JPS6233121A - 抗腫瘍性成分ｓｐｆ１０ｃａｐ２及びその製法 - Google Patents
抗腫瘍性成分ｓｐｆ１０ｃａｐ２及びその製法Info
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- JPS6233121A JPS6233121A JP60170575A JP17057585A JPS6233121A JP S6233121 A JPS6233121 A JP S6233121A JP 60170575 A JP60170575 A JP 60170575A JP 17057585 A JP17057585 A JP 17057585A JP S6233121 A JPS6233121 A JP S6233121A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規な抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２及び
その製法に関するものである。
その製法に関するものである。
従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）の生菌体
を弱毒化して製剤化したものは、すてに制癌剤として使
用されている。
を弱毒化して製剤化したものは、すてに制癌剤として使
用されている。
また、溶連菌の菌体を破砕抜水または塩類溶液で有効成
分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍性成分を沈澱と
して、回収する方法（特公昭３８−１６４７）、溶連菌
を溶菌酵素リゾチーム、セルラーゼまたは蛋白質分解酵
素により、溶菌し、活性画分を水溶性区分として分画す
る方法（英国特許１１６３８６５号）、溶連菌の菌体を
破砕接水不溶性物質を採取し、核酸分解酵素および蛋白
分解酵素で処理する方法（特開昭５５−７０１４）など
が知られている。
分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍性成分を沈澱と
して、回収する方法（特公昭３８−１６４７）、溶連菌
を溶菌酵素リゾチーム、セルラーゼまたは蛋白質分解酵
素により、溶菌し、活性画分を水溶性区分として分画す
る方法（英国特許１１６３８６５号）、溶連菌の菌体を
破砕接水不溶性物質を採取し、核酸分解酵素および蛋白
分解酵素で処理する方法（特開昭５５−７０１４）など
が知られている。
このように、ストレプトコッカス属細菌そのものもしく
はその菌体成分に抗腫瘍活性があることは広く知られて
いるのであるが、従来知られたものは、菌体もしくは水
溶性もしくは水不溶性高分子細胞構成物質であるに過ぎ
なかった。菌体もしくは菌体内から有効成分を単離しよ
うとすれば、菌体を溶菌したり、機械的に破砕したりし
て全体を分画しなければならなかった。
はその菌体成分に抗腫瘍活性があることは広く知られて
いるのであるが、従来知られたものは、菌体もしくは水
溶性もしくは水不溶性高分子細胞構成物質であるに過ぎ
なかった。菌体もしくは菌体内から有効成分を単離しよ
うとすれば、菌体を溶菌したり、機械的に破砕したりし
て全体を分画しなければならなかった。
このような処理では、精製は複雑となり、有効成分の単
離はきわめて困難であった。実際に分離し、有効成分と
して甜定された例では分子量２００．０００ノ蛋白質（
特公昭４８−４３８４１、特開昭５ｌ−４４６１７）及
び分子量１５０，０００の糖蛋白質（特開昭５８−２２
０２６）が知られている程度である。
離はきわめて困難であった。実際に分離し、有効成分と
して甜定された例では分子量２００．０００ノ蛋白質（
特公昭４８−４３８４１、特開昭５ｌ−４４６１７）及
び分子量１５０，０００の糖蛋白質（特開昭５８−２２
０２６）が知られている程度である。
本発明者らは、先に溶連菌の培養液中に抗腫瘍性成分を
溶出させる方法を鋭意研究したところ、培養中にペニシ
リン又はその関連物質を添加することによって抗腫瘍性
成分が培養液中に溶出することを見出しく特開昭６０−
３０６７７号）、培養液中から生理活性物質ＳＰＦ−１
を分離するに至ったのである（特開昭６０−３０６８９
号）。
溶出させる方法を鋭意研究したところ、培養中にペニシ
リン又はその関連物質を添加することによって抗腫瘍性
成分が培養液中に溶出することを見出しく特開昭６０−
３０６７７号）、培養液中から生理活性物質ＳＰＦ−１
を分離するに至ったのである（特開昭６０−３０６８９
