JPH03184995A - 抗腫瘍剤 - Google Patents

抗腫瘍剤

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JPH03184995A
JPH03184995A JP1291239A JP29123989A JPH03184995A JP H03184995 A JPH03184995 A JP H03184995A JP 1291239 A JP1291239 A JP 1291239A JP 29123989 A JP29123989 A JP 29123989A JP H03184995 A JPH03184995 A JP H03184995A
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JP
Japan
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pco
spf
streptococcus
precipitate
solution
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Juzo Udaka
重三 鵜高
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、抗腫瘍剤に関するものである。
また、本発明は、特に、ピシバニールを併用して効果的
に抗腫瘍活性を高めてなる抗腫瘍剤に関するものである
(従来技術及び問題点) 従来、溶血性連鎖状球菌(以下溶連菌という)の生菌体
を弱毒化して製剤化したものは、すでに制癌剤″ピシバ
ニール″として使用されている。
また、本発明者らは、先に、溶連菌(ストレプトコッカ
ス属菌)の培養濾液又はその限外濾過濃縮液に有機溶剤
を添加して得られる沈澱物から分離したSPF−PCO
−20,SPF−PCO−30に抗腫瘍活性を認めて特
許出願をした。(特開昭63−101400、特開昭6
3−101392) このように、従来、溶連菌に関する抗腫瘍剤については
、単品についてかなりの抗腫瘍効果をあげているのであ
るが、更によりすぐれた抗腫瘍剤の出現が望まれるので
ある。
(問題点を解決するための手段) 本発明者らは、溶連菌に関する各種抗腫瘍剤の抗腫瘍効
果を高める研究を行った結果、溶連菌菌体製剤であるピ
シバニールと溶連菌培養濾液沈澱物との併用がすぐれた
抗腫瘍効果を発揮することを見出したのである。
本発明は、ストレプトコッカス属菌の培養濾液2 もしくはその限外濾過濃縮液に有機溶剤を添加して得ら
れる沈澱物又はこの沈澱物から分離されたSPF−PC
O−20もしくはSPF−PCO−30、と、ビシバー
ルとを併用して効果的に抗腫瘍活性を高めてなる抗腫瘍
剤に関する。
又、本発明は、ストレプトコッカス属菌の培養濾液もし
くはその限外濾過濃縮液に有機溶剤を添加して得られる
沈澱物で抗腫瘍活性を有するSPF−pcoに関するも
のである。
本発明に使用する沈澱物は、ストレプトコッカス属菌の
培養濾過もしくはその限外濾過濃縮液に有機溶剤を添加
することによって生じる沈澱物である。
使用するストレプトコッカス属菌は次に例示される。
ストレプトコッカス・ピオゲネス ATCC21060
(Streptococcus pyogenes)ス
トレプトコッカス・エスピー  ATCC21597(
Streptococcus sp、)ストレプトコッ
カス・ピオゲネス ATCC215463− (Streptococcus pyogenes)ス
トレプトコッカス・ピオゲネス ATCC21547(
Streptococcus pyogenes)スト
レプトコッカス・ピオゲネス ATCC21548(S
treptococcus pyogenes)培養液
は、肉エキス培地、酵母エキス培地、プレイン・ハート
・インフュージョン培地(BHI培地)等の天然培地が
よく用いられるが、ストレプトコツカス属細菌の生育に
適した培地であれば任意の培地を使用できる。
培養pHは、5.0〜8,0、好ましくは、6.1〜7
.2であり、温度は30〜40℃、好ましくは35℃〜
37℃であり、嫌気的に静置培養または攪拌培養を行う
ことができる。
培養時間は、対数増殖期にかかって後↓〜30時間、好
ましくは2〜20時間である。
培養液は遠心分離によって菌体を除去し、濾液を得る。
濾液は、硫安を添加し50〜90%飽和度の画分とし濃
縮するか、もしくは、限外濾過膜を用いて濃縮すること
もできる。
4− 沈澱物は、培養濾液もしくはその限外濾過濃縮液に、メ
タノール、エタノール等のアルコール類、アセトン等の
有機溶媒を添加することにより、沈澱物として得られる
メタノール、エタノール等のアルコール類又はアセトン
等の有機溶媒は、培養濾液又は濃縮液1部に対して0.
