JPS62164629A - 抗腫瘍性成分ｓｐｆ１０−１２及びその製法 - Google Patents
抗腫瘍性成分ｓｐｆ１０−１２及びその製法Info
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- JPS62164629A JPS62164629A JP61004187A JP418786A JPS62164629A JP S62164629 A JPS62164629 A JP S62164629A JP 61004187 A JP61004187 A JP 61004187A JP 418786 A JP418786 A JP 418786A JP S62164629 A JPS62164629 A JP S62164629A
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規な抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２及びそ
の製法に関するものである。
の製法に関するものである。
従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）の生菌体
を弱毒化して製剤化したものは、すてに制癌剤として使
用されている。
を弱毒化して製剤化したものは、すてに制癌剤として使
用されている。
また、溶連菌の菌体を破砕接水または塩類溶液で有効成
分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍性成分を沈澱と
して、回収する方法（特公昭３８−１６４７）、溶連菌
を溶菌酵素リゾチーム、セルラーゼまたは蛋白質分解酵
素により、溶菌し、活性画分を水溶性区分として分画す
る方法（英国特許１１６３８６５号）、溶連菌の菌体を
破砕復水不溶性物質を採取し、核酸分解酵素および蛋白
分解酵素で処理する方法（特開昭５５−７０１４）など
が知られている。
分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍性成分を沈澱と
して、回収する方法（特公昭３８−１６４７）、溶連菌
を溶菌酵素リゾチーム、セルラーゼまたは蛋白質分解酵
素により、溶菌し、活性画分を水溶性区分として分画す
る方法（英国特許１１６３８６５号）、溶連菌の菌体を
破砕復水不溶性物質を採取し、核酸分解酵素および蛋白
分解酵素で処理する方法（特開昭５５−７０１４）など
が知られている。
このように、ストレプトコッカス属細菌そのものもしく
はその菌体成分に抗腫瘍活性があることは広く知られて
いるのであるが、従来知られたものは、菌体もしくは水
溶性もしくは水不溶性高分子細胞構成物質であるに過ぎ
なかった。菌体もしくは菌体内から有効成分を単離しよ
うとすれば、菌体を溶菌したり１機械的に破砕したりし
て全体を分画しなければならなかった。
はその菌体成分に抗腫瘍活性があることは広く知られて
いるのであるが、従来知られたものは、菌体もしくは水
溶性もしくは水不溶性高分子細胞構成物質であるに過ぎ
なかった。菌体もしくは菌体内から有効成分を単離しよ
うとすれば、菌体を溶菌したり１機械的に破砕したりし
て全体を分画しなければならなかった。
このような処理で°は、精製は複雑となり、有効成分の
単離はきわめて困難であった。実際に分離し、有効成分
として測定された例では分子量２００．０００の蛋白質
（特公昭４８−４３８４１、特開昭５ｌ−４４６１７）
及び分子ｆｆ１１５０，０００の糖蛋白質（特開昭５８
−２２０２６）が知られている程度である。
単離はきわめて困難であった。実際に分離し、有効成分
として測定された例では分子量２００．０００の蛋白質
（特公昭４８−４３８４１、特開昭５ｌ−４４６１７）
及び分子ｆｆ１１５０，０００の糖蛋白質（特開昭５８
−２２０２６）が知られている程度である。
本発明者らは、先に溶連菌の培養液中に抗腫瘍性成分を
溶出させる方法を鋭意研究したところ、培養中にペニシ
リン又はその関連物質を添加することによって抗腫瘍性
成分が培養液中に溶出することを見出しく特開昭６０−
３０６７７号）、培養液中から生理活性物質５ＰＦ−１
を分離するに至ったのである。（特開昭６０−３０６８
９号） 本発明者らは、更に、溶連菌の培養濾液中からより有効
な成分を分離する目的で研究したところ。
溶出させる方法を鋭意研究したところ、培養中にペニシ
リン又はその関連物質を添加することによって抗腫瘍性
成分が培養液中に溶出することを見出しく特開昭６０−
３０６７７号）、培養液中から生理活性物質５ＰＦ−１
を分離するに至ったのである。（特開昭６０−３０６８
９号） 本発明者らは、更に、溶連菌の培養濾液中からより有効
な成分を分離する目的で研究したところ。
本発明において、癌化白血球培養細胞Ｌ １２１０（以
下培養細胞Ｌ １２１０という）の生育を阻害し、かつ
、アンスロン硫酸法による呈色反応陽性の画分であるこ
とにより特徴づけられる抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２
を分離するに至った。
下培養細胞Ｌ １２１０という）の生育を阻害し、かつ
、アンスロン硫酸法による呈色反応陽性の画分であるこ
