JPS59189101A - 多糖誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗腫瘍性を有する新規な多糖誘導体に関する
。

本発明者らは、先に放線菌ミクロエロボスボリア・グリ
ゼア（Ｍｉｃｒｏｏｎｏｂｏｓｐｏｒｉａ　ｇｒｉｅｅ
ａ　）が培養液中に抗腫瘍活性を有する多糖体ＤＨ−６
６６５Ｆを産生ずることを見出し、その分離精製に成功
した（特開昭５６−１５５２０１号公報参照）。

しかし、ＤＨ−６６６５Ｆには一過性の発熱等の副作用
が認められる場合があった。

そこで本発明者は種々検討した結果、ＤＨ−６６６５Ｆ
に過ヨウ素酸またはその塩を作用さル化し、得られたポ
リアルコール体を弱い条件下で酸加水分解することによ
り多糖誘導体を取得し、このものが前記の副作用はなく
かつ抗腫瘍活性が増強されていることを見出し９本発明
を完成した。

すなわち１本発明は、平均的な構成単位が式（式中＋Ｒ
１及びＲ７はそれぞれ Ｈ：ヒドロキシル基 Ｍ：α−Ｄ−マンノース残基 から選ばれる。）で表わされ９分子中の（Ａの個数十Ｂ
の個＠）＝Ｈの個数：Ｍの個数の比が１〜１１：６〜４
０４９３〜４９であり１元素分析値が０　４１〜４４％
、Ｈ５〜７％、Ｎ　０４％　以下である多糖誘導体に関
するものである。

以下式（１）のＡ及びＢで表わされる基をポリアルコー
ル基と称す。

本発明の多糖誘導体は、ＤＨ−ｆｌｆｉ６５Ｆのピラノ
ース環を部分的に酸化的開環したのち。

生じたアルデヒド基を還元して、得られたポリアルコー
ル体をさらに緩和酸水解することにより得ることができ
る。

原料のポリアルコール体は次のようにして製造される。

ＤＨ−６６６５Ｆの希水溶液に水冷下、糖残基（分子量
１６２）当り一定モル数の過ヨウ素酸もしくはその塩１
例えば過ヨウ素酸ナトリウムの水溶液を攪拌しながら加
えた後、１０℃以下の低温で遮光上数日以上保ち、酸化
反応を完結させる。反応時間は９例えば糖残基当り０．
２５モルの過ヨウ素酸ナトリウムを用いた場合、５℃に
おいて４〜５日後に過ヨウ素酸イオンが消失することか
ら、５日間以上が好ましい。

反応終了後、過剰の水素化ホウ素す）　ＩＪウムを加え
、アルデヒド基を還元してアルコール基とするために、
室温で約２０時間反応させる。次いで反応液に希酢酸を
水冷下加えてｐＨを５に調整し、過剰の水素化ホウ素ナ
トリウムを分解する。次に脱イオン水に対して透析し、
脱塩された透析内液を濃縮し、不溶物があれば遠心外陣
して除去する。得られた上清を２〜４倍のエタノール中
に攪拌しながら注ぎ、生ずる沈澱を集め、エタノール、
次いでアセトンで洗った後真空乾燥すれば中間体のポリ
アルコール体が得られる。なお、脱塩するためには透析
以外の方法１例えばホウ酸アルカリ性下、セチルピリジ
ニウムクロライドなどの四級アンモニウム塩を加え、多
糖体をセチルピリジニウム−ホウ酸複合体として沈澱さ
せる方法を採用しても良く。

得られる複合体沈澱を希酢酸に溶解し、アルコール類を
加えることにより、同様に脱塩された多糖誘導体を得る
ことができる。

また、上述の酸化反応において、糖残基当りの過ヨウ素
酸もしくはその塩のモル比を調節することにより側鎖マ
ンノースの開環割合がやや相違するポリアルコール体（
ＦＡ体）を得ルコとができる。

例えば１分子量ピークが約１００万で〔αへ５が＋６５
°のＤ　Ｈ−６６６５Ｆを原料として使用した場合、過
ヨウ素酸を糖残基あたり０．０５％＃、　０．１０　％
ル、　０．２５　モル及びＯＪ５％ル使用するとその量
に応じてＦＡ−５，ＦＡ−１０、ｐＡ−２５及びＦＡ−
８５等各種のポリアルコール体が得られる。

