JPS63101392A - 抗腫瘍性成分ｓｐｆ−ｐｃｏ−３０ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣ：０−３０及
びその製法に関するものである。

従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）の生菌体
を弱毒化して製剤化したものは、すてに製癌剤として使
用されている。

また、溶連菌の菌体を破砕後、水または塩類溶液で有効
成分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍性成分を沈澱
として回収する方法（特公昭３８−１６４７）、溶連菌
を溶菌酵素、リゾチーム、セルラーゼまたは蛋白質分解
酵素により溶菌し、活性画分を水溶性成分として分画す
る方法（英国特許１１６３８６５号）、溶連菌の菌体を
破砕後水不溶性物質を採取し、核酸分解酵素および蛋白
分解酵素で処理する方法（特開昭５５−７０１４）など
が知られている。

このように、ストレプトコッカス属細菌そのものもしく
はその菌体成分に、式腫瘍活性があることは広く知られ
ているのであるが、従来知られたものは、菌体もしくは
菌体内成分であり、有効成分として測定された例では分
子量２００，０００の蛋白質（特公昭４８−４３８４１
、特開昭５ｌ−４４６１７）及び分子量１５０，０００
の糖蛋白質（特開昭５８−２２０２６）が知られている
程度である。

また、ストレプトコッカス属細菌は抗腫瘍性成分を菌体
外に出さないものとして知られてきた。

（Ｈ，Ｏｋａｍｏｔｏ、　Ｓ、　５ｈｏｉｎ、　Ｓ、　
Ｋｏｓｈｉｍｕｒａ。

５ｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ　　Ｓ−ｆｏｒｍｉｎｇ　　
ａｎｄ　　ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
　ｏｆ　Ｇｒｏｕｐ　Ａ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、
　Ｉｎ“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｔｏｘｉｎｓ　ａｎｄ　
Ｃｅ１ｌ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、”　ｅｄ。

Ｊ、　Ｊｅｌｊａｚｅｗｉｃｚ　ａｎｄ　Ｔ、　ＩＮａ
ｄｓｔｒ６ｍ、　ｐｐ、２５９−２８９゜Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、
５ａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、１９７ｇ）。

本発明者らは、先に溶連菌の培養液中に抗腫瘍性成分を
溶出させる方法を鋭意研究したところ、培養中にペニシ
リン又はその関連物質を添加することによって抗腫瘍性
成分が培養液中に溶出することを見出しく特開昭６０−
３０６７７号）、培養液中から生理活性物質ＳＰＦ−１
（特開昭６０−３０６８９号）及びＳＰＦ−１４０（特
開昭６ｌ−６９７２５）を分離するに至ったのである。

本発明者らは、更に、溶連菌の培養濾液中から簡単に、
より有効な成分を分離する目的で研究したところ、培養
中にペニシリン又はその関連物質を添加しても、しなく
ても、培養物中に新たな抗腫瘍性成分が存在することを
確認し、この新規抗腫瘍性成分をＳＰＦ−ＰＣＯ−３０
と命名し、本発明を完成するに至った。

本発明の抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０（以下、単
にＳＰＦ−ＰＣＯ−３０ということもある）は培養細胞
Ｊ７７４−１の生育を阻害する画分であることにより特
徴づけることもできる。

また、本発明は、ペニシリン又はその関連物質を添加し
なくてもよいため、ペニシリン又はその関連物質に要す
るコストの低減、ペニシリン又はその関連物質添加後に
要する培養時間の短縮、さらにペニシリンを用いないた
め、製品中に混入した場合生じる可能性のあるペニシリ
ンショックを防ぐなどの利点の他、ペニシリン又はその
関連物質の添加による、抗腫瘍性活性成分以外の余分の
菌体成分の混入が減少し、簡単に精製出来るなど多くの
利点を有する。

また、ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０の精製は、培養濾液もしく
はその限外濾過濃縮液に、メタノール、エタノール等の
アルコール類または、アセトン等の有機溶剤を添加する
とき培養細胞Ｊ７７４−１で測定されるほとんどの活性
が効果的に少量の沈澱物として得られ、その沈澱物を、
ハイドロキシアパタイトに吸着させ、０．１Ｍリン酸緩
衝液で洗浄後０．２５Ｍリン酸緩衝液で溶出させるだけ
で著じるしく簡潔に゛行うことができるものである。

本発明の抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０は、元素分
析、呈色反応、および赤外線吸収スペクトル、電気泳動
等から糖を含むペプチド様物質と考えられるが。