号）。
本発明者は、更に、溶連菌の培養源液中からより有効な
成分を分離する目的で研究したところ、本発明において
、癌化白血球培養細胞Ｌ １２１０（以下培養細胞Ｌ
１２１０という）の生育を阻害し、かつ、アンスロン硫
酸法による呈色反応陽性の画分であることにより特徴づ
けられる抗腫瘍性成分ＳＰＦＩＯＣＡＰ２を分離するに
至った。
成分を分離する目的で研究したところ、本発明において
、癌化白血球培養細胞Ｌ １２１０（以下培養細胞Ｌ
１２１０という）の生育を阻害し、かつ、アンスロン硫
酸法による呈色反応陽性の画分であることにより特徴づ
けられる抗腫瘍性成分ＳＰＦＩＯＣＡＰ２を分離するに
至った。
本発明の抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２は元素分析、
呈色反応等から糖を含むペプチド様物質と考えられるが
、紫外線吸収スペクトルから、既知の抗腫瘍性物質とは
、相違する新規な物質と認められるものである。
呈色反応等から糖を含むペプチド様物質と考えられるが
、紫外線吸収スペクトルから、既知の抗腫瘍性物質とは
、相違する新規な物質と認められるものである。
本発明は、ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分
ＳＰＦ１０ＣＡＰ２生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍
性成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２を採取することを特徴とする
抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２の製造法を包含するも
のである。
ＳＰＦ１０ＣＡＰ２生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍
性成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２を採取することを特徴とする
抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２の製造法を包含するも
のである。
本発明においては、ストレプトコッカス属に属する抗腫
瘍性成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２生産菌が広く使用できる。
瘍性成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２生産菌が広く使用できる。
次に抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２生産菌を記載する
。
。
培養液は、肉エキス培地、酵母エキス培地、プレイン・
バー１へ・インフュージョン培地（ＢＨＩ 培地）等の
天然培地がよく用いられるが、ストレプトコッカス属細
菌の生育に適した培地であれば任意の培地を使用できる
。
バー１へ・インフュージョン培地（ＢＨＩ 培地）等の
天然培地がよく用いられるが、ストレプトコッカス属細
菌の生育に適した培地であれば任意の培地を使用できる
。
培養は、ｐＨ５，０〜８．０、好ましくは、６．１〜７
．２であり、培養温度は、３０〜４０℃、好ましくは、
３５〜３７℃であり、嫌気的に静置培養または、攪拌培
養を行なうことができる。
．２であり、培養温度は、３０〜４０℃、好ましくは、
３５〜３７℃であり、嫌気的に静置培養または、攪拌培
養を行なうことができる。
本発明においては、培養中に適当な時期に、ペニシリン
または、その関連物質を添加することが、抗腫瘍性成分
ＳＰＦＩＯＣＡＰ２の採取に重要な役割をはだすことに
なる。
または、その関連物質を添加することが、抗腫瘍性成分
ＳＰＦＩＯＣＡＰ２の採取に重要な役割をはだすことに
なる。
ペニシリンまたは、その関連物質の添加時間は、３５〜
３７℃の培養で、対数増殖期にかかって後、３〜２０時
間の間、特に５〜１０時間が好ましい。その後１〜２０
時間、好ましくは３〜］５時間培養を継続することによ
り、培養中に抗腫瘍性成分ＳＰＦ１．０ＣＡＰ２を多量
蓄積させることができる。
３７℃の培養で、対数増殖期にかかって後、３〜２０時
間の間、特に５〜１０時間が好ましい。その後１〜２０
時間、好ましくは３〜］５時間培養を継続することによ
り、培養中に抗腫瘍性成分ＳＰＦ１．０ＣＡＰ２を多量
蓄積させることができる。
