 3 a 30 unidades de sacáridos,
escogiéndose las características de concentración en óligo \beta
1-3 glucanos y de aplicación de esta composición de
manera tal que aporta por hectárea de cultivo una cantidad de óligo
\beta 1-3 glucanos inferior a la que inducen
directamente las reacciones de defensa naturales, encontrándose esta
cantidad en la práctica entre 1 y 200 g, preferentemente de 4 a 80 g
por hectárea en el caso de cereales y, en especial, del trigo.
La puesta en práctica se realiza por aplicación,
especialmente por pulverización foliar, en una o dos veces, en los
estadios vegetales precoces, especialmente en el estadio de dos
hojas.
En el momento preciso de la aplicación o
aplicaciones, se escogerá especialmente en función de la planta
tratada y de su estado vegetativo.
La composición utilizada es en general acuosa en
el caso de aplicación foliar; contiene, no solamente la sustancia
activa constituida por el oligo \beta 1-3 glucano
o glucanos, sino igualmente los constituyentes clásicos de este tipo
de composición, siendo la concentración en sustancia activa del
compuesto de 0,001 a 0,02 g/l, preferentemente de 0,002 a 0,01 g/l
en el caso de los cereales.
Para establecer la mencionada composición, se
puede utilizar, en lugar de agua, un vehículo escogido en el grupo
que comprende los aceites minerales y vegetales, los cuerpos grasos
líquidos y los alcoholes, en especial el propilenglicol y el
glicerol.
Los componentes clásicos de dichos compuestos se
escogen, en función de las plantas a tratar, entre el grupo que
comprende disolventes, agentes tensoactivos, agentes dispersantes y
cargas sólidas.
El volumen de la composición utilizado por
hectárea es de 10 a 1000 litros y, en general, del orden de 500
litros.
En una forma de realización ventajosa, dicho
compuesto fitosanitario comprende, en combinación con los óligo
\beta 1-3 glucanos, como mínimo, otro producto
fitosanitario escogido entre el grupo que comprende los fungicidas y
los insecticidas.
La presente invención tiene igualmente por objeto
un concentrado en forma de líquido o en forma de polvo o de gránulos
apropiado para facilitar por dilución, con una cantidad apropiada de
disolvente, especialmente agua, el compuesto utilizado según la
invención.
Para preparar dichos óligo \beta
1-3 glucanos, se pueden hidrolizar \beta
1-3 glucanos que son polisacáridos de peso molecular
variable de 60000 a más de 1 millón de Daltons; estos polisacáridos
consisten, esencialmente, en unidades de D-glucosa
conectadas específicamente por enlaces
\beta-glucosídicos entre el carbono 1 del primer
grupo de la glucosa y el carbono 3 del segundo grupo de la glucosa;
estos enlaces son, como consecuencia, enlaces
\beta(1\rightarrow3), tratándose de polisacáridos
lineales que pueden tener ramificaciones \beta 1-6
y que tienen hasta 10000 unidades de sacáridos por molécula.
Los \beta 1-3 glucanos tienen
diversos orígenes.
Se pueden extraer de:
- bacterias, en especial Alcaligenes
faecalis, llamándose el extracto en cuestión ``curdlan''
- hongos, en especial Schizophyllum común
(siendo el extracto el esquizofilano), Sclerotium glucanium
(siendo el extracto el escleroglucano), siendo otros extractos
fúngicos el paquimán, el liquenán (extracto de Cetraria
islandica), el paramilón y el lentinán (extracto de Lentinus
edodes)
- levaduras, en especial Saccharomyces
cerevisae, siendo los extractos obtenidos de esta manera el
``Yeast glucan'' y el cimosán, y
- diferentes plantas, en especial, algas y
cereales, estando designados los extratos correspondientes por
``\beta-glucano de algas marinas'' y
``\beta-glucano de cereales'', siendo otros
extractos el caloec (extracto, por ejemplo, de granos de polen de
gramíneas).
La hidrólisis de los \beta 1-3
glucanos se puede efectuar por vía encimática o por vía ácida.
La degradación encimática de los \beta
1-3 glucanos se puede efectuar por utilización de
\beta-glucanasas extraídas de las levaduras de
tipo Saccharomyces cerevisiae o de moluscos.
Entre estas \beta-glucanasas se
pueden citar EC 3.2.1.21. o EC 3.2.1.6.
A partir del hidrolizado obtenido de este modo se
aísla por ultrafiltración la fracción de oligosacárido
pretendida.
Se ha señalado que los óligo \beta
1-3 glucanos considerados en el marco de la
invención pueden igualmente ser preparados por síntesis química por
utilización de la reacción de Koenig y Knorr.
Una primera etapa de esta reacción consiste en la
acetilación de la \beta D-glucosa en caliente en
acetato sódico (CH_{3}COONa).
En una segunda etapa el \beta
D-glucopentacetato obtenido de este modo es sometido
a reacción de Koenig y Knorr.