紫外線吸収スペクトルおよび赤外線吸収スペクトルから
、既知の抗腫瘍性物質とは相違する新規な成分と認めら
れるものである。

本発明は、ストレプトコッカス属に屈する抗腫瘍性成分
ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０生産菌を培養し、培養物から抗腫
瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０を採取することを特徴と
する抗Ｍｇｌ瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０の製造法を
包含するものである。

本発明においては、ストレプトコッカス属に属する抗腫
瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０生産菌が広く使用できる
。

次に抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０生産菌の例を記
載する６ 培養液は、肉エキス培地、酵母エキス培地、プレイン・
ハート・インフュージョン培地（ＢＨＩ培地）等の天然
培地がよく用いられるが、ストレプトコッカス属細菌の
生育に適した培地であれば任意の培地を使用できる。

培養Ｐ）１は、５．０〜８．０、好ましくは、６．１〜
７．２であり、温度は３０〜４０℃、好ましくは３５℃
〜３７℃であり、嫌気的に静置培養または、撹拌培養を
行うことができる。

培養時間は、対数増殖期にかかって後１〜３０時間、好
ましくは２〜２０時間である。

培養液は遠心分離によって菌体を除去し、濾液を得る。

濾液は、硫安を添加し５０〜９０％飽和度の画分とし濃
縮するか、もしくは限外濾過膜を用いて濃縮することも
できる６ 得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０を含む濃縮
液は、凍結状態で保存することもできる。

抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０は、培養濾液もしく
は濃縮液に、メタノール、エタノール等のアルコール類
、アセトン等の有機溶媒を添加することにより沈澱物と
して得られる。

メタノール、エタノール等のアルコール類又はアセトン
等の有機溶媒は、培養濾液又は濃縮液１部に対して０．
６５〜３部、好ましくは０．６５〜１．５部撹拌しなが
ら添加する。その場合抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣ：０−
３０を含む沈澱物は、遠心分難により分離できる。

このようにして得た沈澱物は、水もしくはＢ衝液に溶解
し、ハイドロキシアパタイトに吸着させ、０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液で充分洗浄後０．２５Ｍリン酸緩衝液で溶出
させるとき、抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０を得る
ことができる。

次に、実施例１で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ
−３０の凍結乾燥標品は次の理化学的性質を示す。

抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０の理化学的性質１、
元素分析 Ｃ３７，１〜３９．３ Ｈ５，４〜　６．４ Ｎ　　　　３．５〜４．８ ０　　５０．５〜４５．７ Ａｓｈ　　　　３．５〜３．８ ２、分解点 本物質は１８５℃で褐変し、２５５℃になると黒色とな
り分解する。

３、比旋光度 〔α〕２０Ｄ＝３０°〜８０ａ（Ｃ＝１．００）４、紫
外線吸収スペクトル 本物質の水溶液の紫外線吸収スペクトルは第１図に示さ
れる。

５、赤外線吸収スペクトル 第２図に示される。

６、塩基性、酸性、中性の区別 本物質の０．１％の水溶液のｐＨは５．５〜５．８であ
る。

７、物質の色 白ないし微黄色 ８、呈色反応 ローリ−反応　　　　　　十 ビューレット反応　　　　十 ニンヒドリン反応　　　　十 アンスロン硫酸反応　　　十 システィン硫酸反応　　　十 オルシン反応　　　　　　− ９、分子量 ゲル濾過法による測定では、分子量１０，０００以上で
ある。

１０、陰イオン交換体に対する挙動 ハイドロキシアパタイトに吸着され、 ０．２５Ｍリン酸緩衝液により溶出される。

１１、溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノール、エタノール、ｎ−プロ
パノール、アセトン、エチルエーテル、ｎ−ヘキサン、
クロロホルム、酢酸エチル等の溶剤には、憇溶又は不溶
である。

１２、温度に対する安定性 本物質の水溶液は、４５℃、３０分の加熱によリインビ
トロで測定される抗腫瘍性活性を保持する。

１３、蛋白質分解酵素に対する安定性 本物質は、トリプシンによる処理後もインビトロで測定
される抗腫瘍性活性において活性保持する。しかし、プ
ロナーゼによる処理後は抗腫瘍活性がやや低下する。

