JPS6326994B2

JPS6326994B2 -

Info

Publication number: JPS6326994B2
Application number: JP58199294A
Authority: JP
Inventors: Juzo Udaka; Hideo Kamyama; Junichi Taniguchi; Keiji Adachi
Original assignee: Shikishima Boseki KK
Current assignee: Shikishima Boseki KK
Priority date: 1983-10-26
Filing date: 1983-10-26
Publication date: 1988-06-01
Also published as: JPS6091989A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はストレプトコツカス属細菌から生理活
性物質SPF―１生産菌を取得し、該菌を用いて生
理活性物質SPF―１を生産する方法に関するもの
である。従来、溶連菌（Streptococcus pyogenes）の
生菌体を弱毒化して製剤化したものは、すでに制
癌剤として使用されている。また、ストレプトカツクス・ピオゲネスの菌体
を破砕後、水または塩類溶液で有効成分を抽出
し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍性成分を沈澱とし
て、回収する方法（特公昭38−1647）、溶連菌を
溶菌酵素、リゾチーム、セルラーゼまたは、蛋白
質分解酵素により、溶菌し、活性画分を水溶性区
分として分画する方法（英国特許第1163865号）
などが知られている。このように、ストレプトコツカス属細菌そのも
のもしくはその菌体成分に抗腫瘍活性があること
は広く知られているのであるが、従来知られたも
のは、菌体もしくは水可溶性もしくは、不溶性高
分子細胞構成物質であるに過ぎなかつた。菌体も
しくは菌体内から有効成分を単離しようとすれば
菌体を溶菌したり、機械的に破砕したりして全体
を分画しなければならなかつた。このような処理
によれば、精製は複雑となり、有効成分の単離は
きわめて困難であつた。本発明者らは、ストレプトコツカス属細菌の菌
体外に生産する抗腫瘍活性などの生理活性のある
物質を求めて研究を行なつたところ、本発明にお
いて生理活性物質生産菌を取得する方法を見出
し、ここに取得した菌を培養すれば生理活性物質
SPF―１が得られることがわかつた。本発明はストレプトコツカス属細菌の培養物を
用いて高分子透過性大腸菌変異株MP―２の生育
阻止の有無を検知し、生育阻止能を示すストレプ
トコツカス属に属する細菌を培養し、生理活性物
質SPF―１を生産せしめることを特徴とするスト
レプトコツカス属細菌による生理活性物質SPF―
１の生産方法である。本発明において使用する高分子透過大腸菌変異
株MP―２は細胞膜が高分子ペプタイドを透過す
るようになつた大腸菌の変異株として知られてい
る。（Ohishi.T.，Yamagata.H.，Udaka，S.：
Agric.Biol.Chem.，43，371〜378（1979）そして、
高分子透過性大腸菌変異株MP―２は微工研に
FERM―5432として寄託されている。本発明においては、ストレプトコツカス属細菌
であればいかなる菌株でもよいが、下記の菌株を
培養し、MP―２の生育阻止の有無の検知に供す
る。 Streptococcus pyogenes ATCC 21060 Streptococcus sp ATCC 21597 Streptococcus pyogenes ATCC 21546 Streptococcus pyogenes ATCC 21547 Streptococcus pyogenes ATCC 21548 培養液は、肉エキス培地、酵母エキス培地、ブ
レイン・ハート・インフユージヨン培地（BHI
培地）等の天然培地がよく用いられるが、ストレ
プトコツカス属細菌が有効に生育する培地であれ
ば、炭素源、窒素源等含んだ一般培地も使用する
ことができる。培養はストレプトコツカス属細菌が生育する条
件が選ばれるが、PH6.0〜8.0、好ましくは6.8〜
7.2で30〜40℃好ましくは35〜37℃であり嫌気的
に静置培養をおこなうのが一般的であるが、その
他撹拌培養等の変法も採用することができる。培養液は遠心分離して菌体を除去して用意す
