JPS58107186A - 制癌作用物質及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な制癌作用物質ＹＭ　−３２２９Ｇ及びそ
の製造法に関する。

本発明者らは、薬理作用物質を産生する微生物について
検策中、土壌より新たに分離した細菌を培養すると新規
な制癌作用物質ＹＭ　−３２２９Ｇが蓄積されることを
つきとめ、その知見に基づいて本発明を完成した。

本発明にお（・て利用される微生物は、札幌市丸山公園
内の土壌から分離された新種の細菌であり、その菌学的
性質は次のとおりである。

■　形態学的性質 肉汁寒天培地上で培養した細胞は、０６〜０．８　Ｘ　
１．５〜３０μｍの大きさをもつ桿菌であり。

極子を有し運動性がある。胞子を形成せず。

ダラム染色性は陰性である。細胞の多形性及び抗酸性は
な（・。

■　各種培地における生育状態 （１）　　肉汁寒天培地（２８ｔＺ’、２〜６日）菌体
は淡黄色を呈し、増殖はよ℃・。

（２）　　肉汁ブロス（２８ｒ、２〜６日）表面に薄膜
を形成する。培地は全体に濁る。

（３）　　リドマス　ミルク（２８１１：：、２〜６日
）中性〜アルカリ性のまま液化される。

（４）　　肉汁ゼラチン穿刺培養 液化される。

■　生理学的性質 （１）　　デンプンの加水分解　　　　陰性（２）　　
ゼラチンの液化　　　　　　陽性（３）　　カゼインの
加水分解　　　　陰性（４）　　カタラーゼ反応　　　
　　　陰性（５）　　インドールの生成　　　　　陰性
（６）　　硫化水素の生成　　　　　　陰性（７）　　
ウレアーゼ反応　　　　　　陰性（８）　　硝酸塩の還
元　　　　　　　陽性（９）　　クエン酸の利用（シモ
ンズ培地）　陽性００）卵黄反応　　　　　　　　　陰
性（ｌυ　オキシダーゼ　　　　　　　陽性ａ’ａ　　
ｖｐテスト　　　　　　　　陰性０３）　　ＭＲテスト
　　　　　　　　　陽性０４　　栄養要求性　　　　　
　　　　なしα９　嫌気性条件下での生育　　　　生育
せずＱ６）　　ｊｔＱＩ［窒素源）利用７７”Ｌ′、、
［、ｆｊｌＪｆｌ。

硝酸塩利用せず。

０？）　　色素の生成　　　　　　　　　なしＯＦＱ　
　　ポリ−β−ハイドロキシブチレート陰性 の体内蓄積 ＯＩ　　脱窒反応　　　　　　　　　　陰性（イ）　Ｏ
−Ｆテスト　　　　　　　　０型Ｃυ　生育温度範囲　
１５〜３７Ｄ　　４０Ｃでは生育しない。

（ハ）糖の利用性 Ｄ−グルコース、スターチ、クリセリンを各々唯一の炭
素源として生育するが、　Ｌ　−アラビノース、Ｄ−キ
シロース、Ｄ−フラクトース、シー−クロース、イノシ
トール。

Ｌ−ラムノース、ラフィノース、Ｄ−マンニトール、Ｄ
−ガラクトース、マルトース。

トレハロース＋　ラフ）−ス、Ｄ−ソルビトール、サク
シン、エスクリンの℃・ずれも生育に利用できない。

以上の菌学的性質についてパージエイズ　マニーアル　
オプ　デターミネイティブ　バクテリオロジイ（Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）第８版（１９
７４年）Ｋより検策すると９本菌株はダラム陰性の桿菌
で、胞子を形成せず、極子性鞭毛を有し、絶対好気性で
あるところからシー−トモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
Ｓ）属に属すると同定される。さらに、ポリ−β−ハイ
ドロキシブチレートの菌体内蓄積が認められず。

ポリ−β−ハイドロキシブチレートを炭素源として利用
できないことから１本菌株はシュードモナス属のセクシ
ョン（５ｅｃｔｉｏｎ　）　Ｉに属すると考えられる。

セクションＩに包括される菌種のうち、蛍光性色素を生
成せず、脱窒反応が陰性であるものとしては、シュード
モナス　アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　）が挙げられる。

