JPS59124901A - 多糖誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 体に関する。

本発明者らは，先に放線菌ミクロエロボスポリア会グリ
セア（　Ｍｉｃｒｏｅｌｌｏｂｏｓｐｏｒｉａ　ｇｒｉ
ｓｅａ　）が培養液中に抗腫瘍性を有する多糖体Ｄ）（
−６６６５Ｆを産生することを見出し，その分離精製に
成功した（特開昭５６−１５５２０１号公報参照ン。

しかし、ＤＨ−６６６５Ｆには一過性の発熱等の副作用
が認められる場合があった。

そこで本発明者は種々検討した結果、ＤＨ−６６６５Ｆ
に過ヨウ素酸またはその塩を作用させて部分的にピラノ
ース環を開現し９次いで得られたもののアルデヒド基を
還元してアルコール化し多糖誘導体を取得し、このもの
、が前記の副作用はなくかつ抗腫瘍活性が増強されてい
ることを見出し１本発明を完成した。

すなわち１本発明は、平均的な構成単位が式％式％ （１） （式中ＧはＤ−グルコース残基を意味し、ＸおよびＹは
それぞれ Ｍ：α−Ｄ−マンノース残基　から選Ｃずれる）で表わ
され２分子中の（Ａの個数十Ｂの個数）７Ｍの個数が２
７９８〜５２７４８であり、ゲル濾過（デキストラン標
準）による分子量のヒ。

−りが８５万土９万乃至１２０万±１２万であり１元素
分析値が０４１〜４４％、８６〜７％。

Ｎ０９４％以下であり、〔α〕も５（０，５％、水）力
（＋１５°±３°乃至＋６０°±５°であり、水（こ易
溶でメタノール、エタノール、俳画ｙエチル、アセトン
、ジエチルエーテルに殆ど溶解しなｌ／１多糖誘導体お
よびその製法に関するものである。

本発明の多糖誘導体はＤＨ−６６６５Ｆのヒ。

ラノース環を部分的に酸化的開環したのち、生じたアル
デヒド基を還元することにより得ることができるが、更
に詳しく述べれば多糖誘導体は次のようにして製造され
る。

Ｄ　Ｈ’−６６６５Ｆの希水溶液に水冷下、糖残基（分
子量１６２ン当り一定モル数の過ヨウ素酸もしくはその
塩２例えば過ヨウ素酸ナトリウムの水溶液を攪拌しなが
ら加えた後、１０°Ｃ以下の低温で遮光下数日以上保ち
、酸化反応を完結ざぜる。反応時間は２例えば糖残基当
り０゜２５モルの過ヨウ素酸ナトリウムを用いた場合、
５°Ｃにおいて４〜゛５日後に過ヨウ素酸イオンが消失
することから、５日間以上が好ましい。

反応終了後、過剰の水素化ホウ素す）　ＩＪウムを加え
て、アルデヒド基を還元してアルコール基とするために
、室温で約２０時間反応させる。次いで反応液に希酢酸
を水冷下加えてｐＨを５に調整し、過剰の水素化ホウ素
ナトリウムを分解する。次に脱イオン水に対して透析し
、脱塩された透析内液を濃縮し、不溶物があれば遠心分
離して除去する。得られた上清を２〜８倍のエタノール
中に攪拌しながら注ぎ、生ずる沈澱を集メ、エタノール
、次いでアセトンで洗った後真空乾燥すれば多糖誘導体
が得られる。なお。

脱塩するためには透析以外の方法１例えばホウ酸アルカ
リ性下、セチルピリジニウムクロライドなどの四級アン
モニウム塩を加え、多糖体をセチルピリジニウム−ホウ
酸複合体として沈設させる方法を採用しても良く、得ら
れる複合体沈澱を希酢酸に溶解し、アルコール類を加え
ることにより、同様に脱塩された多糖誘導体を得ること
ができる。

また、上述の酸化反応において、糖残基当りの過ヨウ素
酸もしくはその塩のモル比を調節スることにより側鎖マ
ンノースの開環割合がやや相違する誘導体を得ることが
できる。例えばその量が糖残基当り０．０５モルの場合
のＰＡ−５゜０．１０モルのＰＡ−１０，０，２５モル
のＰＡ−２５および０゜３５モルのＰＡ−３５等がある
。