本発明の多糖誘導体はポリアルコール体からグルコース
−グルコース及びグルコース−マンノースのグリコシド
結合にできるだけ影響を与えずにポリアルコール基を除
去することにより得ることができる。グリコシド結合に
影響を与えずにポリアルコール基を除去する反応として
は酸による加水分解が用いられ２通常は例えば０、ＩＮ
程度の硫酸もしくは塩酸中室温約２０時間の条件が採用
されているが１本ポリアルコール体の場合には不十分で
あった。

そこで、各種条件につき検討した結果、硫酸。

塩酸、ぎ酸等が使用でき、酸濃度９反応温度および反応
時間を適宜設定することによって目的を達することが判
った。例えば、０．５Ｎ硫酸を用いた場合には、室温、
２４時間の反応条件が適当であった。氷解液を水酸化ナ
トリウムで中和後、脱イオン水に対し透析する。透析内
液を濃縮し、不溶物があれば遠心分離して除去する。

得られた上清を２〜４倍のエタノール中に攪拌しながら
注ぎ、生ずる沈澱を集め、エタノール次いでアセトンで
洗浄した後、真空乾燥すれば目的とする多糖誘導体が得
られる。例えば、ポリアルコール体ＦＡ−５，ＦＡ−１
０，ＦＡ−２５およびＰｋ−８５から、それぞれ目的と
する多糖誘導体ＦＡ−５Ｈ，ＦＡ−１０Ｈ，ＰＡ−２５
ＨおよびＰ　Ａ　−８５Ｈを得ることができる。

以下にこれらの多糖誘導体の性質について詳述する。

■　物理学的ならびに化学的性質 （１）溶解性 ＰＡ−５Ｈ，ＦＡ−１０Ｈ，ＰＡ−２５ＨおよびＦ　Ａ
−８５Ｈけいづれも水に易溶であり、メタノール、エタ
ノール、酢酸エチル、アセトン、葱チルエーテルなどの
有機溶媒にはほとんど溶けない。

（２）旋光性 ０．５％水溶液における比旋光度〔α〕皆はＰＡ−５Ｈ
が＋６−８±６°、ＦＡ−１０Ｈが＋５９±６°ＨＰＡ
−２５Ｈが４・４４±４８Ｐ　Ａ　−８５Ｈが＋３２±
３°であった。

（３）元素分析値ぴ） 炭素　水素　　　窒素 ＰＡ−５Ｈ４Ｌ９　　ｆＬ４　　０．４以下ＦＡ−１０
Ｈ４２，０６，１０，４以下ＰＡ−２５Ｈ４，２，９６
，８０，４以下ＦＡ−８５Ｈ４３，１６，４０，４以下
（４）分子量 東洋曹達工業製ＨＬＯ−８０８Ｄ高速液体クロマトグラ
フに接続したＧ−５０００ＰＷカラム（東洋曹達工業製
）に各検体水溶液（０，１％、１００μｌ）を注入し、
０．１Ｍ酢酸カリウム緩衝液（ｐｎ　６．５　）により
流速１−７分で溶出し、デキストランＴ−５００、Ｔ−
７０およびＴ−４０（ファルマシア・ファインケミカル
ズ礼製）を標準に示差屈折計で検出した結果１分子量の
ピークはＦＡ−５Ｈが１，０００，０００±１００．０
００．ＦＡ、−１０Ｈが９２（１，０００±９０，００
０．　ＦＡ−２５Ｈが７９０，０００−ｔ：　ｓ　ｏ、
　ｏ　ｏ　ｏおよびＦＡ−３５Ｈが今６２０．０００±
６０．０００であった。

（５）多糖誘導体、ポリアルコール体およびＤＨ−６６
６５Ｆ’の構造を解明するために以下の分析を行なった
。

（ａ）　　Ｆ　Ａ　−５Ｈ、Ｆ　Ａ　−１０Ｈ、Ｆ　Ａ
　−２５Ｈ，ＦＡ−８５ＨおよびＤＨ− ６６６５Ｆを各々完全酸加水分解（封管中　Ｎ硫酸　１
００℃　６時間）後、常法によりアルジトールアセテー
トとしてガスクロマトグラフィーによって構成糖比、生
成するグリセロールおよびエリスリトールを定量した結
果を表１に示した（モル比）。

