JPH0368881B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、抗腫瘍性を有する新規な多糖誘導体
に関する。 本発明者らは、先に放線菌ミクロエロボスポリ
ア・グリゼア（Microellobosporia grisea）が培
養液中に抗腫瘍性を有する多糖体DH−6665Fを
産生することを見出し、その分離精製に成功した
（特開昭56−155201号公報参照）。 しかし、DH−6665Fには一過性の発熱等の副
作用が認められる場合があつた。 そこで本発明者は種々検討した結果、DH−
6665Fに過ヨウ素酸またはその塩を作用させて部
分的にピラノース環を開環し、次いで得られたも
ののアルデヒド基を還元してアルコール化し多糖
誘導体を取得し、このものが前記の副作用はなく
かつ抗腫瘍性が増強されていることを見出し、本
発明を完成した。 すなわち、本発明は、平均的な構成単位が式
（） （式中ＧはＤ−グリコース残基を意味し、Ｘおよ
びＹはそれぞれ Ａ： および Ｍ：α−Ｄ−マンノース残基から選ばれる）で表
わされ、分子中の（Ａと個数＋Ｂの個数）／Ｍの
個数が2/98〜52/48であり、ゲル濾過（デキスト
ラン標準）による分子量のピークが85万±９万乃
至120万±12万であり、元素分析値がC41〜44％、
H6〜７％、N0.4％以下であり、［α］²⁵ _D（0.5％、
水）が＋15°±3°乃至＋60°±5°であり、水に易溶
でメタノール、エタノール、酢酸エチル、アセト
ン、ジエチルエーテルに殆ど溶解しない多糖誘導
体およびその製法に関するものである。 本発明の多糖誘導体はDH−6665Fのピラノー
ス環を部分的に酸化的開環したのち、生じたアル
デヒド基を還元することにより得ることができる
が、更に詳しく述べれば多糖誘導体は次のように
して製造される。 DH−6665Fの希水溶液に氷冷下、糖残基（分
子量162）当り一定モル数の過ヨウ素酸もしくは
その塩、例えば過ヨウ素酸ナトリウムの水溶液を
撹拌しながら加えた後、10℃以下の低温で遮光下
数日以上保ち、酸化反応を完結させる。反応時間
は、例えば糖残基当り0.25モルの過ヨウ素ナトリ
ウムを用いた場合、５℃において４〜５日後に過
ヨウ素酸イオンが消失することから、５日間以上
が好ましい。反応終了後、過剰の水素化ホウ素ナ
トリウムを加えて、アルデヒド基を還元してアル
コール基とするために、室温で約20時間反応させ
る。次いで反応液に希酢酸を氷冷下加えてPHを５
に調整し、過剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解
する。次に脱イオン水に対して透析し、脱塩され
た透析内液を濃縮し、不溶物があれば遠心分離し
て除去する。得られた上清を２〜３倍のエタノー
ル中に撹拌しながら注ぎ、生ずる沈澱を集め、エ
タノール、次いでアセトンで洗つた後真空乾燥す
れば多糖誘導体が得られる。なお、脱塩するため
には透析以外の方法、例えばホウ酸アルカリ性
下、セチルピリジニウムクロライドなどの四級ア
ンモニウム塩を加え、多糖体をセチルピリジニウ
ム−ホウ酸複合体として沈澱させる方法を採用し
ても良く、得られる複合体沈澱を希酢酸に溶解
し、アルコール類を加えることにより、同様に脱
塩された多糖誘導体を得ることができる。 また、上述の酸化反応において、糖残基当りの
過ヨウ素酸もしくはその塩のモル比を調節するこ
とにより側鎖マンノースの開環割合がやや相違す
る誘導体を得ることができる。例えばその量が糖
残基当り0.05モルの場合のPA−５，0.10モルの
PA−10，0.25モルのPA−25および0.35モルの
PA−35等がある。 以下にこれらの多糖誘導体の性質について詳述
する。 物理学的ならびに化学的性質 (1) 溶解性 PA−５、PA−10、PA−25およびPA−35は
いずれも水に易溶であり、メタノール、エタノ
ール、酢酸エチル、アセトン、エチルエーテル
などの有機溶媒にはほとんど溶けない。 (2) 旋光性 0.5％水溶液における比旋光度〔α〕²⁵ _DはPA
−５が＋60°±5°、PA−10が＋51°±5°、PA−
25が＋30°±3°、PA−35が＋15°±3°であつた。 (3) 元素分析値（％） 炭素 水素 窒素 PA−５ 41.9 6.1 0.4以下 PA−10 42.1 6.1 0.4以下 PA−25 42.4 6.4 0.4以下 PA−35 42.1 6.2 0.4以下 (4) 分子量 東洋曹達工業製HLC−803D高速液体クロマ
トグラフに接続したＧ−5000PWカラム（東洋
曹達工業製）に各検体水溶液（0.1％、100μl）
を注入し、0.1M酢酸カリウム緩衝液（PH6.5）
により流速１ml／分で溶出し、デキストランＴ
−500、Ｔ−70およびＴ−40（フアルマシア・フ
アインケミカルズ社製）を標準に示差屈折計で
検出した結果、分子量のピークはPA−５が
920000±90000、PA−10が1050000±100000、
PA−25が120000±120000およびPA−35が
850000±90000であつた。 (5) 多糖誘導体およびDH−6665Fの構造を解明
するために以下の分析を行なつた。 (a) PA−５、PA−10、PA−25、PA−35およ
びDH−6665Fを各々完全酸加水分解（封管
中 Ｎ硫酸 100℃ ６時間）後、常法によ
りアルジトールアセテートとしてガスクロマ
トグラフイーによつて構成糖比、生成するグ
リセロールおよびエリスリトールを定量した
結果を表１に示した（モル比）。