以下にこれらの多糖誘導体の性質について詳述する。

■　物理学的ならびに化学的性質 （１）溶解性 ｊＡ−５，’ＰＡ−１０，−ＰＡ−２５お、よびＰＡ−
８５はいづれも水に易溶であり。

、メタノール、エタノール、酢酸エチル、アセトン、エ
チルエＴチルなどの有機溶媒にはほとんど溶けない。

（２）旋光性 ０．５％水溶液における比旋光度〔α〕八へはＰＡ−５
が＋６０’±５°、ＰＡ、−１０が＋５１゜±５°、Ｐ
　Ａ　−２５が＋３．００±３°、ＰＡ−’３５が＋１
５°±３°であった。

（３）元素分析値（％） 炭素　　水素　　　窒素 ＰＡ−５’　　４１−９　　６．１　　０．４−以下Ｐ
Ａ−１，０４２，１（ｉ、１　　０１以下ＰＡ−２５４
２，４６，４０，４，以下ＰＡ−３５４２，１６，２０
，４，以下（４）分子量 東洋曹達工業前ＨＬ　Ｃ−８０３Ｄ高速液体クロマトグ
ラフに接続したＣＣ−５０００ｐカラム（東洋曹達工業
前）に各検体水溶液（０，１％、１００μｌ）を注入り
、０．１Ｍ酢酸カリウム緩衝液（ｐｉ（６，５）により
流速１ｔｎ１．７分で溶出し、デキストランＴ−５００
、Ｔ−７０およびＴ　−４，０（ファルマシア・ファイ
ンケミカルズ礼製）を標準に示差屈折計で検出した結果
９分子量のピークはＰＡ−５が９２０，０００±ｎｏ、
０００゜ＰＡ−１０が１，０５０，００’０土１００，
０００゜ＰＡ−２５が１，２００，０００±１．２０，
０００およびＰＡ−３５が８５０，０００±９０，００
０であった。

（５）多糖誘導体およびＤＨ−６（＋６５Ｆの構造を解
明するために以下の分析を行なった。

（ａ）　　Ｐ　Ａ　−５、Ｐ　Ａ　−１０、Ｐ　Ａ　−
２５、ＰＡ−３５およびＤＨ−６６６５Ｆを各々完全酸
加水分解（封管中　トＩ硫酸　１００°Ｃ６時間）’１
に、常法によりアルジトールアセテートとしてガスクロ
マトグラフィーによって構成糖比、生成するグリセロー
ルおよびエリスリトールを定量した結果を表１に示した
（モル比）。

表１　　構成糖比 （＋））　　Ｄ　Ｈ−６６６５Ｆを輪重法により完全メ
チル化後、常法によりアルジトールアセテートとしてガ
スクロマトグラフィーにょっ（ｃ）　　Ｄ　Ｈ−６６６
５Ｆの完全スミス分解および緩和スミス分解の結果は９
表３の通りであった（モル比）。

表３　　スミス分解 （（１）　　Ｄ　Ｈ−６６６５Ｆの緩和スミス分解物と
して７表３に示したグリセロール（２，０モル）、エリ
スリトール（０，１４モル）の他２−０−β−Ｄ−グル
コシル−Ｄ−エリスリトール（０，７４モル）および２
，４−ビス−ヒドロキシメチル−５−〇−β−Ｄ−グル
コシルー１．３−ジオキサン（０，３５モル）が、また
アセトリシスの結果、３−０−α−Ｄ−マンノシルーＤ
−グルコースとセロビオースが、また部分酸加水分解物
（０，３３規定硫酸で１００°０７時’ｆｆｊＴ　）　
トＬ、　テロ　−０−α−Ｄ−マンノシルーＤ−グルコ
ースとセロビオースが各々得られた。