る。一方、MP−２は次の組成のペプトン肉エキス
培地で培養する。（ペプトン肉エキス培地）ペプトン 0.5％肉エキス 0.5％ NaCl 0.3％培養は37℃で約17時間培養する。得られた培養
液は、遠心処理して菌体を得る。菌体は上記ペプ
トン肉エキス培地に寒天0.8％を加えた培地に菌
体が１ml中10⁴個になるように懸濁させる。別に、下記の組成のM3培地を調整する。（M3培地）バクト・アンチバイオチツク・メデウム３
1.75％寒天 1.5％ M3培地を入れたプレートに上記菌体懸濁液２
mlを加え、均一にひろげ、固化させる。この固化面に、上記培養液0.06mlをしみこまし
たペーパー・デイスクを置き、37℃で17時間培養
して、生成した阻止円を観察する。この阻止面の有無によつて生理活性物質SPF―
１生産性の有無を判断することができる。本発明で、MP―２の生育阻止の有無の検知に
用いた前記ストレプトコツカス属の各菌株で、す
べてにおいて阻止円が確認された。このようにしてMP―２の阻止円が確認された
ストレプトコツカス属細菌は生理活性物質生産菌
として使用され、培養することによつて生理活性
物質SPF―１を生産させることができるものであ
る。この沈澱物全量を安定剤含有緩衝液に溶解し、
溶解液をDEAE―セルロースカラムに加え、生理
活性物質を吸着させ、これに0.3M NaCl溶液を
用いて段階的に溶出させ、活性部分を分取する。
活性部分を緩衝液に対して透析し、次に、DEAE
―セフアデツクスＡ―25のカラムに加え、活性部
分を吸着させ、これに燐酸緩衝液中の食塩濃度を
直線的に上昇させつつ溶出を行い、活性部分を分
取する。更に、この溶出液を濃地とゲル濾過材トヨパー
ルHW―50Fのカラムに加え、活性画分を分取す
る。ここに得られた溶出液を凍結乾燥し生理活性物
質SPF―１の白色粉末を得る。培養液は、肉エキス培地、酵母エキス培地、ブ
レイン・ハート・インフユージヨン培地（BHI
培地）等の天然培地がよく用いられるが、ストレ
プトコツカス属細菌が有効に生育する培地であれ
ば、炭素源、窒素源等含んだ一般培地も使用する
ことができる。培養はストレプトコツカス属細菌が生育する条
件が選ばれるが、PH6.0〜8.0、好ましくは6.8〜
7.2で30〜40℃好ましくは35〜37℃であり嫌気的
に静置培養をおこなうのが一般的であるが、その
他撹拌培養等の変法も採用することができる。培地中には、培養の適宜時期に界面活性剤、ペ
ニシリン又はその関連物質を添加することによつ
て菌体が生産する各種有用物質を菌体外に排出し
やすくなる。ペニシリン又はその関連物質としてはすでに知
られたペニシリンと類似の作用をもつ関連物質で
あればいかなるものでもよいが、ペニシリンＧが
普通用いられる、添加量はペニシリンＧで100〜
3000単位／ml、好ましくは1000単位／ml培養液程
度で十分である。本発明の方法においては、ストレプトコツカス
属細菌の生産する生理活性物質SPF―１は菌体外
に排出され、培養液中に存在するようになるの
で、菌体を濾過して除去し、培養濾液を精製すれ
ばよいので、単離はかなり容易なものとなる。得られた培養液は、遠心分離によつて菌体を分
離と、濾液に硫安を添加し、沈澱物として有効成
分を得ることができる。沈澱物は凍結状態で保存
することができる。次に、生理活性物質SPF―１の理化学的性質を
示す。１元素分析２分子量ゲル濾過法による測定では、分子量約500〜
7000である。３分解点本物質は170℃では褐変し、200℃になると黒色
となり分解する。４比旋光度〔α〕²⁰ _D＝＋63.3〜64.3゜（Ｃ＝1.04）５紫外線吸収スペクトル本物質の3.3％の水溶液の紫外線吸引スペクト
ルは第１図に示され、3.1％の水溶液の紫外線吸
収スペクトルは第２図に示される。いずれも、
257nm、265nm、280nm、287nmに吸収がみら
れ、特徴的である。６赤外線吸収スペクトル第３図に示される。７溶剤に対する溶解性水に可溶であるが、メタノール、エタノール、
ｎ―ブタノール、、イソブタノール、ｎ―プロパ
ノール、ｎ―ヘキサン、クロロホルム、、アセト
ン、メチルイソブチルケトン、エチルエーテル等
の溶剤には不溶である。８塩基性、酸性、中性の区別本物質の0.85％の水溶液のPHは6.5である。９物質の色白色粉末状である。 10 呈色反応ニンヒドリン反応＋ビユウレツト反応＋モーリツシユ反応 − デイシユ反応 − アンスロン反応 − システイン硫酸反応 − 11 安定化本物質はＬ―システイン、ジチオスレイトール