Los ejemplos no limitativos siguientes se
facilitan en relación, en especial, con formas de realización
ventajosas.
La materia prima está constituida por el curdlan
que es un \beta (1-3) glucano extraído de una
bacteria, a saber, Alcaligenes faecalls, siendo comercializado el
curdlan por la Sociedad SIGMA Chimie con la referencia C 7821.
Se disuelven 20 g de curdlan en 2 litros de agua
desmineralizada.
Esta solución se mantiene por medios
termostáticos a 40ºC y se añaden 80 unidades de la mencionada
encima.
Se mantiene el conjunto a 40ºC durante 2 horas y
45 minutos.
Se ultrafiltra, a continuación, la solución
obtenida en el dispositivo de ultrafiltración tangencial
comercializado por la Sociedad MILLIPORE con la marca Pellicon,
dotado de un cassette de porosidad de 5000 Daltons.
La presión de entrada es de 3 bares.
Durante esta ultrafiltración, el volumen que se
tiene que ultrafiltrar se mantiene constantemente en 2 litros por
adición de un complemento de 3 litros de agua desmineralizada.
El ultrafiltrado de 4 litros obtenido a la salida
de esta operación de ultrafiltrado contiene los óligo \beta
1-3 glucanos de masa molecular inferior a 5000
Daltons; sabiendo que la masa molecular de la unidad de sacárido es
aproximadamente de 180, los óligo \beta 1-3
glucanos contenidos en el ultrafiltrado están constituido, como
máximo, por 30 unidades de sacárido. La solución es concentrada, a
continuación, a un volumen de 50 ml por evaporación a 80ºC con la
ayuda de un dispositivo marca Rotovapor y, a continuación, se
efectúa la liofilización.
Se obtienen 16 g de un material en polvo de color
crema que constituye el hidrolizado H13.
El análisis por cromatografía iónica acoplado a
amperometría y utilizando resina de intercambio de iones,
comercializada por la Sociedad DIONEX Chemical Corp. con la marca
Dionex, muestra que los óligo \beta 1-3 glucanos
constitutivos de dicho material en polvo tienen, en realidad, de 2 a
30 unidades de sacáridos, siendo el grado medio de polimerización de
3 a 15.
La materia prima es una alga marina denominada
Laminaría digitaka.
A 300 g de algas frescas del tipo Laminaría
digitata recogidas en el mes de agosto en forma fresca o seca, se
añaden progresivamente un litro de ácido sulfúrico al 0,3%.
La operación se realiza en baño maría a una
temperatura aproximada de 70ºC durante 2 horas y 30 minutos en
agitación.
Esta operación es llevada a cabo dos veces.
El extracto obtenido es clarificado por filtrado
sobre el filtro de porosidad 1,2 \mum.
El líquido resultante de esta filtración se
somete a una ultrafiltración tangencial sobre una membrana de
porosidad a 50000 Daltons.
La ultrafiltración es realizada manteniendo una
presión de 1 bar.
Se obtiene de esta manera un ultrafiltrado de pH
5,5 que presenta un volumen aproximado 0,8 litros. Este
ultrafiltrado es sometido a diálisis sobre una membrana de éster de
celulosa de porosidad igual a 500 Daltons.
Se obtiene un dializado que es concentrado en
volumen de 100 ml por evaporación a 80ºC con ayuda de un dispositivo
tipo ROTOVAPOR, y después es liofilizado.
Se obtienen 7 gramos de un material en polvo de
color crema que constituye el extracto H11.
Un análisis por cromatografía iónica acoplada a
la amperometría y utilizando una resina de intercambio de iones
comercializada por la sociedad DIONEX, muestra que los oligo \beta
1-3 glucanos constitutivos del mencionado material
en polvo tienen en realidad de 3 a 30 unidades de sacáridos, con un
grado de polimerización medio de 20 a 30.
La materia prima es el cimosan.
Se disuelve en 2 litros de agua desmineralizada,
una cantidad de 20 gramos de cimosan que es un \beta
1-3 glucano extracto de Saccharomyces
cerevisiae comercializado por la sociedad SIGMA Chimie con la
referencia Z4250.
A esta solución se añaden 20,4 gramos de una
solución concentrada de ácido sulfúrico al 96%, de manera que se
obtiene una concentración final de SO_{4}H_{2}de 0,1 M.
Se mantiene la mezcla de 75-80ºC
durante 6 horas.
Se neutraliza a continuación el medio hasta pH 6
por adición de una solución de sosa al 50%.
Se efectúa una ultrafiltración tangencial con
ayuda de un dispositivo utilizado en el ejemplo 1 y dotado de un
cassette de porosidad de 5000 Daltons; la presión de entrada es de 3
bares, manteniéndose esta presión durante la ultrafiltración, lo que
permite el paso de moléculas de peso molecular ligeramente superior
al umbral de corte teórico impuesto por el cassette de porosidad a
5000 Daltons; el ultrafiltrado obtenido es sometido a una
ultrafiltración suplementaria con ayuda del mismo dispositivo de
ultrafiltración pero equipado de un cassette de porosidad de 500
Daltons, gracias a lo cual la solución es desalada.