【表】 (b) DH−6665Fを箱守法により完全メチル化
後、常法によりアルジトールアセテートとし
てガスクロマトグラフイーによつて分析した
結果は、表２の通りであつた。

【表】 (c) DH−6665Fの完全スミス分解および緩和
スミス分解の結果は、表３の通りであつた
（モル比）。

【表】 (d) DH−6665Fの緩和スミス分解物として、
表３に示したグリセロール（2.0モル）、エリ
スリトール（0.14モル）の他２−０−β−Ｄ
−グルコシル−Ｄ−エリスリトール（0.74モ
ル）および2.4−ビス−ヒドロキシメチル−
５−０−β−Ｄ−グルコシル−１，３−ジオ
キサン（0.35モル）が、またアセトリシスの
結果、３−０−α−Ｄ−マンノシル−Ｄ−グ
ルコースとセロビオースが、また部分酸加水
分解物（0.33規定硫酸で100℃７時間）とし
て６−０−α−Ｄ−マンノシル−Ｄ−グルコ
ースとセロビオースが各々得られた。 以上の分析結果を総合してDH−6665Fの主構
造を次のごとく推定した。 すなわち、DH−6665Fの構造はセルロースの
主鎖のグルコース残基の一個おきに二個のマンノ
ースが側鎖として３位及び６位にα結合したもの
である。 また、多糖誘導体、例えばPA−５、PA−10、
PA−25、PA−35の構造は、表１の結果からDH
−6665Fの構造において主として３位または６位
のマンノース側鎖が開環してアルコール化された
ものと推定され、その平均的な構成単位は前記の
式（）で表わすことができる。この式中のＸと
Ｙに関し、Ａの個数とＢの個数の合計とＭの個数
の比率（（Ａ＋Ｂ）／Ｍ）は２／98〜52／48の範
囲のものが副作用と効果の面から優れており、代
表的な多糖誘導体におけるこの比率を表１に基づ
いて算出し、表４に示した。

【表】 なお、多糖誘導体は式（）で表わされた構成
単位が重合した型をとるが、この式中で一個おき
に存在する非分岐の１，４−結合グルコース残基
も一部が開環してアルコール化されていると解さ
れ、例えばPA−５、PA−10、PA−25では非分
岐グルコース全体の２％未満の、PA−35では２
％の 残基を含んでいると考えられる。 生物学的性質 (1) 発熱性試験 日本薬局方（10局）に準じ多糖誘導体につい
て発熱性試験を行なつた。体重約２Kgのウサギ
を各群３匹使用し、滅菌生理食塩水（局方）に
溶解した検体を体重１Kg当り10mlを耳静脈から
投与した。投与後のウサギを体温上昇を表５に
示した。

【表】

【表】 以上の結果は、PA−５およびPA−25は原物
質であるDH−6665Fと比べて発熱性が明らか
に減弱していることを示している。 (2) 抗腫瘍作用 マウス移植癌を用いて検討した結果を以下に
例示する。 (a) 同種腫瘍エーリツヒ固型癌に体する効果３
×10⁶個のエーリツヒ癌細胞をddYマウスの
そけい部皮下に接種し、癌移植後12日目およ
び17日目の２回、生理食塩水に溶解した各試
料を腹腔内に投与した。実験各群マウスは６
匹とし、12日目の試料投与時に腫瘍の直径を
ノギスで計測し各群のマウスの腫瘍の大きさ
を揃えてから検討を行なつた。また、活性対
照としてDH−6665Fを同様に投与して比較
した。実験終了後（30日目）にマウスを屠殺
し、摘出した各群の腫瘍重量の平均値（Ｔ）
とその対照群(C)に対する百分率（Ｔ／Ｃ×
100、％）を表６に示した。