65〜3部、好ましくは0,65〜1.5部攪拌しなが
ら添加する。
得られた溶連菌培養濾液沈澱物は、濾取して。
凍結乾燥等によって乾燥物とし、このまま抗腫瘍剤とし
て使用することもできる。この溶連菌培養濾液沈澱物を
SPF−PCOと名付けた。
この溶連菌培養濾液沈澱物SPF−PCOは各種成分の
混合物であるが、次に示す一定の理化学的性質を示す。
溶連菌培養濾液沈澱物の理化学的性質 J、塩基性、酸性、中性の区別 本物質の0.1%の水溶液のPHは5.3〜5.8であ
る。
2、物質の色 白ないし微黄色 3、本物質は210℃で褐変し、 300℃で全体が褐色となる。
4、 元素分析 C:  43.79% H’:   6.86% 0  :  45.’64% N  :   2.41% 5、紫外線吸収スペク ある。
6゜赤外線吸収スペク ある。
7、比旋光度 〔α〕′D。=+105.3°(C= 1.H2O)8
、呈色反応 ローリ−反応     十 ビューレット反応   十 ニンヒドリン反応   十 アンスロン硫酸反応  十 システィン硫酸反応  十 オルシン反応     士 トルは第2図に示す通りで トルは第1図に示す通りで 258℃で一部融解し、 9、分子量 ゲル濾過法による測定では、分子量10,000以上で
ある。
】0.蛋白質吸着体に対する挙動 ハイドロキシアパタイトにほとんどが吸着される。
11、溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノール、エタノール、n−プロ
パツール、アセトン、エチルエーテル、n−ヘキサン、
クロロホルム、酢酸エチル等の有機溶剤には、難溶又は
不溶である。
溶連菌培養濾液沈澱物は、水もしくは緩衝液に溶解し、
ハイドロキシアパタイトに吸着させ、0.011ン酸緩
衝液で充分洗浄後0.1MIJン酸緩衝液で溶出させる
とき、抗腫瘍性成分SPF−PCO−20を得ることが
できる。溶出成分は脱イオン水に対して透析し、凍結乾
燥することによってSPF−PCO−20乾燥標品を得
ることができる。
0.1Mリン酸緩衝液でSPF−PCO−20を溶出さ
せた後は、0.25Mリン酸緩衝液で溶出させるとき、
抗腫瘍性成分SPF−PCO−30を得ることができる
。溶出成分は脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥する
ことによってSPF−PCO−30乾燥標品を得ること
ができる。
次に、実施例2で得られた抗腫瘍性成分SPFPC:0
−20の凍結乾燥標品は次の理化学的性質を示す。
抗腫瘍性成分SPF−PCO−20の理化学的性質。
1、元素分析 0  38.2〜40.5 H5,5〜6,6 N  2.3〜3.2 0 50.9〜46.3 Ash   3.1〜3.4 2、分解点 本物質は185℃で褐変し、267℃になると黒色とな
り分解する。
3、比旋光度 〔α]21′= 80° 〜150° (C= 1.0
0)8− 4、紫外線吸収スペクトル 本物質の水溶液の紫外線吸収スペクトルは第3図に示さ
れる。
5、赤外線吸収スペクトル 第4図に示される。
6、塩基性、酸性、中性の区別 本物質の0.1%の水溶液のpHは5.3〜5.7であ
る。
7、物質の色 白ないし微黄色 8、呈色反応 ローリ−反応     十 ビューレット反応   十 ニンヒドリン反応   十 アンスロン硫酸反応  十 システィン硫酸反応  十 オルシン反応 9、分子量 ゲル濾過法による測定では、分子量io、ooo以」二
である。
一 10、蛋白質吸着体に対する挙動 ハイドロキシアパタイトに吸着され、0.1Mリン酸緩
衝液により溶出される。
11、溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノール、エタノール、n−プロ
パツール、アセトン、エチルエーテル。
n−ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル等の溶剤には