El resultado de esta operación es concentrado por
evaporación a 80ºC con ayuda del dispositivo de tipo ROTOVAPOR
utilizado en el ejemplo 1 hasta un volumen de 50 ml, y después es
liofilizado.
Se obtienen de esta manera 15 gramos en polvo de
color crema constituido por oligo \beta 1-3
glucanos con una masa molecular de 500 a 5400 Daltons, es decir, de
3 a 30 unidades de sacáridos; este material en polvo constituye el
hidrolizado H14.
El rendimiento es de 60 a 75% con respecto a la
materia prima.
Un análisis por cromatografía iónica acoplada a
la amperometría y utilizando una resina de cambio iónico
comercializada por la sociedad DIONEX Chemical Corporation con la
Marca Dionex, muestra que los oligo \beta 1-3
glucanos constitutivos de dicho material en polvo tienen
efectivamente de 3 a 30 unidades de sacáridos, con un grado de
polimerización medio de 4 a 10.
La materia prima está constituida por liquenan,
que es un \beta 1-3 glucano extraído de un hongo,
Cetraria islandica, comercializado por la sociedad SIGMA Chimie con
la referencia L6133.
Se utiliza como encima, el CEREFLO que es un
preparado de \beta-glucanasa producido por
fermentación de una cepa bacteriana del tipo de Bacilus subtilis y
comercializado por la sociedad NOVO.
Se disuelven 10 gramos de liquenan en 2 litros de
agua desmineralizada.
A esta solución, que es controlada
termostáticamente a 30ºC, se añaden 100 unidades de la mencionada
encima.
Se mantiene el conjunto a 30ºC durante 2
horas.
Se ultrafiltra a continuación la solución en un
sistema de ultrafiltración tangencial comercializado por la sociedad
MILLIPORE con la Marca Pelicon, equipado de un cassette con una
porosidad de 10000 Daltons.
Durante esta ultrafiltración el volumen a
ultrafiltrar es lavado mediante un complemento de 2 litros de agua
desmineralizada.
El ultrafiltrado de 4 litros obtenido a la salida
de esta operación de ultrafiltración contiene los oligo \beta
1-3 glucano de masa molecular inferior a 10000
Daltons; sabiendo que la masa molecular de la unidad de sacárido es
aproximadamente 180, los oligo \beta 1-3 glucanos
contenidos en el ultrafiltrado están contenidos como máximo por 50
unidades de sacáridos.
La solución es concentrar a continuación a un
volumen de 50 ml por evaporación a 80ºC con ayuda de un dispositivo
de Marca ROTOVAPOR, y a continuación es liofilizado.
Se obtienen 8 gramos de un material en polvo de
color crema que constituye el hidrolizado H30.
Un análisis por cromatografía iónica acoplada a
la amperometría y utilizando la resina de cambio de iones
comercializada por la sociedad DIONEX Chemical Corporation con la
Marca Dionex, demuestra que los oligo \beta 1-3
glucanos constitutivos de dicho material en polvo tienen de manera
efectiva de 3 a 50 unidades de sacárido, con un grado de
polimerización medio de 10 a 40.
Este compuesto concentrado presenta esencialmente
los componentes siguientes:
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|r|}\hline Extracto H11 \+ 200 g \\ Agente tensoactivo Tween 80 \+ 5 g \\ Agente conservante (metilparaben sódico) \+ 5g \\ Agua \+ 790 g \\ \+ 1000 g \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Para su puesta en práctica, ese compuesto
concentrado al 20% en peso de sustancia activa puede ser diluido con
una cantidad de agua suficiente para llevar la concentración de
materia activa en la mezcla final a un valor de 0,01 g/l.}
El compuesto obtenido de este modo, listo para su
utilización, puede ser utilizado por pulverización sobre las hojas
de las plantas a tratar.
Se trata de un compuesto soluble en agua que se
presenta en forma de un material en polvo que contiene la materia
activa y los componentes clásicos.
Su constitución es la que se indica a
continuación:
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|r|}\hline Hidrolizado H13 \+ 200 g \\ Kaolin como carga mineral \+ 500 g \\ Agente conservante (metilparaben sódico) \+ 5 g \\ Almidón purificado como producto antiaglomerante \+ 295 g \\ \+ 1000 g \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Para su utilización por pulverización, este
material en polvo al 20% en peso de sustancia activa puede ser
disuelto a razón de 10 gramos en 1000 ml de agua.