以上の分析結果を総合してＤＨ−６６６、’５Ｆの主構
造を次のごとく推定した。

すなわち、ＤＨ−６６６５Ｆの構造はセルロースの主鎖
のグルコース残基の一個おきに二個のマンノースが側鎖
として３位及び６位にα結合したものである。

また、多糖誘導体２例えばＰＡ−５，ＰＡ−１０＋　　
Ｐ　Ａ−２５＋　　Ｐ　／に−３５の構造は。

表１の結果からＤＨ−６６６５Ｆの構造において主とし
て３位または６位のマンノース側鎖が開環してアルコー
ル化されたものと推定され、その平均的な構成単位は前
記の式（Ｉ）で表わすことができる。この式中のＸとＹ
に関し、Ａの個数とＢの個数の合計とＭの個数の比率（
（ＡＦＢ）／奎ｌ）は２／９８〜５２／４８の範囲のも
のが副作用と効果の面から優れており９代表的な多糖誘
導体におけるこの比率を表１に基づいて算出し７表４・
に示した。

表４　　側鎖の構成比率（％） なお、多糖誘導体は式（Ｉ）で表わされた構成単位が重
合した型をとるが、この式中で一個おきに存在する非分
岐の１．４−結合グルコース残基も一部が開環してアル
コール化されていると解され９例えばＰＡ−５，ＰＡ−
１０゜ＰＡ−２５では非分岐グルコース全体の２％残基
を含んでいると考えられる。

■　生物学的性質 （１）発熱性試験 日本薬局方（１０局）に準じ多糖誘導体について発熱性
試験を行なった。体重約２に９のウサギを各群３匹使用
し、滅酬生理食塩水（局方）に溶解した検体を体重１　
ｋｇ当り１０−を耳静脈から投与した。投与後のウサギ
の体温上昇を表５に示した。

表５　　発熱性試験結果 米−（陰性）、＋（陽性） 以上の結果は、ＰＡ−５およびＰＡ− ２５は原物質であるＤ）（−６６６５Ｆと比べて発熱性
が明らかに域別していることを示している。

（２）抗腫瘍作用 マウス移植症を用いて横開した結果を以下に例示する。

（ａ）同種ＩＩ！瘍エーリ、ヒ［！１型癌に対する効果
３Ｘ１０６個の二−リ、ヒ癌細胞をｃｌｄＹマウスのそ
けい部皮下に接細し、癌移植後１２日目および１７日口
の２回、生理食ｊ盆水に溶解した各試料を腹腔内に投与
した。

実験各群のマウスは６匹とし、１２日口の試料投与時に
腫瘍の直径をノギスで請訓し各群のマウスの腫瘍の大き
さを揃えてから検討を行なった。また、活性対照として
ＤＨ−６６６５Ｆを同様に投与して比較した。実験終了
時（８０日日目にマウスを層殺し、摘出した各群の腫編
重量の平均値（Ｔ）とその対照群（Ｃ）に対する百分率
（Ｔ／Ｃ×１００９％）を表６に示した。

表６　エールリッヒ固型症（腹腔内投与）１）　来Ｐ（
０，０５，来米Ｐ＜０．０１．。

ｌｆ＊来Ｐ＜０．００１ ２）腫瘍重量：２．１１±０．４０　（９）（ｂ）　　
同系腫瘍Ｍ　Ｍ　４６固型癌に対する効果４　Ｘ　１０
６個のＭＭ４６乳癌ｉｌｌ胞をｃａＨ／＋＋ｅ　　マウ
スのそけい部皮下に接種し。

癌移植後１２日目および１７日口の２回。

生理食塩水に溶解した各試料をマウスの背部皮下に投与
した。各実験群のマウスは７匹とし、以下エーリッヒ癌
の場合と丙様にＤＨ−６６６５Ｆと比較検討した。腫瘍
移植２９日日目判定した結果を表７に示した。

表７　　ＭＭ４６固型癌（皮下投与） ■）　米Ｐ＜０．０５．　　未来Ｐ＜０．０１゜米米米
Ｐ＜０．００１ ２）腫瘍重量：２．５６±０．２　ａ　（の以上の結果
にみられる如＜、ＰＡ−５゜ＰＡ−１０，ＰＡ−２５お
よびＰＡ−３５は、活性対照として用いた原ｖＪ質であ
るＤＩ−１−６６６５Ｆと比較しても、同等以上の優れ
た抗腫瘍活性を示す物質であることが明らかである。

実施例１ 未 ＤＨ−６６６５Ｆ５．０９を脱イオン１．Ｏｌに／＼ 溶かし５°Ｃに冷却後、５℃に予冷したＩ。６５％過ヨ
ウ素酸ナトリウム水溶液２０−を攪拌下加え、５°Ｃで
遮光下１４日間過ヨウ素酸酸化した。