とにより特徴づけられる抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２
を分離するに至った。
本発明の抗腫瘍性成分５ＰＦＬＯ−１２は元素分析、呈
色反応および赤外線吸収スペクトル等から糖を含むペプ
チド様物質と考えられるが、紫外線吸収スペクトルおよ
び赤外線吸収スペクトルから、既知の抗腫瘍性物質とは
、相違する新規な物質と認められるものである。
色反応および赤外線吸収スペクトル等から糖を含むペプ
チド様物質と考えられるが、紫外線吸収スペクトルおよ
び赤外線吸収スペクトルから、既知の抗腫瘍性物質とは
、相違する新規な物質と認められるものである。
本発明は、ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分
ＳＰＦ１０−１２生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性
成分ＳＰＦ１０−１２を採取することを特徴とする抗腫
瘍性成分ＳＰＦ１０−１２の製造法を包含するものであ
る。
ＳＰＦ１０−１２生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性
成分ＳＰＦ１０−１２を採取することを特徴とする抗腫
瘍性成分ＳＰＦ１０−１２の製造法を包含するものであ
る。
本発明においては、ストレプトコッカス属に属する抗腫
瘍性成分ＳＰＦ１０−１２生産菌が広く使用できる。次
に抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２生産菌を記載する。
瘍性成分ＳＰＦ１０−１２生産菌が広く使用できる。次
に抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２生産菌を記載する。
培養液は、肉エキス培地、酵母エキス培地、プレイン・
ハート・インフユージゴン培地（ＢＨＩ培地）等の天然
培地がよく用いられるが、ストレプトコッカス属細菌の
生育に適した培地であれば任意の培地を使用できる。
ハート・インフユージゴン培地（ＢＨＩ培地）等の天然
培地がよく用いられるが、ストレプトコッカス属細菌の
生育に適した培地であれば任意の培地を使用できる。
培養は、ｐ１１５．０〜８．０、好ましくは、６．１〜
７．２であり、培養温度は、３０〜４０℃、好ましくは
、３５〜３７℃であり、嫌気的に静置培養または、攪拌
培養を行なうことができる。
７．２であり、培養温度は、３０〜４０℃、好ましくは
、３５〜３７℃であり、嫌気的に静置培養または、攪拌
培養を行なうことができる。
本発明においては、培養中に適当な時期に、ペニシリン
または、その関連物質を添加することが、抗腫瘍性成分
ＳＰＦ、１０−１２の採取に重要な役割をはだすことに
なる。
または、その関連物質を添加することが、抗腫瘍性成分
ＳＰＦ、１０−１２の採取に重要な役割をはだすことに
なる。
ペニシリンまたは、その関連物質の添加時期は、３５〜
３７℃の培養で、対数増殖期にかかって後、３〜２０時
間の間、特に５〜１０時間が好ましい。その後１〜２０
時間、好ましくは３〜１５時間培養を継続することによ
り、培養中に抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２を多ＨＭ積
させることができる。
３７℃の培養で、対数増殖期にかかって後、３〜２０時
間の間、特に５〜１０時間が好ましい。その後１〜２０
時間、好ましくは３〜１５時間培養を継続することによ
り、培養中に抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２を多ＨＭ積
させることができる。
ペニシリンまたはその関連物質としては、すでに知られ
たペニシリンと類似の作用をもつ関連物質であればいか
なるものでもよいが、ペニシリンＧが普通用いられる。
たペニシリンと類似の作用をもつ関連物質であればいか
なるものでもよいが、ペニシリンＧが普通用いられる。
添加量は、ペニシリンＧで１００〜７０００単位／ｍＱ
、好ましくは、 ３００−５０００単位／ ｍ Ｑ培養
液程度で十分である。
、好ましくは、 ３００−５０００単位／ ｍ Ｑ培養
液程度で十分である。
ストレプトコッカス属細菌のペニシリンまたは、その関
連物質の添加培養によって得られた培養液は遠心分離に
よって菌体を除去し、濾液を得る。
連物質の添加培養によって得られた培養液は遠心分離に
よって菌体を除去し、濾液を得る。
濾液は、硫安を添加し、５０〜９０％飽和度の画分を分
取するか、もしくは、濾液は、限外濾過膜を用いて濃縮
する。
取するか、もしくは、濾液は、限外濾過膜を用いて濃縮
する。
得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２を含む硫安塩析
物は凍結状態で保存することもできる。
物は凍結状態で保存することもできる。
この硫安塩析物から抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２を抽
出するには、塩析物を緩衝液に溶解して用いる。
出するには、塩析物を緩衝液に溶解して用いる。
又、限外濾過膜を用いて得た濃縮液を、そのまま用いる
