JPH0368882B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、抗腫瘍性を有する新規な多糖誘導体
に関する。 本発明者らは、先に放線菌ミクロエロボスボリ
ア・グリゼア（Microellobosporia grisea）が培
養液中に抗腫瘍活性を有する多糖体DH−6665F
を産生することを見出し、その分離精製に成功し
た（特開昭56−155201号公報参照）。 しかし、DH−6665Fには一過性の発熱等の副
作用が認められる場合があつた。 そこで本発明者は種々検討した結果、DH−
6665Fに過ヨウ素酸またはその塩を作用させて部
分的にピラノース環を開環し、次いで得られたも
ののアルデヒド基を還元してアルコール化し、得
られたポリアルコール体を弱い条件下で酸加水分
解することにより多糖誘導体を取得し、このもの
が前記の副作用はなくかつ抗腫瘍活性が増強され
ていることを見出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、平均的な構成単位が式 （式中、R₁及びR₂はそれぞれ Ｚ：ヒドロキシル基 Ｍ：α−Ｄ−マンノース残基 から選ばれる。）で表わされ、分子中の（Ａの個
数＋Ｂの個数）：Ｚの個数：Ｍの個数の比が１〜
11：６〜40：93〜49であり、元素分析値がＣ 41
〜44％、Ｈ ５〜７％、Ｎ 0.4％以下である多
糖誘導体に関するものである。 以下式（）のＡ及びＢで表わされる基をポリ
アルコール基と称す。 本発明の多糖誘導体は、DH−6665Fのピラノ
ース環を部分的に酸化的開環したのち、生じたア
ルデヒドを還元して、得られたポリアルコール体
をさらに緩和酸水解することにより得ることがで
きる。 原料のポリアルコール体は次のようにして製造
される。 DH−6665Fの希水溶液に氷冷下、糖残基（分
子量162）当り一定モル数の過ヨウ素酸もしくは
その塩、例えば過ヨウ素酸ナトリウムの水溶液を
撹拌しながら加えた後、10℃以下の低温で遮光下
数日以上保ち、酸化反応を完結させる。反応時間
は、例えば糖残基当り0.25モルの過ヨウ素酸ナト
リウムを用いた場合、５℃において４〜５日後に
過ヨウ素酸イオンが消失することから、５日間以
上が好ましい。反応終了後、過剰の水素化ホウ素
ナトリウムを加え、アルデヒド基を還元してアル
コール基とするために、室温で約20時間反応させ
る。次いで反応液に希酢酸を氷冷下加えてPHを５
に調整し、過剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解
する。次に脱イオン水に対して透析し、脱塩され
た透析内液を濃縮し、不溶物があれば遠心分離し
て除去する。得られた上清を２〜４倍のエタノー
ル中に撹拌しながら注ぎ、生ずる沈澱を集め、エ
タノール、次いでアセトンで洗つた後真空乾燥す
れば中間体のポリアルコール体が得られる。な
お、脱塩するためには透析以外の方法、例えばホ
ウ酸アルカリ性下、セチルピリジニウムクロライ
ドなどの四級アンモニウム塩を加え、多糖体をセ
チルピリジニウム−ホウ酸複合体として沈澱させ
る方法を採用しても良く、得られる複合体沈澱を
希酢酸に溶解し、アルコール類を加えることによ
り、同様に脱塩された多糖誘導体を得ることがで
きる。 また、上述の酸化反応において、糖残基当りの
過ヨウ素酸もしくはその塩のモル比を調節するこ
とにより側鎖マンノースの開環割合がやや相違す
るポリアルコール体（PA体）を得ることができ
る。 例えば、分子量ピークが約100万で〔α〕²⁵ _Dが＋
65°のDH−6665Fを原料として使用した場合、過
ヨウ素酸を糖残基あたり0.05モル、0.10モル、
0.25モル及び0.35モル使用するとその量に応じて
PA−５、PA−10、PA−25及びPA−35等各種の
ポリアルコール体が得られる。 本発明の多糖誘導体はポリアルコール体からグ
ルコース−グルコース及びグルコース−マンノー
スのグルコシド結合にできるだけ影響を与えずに
ポリアルコール基を除去することにより得ること
ができる。グリコシド結合に影響を与えずにポリ
アルコール基を除去する反応としては酸による加
水分解が用いられ、通常は例えば0.1N程度の硫
酸もしくは塩酸中室温約20時間の条件が採用され
ているが、本ポリアルコール体の場合には不十分
であつた。 そこで、各種条件につき検討した結果、硫酸、
塩酸、ぎ酸等が使用でき、酸濃度、反応温度およ
び反応時間を適宜設定することによつて目的を達
成することが判つた。例えば、0.5N硫酸を用い
た場合には、室温、24時間の反応条件が適当であ
つた。水解液を水酸化ナトリウムで中和後、脱イ
オンに対し透析する。透析内液を濃縮し、不溶物
があれば遠心分離して除去する。得られた上清を
２〜４倍のエタノール中に撹拌しながら注ぎ、生
ずる沈澱を集め、エタノール次いでアセトンで洗
浄した後、真空乾燥すれば目的とする多糖誘導体
が得られる。例えば、ポリアルコール体PA−５、
PA−10、PA−25およびPA−35から、それぞれ
目的とする多糖誘導体PA−5H、PA−10H、PA
−25HおよびPA−35Hを得ることができる。 以下にこれらの多糖誘導体の性質について詳述
する。 物理学的ならびに化学的性質 (1) 溶解性 PA−5H、PA−10H、PA−25Hおよび
PA−35Hはいづれも水に易溶であり、メタ
ノール、エタノール、酢酸エチル、アセト
ン、ジエチルエーテルなどの有機溶媒にはほ
とんど溶けない。 (2) 旋光性 0.5％水溶液における比旋光度〔α〕²⁵ _Dは
PA−5Hが＋63±6°、PA−10Hが＋59±6°、
PA−25Hが＋44±4°、PA−35Hが＋32±3°
であつた。 (3) 元素分析値（％） 炭素 水素 窒素 PA−5H 43.9 6.4 0.4以下 PA−10H 42.0 6.1 0.4以下 PA−25H 42.9 6.3 0.4以下 PA−35H 43.1 6.4 0.4以下 (4) 分子量 東洋曹達工業製HLC−803D高速液体クロ
マトグラフに接続したＧ−5000PWカラム
（東洋曹達工業製）に各検体水溶液（0.1％、
100μ）を注入し、0.1M酢酸カリウム緩衝
液（PH6.5）により流速１ml／分で溶出し、
デキストランＴ−500、Ｔ−70およびＴ−40
（フアルマシア・フアインケミカルズ社製）
を標準に示差屈折計で検出した結果、分子量
のピークはPA−5Hが1000000±100000、PA
−10Hが920000±90000、PA−25Hが790000
±80000およびPA−35Hが620000±60000で
あつた。 (5) 多糖誘導体、ポリアルコール体およびDH
−6665Fの構造を解明するために以下の分析
を行なつた。 (a) PA−5H、PA−10H、PA−25H、PA
−35HおよびDH−6665Fを各々完全酸加
水分解（封管中 Ｎ硫酸 100℃ ６時間）
後、常法によりアルジトールアセテートと
してガスクロマトグラフイーによつて構成
糖比、生成するグリセロールおよびエリス
リトールを定量した結果を表１に示した
（モル比）。