表１　　ｔｉｌｌ成糖比 （ｂ）　　Ｄ　Ｈ−６６６５１！を箱守法により完全メ
チル化後、常法によりアルジトールアセテートとしてガ
スクロマトグラフィーによって分析した結果は１表２の
通りであった。

表２　メチル化分析 （ｃ）　　Ｄ　Ｈ−６６６５Ｆの完全スミス分解および
緩和スミス分解の結果は１表３・の通りであった（モル
比）。

表８　スミス分解 （ｄ）　　Ｄ　）］　−６６６５Ｆの緩和スミス分解物
として９表３に示したグリセロール （２，０モル）、エリスリトール（０，１４モル）の他
２−０−β−Ｄ−グルコシル−Ｄ−エリスリトール（０
，７４モル）および２，４−ビス−ヒドロキシメチル−
５−〇−β−Ｄ−グルコシルー１，８−ジメキザン（Ｏ
Ｊ５モル）が、またアセトリシスの結果、３−０−α−
Ｄ−マンノシルーＤ−グルコースとセロビオースカ。

また部分酸加水分解物（０，８８規定硫酸で１００℃、
７時間）として６−０−α−Ｄ−マンノシルーＤ−グル
コースとセロビオースが各々得られた。

以上の分析結果を総合してＤ）Ｉ−６６６５Ｆの主構造
を次のごとく推定した。

すなわち、ＤＨ−６６６５１１’の構造はセルロースの
主鎖のグルコース残基の一個オきに二個のマンノースが
側鎖として８位及び６位にα結合したものである。

また、ポリアルコール体９例えばＰ八−５、ＦＡ−１０
，ＦＡ−２５，ＦＡ−８５の構造は１表１の結果からＤ
Ｈ−６６６５Ｆの構造において主として３位又は６位の
マンノース側鎖が開環してアルコール化されたちのと推
定され、その平均的な構成単位は式 （式中＋　Ｒ３及びＲ４はそれぞれＡ、Ｂ及びＭより選
ばれる。但し、Ａ、Ｂ及びＭは前記に同じ）で表わされ
ることができる。なお、ポリアルコール体は式（ｎ）で
表わされた構成単位が重合した型をとるが、この式中で
−個おきに存在する非分岐の１．４−結合グルコース残
基も一部が開環してアルコール化されていると解され９
例えばＦＡ−５゜ＦＡ−Ｎｏ、ＦＡ−２５では非分岐グ
ルコース全体の２％未満の、Ｐ　Ａ　−８’５では２％
の 残基を含んでいると考えられる。

さらに多糖誘導体９例えばＦＡ−５Ｈ。

ＦＡ−１０Ｈ，ＦＡ−１５Ｈ，ＦＡ−８５Ｈの構造は１
表１の結果からポリアルコール体（ＩＩ）の構造におい
て主としてグルコース残基の３位及び６位のポリアルコ
ール基が脱離され、更に場合によっては極く一部のα−
Ｄ−マンノース残基が脱離されてヒドロキシル基になっ
たものと推定され、その平均的な構成単位は前記の式（
１）で表わされることができる。この式中のＲ，及びＲ
１に関し、（Ａの個数十Ｂの個数）：Ｈの個数：Ｍの個
数の比が１〜１１：６〜４０７９８〜４９の範囲のもの
が副作用と効果の面から優れており９代表的な多糖誘導
体におけるこの比率を表１に基づいて算出し１表４に示
した。

表４　側鎖の構成比率（％） ■　生物学的性質 （１）発熱性試験 日本薬局方（１０局）に準じ多糖誘導体について発熱性
試験を行なった。体重約２神のウサギを各群８匹使用し
、滅菌生理食塩水（局方）に溶解した検体を体重１ｋｇ
当りｌＯ−を耳静脈から投与した。投与後の　　・ウサ
ギの体温上昇を表５に示した。

表５　発熱性試験結果 ＊−（陰性）、　　＋（＠性） 以上の結果は、ＦＡ−５ＨおよびＰＡ−２５Ｈは原料物
質であるＤＨ−６６６５Ｆと比べて発熱性が明らかに減
弱していることを示している。