Este compuesto concentrado presenta esencialmente
los componentes siguientes:
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|r|}\hline Hidrolizado H14 \+ 200 g \\ Agente tenso-activo Tween 80 \+ 5 g \\ Agente conservante (metilparaben sódico) \+ 5 g \\ Agua \+ 790 g \\ \+ 1000 g \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Para su utilización, este compuesto concentrado
al 20% en peso de sustancia activa puede ser diluido con una
cantidad de agua suficiente para llevar la concentración de materia
activa en la mezcla final a un valor de 0,01 g/l.
El compuesto obtenido de este modo, listo para su
utilización, puede ser utilizado por pulverización sobre las hojas
de las plantas a tapar.
Se trata de un compuesto soluble en agua que se
presenta en forma de un material en polvo que contiene la materia
activa y los componentes clásicos.
Su constitución es la indicada a
continuación:
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|r|}\hline Hidrolizado H30 \+ 200 g \\ Kaolin como carga mineral \+ 500 g \\ Agente conservante (metilparaben sódico) \+ 5 g \\ Almidón purificado como antiaglomerante \+ 295 g \\ \+ 1000 g \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Para su utilización por pulverización, este
material en polvo al 20% en peso de sustancia activa puede ser
disuelto a razón de 10 gramos de H30 en 1000 ml de agua.
La eficacia de los oligo \beta
1-3 glucanos que constituyen el hidrolizado H13 y el
extracto H11 ha sido puesta en evidencia por plantas de trigo
infectadas por septoriosis; se ha demostrado por otra parte la
potenciación de las defensas naturales obtenidas con ayuda del
extracto H11 y del hidrolizado H13 en el caso de cultivos de células
de tabaco.
Las experiencias correspondientes se describen en
los ejemplos 9 a 12.
Para este estudio se utilizan 200 planteles de
trigo de invierno del tipo ``Tendral'' conocido por su sensibilidad
con respecto a Septoria tritici.
Se cultivan estos planteles en 20 cubetas cada
una de las cuales contiene 10 planteles.
Se forman 5 conjuntos, respectivamente indicados
A, B, C, D y E y constituido cada uno de ellos por 4 cubetas, es
decir, 4 lotes de 10 planteles.
En cada conjunto
- el primer y segundo lotes de planteles, que son
los lotes testigo, son tratados por pulverización foliar en el
estadio vegetativo de 2 hojas (GS 12 de acuerdo con la escala de
Zadocks) mediante agua destilada en presencia de 0,1% de TWEEN
20,
- el tercer y cuarto lotes son tratados por
pulverización foliar en el estadio vegetativo de 2 hojas (GS 12
según la escala de Zadocks) con 5 ml de un primer compuesto según la
invención que comprende, como sustancia activa, el hidrolizado
H13.
Dicho compuesto contiene en agua destilada en
presencia de TWEEN 20:
- en el experimento en el conjunto A, 1 mg/l de
hidrolizado H13,
- en el experimento en el conjunto B, 2 mg/l de
hidrolizado H13,
- en el experimento en el conjunto C, 10 mg/l de
hidrolizado H13,
- en el experimento en el conjunto D, 100 mg/l de
hidrolizado H13,
- en el experimento en el conjunto E, 1000 mg/l
de hidrolizado H13,
Después de los mencionados tratamientos por
pulverización, los planteles de los cuatro lotes de cada conjunto
se mantienen a temperatura ambiente durante 4 horas con la finalidad
de dejar secar las gotitas de productos en la superficie de las
hojas. A continuación son colocadas en una cámara climática a 19ºC
durante el día y l7ºC durante la noche, con un fotoperiodo de 12
horas de luz seguido de 12 horas de oscuridad con una humedad
relativa de 65%.
48 horas después de este tratamiento se inocula
por pulverización al primer y tercer lotes de cada conjunto una
suspensión en agua en presencia de 0,1% de TWEEN 20 conteniendo
10^{5} picnosporas por ml de una cepa de Septoria tritici.
El segundo y cuarto lotes de cada conjunto son
sometidos a la misma inoculación de agente patógeno 72 horas después
del tratamiento por el hidrolizado H13.
Los planteles de los lotes testigo y los de los
lotes inoculados con Septoria tritici son colocados en una cámara
climatizada a 19ºC durante el día y 17ºC durante la noche, con un
fotoperiodo de 12 horas de luz seguido de 12 horas de oscuridad y
una humedad relativa de 100% durante las primeras 96 horas y de 85%
a continuación.
21 días después respectivamente de la primera y
segunda series de inoculación con Septoria tritici, se inspeccionan
los planteles de trigo de los cinco conjuntos de cuatro lotes.
La eficacia de los productos se caracteriza, por
una parte, por el porcentaje de protección PP y, por otra parte, por
la intensidad de infección II, ambos expresados en porcentaje.
Las dos magnitudes se definen con respecto a los
lotes testigo.