ペニシリンまたはその関連物質としては、すでに知られ
たペニシリンと類似の作用をもつ関連物質であればいか
なるものでもよいが、ペニシリンＧが普通用いられる。
たペニシリンと類似の作用をもつ関連物質であればいか
なるものでもよいが、ペニシリンＧが普通用いられる。
添加量は、ペニシリンＧで１．００−７０００単位／ｍ
Ｑ、好ましくは、３００−５０００単位／ ｍ Ｑ培養
液程度で十分である。
Ｑ、好ましくは、３００−５０００単位／ ｍ Ｑ培養
液程度で十分である。
ストレプトコッカス属細菌のペニシリンまたは、その関
連物質の添加培養によって得られた培養液は遠心分離に
よって菌体を除去し、濾液に硫安を添加し、５０〜９０
％飽和度の画分を分取する。
連物質の添加培養によって得られた培養液は遠心分離に
よって菌体を除去し、濾液に硫安を添加し、５０〜９０
％飽和度の画分を分取する。
得られた抗腫瘍性組成物ＳＰＦ１０ＣＡＰ２を含む硫安
塩析物は凍結状態で保存することもできる。
塩析物は凍結状態で保存することもできる。
この硫安塩析物から抗腫瘍性組成物ＳＰＦ１０ＣＡＰ２
を抽出するには、塩析物を緩衝液に溶解し、この水溶液
をＤＥＡＥセルロースカラムに吸着させ、燐酸緩衝液を
用いて段階的に溶出させ、培養細胞ＬＩ２１０の生育を
阻害する活性画分を分取し、この活性画分をＤＥＡＥセ
ファデックスＡ−２５カラムに吸着させ、燐酸緩衝液中
の塩化ナトリウム濃度を直線的に上昇させつつ溶出し、
その非吸着部分及び塩化ナトリウム低濃度部分を分取し
、この分画部分を緩衝液に対して透析し、ゲル濾過材ト
ヨパールＩＩＷ−５０Ｆカラムに吸着させ、Ｏ，］、Ｍ
ＮａＣＱを含む燐酸緩衝液で溶出させ、アンスロン硫
酸法による呈色反応陽性部分を分取し、次いでこの分画
部分を燐酸緩衝液に対して透析脱塩後、ハイドロキシア
パタイトカラムに吸着させ、１×１０−”Ｍリン酸緩衝
液でＳＰＦＩＯＣＡＰＩを溶出させ、その後１×１０−
１Ｍリン酸緩衝液で溶出し、これを凍結乾燥することに
よって得ることができる。
を抽出するには、塩析物を緩衝液に溶解し、この水溶液
をＤＥＡＥセルロースカラムに吸着させ、燐酸緩衝液を
用いて段階的に溶出させ、培養細胞ＬＩ２１０の生育を
阻害する活性画分を分取し、この活性画分をＤＥＡＥセ
ファデックスＡ−２５カラムに吸着させ、燐酸緩衝液中
の塩化ナトリウム濃度を直線的に上昇させつつ溶出し、
その非吸着部分及び塩化ナトリウム低濃度部分を分取し
、この分画部分を緩衝液に対して透析し、ゲル濾過材ト
ヨパールＩＩＷ−５０Ｆカラムに吸着させ、Ｏ，］、Ｍ
ＮａＣＱを含む燐酸緩衝液で溶出させ、アンスロン硫
酸法による呈色反応陽性部分を分取し、次いでこの分画
部分を燐酸緩衝液に対して透析脱塩後、ハイドロキシア
パタイトカラムに吸着させ、１×１０−”Ｍリン酸緩衝
液でＳＰＦＩＯＣＡＰＩを溶出させ、その後１×１０−
１Ｍリン酸緩衝液で溶出し、これを凍結乾燥することに
よって得ることができる。
次に、実施例１で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦＩＯＣＡ
Ｐ２の凍結乾燥標品は１次の理化学的性質を示す。
Ｐ２の凍結乾燥標品は１次の理化学的性質を示す。
■、 元素分析 Ｃ４０，０〜４４，５％■ ５．８
〜６．５％ Ｎ １２．９〜１５．４％ ０ ３１．１〜４０．０％ Ａｓｈ １．３−２．５％ ２、分解点 本物質は１６５℃で褐変し２４０℃になる
と黒色となり分解する。
〜６．５％ Ｎ １２．９〜１５．４％ ０ ３１．１〜４０．０％ Ａｓｈ １．３−２．５％ ２、分解点 本物質は１６５℃で褐変し２４０℃になる
と黒色となり分解する。
３、比旋光度 〔α〕２０Ｄ＝−７２°〜−８８°（Ｃ
＝１．００） ４、紫外線吸収スペクトル 本物質０．１％の水溶液の
紫外線吸収スペトルは第１図に示される６５、赤外線吸
収スペクトル 第２図に示される。
＝１．００） ４、紫外線吸収スペクトル 本物質０．１％の水溶液の
紫外線吸収スペトルは第１図に示される６５、赤外線吸
収スペクトル 第２図に示される。
６、塩基性、酸性、中性の区別 本物質１．０％の水溶
液のｐＨは６．５である。
液のｐＨは６．５である。
７、物質の色 淡褐色
８、 呈色反応
ローリ−反応 十
ビューレット反応 十
ニンヒドリン反応 十
アンスロン硫酸反応 十
モーリッシュ反応 ＋
システイン硫酸反応 十
オルシン塩酸反応 −
９、分子量 ゲル濾過法による測定では分子量約２×１
０４〜５×１０４である。
０４〜５×１０４である。