【表】

【表】 (b) DH−6665Fを箱守法により完全メチル
化後、常法によりアルジトールアセテート
としてガスクロマトグラフイーによつて分
析した結果は、表２の通りであつた。

【表】 (c) DH−6665Fの完全スミス分解および緩
和スミス分解の結果は、表３の通りであつ
た（モル比）。

【表】 (d) DH−6665Fの緩和スミス分解物として、
表３に示したグリセロール（2.0モル）、エ
リスリトール（0.14モル）の他２−０−β
−Ｄ−グリコシル−Ｄ−エリスリトール
（0.74モル）および２，４−ビス−ヒドロ
キシメチル−５−０−β−Ｄ−グルコシル
−１，３−ジオキサン（0.35モル）が、ま
たアセトリシスの結果、３−０−α−Ｄ−
マンノシル−Ｄ−グルコースとセロビオー
スが、また部分酸加水分解物（0.33規定硫
酸で100℃、７時間）として６−０−α−
Ｄ−マンノシル−Ｄ−グルコースとセロビ
オースが各々得られた。 以上の分析結果を総合してDH−6665Fの
主構造を次のごとく推定した。 すなわち、DH−6665Fの構造はセルロー
スの主鎖のグルコース残基の一個おきに二個
のマンノースが側鎖として３位及び６位にα
結合したものである。 また、ポリアルコール体、例えばPA−５、
PA−10、PA−25、PA−35の構造は、表１
の結果からDH−6665Fの構造において主と
して３位又は６位のマンノース側鎖が開環し
てアルコール化されたものと推定され、その
平均的な構成単位は式 （式中、R₃及びR₄はそれぞれＡ、Ｂ及びＭよ
り選ばれる。但し、Ａ、Ｂ及びＭは前記に同
じ）で表わされることができる。なお、ポリア
ルコール体は式（）で表わされた構成単位が
重合した型をとるが、この式中で一個おきに存
在する非分岐の１，４−結合グルコース残基も
一部が開環してアルコール化されていると解さ
れ、例えばPA−５、PA−10、PA−25では非
分岐グルコース全体の２％未満の、PA−35で
は２％の 残基を含んでいると考えられる。 さらに多糖誘導体、例えばPA−5H、PA−
10H、PA−25H、PA−35Hの構造は、表１の
結果からポリアルコール体（）の構造におい
て主としてグルコース残基の３位及び６位のポ
リアルコール基が脱離され、更に場合によつて
は極く一部のα−Ｄ−マンノース残基が脱離さ
れてヒドロキシル基になつたものと推定され、
その平均的な構成単位は前記の式（）で表わ
されることができる。この式中のR₁及びR₂に
関し、（Ａの個数＋Ｂの個数）：Ｈの個数：Ｍの
個数の比が１〜11：６〜40：93〜49の範囲のも
のが副作用と効果の面から優れており、代表的
な多糖誘導体におけるこの比率を表１に基づい
て算出し、表４に示した。