こともできる。この水溶液をＤＥＡＥセルロースカラム
に吸着させ、燐酸緩衝液を用いて段階的に溶出させ、培
養細胞Ｌ １２１０の生育を阻害する活性画分を分取し
、この活性画分をＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラ
ムに吸着させ、燐酸緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直
線的に上昇させつつ溶出し、その非吸着部分及び塩化ナ
トリウム低濃度部分を分取し、この分画部分を緩衝液に
対して透析し、ゲル濾過材トヨパールＨＷ−５０Ｆカラ
ムに吸着させ、０．ＩＭ ＮａＣＱを含む燐酸緩衝液で
溶出させ、アンスロン硫酸法による呈色反応及び培養細
胞Ｌ１２１０に対する活性を調べる。ここで培養細胞Ｌ
１２１０に対して強い活性を示す画分すなわち、トヨパ
ール１Ｉ１１５０Ｆの排除限界（以下Ｖｏと略す）付近
のアンスロン硫安法による呈色反応でピークを形成する
画分を得る。この画分を濃縮し、トヨパールｌｌｌ＋１
６０Ｆカラムに吸着させ、０．ＩＭ ＮａＣ１を含む燐
酸緩衝液で溶出させる。５ＰＦ１０−１２はトヨパール
Ｈｌｉ１６０Ｆカラムクロマトグラフィーにおいて２８
０ｎｍの吸収が強く、かつアンスロン硫酸法で弱い呈色
を示す画分として得ることが出来る。
こともできる。この水溶液をＤＥＡＥセルロースカラム
に吸着させ、燐酸緩衝液を用いて段階的に溶出させ、培
養細胞Ｌ １２１０の生育を阻害する活性画分を分取し
、この活性画分をＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラ
ムに吸着させ、燐酸緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直
線的に上昇させつつ溶出し、その非吸着部分及び塩化ナ
トリウム低濃度部分を分取し、この分画部分を緩衝液に
対して透析し、ゲル濾過材トヨパールＨＷ−５０Ｆカラ
ムに吸着させ、０．ＩＭ ＮａＣＱを含む燐酸緩衝液で
溶出させ、アンスロン硫酸法による呈色反応及び培養細
胞Ｌ１２１０に対する活性を調べる。ここで培養細胞Ｌ
１２１０に対して強い活性を示す画分すなわち、トヨパ
ール１Ｉ１１５０Ｆの排除限界（以下Ｖｏと略す）付近
のアンスロン硫安法による呈色反応でピークを形成する
画分を得る。この画分を濃縮し、トヨパールｌｌｌ＋１
６０Ｆカラムに吸着させ、０．ＩＭ ＮａＣ１を含む燐
酸緩衝液で溶出させる。５ＰＦ１０−１２はトヨパール
Ｈｌｉ１６０Ｆカラムクロマトグラフィーにおいて２８
０ｎｍの吸収が強く、かつアンスロン硫酸法で弱い呈色
を示す画分として得ることが出来る。
次に、実施例１で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１
２の凍結乾燥標品は、次の理化学的性質を示す。
２の凍結乾燥標品は、次の理化学的性質を示す。
■８元素元析 Ｃ４１，３〜４３．５％■ ５．
９〜６．７％ Ｎ １４．２〜１６．６％ ０ ３７．９〜３１．４％ Ａｓｈ ０．７〜１．８％ ２、分解点 本物質は１６５℃で褐変し２４０℃になる
と黒色となり分解する。
９〜６．７％ Ｎ １４．２〜１６．６％ ０ ３７．９〜３１．４％ Ａｓｈ ０．７〜１．８％ ２、分解点 本物質は１６５℃で褐変し２４０℃になる
と黒色となり分解する。
３、比旋光度〔α〕も’＝−８０°〜−９５’ （Ｃ＝
１．０Ｏ）４、紫外線吸収スペクトル 本物質０．１％
の水溶液の紫外線吸収スペクトルは第１図に示される。
１．０Ｏ）４、紫外線吸収スペクトル 本物質０．１％
の水溶液の紫外線吸収スペクトルは第１図に示される。
５、赤外線吸収スペクトル 第２図に示される。
３３００ｃｍ−１付近及び１６５０ｃｍ−１付近のペプ
チドによる吸収が認められ特徴的である。
チドによる吸収が認められ特徴的である。
６、塩基性、酸性、中性の区別 本物質０．１％の水溶
液のｐＨは５．５〜６．０である。
液のｐＨは５．５〜６．０である。
７、物質の色 淡褐色
８、呈色反応
ローリ−反応 十
ビューレット反応 十
ニンヒドリン反応 十
アンスロン硫酸反応 十
モーリッシュ反応 十
システィン硫酸反応 十
オルシン塩酸反応 −
９、分子量 ゲル濾過法による測定では分子量約１０，
０００〜４０，０００である。
０００〜４０，０００である。
１０、 溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メ
タノール、エタノール、ｎ−プロパノール、アセトン、
エチルエーテル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、酢酸エ
チル等の溶剤には難溶又は不溶である。
タノール、エタノール、ｎ−プロパノール、アセトン、
エチルエーテル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、酢酸エ
チル等の溶剤には難溶又は不溶である。
次にインビトロにおける培養細胞Ｌ １２１０に対する
抗腫瘍性活性の測定方法及びアンスロン硫酸法による呈
色反応の方法を示す。
抗腫瘍性活性の測定方法及びアンスロン硫酸法による呈