El ``porcentaje de protección'' se calcula por la
fórmula siguiente:
\formulai
La ``intensidad de infección'' se calcula por la
fórmula siguiente:
\formulaii
Los resultados del conjunto de estas
determinaciones se reúnen en la tabla 1.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|c|c|}\hline Hidrolizado \+\multicolumn{2}{|c|}{Conjunto }\+\multicolumn{4}{|c|}{Resultados registrados 21 días después}\\ utilizado \+\multicolumn{2}{|c|}{(concentración de }\+\multicolumn{4}{|c|}{ }\\ \+\multicolumn{2}{|c|}{hidrolizado del }\+\multicolumn{4}{|c|}{ }\\ \+\multicolumn{2}{|c|}{compuesto de }\+\multicolumn{4}{|c|}{ }\\ \+\multicolumn{2}{|c|}{tratamiento) }\+\multicolumn{4}{|c|}{ }\\\dddcline{4}{7} \+\multicolumn{2}{|c|}{ }\+\multicolumn{2}{|c|}{Inoculación de las }\+\multicolumn{2}{|c|}{Inolucación de}\\ \+\multicolumn{2}{|c|}{ }\+\multicolumn{2}{|c|}{esporas 48 horas }\+\multicolumn{2}{|c|}{las esporas 72}\\ \+\multicolumn{2}{|c|}{ }\+\multicolumn{2}{|c|}{después del }\+\multicolumn{2}{|c|}{horas después del}\\ \+\multicolumn{2}{|c|}{ }\+\multicolumn{2}{|c|}{tratamiento }\+\multicolumn{2}{|c|}{tratamiento}\\\hline \+\multicolumn{2}{|c|}{ }\+ PP% \+ II% \+ PP% \+ II% \\\hline H13 \+ A \+ 1 mg/l \+ 6,4 \+ 4,6 \+ 12,3 \+ 16,8 \\\dddcline{2}{7} \+ B \+ 2 mg/l \+ 34,5 \+ 30,4 \+ 58,4 \+ 85,4 \\\dddcline{2}{7} \+ C \+ 10 mg/l \+ 27,5 \+ 20,0 \+ 39,7 \+ 65,6 \\\dddcline{2}{7} \+ D \+ 100 mg/l \+ 3,3 \+ 4,5 \+ 21,9 \+ 28,8 \\\dddcline{2}{7} \+ E \+ 1000 mg/l \+ 0 \+ 0 \+ 0 \+ 0 \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Del examen de los resultados reunidos en la tabla
I resulta
- que la pulverización de H13 comporta una
disminución de la infección por Septoria tritici,
- que el tratamiento debe ser efectuado antes de
una eventual infección por un agente patógeno; así pues, los
resultados registrados para una inoculación 72 horas después del
tratamiento son mejores que los registrados para una inoculación 48
horas después del tratamiento,
- que las concentraciones de los compuestos
aplicadas son ventajosamente y de modo aproximado de 2 a 10 mg/l,
valores para los cuales, según el ejemplo 12 que se indica a
continuación, no ha habido prácticamente elicitación de las
reacciones de defensa.
Para este estudio, se utilizan 200 planteles de
trigo tierno de invierno, de tipo ``Tendral'', conocido por su
sensibilidad con respecto a Septoria Tritici.
Se cultivan estos planteles en 20 cubetas que
contienen, cada una de ellas, un lote de 10 planteles.
Se forman 5 conjuntos, indicados respectivamente
A, B, C, D y E, constituido cada uno de ellos por 4 cubetas, es
decir, 4 lotes de 10 planteles.
En cada conjunto:
- el primer y segundo lotes de planteles, que son
lotes testigo, son tratados por pulverización foliar en el estadio
vegetativo de 2 hojas (GS 12 según la escala de Zadocks) por agua
destilada en presencia de 0,1% de TWEEN 20.
- los lotes tercero y cuarto son tratados por
pulverización foliar en el estadio vegetativo de 2 hojas (GS 12
según la escala de Zadocks) con 5 ml de un primer compuesto, según
la invención, que comprende como sustancia activa el extracto
H11.
Dicho compuesto contiene en agua destilada en
presencia de TWEEN 20:
- en el experimento sobre el conjunto A, 1 mg/l
de extracto H11,
- en el experimento sobre el conjunto B, 2 mg/l
de extracto H11,
- en el experimento sobre el conjunto C, 10 mg/l
de extracto H11,
- en el experimento sobre el conjunto D, 100 mg/l
de extracto H11,
- en el experimento sobre el conjunto E, 1000
mg/l de extracto H11.
Después de los mencionados tratamientos por
pulverización, los planteles de cuatro lotes de cada conjunto son
mantenidos a temperatura ambiente durante 4 horas, con la finalidad
de dejar secar las gotitas de los productos en la superficie de las
hojas. Se colocan a continuación en una cámara climática a 19ºC
durante el día y 17ºC durante la noche, con un fotoperiodo de 12
horas de luz, seguido de 12 horas de oscuridad y una humedad
relativa de 65%.