反応終了後、水素化ホウ素ナトリウムを０．５７加え、
室温で２０時間還元し、過剰の水素化ホウ素ナトリウム
は酢酸を冷却下加え１反応液のｐＨを５に調整して分解
させた。次に、脱イオン水に対して透析し、透析内液を
約４００−まで濃縮後、９．ＯＯＯｒｐｍで４０分間遠
心分離した。得られた上清をエタノール１．Ｏｌ中へ攪
拌下注前し、生じた白色沈澱を集め、エタノール、次い
でアセトンで洗った後、真空乾燥してＰＡ−５の白色粉
末を４．８９得た。

実施例２ Ｄ　Ｈ−６６６’　５　Ｆ　５゜０りを実施例１と同様
に１．６５％過ヨウ素酸ナトリウム水溶液４６ｍ１と水
素化ホウ素ナトリウム１．０９を用いてＰＡ−１Ｏの白
色粉末を４・、７り得た。

実施例３ ＤＨ−６６６５Ｆ５．０９を実施例１と同様に１．６５
％過ヨウ素酸ナトリウム水’１Ｂ液１ｏｏｍｔと水素化
ホウ素ナトリウム２．５りを用いてＰＡ−２５の白色粉
末を４．７９得た。

実施例４ ＤＨ−６６６５Ｆ５．０９を実施例１と同様に１．６５
％過ヨウ素酸ナトリウム水溶液１４０ｉと水素化ホウ素
ナトリウム３．５りを用いてＰＡ−３５の白色粉末を４
．７り得た。

実施例５ ＤＨ−６６６５Ｆ５０．０９を脱イオン水１０、Ｏ７に
溶かし５°Ｃに冷却後５°Ｃに予冷した１、６５％過ヨ
ウ素酸ナトリウム水溶液２０ＱｍＡを攪拌下加え、５°
Ｃで遮光下、１４日間過ヨウ素酸酸化した。反応終了後
、水素化ホウオざナトリウムを５．０り加え、室温で２
０時間還元し。

過剰の水素化ホウ素す）ＩＪウムは酢酸を冷却下加え１
反応液のｐＨを５に調整して分解させた。

次に、１０％へセチルピリジニウムクロライド水溶液を
１．０１．次いで０．５Ｍホウ酸Ｌｇｕ液（ｐＨ１０）
を１．５７！加えて多糖のセチルピリジニウムニホウ酸
複合体を形成せしめた。この複合体を集め、脱イオン水
にて洗浄後、２％酢酸水溶液３゜Ｏｌに冷却下溶かし、
メタノール９、Ｏ７中へ撹拌下注加し、生じた沈澱を集
めた。

この沈澱をメタノールで洗った後、脱イオン水ａ、ｏｚ
ｃｆ溶かし、９．００Ｏｒｐｍで４０分間遠心分離した
。得られた上清に酢酸す）　ＩＪウム１．０９を沈澱助
剤として溶かし、メタノール９、Ｏｌ中へ攪拌下注加し
、生じた白色沈澱を集め、メタノール、次いでアセトン
で洗った後。

真空乾燥してＰＡ−５の白色粉末を４１５．　ｏ　ｑ得
た。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）平均的な構成単位が式 （式中ＧはＤ−グルコース残基を意味し、ＸおよびＹは
   それぞれ Ｍ：α−Ｄ−マンノース残基　から選ばれる）で表わさ
   れ２分子中の（Ａの個数子Ｂの個数）７Ｍの個数が２／
   ９８〜５２／４．８であり、ゲル濾過（デキストラン標
   準）による分子量のピークが８５万±９万乃至１２０万
   ±１２万であり２元素分析値が０４１〜４４％、Ｈ（５
   〜７％、　Ｎ　Ｏ，４％以下であり、〔α）：５　（ｏ
   、　５％、水）が＋１５°±３°乃至＋６０°±５°で
   あり、水に易溶でメタノール、エタノール、酢酸エチル
   、アセトン、ジエチルエーテルに殆ど溶解しない多糖誘
   導体
2. （２）多動外ＤＨ−６６６５Ｆを過ヨウ素酸で処理し１
   次いで生成物を還元することを特徴とする特許請求の範
   囲第一項の多糖誘導体の製法