（２）抗腫瘍作用 マウス移植癌を用いて検討した結果を以下に例示する。

（ａ）　　同種腫瘍エーリッヒ固型癌に対する効果 ８　Ｘ　１０”個のエーリ、ヒ癌細胞を工ＯＲマウスの
そけい部皮下に接種し。

癌移植後１２日目および１７日口の２回。

生理食塩水に溶解した各試料を腹腔内に投与した。実験
各群のマウスは６匹とし。

１２日口の試料投与時に腫瘍の長径及び短径をノギスで
計測し各群のマウスの腫瘍の大きさを揃えてから検討を
行なった。

また、活性対照としてＤＨ−６６６５Ｆを同様に投与し
て比較した。実験終了時（８０日口重にマウスを層殺し
、摘出した各群の腫瘍重量の平均値（Ｔ）とその対照群
（０）に対する百分率（Ｔ　／　Ｏ×１００　＋％）を
表６に示した。

表６　エールリッヒ固型症 （腹腔内投与） １）　＊＊　Ｐ（０，０１，卆＊＊　Ｐ＜０．００１２
）腫瘍型＠：　　２．７７±０．４０（９）（ｂ）　　
同系腫瘍ＭＭ４６固型癌に対する効果４　Ｘ　１０’個
のＭ、Ｍ４６乳癌細胞を（１！　８　Ｈ／Ｈｅ　　マウ
スのそけい都度下に接種し、癌移植後１２日目および１
７日目の２回、生理食塩水に溶解した各試料をマウスの
背部皮下に投与した。各実験群のマウスは７匹とし、以
下エーリ、ヒ癌の場合と同様にＤＨ−６６６５Ｆと比較
検討した。腫瘍移植２９日目に判定した結果を表７に示
した。

表７　　ＭＭ４６固型癌（皮下投与） ］、）　　＊＊　　Ｐ＜０．０１．、　　　＊＊十　Ｆ
＜０．００１２）腫瘍重量：　　２．５６±ｏ、２ｅ（
９）以上の結果にみられる如＜、ＰＡ−５Ｈ。

ＦＡ−１０Ｈ，ＦＡ−２５ＨおよびＰ　Ａ−３５１■は
、活性対照として用いた原料物質であるＤＨ−６６６５
Ｆと比較しても、同等以上の優れた抗腫瘍活性を示す物
質であることが明らかである。

参考例Ｉ ＤＨ−６６６５Ｆ（分子量ピーク約１００万。

〔α）２５＋６５．　　以下参考例５迄同じ）　５．０
９を脱イオン水１．０／に溶かし５℃に冷却後、５℃に
予冷した１、６５％過ヨウ素醪ナトリウム水溶液２０−
を攪拌下加え、５℃で遮光下１４日間過ヨウ素酸酸化し
た。反応終了後、水素化ホウ素す）　ＩＪウムを０．５
９加え、室温で２０時間還元し、過剰の水素化ホウ素ナ
トリウムは酢酸を冷却下加え９反応液のｐＨを５に調整
して分解させた。次に、脱イオン水に対して透析し、透
析内液を約４００　ｗｅｔまで濃縮後、　９，０００　
ｒｐｍで４０分間遠心分離した。得られた上清をエタ／
−ル１．Ｏ７中へ攪拌下注加し、生じた白色沈澱を集め
、エタノール、次いでアセトンで洗った後、真空乾燥し
てＦＡ、−，５の白色粉末を４．８９得た。

参考例２ ＤＨ−６６６５Ｆ５．０９を参考例１と同様に１．６５
％過ヨウ素酸ナトリウム水溶液４０−と水素化ホウ素ナ
トリウム１．０９を用いてＦＡ−１０の白色粉末を４．
７ｇ得た。

参考例８ Ｄ　Ｈ−６６６５Ｆ　５．０９を参考例１と同様に１．
６５％過ヨウ素酸ナトリウム水溶液１０〇−と水素化ホ
ウ素ナトリウム２．５ｇを用いてＦＡ−２５の白色粉末
を４．７９得た。

参考例４ ＤＨ−６６６５Ｆ５．０ｇを参考例１と同様に１．６５
％過ヨウ素酸ナトリウム水溶液１４〇−と水素化ホウ素
ナトリウム８．５２を用いてＦＡ−８５の白色粉末をも
７９得た。