48 horas después de este tratamiento se inocula
por pulverización en el primer y tercer lotes de cada conjunto, una
suspensión en agua en presencia de 0,1% de TWEEN 20, conteniendo
10^{5} picnosporas por ml de una cepa de Septoria Tritici.
El segundo y cuarto lotes de cada conjunto se
someten a la misma inoculación de agente patógeno 72 horas después
del tratamiento por extracto H11.
Los planteles de los lotes testigo y los de los
lotes que han sido inoculados con Septoria Tritici son colocados en
una cámara climatizada a 19ºC durante el día y 17ºC durante la
noche, con un fotoperiodo de 12 horas de luz, seguido de 12 horas de
oscuridad y de una humedad relativa de 100% durante las primeras 96
horas y de 85% a continuación.
21 días después, respectivamente, de la primera y
segunda series de inoculación con Septoria Tritici, se inspeccionan
los planteles de trigo de los cinco conjuntos de cuatro lotes.
La eficacia de los productos se caracteriza, por
una parte, por el porcentaje de protección PP, y por otra parte, por
la intensidad de infección II, expresándose ambos en porcentaje.
Las dos magnitudes se definen con respecto a los
lotes testigo.
El ``porcentaje de protección'' se calcula por la
siguiente fórmula:
\formulai
La ``intensidad de infección'' se calcula por la
fórmula siguiente:
\formulaii
Los resultados del conjunto de estas
determinaciones se reúnen en la tabla II.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|c|c|}\hline Extracto \+\multicolumn{2}{|c|}{Conjunto }\+\multicolumn{4}{|c|}{Resultados registrados 21 días después}\\ utilizado \+\multicolumn{2}{|c|}{(concentración de }\+\multicolumn{4}{|c|}{ }\\ \+\multicolumn{2}{|c|}{hidrolizado del }\+\multicolumn{4}{|c|}{ }\\\dddcline{4}{7} \+\multicolumn{2}{|c|}{compuesto de }\+\multicolumn{2}{|c|}{Inoculación de las }\+\multicolumn{2}{|c|}{Inolucación de}\\ \+\multicolumn{2}{|c|}{tratamiento) }\+\multicolumn{2}{|c|}{esporas 48 horas }\+\multicolumn{2}{|c|}{las esporas 72}\\ \+\multicolumn{2}{|c|}{ }\+\multicolumn{2}{|c|}{después del }\+\multicolumn{2}{|c|}{del tratamiento}\\ \+\multicolumn{2}{|c|}{ }\+\multicolumn{2}{|c|}{tratamiento }\+\multicolumn{2}{|c|}{ }\\\hline \+\multicolumn{2}{|c|}{ }\+ PP% \+ II% \+ PP% \+ II% \\\hline H-11 \+ A \+ 1 mg/l \+ 32,2 \+ 50,7 \+ 30,1 \+ 45,5 \\\dddcline{2}{7} \+ B \+ 2 mg/l \+ 38,5 \+ 67,3 \+ 39,7 \+ 73,7 \\\dddcline{2}{7} \+ C \+ 10 mg/l \+ 24,1 \+ 33,1 \+ 29,5 \+ 62,7 \\\dddcline{2}{7} \+ D \+ 100 mg/l \+ 12,0 \+ 18,3 \+ 24,9 \+ 30,0 \\\dddcline{2}{7} \+ E \+ 1000 mg/l \+ 0 \+ 0 \+ 0 \+ 0 \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Del examen de los resultados reunidos en la tabla
II resulta:
- que la pulverización de H11 comporta la
disminución de la infección por Septoria tritici.
- que el tratamiento debe ser efectuado con una
eventual infección por un agente patógeno; de este modo, los
resultados registrados para una inoculación 72 horas después del
tratamiento, son mejores que los registrados para una inoculación 48
horas después del tratamiento,
- que las concentraciones de los compuestos
aplicados son ventajosamente entre 2 y 10 mg/l aproximadamente,
valores para los cuales, en base al siguiente ejemplo 12, no existe
prácticamente elicitación de reacciones de defensa.
El hongo responsable de la enfermedad es Septoria
Tritici.
El material es utilizado en forma de compuesto,
tal como se identifica en el ejemplo 5.
La experimentación es llevada en pleno campo en
una variedad sensible a la septoriosis y permite comparar varias
dosis de materia activa, a saber 0,4 g/ha, 4 g/ha, 20 g/ha, 40 g/ha,
60g/ha y 80 g/ha.
Cada dosis es comprobada en cuatro parcelas de 20
m^{2}. Cuatro parcelas suplementarias sirven de testigo.
La eficacia se aprecia por la intensidad de
infección que se calcula por la fórmula siguiente:
\formulaii
El compuesto es aplicado por pulverización foliar
que se efectúa en el estadio BBCH 30 con un volumen de 250 l/ha.
La contaminación es natural.