【表】 生物学的性質 (1) 発熱性試験 日本薬局方（10局）に準じ多糖誘導体につ
いて発熱性試験を行なつた。体重約２Kgのウ
サギを各群３匹使用し、滅菌生理食塩水（局
方）に溶解した検体を体重１Kg当り10mlを耳
静脈から投与した。投与後のウサギの体温上
昇を表５に示した。

【表】 以上の結果は、PA−5HおよびPA−25H
は原料物質であるDH−6665Fと比べて発熱
性が明らかに減弱していることを示してい
る。 (2) 抗腫瘍作用 マウス移植癌を用いて検討した結果を以下
に例示する。 (a) 同種腫瘍エーリツヒ固型癌に対する効果 ３×10⁶個のエーリツヒ癌細胞をICRマ
ウスのそけい部皮下に接種し、癌移植後12
日目および17日目の２回、生理食塩水に溶
解した各試料を腹腔内に投与した。実験各
群のマウスは６匹とし、12日目の試料投与
時に腫瘍の長径及び短径をノギスで計測し
各群のマウスの腫瘍の大きさを揃えてから
検討を行なつた。また、活性対照として
DH−6665Fを同様に投与して比較した。
実験終了時（30日目）にマウスを屠殺し、
摘出した各群の腫瘍重量の平均値(T)とその
対照群(C)に対する百分率（Ｔ／Ｃ×100、
％）を表６に示した。

【表】 (b) 同系腫瘍MM46固型癌に対する効果４×
10⁶個のMM46乳癌細胞をC3H／Heマウス
のそけい部皮下に接種し、癌移植後12日目
および17日目の２回、生理食塩水に溶解し
た各試料をマウスの背部皮下に投与した。
各実験群のマウスは７匹とし、以下エーリ
ツヒ癌の場合と同様にDH−6665Fと比較
検討した。腫瘍移植29日目に判定した結果
を表７に示した。