色反応の方法を示す。
抗腫瘍活性の測定方法
抗腫瘍活性の測定は、培養細胞Ｌ １２１０の生育阻止
率（ＩＲ％）の測定により行った。
率（ＩＲ％）の測定により行った。
Ｌ １２１０細胞を１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ １６４
０培地（５＋＋＋ｇ／Ｑカナマイシン含有）に懸濁した
。この培養液０．５ｍ１ｌｌをファルコン２０５８チュ
ーブに注加し、細胞数がｌ Ｘ １０’ ｃｅｌｌｓ／
ｔｕｂｅになるようにした。次いでこの培養液に所定
量の標品（抗腫瘍性成分５ＰＦ１０−１２ ）を目的濃
度になるように培養液に溶解した０、５ｍΩを注加して
、３７℃で５％ＣＯ□存在下に培養した。標品を添加し
て４８時間後にトリパンブルーによる染色をおこない１
次式によりＩＲ（％）を算出した。
０培地（５＋＋＋ｇ／Ｑカナマイシン含有）に懸濁した
。この培養液０．５ｍ１ｌｌをファルコン２０５８チュ
ーブに注加し、細胞数がｌ Ｘ １０’ ｃｅｌｌｓ／
ｔｕｂｅになるようにした。次いでこの培養液に所定
量の標品（抗腫瘍性成分５ＰＦ１０−１２ ）を目的濃
度になるように培養液に溶解した０、５ｍΩを注加して
、３７℃で５％ＣＯ□存在下に培養した。標品を添加し
て４８時間後にトリパンブルーによる染色をおこない１
次式によりＩＲ（％）を算出した。
ここで（Ａ）とは対照群の生細胞数を示す。
対照は標品を含まない培養液０．５＋ｎＱを用い同時に
行った。
行った。
アンスロン硫酸法による呈色反応
脱イオン水に溶解し目的濃度にした標品１ｍＱに２ｍ１
２のアンスロン試薬（０，２０ｇｒのアンスロンを１０
０ｍＱの濃硫酸に溶解したもの）を注加し、混合３０分
後、標品１ＨＩＱに代えて脱イオン水１ｍＱに２ｍ、Ｉ
２のアンスロン試薬を注加した液を対照として６２０ｎ
ｍで吸収を測定する。定量値はグルコースを用いて同様
に測定して得た検量式より求める。
２のアンスロン試薬（０，２０ｇｒのアンスロンを１０
０ｍＱの濃硫酸に溶解したもの）を注加し、混合３０分
後、標品１ＨＩＱに代えて脱イオン水１ｍＱに２ｍ、Ｉ
２のアンスロン試薬を注加した液を対照として６２０ｎ
ｍで吸収を測定する。定量値はグルコースを用いて同様
に測定して得た検量式より求める。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１
ストレプトコッカス・ピオゲネス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）
ＡＴＣＣ２１０６０をＢＨＩ培地Ｌｏｏｍ Ｑに接種し
て３７℃、８時間静置培養をおこなって得た種培養液を
第１表に示す培地ＡＩＱに接種し、種培養と同一条件で
嫌気的に前培養を行った・ 第１表 培地Ａ マルトース ０．２５％肉エキス
１．０％ ポリペプトン １．０％ 酵母エキス ０．２５％酸性第一燐酸
カリウム ０．１％ 硫酸マグネシウム ０．０５％ｐＨ＝６．８ １０Ｑジャーファーメンタ−に培地Ａ８Ｑを投入して１
２０℃、１０分間加熱殺菌後、３７℃まで冷却して、前
培養液ＩＱを接種し、３７℃、１５．５時間、１）１１
６．８．３００回転／分で攪拌しながら嫌気的に培養す
る。次いでペニシリンａ ｒｏｏｏｔｌｔ位／ ｍ Ｑ
培養液になるように添加して、培養を更に５時間継続し
た。
ＡＴＣＣ２１０６０をＢＨＩ培地Ｌｏｏｍ Ｑに接種し
て３７℃、８時間静置培養をおこなって得た種培養液を
第１表に示す培地ＡＩＱに接種し、種培養と同一条件で
嫌気的に前培養を行った・ 第１表 培地Ａ マルトース ０．２５％肉エキス
１．０％ ポリペプトン １．０％ 酵母エキス ０．２５％酸性第一燐酸
カリウム ０．１％ 硫酸マグネシウム ０．０５％ｐＨ＝６．８ １０Ｑジャーファーメンタ−に培地Ａ８Ｑを投入して１
２０℃、１０分間加熱殺菌後、３７℃まで冷却して、前
培養液ＩＱを接種し、３７℃、１５．５時間、１）１１
６．８．３００回転／分で攪拌しながら嫌気的に培養す
る。次いでペニシリンａ ｒｏｏｏｔｌｔ位／ ｍ Ｑ
培養液になるように添加して、培養を更に５時間継続し
た。
得られた培養液を遠心分離にかけて菌体を除去した。
培養濾液は、分画分子量１０，０００の限外濾過膜（米
国、ロミコン社）を用いて、１．５Ｑに濃縮した。
国、ロミコン社）を用いて、１．５Ｑに濃縮した。
この濃縮液を、ＤＥＡＥセルロースカラム（５Ｘ ７０
ｃｍ）に吸着させた後、 １１０１ｕ、ｐ）１７．０の
燐酸緩衝液を用いて、洗浄し１次いで０．３Ｍ塩化ナト
リウムを含む上記燐酸緩衝液を用いて、段階的に溶出さ
せ、アンスロン硫酸法による呈色反応陽性でかつ培養細
胞Ｌ１２１０の生育を阻害する活性画分を分取した。
ｃｍ）に吸着させた後、 １１０１ｕ、ｐ）１７．０の
燐酸緩衝液を用いて、洗浄し１次いで０．３Ｍ塩化ナト
リウムを含む上記燐酸緩衝液を用いて、段階的に溶出さ
せ、アンスロン硫酸法による呈色反応陽性でかつ培養細
胞Ｌ１２１０の生育を阻害する活性画分を分取した。
この活性画分をＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラム
（７，５Ｘ ５０ｃｍ）に吸着させ、次いで上記燐酸緩
衝液で洗浄後塩化ナトリウム濃度を直線的に上昇させて