１４、３　Ｄ　Ｓアクリルアミドゲル電気泳動で糖と蛋
白に分離するのが確認される。

次にインビトロにおける培養細胞Ｊ７７４−１に対する
抗腫瘍性活性の測定方法を示す。

培養細胞Ｊ７７４−１による抗腫瘍性活性の測定方法（
Ａ）培養細胞Ｊ７７４−１の生育阻止率（ＩＲ％）の測
定により行う方法 標品（抗Ｉｌ！を癌性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−２０）を目
的濃度になるように生理食塩水に溶解しファルコン社製
平底９６穴プレート（Ｎα３０７２）　２０μＱ注加し
、２段階希釈法により生理食塩水で希釈した。

別に、Ｊ７７４−１細胞を１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭ１１
６４０培地（８０■／Ｑカナマイシン含有に懸濁し、そ
の細胞懸濁液２００μΩを上記プレートの各穴に注加し
、細胞数Ｉ　Ｘ　１０’ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるよ
うにした。このプレートは３７℃で５％ＣＯ２存在下培
養した。

７２時間後、上澄を完全に除去し、メチルアルコールを
加えることによって、細胞をプレート底に固定させた。

３０分後メチルアルコールを除去し、ＰＢＳ（−）に溶
解した０、０５％メチレンブルーを加え細胞を染色した
。この場合、生細胞のみがメチレンブルー色素を取り込
む。１時間後染色液を除去しＰＢＳ（−）で３回ウェル
を洗浄した後、３％）ＩＣＩＩＩを用いて細胞内の色素
を抽出した。この抽出液は、６６５ｎｍの吸収値（ＯＤ
−ｓｓと略す）を測定し、次式を用いて生育阻止率（Ｉ
Ｒ％）を算出した。以下この方法をｄｙｅ　ｕｐｔａｋ
ｅ　ｍｅｔｈｏｄと略す。

ここで対照群は、標品を含まないウェルの平均値を示す
。

（Ｂ）検鏡による膨化活性の測定 （Ａ）において、７２時間後Ｊ７７４−１細胞について
ｄｙｅｕｐｔａｋｅ　ｍｅｔｈｏｄを行う前に倒立顕微
鏡で形態観察を行った。

標品を含む群は、Ｊ７７４−１細胞に明細な膨化が観察
された。膨化の度合は、メチレンブルーによる色素取り
込み（ｄｙｅ　ｕｐｔａｋｅ　ｍｅｔｈｏｄ）で求めら
れるＩＲ％とよく一致し、膨化の認められる最少濃度を
標品の最少生育阻止濃度（ＭＩＣ）とした。よって、簡
単に行うため検鏡で認められる膨化によって示される阿
ＩＣとした。

実施例１ ストレプトコッカス・ピオゲネス （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎａｓ）　
ＡＴＣＣ２１０６０をＢＨＩ培地培地１００屹Ｑ種して
３７℃、８時間静置培養をおこなって得た種培養液を第
１表に示す培地ＡＩＱに接種し、種培養と同一条件で嫌
気的に前培養を行った。

第１表　培地Ａ マルトース　　　　　　　　０．２５％肉エキス　　　
　　　　　　１．０％ ポリペプトン　　　　　　　１．０％ 酵母エキス　　　　　　　　０．２５％ＫＨ２ＰＯ４０
，１％ ＭｇＳＯ４・７１（２００，０５％ ＮａＣ４０，１％ ｐＨ６，５ １０Ｑジャーファーメンタ−に培地Ａ８Ｑを投入して１
２０℃、１０分間加熱殺菌後、３７℃まで冷却して、前
培養液ＩＱを接種し、３７℃、１５．５時間、ｐＨ６，
５，５Ｏｒ、ｐ、ｍ、で撹拌しながら嫌気的に培養する
。

得られた培養液を遠心分離にかけて菌体を除去し、培養
濾液を得た。培養濾液の濃縮方法は次の通り行った。

培養濾液は、分画分子量１０　、０００の限外濾過膜（
米国、ロミコン社）を用いて、１．５Ｑに濃縮した。

この濃縮液を用いて下記の通り精製した。

濃縮液は、充分冷却しつつ、あらかじめ冷却しておいた
エチルアルコール１．ＯＱを少量づつ撹拌下に加え、４
時間放置した。生じた沈澱物は、遠心分離機を用いて集
め、凍結乾燥した。凍結乾燥標品は、　０．１Ｍリン酸
緩衝液に溶解し、０．１Ｍリン酸緩衝液で平衡化したハ
イドロキシアパタイトカラムに吸着させ、０．１Ｍリン
酸緩衝液で充分洗浄後０．２５阿リン酸緩衝液で溶出し
てくるフラクションをプール後、脱イオン水に対して透
析し、凍結乾燥した。この凍結乾燥標品は抗腫瘍性成分
ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０であり、８６ｍｇを得た。