【表】

【表】 以上の結果にみられる如く、PA−5H、
PA−10H、PA−25HおよびPA−35Hは、
活性対照として用いた原料物質であるDH−
6665Fと比較しても、同等以上の優れた抗腫
瘍活性を示す物質であることが明らかであ
る。 参考例 １ DH−6665F（分子量ピーク約100万、〔α〕²⁵ _D＋
65°、以下参考例５迄同じ）5.0ｇを脱イオン水1.0
に溶かし５℃に冷却後、５℃に予冷した1.65％
過ヨウ素酸ナトリウム水溶液20mlを撹拌下加え、
５℃で遮光下14日間過ヨウ素酸酸化した。反応終
了後、水素化ホウ素ナトリウムを0.5ｇ加え、室
温で20時間還元し、過剰の水素化ホウ素ナトリウ
ムは酢酸を冷却下加え、反応液のPHを５に調整し
て分解させた。次に、脱イオン水に対して透析
し、透析内液を約400mlまで濃縮後、9000rpmで
40分間遠心分離した。得られた上清をエタノール
1.0中へ撹拌下注加し、生じた白色沈澱を集め、
エタノール、次いでアセトンで洗つた後、真空乾
燥してPA−５の白色粉末を4.8ｇ得た。 参考例 ２ DH−6665F5.0ｇを参考例１と同様に1.65％過
ヨウ素酸ナトリウム水溶液40mlと水素化ホウ素ナ
トリウム1.0ｇを用いてPA−10の白色粉末を4.7
ｇ得た。 参考例 ３ DH−6665F5.0ｇを参考例１と同様に1.65％過
ヨウ素酸ナトリウム水溶液100mlと水素化ホウ素
ナトリウム2.5ｇを用いてPA−25の白色粉末を
4.7ｇ得た。 参考例 ４ DH−6665F5.0ｇを参考例１と同様に1.65％過
ヨウ素酸ナトリウム水溶液140mlと水素化ホウ素
ナトリウム3.5ｇを用いてPA−35の白色粉末を
4.7ｇ得た。 参考例 ５ DH−6665F50.0ｇを脱イオン水10.0に溶かし
５℃に冷却後５℃に予冷した1.65％過ヨウ素酸ナ
トリウム水溶液200mlを撹拌下加え、５℃で遮光
下、14日間過ヨウ素酸酸化した。反応終了後、水
素化ホウ素ナトリウムを5.0ｇ加え、室温で20時
間還元し、過剰の水素化ホウ素ナトリウムは酢酸
を冷却下加え、反応液のPHを５に調整して分解さ
せた。次に、10％セチルピリジウムクロライド水
溶液を1.0、次いで0.5Mホウ酸緩衝液（PH10）
を1.5加えて多糖のセチルピリジウム−ホウ酸
複合体を形成せしめた。この複合体を集め、脱イ
オン水にて洗浄後、２％酢酸水溶液3.0に冷却
下溶かし、メタノール9.0中へ撹拌下注加し、
生じた沈澱を集めた。この沈澱をメタノールで洗
つた後、脱イオン水3.0に溶かし、9000rpmで
40分間遠心分離した。得られた上清に酢酸ナトリ
ウム1.0ｇを沈澱助剤として溶かし、メタノール
9.0中へ撹拌下注加し、生じた白色沈澱を集め、
メタノール、次いでアセトンで洗つた後、真空乾
燥してPA−５の白色粉末を45.0ｇ得た。 実施例 １ 参考例１で得られたPA−５ 2.0ｇを脱イオン
水150mlに溶解後、1N硫酸150mlを加えて室温で
24時間緩和酸水解した。反応液を3N苛性ソーダ
にて中和後、脱イオン水に対して透析し、透析内
液を約200mlまで濃縮し濾過した。濾液をエタノ
ール600ml中へ撹拌下注加し生じた白色沈澱を集
め、エタノール、次いでアセトンで洗つた後、真
空乾燥して多糖誘導体、PA−5Hの白色粉末を
1.9ｇ得た。 実施例 ２ 参考例２で得られたPA−10 2.0ｇを実施例１
に従つて、緩和酸水解して、PA−10Hの白色粉
末を1.8ｇ得た。 実施例 ３ 参考例３で得られたPA−25 2.0ｇを実施例１
に従つて緩和酸水解して、PA−25Hの白色粉末
を1.6ｇ得た。 実施例 ４ 参考例４で得られたPA−35 2.0ｇを実施例１
に従つて緩和酸水解して、PA−35Hの白色粉末
を1.5ｇ得た。 実施例 ５ 参考例５で得られたPA−５ 20.0ｇを脱イオ
ン水1.0に溶解後、1N塩酸1.0を加えて室温で
24時間緩和酸水解した。反応液を5N苛性ソーダ
にて中和後、濾過し、濾液をメタノール6.0中
へ撹拌下注加し、生じた白色沈澱を集め80％メタ
ノール、メタノール及びアセトンで順次洗つた
後、真空乾燥して多糖誘導体PA−5Hを18.7ｇ得
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 平均的な構成単位が式 （式中R₁およびR₂は、各々 Ｚ：ヒドロキシル基および Ｍ：α−Ｄ−マンノース残基 から選ばれる）で表わされ、分子中の（Ａの個数
   ＋Ｂの個数）：Ｚの個数：Ｍの個数の比が１〜
   11：６〜40：93〜49であり、元素分析値が、C41
   〜44％、H5〜７％、Ｎ 0.4％以下であり分子量
   ピークが62万±６万乃至100万±10万である多糖
   誘導体。 ２ 分子量ピークが、62万±６万乃至100万±10
   万であり、［α］²⁵ _D（0.5％、水）が＋32⁰±3⁰乃至
   ＋63⁰±6⁰である特許請求の範囲第１項記載の多
   糖誘導体。 ３ 水に易溶でメタノール、エタノール、酢酸エ
   チル、アセトン、ジエチルエーテルに殆ど溶解し
   ない特許請求の範囲第１項又は第２項記載の多糖
   誘導体。