溶出を行い、培養細胞Ｌ １２１０に対して活性のある
部分を分取する。この溶出曲線は第３図に示される。第
３図において点線部分は非吸着部分で、実線部分は塩化
ナトリウム添加部分である。
（７，５Ｘ ５０ｃｍ）に吸着させ、次いで上記燐酸緩
衝液で洗浄後塩化ナトリウム濃度を直線的に上昇させて
溶出を行い、培養細胞Ｌ １２１０に対して活性のある
部分を分取する。この溶出曲線は第３図に示される。第
３図において点線部分は非吸着部分で、実線部分は塩化
ナトリウム添加部分である。
Ａは培養細胞Ｌ １２１０生育阻害活性画分で、ＭＰ−
２（特開昭１３０−３０６８９）生育阻害非活性画分で
あり、Ｂは培養細胞Ｌ １２１０生育阻害非活性画分で
、ＭＰ−２生育阻害活性画分である。
２（特開昭１３０−３０６８９）生育阻害非活性画分で
あり、Ｂは培養細胞Ｌ １２１０生育阻害非活性画分で
、ＭＰ−２生育阻害活性画分である。
Ａの活性画分の溶出液を分画分子量１０，０００の限外
濾過膜（ミリボア社）で３０ｍ Ｑに濃縮する。この濃
縮液をトヨパールＨ１ｉ１５０Ｆカラム（５，ＯＸ １
００ｃｍ）に吸着させ、次いで、上記燐酸緩衝液中に塩
化ナトリウム０．１Ｍを含む溶液で溶出させ、アンスロ
ン硫酸法による呈色反応陽性の画分を分取した。この溶
出曲線は第４図に示される。第４図において実線は全体
の溶出曲線を示し、点線はアンスロン硫酸法による呈色
反応陽性部分の溶出曲線を示している。ここでＣはアン
スロン硫酸法による呈色反応陽性画分であるが、培養細
胞Ｌ１２１０に対する生育阻止活性を調べ活性の強いＶ
ｏ付近の、アンスロン硫酸法でピークを形成するＤ画分
を得る。Ｄ画分は凍結乾燥する。この凍結乾燥標品を溶
解しトヨパールＨＷ６０Ｆカラム（２，６Ｘ １００ｃ
ｍ）に吸着させ次いでトヨパール１ｌＷ５０Ｆの場合と
同じ溶出液で溶出する。
濾過膜（ミリボア社）で３０ｍ Ｑに濃縮する。この濃
縮液をトヨパールＨ１ｉ１５０Ｆカラム（５，ＯＸ １
００ｃｍ）に吸着させ、次いで、上記燐酸緩衝液中に塩
化ナトリウム０．１Ｍを含む溶液で溶出させ、アンスロ
ン硫酸法による呈色反応陽性の画分を分取した。この溶
出曲線は第４図に示される。第４図において実線は全体
の溶出曲線を示し、点線はアンスロン硫酸法による呈色
反応陽性部分の溶出曲線を示している。ここでＣはアン
スロン硫酸法による呈色反応陽性画分であるが、培養細
胞Ｌ１２１０に対する生育阻止活性を調べ活性の強いＶ
ｏ付近の、アンスロン硫酸法でピークを形成するＤ画分
を得る。Ｄ画分は凍結乾燥する。この凍結乾燥標品を溶
解しトヨパールＨＷ６０Ｆカラム（２，６Ｘ １００ｃ
ｍ）に吸着させ次いでトヨパール１ｌＷ５０Ｆの場合と
同じ溶出液で溶出する。
この溶出曲線は第５図に示される。第５図において実線
は全体の溶出曲線を示し、黒丸付の実線はアンスロン硫
酸法による呈色反応陽性部分の溶出曲線を示している。
は全体の溶出曲線を示し、黒丸付の実線はアンスロン硫
酸法による呈色反応陽性部分の溶出曲線を示している。
ここでアンスロン硫酸法による呈色反応で強い呈色を示
すＦの画分を５ＰＦ１０−１１とし、Ｇの画分をＳＰＦ
１０−１２とした。
すＦの画分を５ＰＦ１０−１１とし、Ｇの画分をＳＰＦ
１０−１２とした。
Ｇの画分を凍結乾燥した。この凍結乾燥標品は抗腫瘍性
成分ＳＰＦ１０−１２であり、０ 、６８ｇｒを得た。
成分ＳＰＦ１０−１２であり、０ 、６８ｇｒを得た。
実施例２
ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは３００単位／ｒｔｒＱ培
養液となるように添加し、更に培養を１０時間継続した
。この培養濾液に硫安を添加し５０〜９０％飽和度の画
分を分取する。
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは３００単位／ｒｔｒＱ培
養液となるように添加し、更に培養を１０時間継続した
。この培養濾液に硫安を添加し５０〜９０％飽和度の画
分を分取する。
透析により硫安を除き実施例１と同様に精製して抗腫瘍
性成分ＳＰＦ１０−１２０，３４ｇｒを得た。
性成分ＳＰＦ１０−１２０，３４ｇｒを得た。
実施例３
ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは３０００単位／ＨＱ培養
液となるように添加し、更に培養を３時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１２０，７３ｇｒを得た。
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは３０００単位／ＨＱ培養
液となるように添加し、更に培養を３時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１２０，７３ｇｒを得た。
実施例４
ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第２表に示した培地Ｂを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ＨＱ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１２０，４６ｇｒを得た。