【表】

【表】 (b) 同系腫瘍MM46固型癌に対する効果４×
10⁶個のMM46乳癌細胞をC3H／Heマウスの
そけい部皮下に接種し、癌移植後12日目およ
び17日目の２回、生理食塩水に溶解した各試
料をマウスの背部皮下に投与した。各実験群
のマウスは７匹とし、以下エーリツヒ癌の場
合と同様にDH−6665Fと比較検討した。腫
瘍移植29日目に判定した結果を表７に示し
た。

【表】

【表】 以上の結果にみられる如く、PA−５、PA−
10、PA−25およびPA−35は、活性対照として用
いた原物質であるDH−6665Fと比較しても、同
等以上の優れた抗腫瘍活性を示す物質であること
が明らかである。 実施例 １ DH−6665F5.0ｇを脱イオン水1.0に溶かし５
℃に冷却後、５℃に予冷した1.65％過ヨウ素酸ナ
トリウム水溶液20mlを撹拌下加え、５℃で遮光下
14日間過ヨウ素酸酸化した。反応終了後、水素化
ホウ素ナトリウムを0.5ｇ加え、室温で20時間還
元し、過剰の水素化ホウ素ナトリウムは酢酸を冷
却下加え、反応液のPHを５に調整して分解させ
た。次に、脱イオン水に対して透析し、透析内液
を約400mlまで濃縮後、9000rpmで40分間遠心分
離多した。得られた上清をエタノール1.0中へ
撹拌下注加し、生じた白沈澱を集め、エタノール
次いでアセトンで洗つた後、真空乾燥してPA−
５の白色粉末を4.8ｇ得た。 実施例 ２ DH−6665F5.0ｇを実施例１と同様に1.65％過
ヨウ素酸ナトリウム水溶液40mlと水素化ホウ素ナ
トリウム1.0ｇを用いてPA−10の白色粉末を4.7
ｇ得た。 実施例 ３ DH−6665F5.0ｇを実施例１と同様に1.65％過
ヨウ素酸ナトリウム水溶液100mlと水素化ホウ素
ナトリウム2.5ｇを用いてPA−25の白色粉末を
4.7ｇ得た。 実施例 ４ DH−6665F5.0ｇを実施例１と同様に1.65％過
ヨウ素酸ナトリウム水溶液140mlと水素化ホウ素
ナトリウム3.5ｇを用いてPA−35の白色粉末を
4.7ｇ得た。 実施例 ５ DH−6665F50.0ｇを脱イオン水10.0に溶かし
５℃に冷却後５℃に予冷した1.65％過ヨウ素酸ナ
トリウム水溶液200mlを撹拌下加え、５℃で遮光
下、14日間過ヨウ素酸酸化した。反応終了後、水
素化ホウ素ナトリウムを5.0ｇ加え、室温で20時
間還元し、過剰の水素化ホウ素ナトリウムは酢酸
を冷却下加え、反応液のPHを５に調整して分解さ
せた。次に、10％セチルピリジニウムクロライド
水溶液を1.0、次いで0.5Mホウ酸緩衝液（PH
10）を1.5加えて多糖のセチルピリジニウム二
ホウ酸複合体を形成せしめた。この複合体を集
め、脱イオン水にて洗浄後、２％酢酸水溶液3.0
に冷却下溶かし、メタノール9.0中へ撹拌下
注加し、生じた沈澱を集めた。この沈澱をメタノ
ールで洗つた後、脱イオン水3.0に溶かし、
9000rpmで40分間遠心分離した。得られた上清に
酢酸ナトリウム1.0ｇを沈澱助剤として溶かし、
メタノール9.0中へ撹拌下注加し、生じた白色
沈澱を集め、メタノール、次いでアセトンで洗つ
た後、真空乾燥してPA−５の白色粉末を45.0ｇ
得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 平均的な構成単位が式 （式中ＸおよびＹは、各々 および から選ばれる） で表わされ、分子中の（Ａの個数＋Ｂの個数）／
   Ｍの個数が2/98〜52/48であり、ゲル濾過（デキ
   ストラン標準）による分子量のピークが85万±９
   万乃至120万±12万であり、元素分析値がC41〜
   44％、H6〜７％、N0.4％以下であり、［α］²⁵ _D
   （0.5％、水）が＋15°±3°乃至＋60°±5°であり、
   水
   に易溶でメタノール、エタノール、酢酸エチル、
   アセトン、ジエチルエーテルに殆ど溶解しない多
   糖誘導体。