しかしながら９本菌株はシュードモナス　アルカリゲネ
スの菌学的性質と比較して、以下の性質においてシュー
ドモナス　アルカリゲネスと異なって℃・る。

１）本菌株はデンプンを含む培地で粘液性の物質を生産
する。

２）本菌株は１５〜３７Ｕを生育温度範囲とし。

４１′ｃでは生育しないのに対し、シュードモナス　ア
ルカリゲネスは４１℃においても生育する。

以上の結果より１本菌株はシー−トモナス属に属するい
ずれの標準種の菌とも峻別でき２本発明者らは本菌株を
シー−トモナス属に属する新菌種のものであると判定し
１本菌株をン一ドモナス　エスピー　ＹＭ　−３２２９
Ｇ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ、ＹＭ　−３２２９
Ｇ　）と命名した。

本菌株は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第６１６７号として寄託されて℃・る。

以上ＹＭ−３２２９Ｇ株につ℃・て説明したが、微生物
の諸性質は一定したものではなく、自然的人工的に変化
することは周知のとおりである。

本発明にお℃・て用いられる菌株としてはシュードモナ
ス属に属し、制癌作用物質ＹＭ−３２２９Ｇを産生する
全ての菌株が挙げられる。また本発明で使用する菌株に
は例えばＸ線、γ線、紫外線等の照射、化学変異剤処理
、ファージ接触。

形質転換、形質導入、接合による遺伝子組換え。

細胞融合による遺伝子組換え、プラスミドによる遺伝子
導入などの処理をすることによって制癌作用物質ＹＭ−
３２２９Ｇの生産能を高めた人工的変異株、あるいは自
然発生した突然変異株も包含される。

本発明によって提供される制癌作用物質ＹＭ−３２２９
Ｇの生産は、シュードモナス属に属する制癌作用物質Ｙ
Ｍ−３２２９Ｇ生産菌を培地に培養し。

培養物より該ＹＭ−３２２９Ｇを採取することにより行
なわれる。

培養はその微生物が利用する栄養源を含有する培地を用
いて行なわれる。培地は合成、半合成又は天然の、固体
又は液体培地の℃・ずれを用いてもよいが２通常天然の
栄養源を含んだ液体培地を使用するのが好まし℃・。培
地に添加する栄養源としては、炭素源としてはＤ−グル
コース、スターチあるいはグリセリンが、窒素源として
は肉エキス、ペプトン、グルテンミール。

カゼイン加水分解物、綿実粕、大豆粉、落下生粉、魚粉
、コーンスチープリカー、乾燥酵母。

酵母エキス、各種アミノ酸（例えばグルタミン酸、アラ
ニン、リジン等）、アンモニウム塩（例えば硝酸アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム。

等）や尿素などの有機、無機の窒素源が用いられる。

また、培地には必要に応じナトリウム、カリウム、マグ
ネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄などの金属の硫酸塩、
硝酸塩、塩化物、炭酸塩。

リン酸塩などを添加することができる。

培養は好気的条件下に行なうのが良く、静置。

振盪１通気攪拌培養のいずれでも可能であるが。

振盪あるいは通気攪拌培養が有利である。培養温度はお
よそ１８〜３５Ｃの範囲内が好ましく。

殊に約２７〜２８Ｃが有利である。また、培地のｐ）Ｉ
は約５５〜８．５．殊に６〜８の中性付近に保持するの
が好適である。培養期間は培地の組成。

９一 温度等の培養条件によって異なるが１通常約２日〜１０
日程度がよ℃・。

培養物よりＹＭ−３２２９Ｇを単離、精製、採取するに
は２通常微生物工業の分野で用いられる手段を適用すれ
ばよい。ＹＭ　−３２２９Ｇは主に培養液中に蓄積され
るので、遠心分離又は濾過等により菌体を除去した後、
除菌液より単離・精製される。

単離・精製は適当な溶剤に対する溶解性及び溶解度の差
、溶液からの析出性及び析出速度の差１種々の吸着剤に
対する吸着親和性の差、２種の液相間における分配の差
などを利用する方法を適用して行なうのが好ましい。こ
れらの方法は必要に応じて単独に用いら札、ある℃・は
任意、順序に組合せ、また反覆して適用できる。

かくして得られた制癌作用物質ＹＭ−３２２９Ｇの理化
学的性質は以下のとおりである。

形状　　白色粉末 融点　　明瞭な融点９分解点を示さないが。

１４５Ｃからやや褐変し、１８０〜１９０Ｃで褐変する
。

元素分析値 Ｃ＝３８．５５　　）Ｔ＝５．９５　　　Ｎ＝０．６３
呈色反応 オルシン塩化第二鉄塩酸反応　　　陽性アンスロン反応
　　　　　　　陽性 フォリンローリ−反応　　　　陰性 エルソンモルガン反応陰性 溶剤に対する溶解性 水に溶けるが、メタノール、エタノール。