第２表に示した培地Ｂを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ＨＱ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１２０，４６ｇｒを得た。
第２表 培地Ｂ
マルトース ０．１％肉エキス
０．５％ポリペプトン １
．０％ 酵母エキス ０．２５％塩化ナトリウム
０．１％ ｐＨ＝７．２ 実施例５ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第３表に示した培地Ｃを用いて実施例１と同様に３５℃
で培養した。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／
ｒａｉｌ培養液となるように添加し、更に培養を５時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製して抗
１１！［癌性成分ＳＰＦ１０−１２０，３２ｇｒを得た
。
０．５％ポリペプトン １
．０％ 酵母エキス ０．２５％塩化ナトリウム
０．１％ ｐＨ＝７．２ 実施例５ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第３表に示した培地Ｃを用いて実施例１と同様に３５℃
で培養した。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／
ｒａｉｌ培養液となるように添加し、更に培養を５時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製して抗
１１！［癌性成分ＳＰＦ１０−１２０，３２ｇｒを得た
。
第３表 培地Ｃ
マルトース ０．１％肉エキス
Ｏ，Ｓ％ ポリペプトン ０．５％ カザミノ酸 ０．３％ 酵母エキス ０．５％ 酸性第一燐酸カリウム ０．１％ 硫酸マグネシウム ０．０５％ｐＨ＝６．５ 実施例６ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第４表に示した培地りを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧはｔｏｏｏ単位／ｍＱ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１２０，２９ｇｒを得た。
Ｏ，Ｓ％ ポリペプトン ０．５％ カザミノ酸 ０．３％ 酵母エキス ０．５％ 酸性第一燐酸カリウム ０．１％ 硫酸マグネシウム ０．０５％ｐＨ＝６．５ 実施例６ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第４表に示した培地りを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧはｔｏｏｏ単位／ｍＱ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１２０，２９ｇｒを得た。
第４表 培地Ｄ
マルトース ０．２５％カザミノ酸
０．３％酵母エキス
１．０％ 酸性第一燐酸カリウム ０．１％ 硫酸マグネシウム ０．０５％ｐＨ＝６．９ 実施例７ ストレプトコッカス・エスピーＡＴＣＣ２１５９７を第
１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養した
。この場合、ペニシリンＧはｔｏｏｏ単位／ｌｎＱ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分５
ＰＦ１０−１２０．５５ｇｒを得た。
０．３％酵母エキス
１．０％ 酸性第一燐酸カリウム ０．１％ 硫酸マグネシウム ０．０５％ｐＨ＝６．９ 実施例７ ストレプトコッカス・エスピーＡＴＣＣ２１５９７を第
１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養した
。この場合、ペニシリンＧはｔｏｏｏ単位／ｌｎＱ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分５
ＰＦ１０−１２０．５５ｇｒを得た。
実施例８
ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１５４６を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍΩ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１２０，６１ｇｒを得た。
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍΩ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１２０，６１ｇｒを得た。
実施例９
ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１５４７を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１２０，６４ｇｒを得た。