参考例５ ＤＨ−６６６５Ｆ５０．０２を脱イオン水１０、Ｏ７に
溶かし５℃に冷却後５℃に予冷した１、６５％過ヨウ素
酸ナトリウム水溶液２００　ｄを攪拌下加え、５℃で遮
光下、１４日間過ヨウ素酸酸化した。反応終了後、水素
化ホウ素ナトリウムを５．０９加え、室温で２０時間還
元し。

過剰の水素化ホウ素ナトリウムは酢酸を冷却下加え１反
応液のｐＨを５に調整して分解させた。

次に、１０％セチルピリジニウムクロライド水溶液を１
．０１．次いで０．５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）−を
１．５ノ加えて多糖のセヂルビリジニウムニホウ酸複合
体を形成せしめた。この複合体を集め、脱イオン水にて
洗浄後、２％酢酸水溶液８．０ノに冷却下溶かし、メタ
ノール９、Ｏ７中へ攪拌下注加し、生じた沈澱を集めた
。

この沈澱をメタノールで洗った後、脱イオン水８、Ｏ７
に溶かし＋　９．００　Ｏｒｐｍで４０分間遠心分離し
た。得られた上清に酢酸ナトリウム１．０９を沈澱助剤
として溶かし、メタノール９、Ｏ７中へ攪拌下注加し、
生じた白色沈澱を集め、メタノール、次いでアセトンで
洗った後。

真空乾燥してＦＡ−５の白色粉末を４５．０９得た。

実施例１ 参考例１で得られたＦＡ−５２，０９を脱イオン水１５
０−に溶解後、ＩＮ硫酸１５０−を加えて室温で２４時
間緩和酸氷解した。反応液を８Ｎ苛性ソーダにて中和後
、脱イオン水に対して透析し、透析内液を約２００−ま
で濃縮し濾過した。濾液をエタノール６００．７中へ攪
拌下注加し生じた白色沈澱を集め、エタノール。

次いでアセトンで洗った後、真空乾燥して多糖誘導体、
’ＰＡ−５Ｈの白色粉末を１．９ｇ得た。

実施例２ 参考例２で得られたＦＡ−１０２，０ｇを実施例１に従
って、緩和酸水解して、ＦＡ−１０Ｈの白色粉末を１．
８ｇ得た。

実施例８ 参考例８で得られた。ｐＡ−２５２，０９を実施例１に
従って緩和酸水解して、ＦＡ−２５Ｈの白色粉末を１．
６９得た。

実施例４１ 参考例４で得られたＦＡ−８！５　２．０９を実施例１
に従って緩和酸水解して、ＦＡ−８５Ｈの白色粉末を１
．５ｇ得た。

実施例５ 参考例５で得られたＦＡ−５２０，０９を脱イオン水１
．０１に溶解後、ＩＮ塩酸１．０１を補えて室温で２４
時間緩和酸氷解した。反応液を５Ｎ苛性ソーダにて中和
後、濾過し、濾液をメタノール６、Ｏ１中へ攪拌下注加
し、生じた白色沈澱を集め８０％メタノール、メタノー
ル及びアセトンで順次洗った後、真空乾燥して多糖誘導
体ＦＡ−５Ｈを１８．７９得た。

７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）平均的な構成単位が式 （式中、Ｒ１及びＲ７はそれぞれ Ｈ：　ヒドロキシル基 Ｍ：　α−Ｄ−マンノース残基 から選ばれる、）で表わされ１分子中の（Ａの個数子Ｂ
   の個数）：Ｈの個数二Ｍの個数の比が１〜１１：６〜４
   ０；９８〜４９であり。 元素分析値が０　４１〜４４％、Ｈ５〜７％、　Ｎ　Ｏ
   ，４％以下である多糖誘導体 ２）分子量のピークが６２±６万乃至１００±１０万で
   あり、〔α）％５　（ｏ、　ｓ％、水）が＋３２±８°
   乃至＋６８±６°である特許請求の範囲第１項記戦の多
   糖誘導体 ８）水に易溶で、エタノール、酢酸エチル、ア　゛セト
   ン、ジエチルエーテルに殆んど溶解しない特許請求の範
   囲第１項及び第２項記載の多糖誘導体 ４）ＤＨ−６６６５Ｆを過ヨウ素酸で処理し。 次いで生成物を還元して得られるぎりアルコール体を酸
   処理することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   多糖誘導体の製法