ブタノール、アセトン、クロロホルム。

ベンゼン、酢酸エチル、酢酸ブチルなどの有機溶媒には
全く溶けない。

イオン交換樹脂に対する吸着性 強塩基性及び強酸性のイオン交換樹脂 ［Ｄｏｗｅｘ　ｌｘｌ　（Ｏ）（型）　、　Ｄｏｗｅｘ
５０Ｗ　（Ｈ型）〕のいずれにも吸着されな℃・。

薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０．　Ｆ２５４
）ｔｅｒｔ−ブタノール−水（７：３）、ｎ−ブタノー
ル−酢酸−水（４：１：２）、ｎ−ブタノール−メタノ
ール−水（４：１　：２）、　ｎ−プロパノ−ルー水酸
化アンモニウム−水（４０：６０：５）のいずれの溶媒
系においても、硫酸発色、トルイジンブルーによる染色
で原点であった。

セルローズアセテート膜による電気泳動１Ｍ酢酸−ビリ
ジン（ｐＨ３，５）　；　０．５ｍＡ７４ｉ（総電流量
７ｍＡ）２０分の泳動で移動は認められなかった。

物性　　中性多糖類 本発明微生物より生産されるＹＭ−３２２９Ｇは優れた
制癌作用を示す。その薬理効果を以下に示す。

〔試験方法〕

１群１０匹のＩＣＲ／ＣＲＴ　５週の雌性マウスにザル
コーマ（Ｓａｒｃｏｍａ　）　１８０３　Ｘ　１０５個
の細胞をマウス皮下に接種して腫瘍を作る。このマウス
にＹＭ　−３２２９ａ　（ｉ　ｍｇＡｇ、　５ｍｇ／ｋ
ｇ、　１０ｍｇＡｇ　）を腹腔内より１日１回１０日間
連投し、７日、１５日。

２１８．２８日目における腫瘍の大きさを測定し。

対照との比較においてＹＭ−３２２９Ｇの腫瘍に対する
抑制率を求めた。

〔結　果〕　試験結果を第１表に示す 第１表 以下に実施例を掲記し２本発明を更に詳細に説明する。

なお、制癌作用物質の力価の測定は以下の方法によった
。

〔５′−ヌクレオチダーゼ活性阻止物質の検定法〕基質
溶液；　５．５ｍＭの塩化マグネシウムを含む５５綱の
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）に１．１ｍＭのアデノ
シンモノホスフェートナトリウム塩と１０ｍＭの酒石酸
ナ トリウム、カリウム塩を溶解したも のを用いる。

酵素液；ラット肝臓形質膜５′−ヌクレオチダーゼ 測　　定；基質溶液０．９　ｍｌと酵素液６０ｕ及びＹ
Ｍ−３２２９Ｃ，の培養液（又はＹＭ−３２２９Ｇの水
溶液）４０局を加え温浴中３０ Ｃで３０分間反応させる。反応終了 後、１ｍＺの１０％トリクロロ酢酸を 加えて夾雑するタンパク質を沈澱さ せ、遠心分離する。上清１　ｍｌをとり１％トリトン５
０　／Ｌｅ、蒸留水３．５　ｍｌ及び２．５％（Ｗ／１
）モリブデン酸アンモニウムを含む５規定の硫酸水溶液
０５ ｍｔを加え、　２０分後６６０　ｎｍの吸光度をを用℃
・て測定する。

実施例　１ （１）　　グルコース２．５％、大豆粉１．５％、綿実
粕０．５％、肉エキス１％、炭酸カルシウム０．３％、
塩化ナトリウム０２％を含むｐＨ７，０の液体培地３Ｌ
を用意し、培地を５００　ｍＺの三角フラスコにそれぞ
れ１００　ｍＺずつ分注し、１２Ｏｒで２０分間滅菌す
る。

滅菌終了後、了じめ調製したシー−トモナスエスピー　
ＹＭ　−３２２９Ｇ株の前培養菌液をそれぞれのフラス
コに２ｍｌずつ接種し、２７Ｃで４日間振盪培養する。

培養終了後、それぞれのフラスコ中の培養液を集め、　
５０００回転、１０分間遠心分離し、遠心上清を集める
と２．５８１の培養液が得られる。

この培養液には、前記検定法によって測定したところ５
′−ヌクレオチダーゼ活性を５０％阻止する濃度を１単
位とすると、５′−ヌクレオチダーゼ活性阻止物質が全
体量として４９０，０００単位含有する。