実施例２ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第２表に示した培地Ｂを用いて実施例１と同様に培養し
た。培養濾液の濃縮方法、及び精製方法は、実施例１と
同様に行ない抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０をｌｏ
Ｏｍｇ得た。

第２表　培地Ｂ グルコース　　　　　　　　０．３％ プロテオースペプトン　　　０．５％ 酵母エキス　　　　　　　　０．２５％ＫＨ２Ｐ０．　
　　　　　　　　　０．１％ＭｇＳＯ４・７１（，００
，０５％ ＮａＣＱ　　　　　　　　　　　　Ｏ，１％ｐＨ６，５ 実施例３ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第３表に示した培地Ｃを用いて実施例−１と同様に培養
した。

この場合培養は４０℃、６時間、　ＰＨ６，０で撹拌し
ながら行なった。培養濾液の濃縮方法及び精製方法は実
施例１に示す方法で行ったが、エチルアルコール１．０
Ｑに代えてメチルアルコール１．５２用いた。

ここで得た抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０は９０ｍ
ｇであった。

第３表　培地Ｃ マルトース　　　　　　　　０．２５％肉エキス　　　
　　　　　　０．５％ ポリペプトン　　　　　　　０．５％ 酵母エキス　　　　　　　　０．２５％ＫＨ２Ｐ０．　
　　　　　　　　　０．０１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ，ＯＯ
，００５％ ＮａＣ９０，１％ ＰＨ６，０ 実施例４ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第４表に示した培地りを用いて実施例１と同様に培養し
た。

この場合培養は３０℃、２０時間、　ｐＨ７，０で撹拌
しながら行なった。

第４表　培地Ｄ グルコース　　　　　　　　　０．５％カザミノ酸　　
　　　　　　０．５％ 酵母エキス　　　　　　　　０．２５％に８２Ｐ０．　
　　　　　　　　　０．１％Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ，
ＯＯ，０５％ＮａＣＱ、０．１％ ｐＨ７，０ 培養濾液の濃縮方法及び精製方法は実施例１に示す方法
で行ったが、エチルアルコール１．０Ｑに代えてエチル
アルコール３．０Ｑ用いた。ここで得た抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ−ＰＣＯ−３０は１０７ｍｇであった。

実施例５ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第５表に示した培地Ｅを用いて実施例１と同様に培養し
た。

この場合培養は３７℃、１０時間、ＰＨ６，５で撹拌し
ながら行なった。

第５表　培地Ｅ フラグドース　　　　　　　０．３％ ポリペプトン　　　　　　１°０％ 酵母エキス　　　　　　　　０．５％ ＫＨ，ＰＯ４０，１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％ ＮａＣＱ　　　　　　　　　　　　Ｏ、１％ｐＨ６，５ 培養濾液の濃縮方法及び精製方法は実施例１に示す方法
で行ったが、エチルアルコール１．ＯＱに代えてエチル
アルコール１．２３Ｑを用いた。ここで得た抗腫瘍性成
分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０は８０ｍｇであった。

実施例６ ストレプトコッカス・エスピーＡＴＣＣ２１５９７を第
２表に示した培地Ｂを用いて実施例２と全く同様に培養
した。

この場合、培養条件、さらに濃縮方法及び精製方法は実
施例２と全く同じ条件で行った。

二＼で得た抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０は８３ｍ
ｇであった。

実施例７ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１５４６を
第２表に示した培地Ｂを用いて実施例２と同じ条件で培
養した。

この場合、培養条件、さらに濃縮方法及び精製方法は実
施例２と全く同じ条件で行った。

こ＼で得た抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０は６３ｍ
ｇであった。

実施例８ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１５４７を
第２表に示した培地Ｂを用いて実施例２と同様に培養し
た。

この場合、培養条件、さらに濃縮方法及び精製方法は実
施例２と全く同じ条件で行った。

ここで得た抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０は８７ｍ
ｇであった。

実施例９ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１５４８を
第２表に示した培地Ｂを用いて実施例２と全く同様に培
養したに の場合、培養条件、さらに濃縮方法及び精製方法は実施
例２と全く同じ条件で行った。

こ＼で得た抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０は９０ｍ
ｇであった。

実験例１ 抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０のインビトロにおけ
る抗腫瘍性試験は、本文中に記載した抗腫瘍活性の測定
方法により行ない、その結果を第６表に示す。