La proporción de la superficie atacada en las
parcelas testigo, es decir, no tratadas, es de 17%.
Se han repetido tres veces estas experiencias y
la media de los resultados se reúne en la tabla III.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|}\hline Dosis/ha \+ Eficacia en % \\\hline 0,4 g \+ 6 \\\hline 4 g \+ 20 \\\hline 20 g \+ 40 \\\hline 40 g \+ 41 \\\hline 60 g \+ 40 \\\hline 80 g \+ 35 \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
El examen de los valores reunidos en la tabla III
muestra que los mejores resultados se obtienen con dosis de 20 a 60
g/ha.
Se ha procedido a dos experiencias.
En una primera experiencia, a efectos de estudiar
el efecto elicitador directo de los productos H11 y H13, se han
aplicado a los cultivos de células de tabaco BY compuestos con
concentraciones crecientes de H11 y H13, a saber:
- para H11, compuestos con concentraciones
sucesivamente iguales a 2 mg/l, 10 mg/l, 20 mg/l, 50 mg/l y 200
mg/l,
- para H13, compuestos con concentraciones
sucesivamente iguales a 2 mg/l, 10 mg/l, 50 mg/l y 200 mg/l.
Para cada compuesto se han probado cuatro
marcadores de las reacciones de defensa, a saber:
- la actividad fenilamonio liasa (PAL) que es una
enzima clave para la síntesis de las fitoalexinas en las
plantas,
- la actividad O-metil
transferasa (OMT) que es una enzima implicada en la síntesis de la
lignina,
- la actividad lipoxigenasa (LOX) que es una
enzima implicada en la generación de jasmonato de metilo, es decir,
un elemento de la cascada de señalización que conduce a la actividad
de los genes de defensa, y
- el contenido de ácido salicílico (SA) que es
otro mensajero secundario implicado en las reacciones de
defensa.
Los resultados son expresados en forma de un
factor de inducción de los marcadores estudiados, representando la
relación entre los valores medidos en las células elicitadas y los
valores medidos en las células testigo no elicitadas.
Los resultados de estas mediciones que se
efectúan de 4 a 48 horas después del inicio de la incubación se
reúnen en la siguiente tabla IV.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|c|}\hline\multicolumn{2}{|l|}{Oligo \beta 1-3 glucanos utilizados }\+\multicolumn{4}{|l|}{Factor de inducción del marcador de defensa}\\\dddcline{3}{6}\multicolumn{2}{|c|}{ }\+ PAL \+ OMT \+ LOX \+ SA \\\hline H11 \+ 2 mg/l \+ NS ^* \+ NS \+ NS \+ NS \\ \+ 10 mg/l \+ NS \+ NS \+ NS \+ NS \\ \+ 20 mg/l \+ 33 \+ \+ NS \+ \\ \+ 50 mg/l \+ 90 \+ \+ 2,5 \+ \\ \+ 200 mg/l \+ 150 \+ 3,0 \+ 8,0 \+ 35,0 \\\hline H13 \+ 2 mg/l \+ NS \+ \+ \+ NS \\ \+ 10 mg/l \+ 67 \+ \+ \+ NS \\ \+ 50 mg/l \+ 176 \+ \+ \+ 30,0 \\ \+ 200 mg/l \+ 170 \+ \+ \+ 30,0 \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
^*NS = no significativo
El examen de estos resultados demuestra que los
productos H11 y H13 elicitan reacciones de defensa en las células
tratadas, traduciéndose estas elicitaciones por la acumulación de
los marcadores cuando dichos productos son utilizados con
concentraciones que van de 20 a 200 mg por litro; por el contrario,
en base a los marcadores PAL y SA, estas reacciones no son inducidas
de manera significativa cuando la concentración de agente
elicitador, es decir, del producto H11 ó H13, es de 2 ó 10 mg por
litro.
En una segunda experiencia, se tratan previamente
cultivos de las mismas células de tabaco BY al día siguiente al
trasplante, utilizando compuestos que presentan concentraciones de
extracto H11 iguales a 2 ó 10 mg/l.
Seis días más tarde, estos cultivos, así como
cultivos testigos, no pretratados, son tratados por un compuesto que
contiene oligopectinas con una concentración de 40 mg/l.
Se trata de una situación que favorece el ataque
por un agente patógeno.
Se sigue entonces la cinética de acumulación de
ácido salicílico (SA) de 4 a 48 horas después del tratamiento.
Estas mediciones muestran que las células de los
cultivos testigos acumulan SA hasta proporciones que no superan 300
ng por gramo de masa fresca (MF).
Demuestran igualmente que el pretratamiento por
H11 estimula muy fuertemente, de manera totalmente inesperada, la
acumulación de ácido salicílico, cuando la planta es elicitada seis
días más tarde por oligopectinas; se observa en efecto en las
células de tabaco tratadas de este modo, una acumulación de SA de
2900 ng por gramo de MF cuando la concentración de H11 en el
pretratamiento es de 2 mg por litro y de 700 ng por gramo de MF,
cuando la concentración en el pretratamiento es de 10 mg por
litro.