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１２０，６４ｇｒを得た。
実施例１０
ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１５４８を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
たにの場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ培養液
となるように添加し、更に培養を５時間継続した。この
培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分ＳＰ
Ｆ１０−１２０，４８ｇｒを得た。
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
たにの場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ培養液
となるように添加し、更に培養を５時間継続した。この
培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分ＳＰ
Ｆ１０−１２０，４８ｇｒを得た。
実施例１１
ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、セファロスポリンＣは６００μｇ ／
ｍ Ｑ培養液となるように添加し、更に培養を５時間継
続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫
瘍性成分ＳＰＦ１０−１２０，６４ｇｒを得た。
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、セファロスポリンＣは６００μｇ ／
ｍ Ｑ培養液となるように添加し、更に培養を５時間継
続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫
瘍性成分ＳＰＦ１０−１２０，６４ｇｒを得た。
実験例１
実施例１で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２のイ
ンビトロにおける抗腫瘍活性試験は、本文中に記載した
抗腫瘍活性の測定方法により行い、その結果を第５表に
示す。
ンビトロにおける抗腫瘍活性試験は、本文中に記載した
抗腫瘍活性の測定方法により行い、その結果を第５表に
示す。
第５表 ＳＰＦ１０−１２の抗腫瘍活性の結果ＳＰＦ１
０−１２（ｍｇ／ｍＱ） ＩＲ％０．５
８７．９ ０．２５ ５６．１ ０、１２５ ３２．６ 実験例２ 実施例１で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２のイ
ンビボにおける抗腫瘍活性試験は、Ｃｒｊ ； ＣＤ−
１（ＩＣＲ系、雌性７週齢）マウスを使用して実施した
。腫瘍細胞としては、Ｓａｒｃｏｍｓ−１８０腹水癌細
胞を用いこれを生理食塩水に浮遊させ、マウスの腹腔内
に５ Ｘ １０’ ｃｅｌｌｓ／マウス接種した。
０−１２（ｍｇ／ｍＱ） ＩＲ％０．５
８７．９ ０．２５ ５６．１ ０、１２５ ３２．６ 実験例２ 実施例１で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２のイ
ンビボにおける抗腫瘍活性試験は、Ｃｒｊ ； ＣＤ−
１（ＩＣＲ系、雌性７週齢）マウスを使用して実施した
。腫瘍細胞としては、Ｓａｒｃｏｍｓ−１８０腹水癌細
胞を用いこれを生理食塩水に浮遊させ、マウスの腹腔内
に５ Ｘ １０’ ｃｅｌｌｓ／マウス接種した。
癌細胞接種２４時間後から、１日１回５日間連続してＳ
ＰＦ １０−１２を腹腔内に投与してその生存数を［１
しその結果を第６表に示す。
ＰＦ １０−１２を腹腔内に投与してその生存数を［１
しその結果を第６表に示す。
第６表 ＳＰＦ１０−１２の抗腫瘍活性−マウスの生存
数日数 ０ １０ １５ ２０ ２５ ３０コン
トロール ８／８ ６／８ ０／８ ０／８
０／８ ０／８ＳＰＦＩＯ−１２（０，９ｍｇ／マウス
＞ ８／８ ８／８ ７／８ ６／
８ ６／８ ５／８
数日数 ０ １０ １５ ２０ ２５ ３０コン
トロール ８／８ ６／８ ０／８ ０／８
０／８ ０／８ＳＰＦＩＯ−１２（０，９ｍｇ／マウス
＞ ８／８ ８／８ ７／８ ６／
８ ６／８ ５／８
第１図は抗腫瘍性成分ＳＰＦ］、０−１２の紫外線吸収
スペクトルを示し、第２図は同じく赤外線吸収スペクト
ルを示す。第３図は実施例１における活性画分のＤＥＡ
ＥセファデックスＡ−２３６５カラムの７容出曲線を示
す図で、第４図はこのＡ画分をトヨパール１ｌＷ６０Ｆ
カラムに吸着させ、０．ＩＭ ＮａＣΩ含有燐酸緩衝液
による溶出曲線を示す図で、第５図はこのＤ画分をトヨ
パール１ｌＷ６０Ｆカラムに吸着させ、０．ＬＭ Ｎａ
ＣΩ含有燐酸緩衝液による溶出曲線を示す。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 第 ３ 図 第 ４ 図 第 ５ 図
スペクトルを示し、第２図は同じく赤外線吸収スペクト
ルを示す。第３図は実施例１における活性画分のＤＥＡ
ＥセファデックスＡ−２３６５カラムの７容出曲線を示