（DTT）グリセロール、アルブミン、グロブリ
ン、（NH₄）₂SO₄、食塩等の添加によつて安定化
される。 12 生理活性生理活性物質SPF―は、高分子透過性大腸菌変
異株MP―２に対して下表のような生理活性を示
す。MP―２に対する活性の測定方法は、ペーパ
ー・デイスク法で行い、MP―２の生育阻止範囲
をノギスで測定した。

【表】次に本発明の実施例を示す。実施例１バクト・アンチバイオチツクメデイアム３（デ
イフコ社製品）1.75％、寒天1.3％より成る培地
（M3培地）を120℃、15分加熱殺菌し、20mlずつ
シヤーレに分注し、放冷してプレート培地をを調
製する。一方、ペプトン0.5％、肉エキス0.5％、
NaCl0.3％、寒天0.8％より成る培地を120℃、15
分加熱殺菌する。その後42℃の恒温槽に保ち、培
地の温度が42℃になつたらあらかじめ37℃で17時
間培養したMP―２、FERM―P5432を１mlに10⁴
個の細胞が存在する様に培地中に加える。ピペツ
トによつて２mlを採取し、あらかじめ作製して置
いたM3培地表面上に加え、すばやく均一にひろ
げ固化させる。一方、ストレプトコツカス属細菌培養濾液希釈
懸濁液0.05mlをペーパー・デイスク（直径８mm）
（東洋濾紙）にしみ込ませる。このペーパー・デ
イスクを前記作製プレート上に置き、37℃で17時
間培養し、阻止円の大きさを測定する。阻止円の
直径10mmを与える生理活性物質の濃度を１単位
（1u）を定義する。実施例２次の組成の培地A2に、肉エキス１％ポリペプトン１％ NaCl 0.5％ PH＝7.1 Streptococcus pyogenes ATCC21060（BH Ｉ
培地100ml接種して37℃、８時間静置培養により
前培養をおこなつた培養液100ml）を接種し、37
℃、15hr撹拌しながら嫌気的に培養後、ペニシリ
ンG1000単位／mlを添加し、更に培養を5hr継続
する。得られた培養液を遠心分離し、菌体を除去
した。培養濾液を実施例１の方法に従つて測定したと
ころ、培養濾過液には生理活性物質が120単位／
ml含有されていた。この菌株を生理活性物質生産菌とした。実施例３次の組成の培地E3に、肉エキス 1.5％ポリペプトン 1.0％ NaCl 0.5％カザミノ酸 0.25％酵母エキス 0.25％ PH＝7.1 Streptococcus pyogenes ATCC21060を、37
℃で8hr静置培養して得た種培養液300mlを添加接
種し37℃、15hr撹拌しながら嫌気的に培養後、ペ
ニシリンG1000単位／mlを添加し、更に培養を
5hr継続する。得られた培養液を遠心分離し、菌
体を除去した。培養濾液３には生理活性物質を56×10⁴単位
含有していた。培養濾液には硫安を添加し50〜80％飽和度の画
分を分取して、沈澱物を得た。この沈澱物は生理
活性物質SPF―１を50×10⁴単位含有していた。この沈澱物全量を安定剤含有緩衝液300mlに溶
解し、溶解液をDEAE―セルロースカラム（５×
70cm）に加え、生理活性物質を吸着させた。これ
に0.3M NaClを溶液を用いて段階的に溶出させ、
活性部分を分取する。得られた活性は30×10⁴単
位であつた。活性部分を緩衝液に対して透析し、次に、
DEAE―セフアデツクスＡ―25のカラム（2.6×
50cm）に加え、活性部分を吸着させ、これに燐酸
緩衝液中の食塩濃度を直線的に上昇させつつ溶出
を行い、活性部分を分取する。得られた活性は
10.6×10⁴単位であつた。更に、この溶出液を濃縮しゲル濾過材トヨパー
ルHW―50Fのカラム（2.6×100cm）に加え、活
性画分を分取する。得られた活性は2.2×10⁴単位
であつた。ここに得られた溶出液を凍結乾燥し生理活性物
質SPF―１の白色粉末350mgを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は生理活性物質SPF―13.3％水溶液の紫
外線吸収スペクトルを示し、第２図は同じく3.1
％水溶液の紫外線吸収スペクトルを示し、第３図
は同じく赤外線吸収スペクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１ストレプトコツカス属細菌の培養物を用いて
高分子透過性大腸菌変異株MP―２の生育阻止の
有無を検知し、生育阻止能を示すストレプトコツ
カス属に属する細菌を培養し、生理活性物質SPF
―１を生産せしめることを特徴とするストレプト
コツカス属細菌による生理活性物質SPF―１の生
産方法。