El efecto potenciador de una reacción de defensa
obtenido gracias la utilización según la invención, queda
demostrado.
Claims (12)
1. Procedimiento para conferir a una planta
agronómicamente útil una resistencia sistémica adquirida, es decir,
una inmunidad con respecto a un agente patógeno, inmunidad que se
traduce, en el momento en el que la planta se encuentra en contacto
de dicho agente patógeno, por una potenciación de las defensas
naturales, caracterizándose el procedimiento por el
tratamiento de dicha planta antes del contacto con dicho agente
patógeno por aplicación, especialmente foliar de un compuesto
líquido que presenta un oligo \beta 1-3 glucano,
compuesto de 3 a 250 unidades de sacárido, siendo la concentración
del compuesto líquido en oligo \beta 1-3 glucano
inferior a la concentración en la que dicho oligo \beta
-1-3 glucano actúa como elicitador, es decir,
aquélla que induce directamente a reacciones de defensa.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que, por una parte, el oligo
\beta 1-3 glucano presenta de 3 a 50,
preferentemente 3 a 20 unidades de sacáridos y, por otra parte, que
la concentración del compuesto líquido en oligo \beta
1-3 glucano es de 1 a 20, preferentemente de 2 a 10
mg/l en el caso de cereales y especialmente trigo, así como en el
caso de tabaco, lo que corresponde a la utilización por hectárea de
cultivo de una cantidad de 1 a 200 gr, preferentemente de 2 a 80
gramos de oligo \beta 1-3 glucano.
3. Procedimiento, según la reivindicación 2,
caracterizado porque el oligo \beta 1-3
glucano se obtiene a partir del curdlan, que está compuesto por 2 a
30 unidades de sacáridos y que su grado de polimerización medio es
de 3 a 15.
4. Procedimiento, según la reivindicación 2,
caracterizado porque el oligo \beta 1-3
glucano es obtenido a partir de laminaria digitada, que está
compuesta por 3 a 30 unidades de sacáridos y que su grado de
polimerización medio es de 20 a 30.
5. Procedimiento, según la reivindicación 2,
caracterizado porque el oligo \beta 1-3
glucano es obtenido a partir de zymosan, que es un compuesto de 3 a
30 unidades de sacárido y cuyo grado de polimerización medio es de 4
a 10.
6. Procedimiento, según la reivindicación 2,
caracterizado porque el oligo \beta 1-3
glucano es obtenido a partir de liquenan, que está compuesto por 3 a
50 unidades de sacárido y cuyo grado de polimerización medio es de
10 a 40.
7. Utilización por aplicación, especialmente
foliar en una planta agronómicamente útil y que tiene contacto con
un agente patógeno, de un compuesto líquido que presenta un oligo
\beta 1-3 glucano, compuesto de 3 a 250 unidades
de sacárido con una concentración inferior a aquélla que induce
directamente a reacciones de defensa, para conferir a dicha planta
una resistencia sistémica adquirida, es decir, una inmunidad con
respecto a un agente patógeno, inmunidad que se traduce en el
momento en el que la planta se encuentra en contacto con dicho
agente patógeno por una potenciación de las defensas naturales.
8. Utilización, según la reivindicación 7,
caracterizada porque, por una parte, el oligo \beta
1-3 glucano comprende de 3 a 50, preferentemente de
3 a 30 unidades de sacárido y, por otra parte, que la concentración
del compuesto líquido en oligo \beta 1-3 glucano
es de 1 a 20, preferentemente de 2 a 10 mg/l, siendo la cantidad de
oligo \beta 1-3 glucano utilizada por hectárea de
cultivo de 1 a 200, preferentemente de 4 a 80 gr.
9. Utilización, según la reivindicación 8,
caracterizada por el hecho de que el oligo \beta
1-3 glucano se obtiene a partir del curdlan, que
está compuesto por 2 a 30 unidades de sacáridos y que su grado de
polimerización medio es de 3 a 15.
10. Utilización, según la reivindicación 8,
caracterizada por el hecho de que el oligo \beta
1-3 glucano es obtenido a partir de laminaria
digitada, que está compuesta por 3 a 30 unidades de sacáridos y que
su grado de polimerización medio es de 20 a 30.
11. Utilización, según la reivindicación 8,
caracterizada por el hecho de que el oligo \beta
1-3 glucano es obtenido a partir de zymosan, que es
un compuesto de 3 a 30 unidades de sacárido y cuyo grado de
polimerización medio es de 4 a 10.
12. Utilización, según la reivindicación 8,
caracterizada por el hecho de que el oligo \beta
1-3 glucano es obtenido a partir de liquenan, que
está compuesto por 3 a 50 unidades de sacárido y cuyo grado de
polimerización medio es de 10 a 40.
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