す図で、第４図はこのＡ画分をトヨパール１ｌＷ６０Ｆ
カラムに吸着させ、０．ＩＭ ＮａＣΩ含有燐酸緩衝液
による溶出曲線を示す図で、第５図はこのＤ画分をトヨ
パール１ｌＷ６０Ｆカラムに吸着させ、０．ＬＭ Ｎａ
ＣΩ含有燐酸緩衝液による溶出曲線を示す。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 第 ３ 図 第 ４ 図 第 ５ 図
Claims (4)
- （１）下記の理化学的性質を有する抗腫瘍性成分ＳＰＦ
１０−１２。 １、元素元析 Ｃ ４１．３〜４３．５％ Ｈ ５．９〜６．７％ Ｎ １４．２〜１６．６％ Ｏ ３７．９〜３１．４％ Ａｓｈ １０．７〜１．８％ ２、分解点 本物質は１６５℃で褐変し２４０℃になる
と黒色となり分解する。 ３、比旋光度〔α〕＾２＾０＿Ｄ＝−８０°〜−９５°
（Ｃ＝１．００）４、紫外線吸収スペクトル 本物質０
．１％の水溶液の紫外線吸収スペクトルは第１図に示さ
れる。 ５、赤外線吸収スペクトル 第２図に示される。 ３３００ｃｍ＾−＾１付近および１６５０ｃｍ＾−＾１
付近のペプチドによる吸収が認められ特徴的である。 ６、塩基性、酸性、中性の区別 本物質０．１％の水溶
液のｐＨは５．５〜６．０である。 ７、物質の色 淡褐色 ８、呈色反応 ローリー反応 ＋ ビューレット反応 ＋ ニンヒドリン反応 ＋ アンスロン硫酸反応 ＋ モーリッシュ反応 ＋ システイン硫酸反応 ＋ オルシン塩酸反応 − ９、分子量 ゲル濾過法による測定では分子量約１０，
０００〜４０，０００である。 １０、溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノ
ール、エタノール、ｎ−プロパノール、アセトン、エチ
ルエーテル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル
等の溶剤には、難溶又は不溶である。 - （２）ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分ＳＰ
Ｆ１０−１２生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性成分
ＳＰＦ１０−１２を採取することを特徴とする抗腫瘍性
成分ＳＰＦ１０−１２の製法。 - （３）ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分ＳＰ
Ｆ１０−１２生産菌を培養するに際し、培養中の適当な
時期にペニシリン又はその関連物質を添加して培養する
ことを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍
性成分ＳＰＦ１０−１２の製法。 - （４）ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分ＳＰ
Ｆ１０−１２生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性成分
ＳＰＦ１０−１２を採取するに当たり、培養細胞Ｌ１２
１０の生育を阻害し、又は／及びアンスロン硫酸法によ
る呈色反応陽性の画分を分取することを特徴とする特許
請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１
２の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61004187A JPS62164629A (ja) | 1986-01-14 | 1986-01-14 | 抗腫瘍性成分ｓｐｆ１０−１２及びその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61004187A JPS62164629A (ja) | 1986-01-14 | 1986-01-14 | 抗腫瘍性成分ｓｐｆ１０−１２及びその製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62164629A true JPS62164629A (ja) | 1987-07-21 |
| JPH0571232B2 JPH0571232B2 (ja) | 1993-10-06 |
Family
ID=11577701
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61004187A Granted JPS62164629A (ja) | 1986-01-14 | 1986-01-14 | 抗腫瘍性成分ｓｐｆ１０−１２及びその製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62164629A (ja) |
-
1986
- 1986-01-14 JP JP61004187A patent/JPS62164629A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0571232B2 (ja) | 1993-10-06 |
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