培養液をｐＨ７，８に調整し、４３Ｃで１２２乙まで濃
縮スると５′−ヌクレオチダーゼ活性阻止物質が全体量
として３３０，０００単位となった。濃縮液（（５０％
トリクロロ酢酸を最終濃度５％となるように加え攪拌し
た後、放置すると沈澱が生ずる。沈澱を１２０００回転
１５分間遠心分離して除去する。遠心上清を集め（総量
１．０１１）、　　これにエタノールを最終濃度８０％
となるように加える。生成する沈澱を５０００回転１０
分間遠心分離１−て回収し、さらに８０％エタノール水
溶液で洗浄した後乾燥すると黄色の粗粉末２２７．３　
ｇが得られる。

粗粉末１１４．７　ｇ　（２２０，０００単位）をとり
、　１１６５ｍＡの蒸留水に溶解し、　Ｄｏｗｅｘ　Ｉ
　Ｘ　２　（側型）（ダウ　ケミカルズ社製）の強塩基
性樹脂を用い、蒸留水で展開し、１フラクション１０ｍ
ｔずつ分画すると。

フラクション４１６〜１０８のものて活性が認められた
。活性画分を集め、凍結乾燥すると３．３１７　ｇの淡
黄色の粗粉末が得られる。この粗粉末１ｒｌ１ｇの力価
は３８単位であり、全体量として１２６，０５０単位で
あった。収率は５７％。

（２）　　この粗粉末６０ｒＩ１ｇを２０　ｍｌの蒸留
水に分散させ、　４０，０００回転３０分間遠心分離し
て沈澱物を除去し、遠心上清を高速液体クロマトグラフ
ィー（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　　ＨＷ５０８φ×５０ｃｍ
、東洋ンーダー社製）に付し、蒸留水で展開して精製し
、減圧濃縮する。

濃縮物を更に同じ操作に付して精製を繰り返して行ない
、溶出時間２０分から３２分までをフラクション２．３
２分から４０分までをフラクション３，４０分間から５
６分までをフラクション４として分取し、それぞれ濃縮
した後凍結乾燥すると白色の粉末が得られる〔フラクシ
ョン２からは１１．７　＋ｎｇ　（３０単位／ｍｇ）、
フラクション３からは１０ｍｇ（３３単位／ｒｒ１ｇ）
、フラクション４からは６ｍｇ（２５単位／ｍｇ）］。

得られた白色粉末１００　ｍｇを、さらに高速液体クロ
マトグラフィー（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　５０００ｐｗ、
東洋ソーダー社製）に付し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）で分画する。得られる活性画分を集め濃縮し
た後。

セロファンチー−プて３日間蒸留水で脱塩透析し。

凍結乾燥して白色粉末の有効物質ＹＭ　−３２２９Ｇが
１５　ｍｇ　（５７単位／ｍｇ）得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図はＹＭ−３２２９Ｇの赤外線吸収スペクトルを示
す。 代理人　佐々木　晃　−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記の理化学的性質を有するＹＭ　−３２２９Ｇ（１）
   　　形状　　白色粉末 （２）　　融点　　明確な融点２分解点を示さないが１
   ４５Ｃからやや褐変し、１８０ 〜１９０Ｃで褐変 （３）　　元素分析値　Ｃ＝３８．５５．　Ｈ＝５．９
   ５．　Ｎ＝０．６３（４）　　赤外線吸収スペクトル ｖ’：：ｒｘｅｒａ−’　；　３４２０，２９００．１
   ７２０．１６１０．１４１０゜１２４０．１０６０．５
   ７０ （５）呈色反応 オルシン塩化第二鉄塩酸反応　陽性 アンスロン反応　　　　　　　陽性 フォリン　ローリ−反応　　　　陰性 エルソンモルガン反応陰性 （６）溶解性　水に溶けるが有機溶媒には溶けない。 （７）　　イオン交換樹脂に対する吸着性アニオン、カ
   チオンのいずれの交換樹脂にも吸着されなし・。 （８）物性　　中性多糖類 （９）　　薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｆ
   ２５４）ｔｅｒｔ−ブタノール−水（７：３）、ｎ−ブ
   タノール−酢酸−水（４：１：２）、ｎ−ブタノール−
   メタノール−水（４：１　：２）、　　ｎ−プロパノ−
   ルー水酸化アンモニウム−水（４０：６０：５）のいず
   れの溶媒系においても、硫酸発色。 トルイジンブルーによる染色で原点。 （１０）　　セルローズアセテート膜による電気泳動１
   Ｍ酢酸−ピリジ：’　（ｐＨ３，５）　０．５ｍＡ／ｃ
   ｍ（総電流７ｍＡ）２０分の電気泳動で移動なし。 ２、　シュードモナス属に属するＹＭ−３２２９Ｇ生産
   菌を培地に培養し、培養物より制癌作用物質ＹＭ−３２
   ２９Ｇを採取することを特徴とするＹＭ　−３２２９Ｇ
   の製造法。