第６表　ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０のＪ７７４−１に対する
抗腫瘍活性の結果Ｊ７７４−Ｈ：対するＭＩＣ 実施例１　　　　　８μｇａｒｂΩ 実施例２　　　　１６μｇ／ＩＩＩＱ 実施例３　　　　　８μｇ／ｍＱ 実験例２ 抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０のインビボにおける
抗腫瘍性活性試験は、Ｃｒｊ　；　ＣＤ−１（ＩＣＲ系
、雄性５週齢）マウスを使用した。腫瘍細胞としては、
Ｓａｒｃｏｍａ−１８０腹水癌細胞を用い、これを生理
食塩水に浮遊させ、マウスの腹腔内に５　Ｘ　１０５ｃ
ｅｌｌｓ／マウス接種した。

痛ａｔ胞接種２４時間後から、１１３１回５日間連続し
てＳＰＦ−ＰＣＯ−３０を腹腔内に投与してその生存数
をＲ察しその結果を第７表に示す。

第７表　ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０の抗腫瘍活性−マウスの
生存数日　数　　　　　　　　　　０　　１０　　１５
　　２０　　２５　　３０Ｃ日）コントロール　　　　
　８／８　８／８　２／８　０／８　０／８　０／８実
施例１（１■／マウス）　　８／８　８／８　７／８　
７／８　６／８　６／８実施例２（１■／マウス）　　
８／８　　ｇ／８　８／８　７／８　７／８　７／８実
施例３（１■／マウス）　　８／８　８／８　８／８　
７／８　６／８　６／８

【図面の簡単な説明】

第１図は、抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０の紫外吸
収スペクトルを示し、第２図は同じ＜　ＫＢｒ法による
赤外線吸収スペクトルを示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有する抗腫瘍性成分ＳＰＦ
   −ＰＣＯ−３０。 １、元素分析 Ｃ　　３７．１〜３９．３ Ｈ　　　５．４〜　６．４ Ｎ　　　３．５〜　４．８ Ｏ　　５０．５〜４５．７ Ａｓｈ　３．５〜　３．８ ２、分解点 本物質は１８５℃で褐変し、２５５℃になると黒色とな
   り分解する。 ３、比旋光度 〔α〕＾２＾０＿Ｄ＝３０°〜８０°（Ｃ＝１．００）
   ４、紫外線吸収スペクトル 本物質の水溶液の紫外線吸収スペクトルは 第１図に示される。 ５、赤外線吸収スペクトル 第２図に示される。 ６、塩基性、酸性、中性の区別 本物質の０．１％の水溶液のｐＨは５．５〜５．８であ
   る。 ７、物質の色 白ないし微黄色 ８、呈色反応 ローリー反応　　　　＋ ビューレット反応　　＋ ニンヒドリン反応　　＋ アンスロン硫酸反応　＋ システイン硫酸反応　＋ オルシン反応　　　　− ９、分子量 ゲル濾過法による測定では、分子量１０，０００以上で
   ある。 １０、陰イオン交換体に対する挙動 ハイドロキシアパタイトに吸着され、０．２５Ｍリン酸
   緩衝液により溶出される。 １１、溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノール、エタノー ル、ｎ−プロパノール、アセトン、エチルエーテル、ｎ
   −ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル等の溶剤には、
   難溶又は不溶である。 １２、温度に対する安定性 本物質の水溶液は、４５℃、３０分の加熱によりインビ
   トロで測定される抗腫瘍性活性を保持する。 １３、蛋白質分解酵素に対する安定性 本物質は、トリプシンによる処理後もイン ビトロで測定される抗腫瘍性活性において活性保持する
   。しかし、プロナーゼによる処理後は抗腫瘍活性がやや
   低下する。 １４、ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動で糖と蛋白に
   分離するのが確認される。
2. （２）ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分ＳＰ
   Ｆ−ＰＣＯ−３０生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性
   成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０を採取することを特徴とする
   抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０の製法。
3. （３）抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０の採取が培養
   細胞Ｊ７７４−１の生育を阻害する画分を分取するもの
   であることを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の
   抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０の製法。
4. （４）抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０の採取が、培
   養液を限外濾過膜で濃縮し、得られた濃縮液を溶剤沈澱
   せしめ、次いでハイドロキシアパタイトに吸着させ、０
   ．２５Ｍリン酸緩衝液で溶出せしめるものであることを
   特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍性成分
   ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０の製法。