、難溶又は不溶である。
12、温度に対する安定性 本物質の水溶液は、45℃30分の加熱後もインビトロ
で測定される抗腫瘍性活性の多くを保持する。
13、蛋白質分解酵素に対する安定性 本物質は、トリプシン又はプロナーゼによる処理後もイ
ンビトロで測定される抗腫瘍性活性の多くを保持する。
14.8DSアクリルアミドゲル電気泳動で糖と蛋白に
分離するのが確認される。
また、実施例3で得られた抗腫瘍性成分SPF−PCO
−30の凍結乾燥標品は次の理化学的性質を示す。
10 抗腫瘍性成分SPF−PC:0−30の理化学的性質1
1元素分析 C37,1〜39.3 H5,4〜6.4 N  3.5〜4.8 0 50.5〜45.7 Ash   3.5−3.8 2、分解点 本物質は185℃で褐変し、255℃になると黒色とな
り分解する。
3、比旋光度 〔α〕20=30° 〜80″’  (C= 1.00
)4、紫外線吸収スペクトル 本物質の水溶液の紫外線吸収スペク 5図に示される。
5、赤外線吸収スペクトル 第6図に示される。
6、塩基性、酸性、中性の区別 トルは第 11− 本物質の0゜1%の水溶液のPHは5.5〜5.8であ
る。
7、物質の色 白ないし微黄色 8、呈色反応 ローリ−反応     十 ビューレット反応   十 ニンヒドリン反応   十 アンスロン硫酸反応  十 システィン硫酸反応  十 オルシン反応 9、分子量 ゲル濾過法による測定では、分子量10,000以上で
ある。
IO9蛋白質吸着体に対する挙動 ハイドロキシアパタイトに吸着され、0.25Mリン酸
緩衝液により溶出される。
11、溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノール、エタノール、n−プロ
パツール、アセトン、エチルエーテル、n−ヘキサン、
クロロホルム、酢酸エチル等の溶12 剤には、難溶又は不溶である。
12、温度に対する安定性 本物質の水溶液は、45℃、30分の加熱によりインビ
トロで測定される抗腫瘍性活性を保持する。
13、蛋白質分解酵素に対する安定性 本物質は、トリプシンによる処理後もインビトロで測定
される抗腫瘍性活性において活性保持する。しかし、プ
ロナーゼによる処理後は抗腫瘍活性がやや低下する。
14.8DSアクリルアミドゲル電気泳動で糖と蛋白に
分離するのが確認される。
本発明においては、溶連菌の培養濾液もしくはその限外
濾過濃縮液に有機溶剤を添加して得られる沈澱物そのも
のを抗腫瘍剤とするものであり、そして沈澱物又はこの
沈澱物から分離されたSPF−PCO−20もしくはS
PF−PCO−30,と、ビシバニールとを併用して抗
腫瘍剤とするものである。
本発明に使用するビシバニールは溶連菌の生菌体を弱毒
化して製剤化したものであるが、すでに3− 市販されているものであるから、容易に入手し得るもの
である。
投与に際しては、溶連菌培養濾液沈澱物を筋肉注射によ
って投与し、また、溶連菌培養濾液沈澱物、SPF−P
CO−20及びSPF−PCO−30から選んだ1種以
上をビシバニールと混合溶解して筋肉注射によって投与
するのがよい。投与量としては、溶連菌培養濾液沈澱物
、 SPF−PCO−20及びSPF−PCO−30か
ら選んだ1種以上が0.1〜100■/kg体重7日程
度がピシバニールの投与適量とともに投与するのがよい
次に、本発明の実施例を示す。
実施例1 ストレプトコッカス・ピオゲネス (Streptococcus pyogenes) 
ATCC21060をBHI培地100m12に接種し
て37℃、8時間静置培養をおこなって得た種培養液を
第1表に示す培地A1Mに接種し、種培養と同一条件で
嫌気的に前培養を行った。
第1表 培地A マルトース       0.25% 14 肉エキス        1.0% ポリペプトン      1.0% 酵母エキス       0.25% に82PO40,1% MgSO4・7H200,05% NaCQ0.1% PH6,5 111ジャーファーメンタ−に培地A8Qを投入して1
20℃、10分間加熱殺菌後、37℃まで冷却して、前
培養液IIlを接種し、37℃、15.5時間、pH6
,5,50r、p、m、で攪拌しながら嫌気的に培養す
る。
得られた培養液を遠心分離にかけて菌体を除去し、培養
濾液を得た。培養濾液の濃縮方法は次の通り行った。
培養濾液は、分画分子量10,000の限外濾過膜(米
国、ロミコン社)を用いて、 i、sQに濃縮した。
この濃縮液を用いて下記の通り精製した。
濃縮液は、充分冷却しつつ、あらかじめ冷却しておいた
メチルアルコール1.0Qを少量づつ攪拌下に加え、4
時間放置した。この場合、10℃を超え5 ないように処理した。生じた沈澱物は、冷却下遠心分離
機を用いて集め、凍結乾燥した。
得られた溶連菌培養濾液沈澱物は450■であった。
実施例2 実施例1で得られた溶連菌培養濾液沈澱物450■を水
に溶解後、0.01Mリン酸緩衝液で平衡化したハイド
ロキシアパタイトカラムに吸着させ、0.01Mリン酸
緩衝液で充分洗浄後0.1Mリン酸緩衝液で溶出してく
るフラクションをプール後、脱イオン水に対して透析し
、凍結乾燥した。この凍結乾燥標品は抗腫瘍性成分SP
F−PCO−20であり、115■を得た。
実施例3 実施例2で0.1Mリン酸緩衝液でSPF−PCO−2
0を溶離させた後のハイドロキシアパタイトカラムを。
0.1Mリン酸緩衝液で充分洗浄後0.25Mリン酸緩
衝液で溶出してくるフラクションをプール後、脱イオン
水に対して透析し、凍結乾燥した。この凍結乾燥標品は
抗腫瘍性成分SPF−PCO−30であり、86■6 を得た。
実施例4 実施例1〜3で得た溶連菌培養濾液沈澱物(以下、SP
F−PCOという)、SPF−PCO−20及びSPF
−PCO−30のそれぞれをピシバニールと併用してマ
ウスにおける抗腫瘍活性をみた。
ピシバニール(以下、PCBという)(中外製薬(株)
製)については市販品を用い、その0.1KEを投与直
前に上記併用剤溶液と混合して投与した。
インビボにおける抗腫瘍性活性試験は、Crj ;CD
、1 (ICR系、雄性5週齢)マウスを使用した。腫
瘍細胞としては、Sarcoma−180腹水癌細胞を
用い、これを生理食塩水に浮遊させ、マウスの腹腔内に
1×10″’cells/マウス接種した。
癌細胞接種24時間後から、1日1回5日間連続して検
体を腹腔内に投与してその生存数を観察しその結果を第
1表に示す。
なお、延命率ILS (%)は、60日間飼育後、それ
ぞれの条件下における平均生存日数を計算し、コントロ
ールにおける日数で割った値で示している。
17 8−
【図面の簡単な説明】
第1図は、SPF−PCOの紫外線吸収スペクトルを示
し、第2図は同じ< KBr法による赤外線吸収スペク
トルを示し、第3図は抗腫瘍性成分SPF−PCO−2
0の紫外線吸収スペクトルを示し、第4図は同じ< K
Br法による赤外線吸収スペクトルを示し、第5図は、
抗腫瘍性成分SPF−PCO−30の紫外吸収スペクト
ルを示し、第6図は同じ< KBr法による赤外線吸収
スペクトルを示す。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)ストレプトコッカス属菌の培養濾液もしくはその
    限外濾過濃縮液に有機溶剤を添加して得られる沈澱物又
    はこの沈澱物から分離されたSPF−PCO−20もし
    くはSPF−PCO−30、と、ピシバニールとを併用
    して効果的に抗腫瘍活性を高めてなる抗腫瘍剤。
  2. (2)ストレプトコッカス属菌の培養濾液もしくはその
    限外濾過濃縮液に有機溶剤を添加して得られる沈澱物で
    抗腫瘍活性を有するSPF−PCO。
JP1291239A 1989-11-10 1989-11-10 抗腫瘍剤 Pending JPH03184995A (ja)

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