１０、溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノ
ール、エタノール、ｎ−プロパノール、アセトン、エチ
ルエーテル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル
等の溶剤には、難溶又は不溶である。
ール、エタノール、ｎ−プロパノール、アセトン、エチ
ルエーテル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル
等の溶剤には、難溶又は不溶である。
１１、 イオン交換体に対する挙動
ハイドロキシアパタイトに吸着され、１×１０−１Ｍリ
ン酸緩衝液により溶出される。
ン酸緩衝液により溶出される。
次にインビトロにおける培養細胞Ｌ １２１０に対する
抗腫瘍性活性の測定方法及びアンスロン硫酸法による呈
色反応の方法を示す。
抗腫瘍性活性の測定方法及びアンスロン硫酸法による呈
色反応の方法を示す。
抗腫瘍活性の測定方法
抗腫瘍活性の測定は、培養細胞Ｌ １２１０の生育阻止
率（ＩＲ％）のｌｌ＋ｑ定により行った。
率（ＩＲ％）のｌｌ＋ｑ定により行った。
Ｌ １２１０細胞を１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ １６４
０培地（５ｍｇ／Ｑカナマイシン含有）に懸濁した。こ
の培養液０．５ｍ＋２をファルコン２０５８チューブに
注加し、細胞数がＩ ＸＩＯ’ ｃｅｌｌｓ／１ｕｂｅ
になるようにした。次いでこの培養液に所定量の標品（
抗腫瘍性組成物ＳＰＦ１０ＣＡＰ２ ）を目的濃度にな
るように培養液に溶解した０、５ｍＱを注加して、３７
℃で５％ＣＯ□存在下に培養した。標品を添加して４８
時間後にトリパンブルーによる染色をおこない、次式に
よりＩＲ（％）を算出した。
０培地（５ｍｇ／Ｑカナマイシン含有）に懸濁した。こ
の培養液０．５ｍ＋２をファルコン２０５８チューブに
注加し、細胞数がＩ ＸＩＯ’ ｃｅｌｌｓ／１ｕｂｅ
になるようにした。次いでこの培養液に所定量の標品（
抗腫瘍性組成物ＳＰＦ１０ＣＡＰ２ ）を目的濃度にな
るように培養液に溶解した０、５ｍＱを注加して、３７
℃で５％ＣＯ□存在下に培養した。標品を添加して４８
時間後にトリパンブルーによる染色をおこない、次式に
よりＩＲ（％）を算出した。
ここで（Ａ）とは対照群の生細胞数を示す。
対照は標品を含まない培養液０．５ｍＱを用い同時に行
った・ アンスロン硫酸法による呈色反応 脱イオン水に溶解し目的濃度にした標品１ｍＱに２ｍｆ
ｌのアンスロン試薬（０，２０ｇｒのアンスロンをＬｏ
ｏｍ Ｑのａ硫酸に溶解したもの）を注加し、混混合３
０分後、標品１ｍＱに代えて脱イオン水１ｍ１２に２ｍ
Ｑのアンスロン試薬を注加した液を対照として６２０ｎ
ｍで吸収を測定する。定量値はグルコースを用いて同様
に測定して得た検量式より求める。
った・ アンスロン硫酸法による呈色反応 脱イオン水に溶解し目的濃度にした標品１ｍＱに２ｍｆ
ｌのアンスロン試薬（０，２０ｇｒのアンスロンをＬｏ
ｏｍ Ｑのａ硫酸に溶解したもの）を注加し、混混合３
０分後、標品１ｍＱに代えて脱イオン水１ｍ１２に２ｍ
Ｑのアンスロン試薬を注加した液を対照として６２０ｎ
ｍで吸収を測定する。定量値はグルコースを用いて同様
に測定して得た検量式より求める。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１
ストレプトコッカス・ピオゲネス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）
ＡＴＣＣ２１０６０をＢＩＩＩ培地１培地１立０ おこなって得た種培養液を第１表に示す培地ＡＩＱに接
種し、種培養と同一条件で嫌気的に前培養を行った。
ＡＴＣＣ２１０６０をＢＩＩＩ培地１培地１立０ おこなって得た種培養液を第１表に示す培地ＡＩＱに接
種し、種培養と同一条件で嫌気的に前培養を行った。
第 １ 表 培地Ａ
マルトース ０．２５％肉エキス
１．０％ポリペプトン
１．０％ 酵母エキス ０．２５％酸性第一燐酸カ
リウム ０．１％ 硫酸マグネシウム ０．０５％ρＩ＋＝６．
８ １（ＩＱジャーファーメンタ−に培地Ａ８Ｑを投入して
１２０℃、１０分間加熱殺菌後、３７℃まで冷却して、
前培養液ＩＱを接種し、３７℃、１５．５時間、ｐＨ６
、８，３００回転／分で攪拌しなから嫌気的に培養する
。次いでペニシリン０ １０００単位／ ｍ Ｑ培養液
になるように添加して、培養を更に５時間継続した。
１．０％ポリペプトン
１．０％ 酵母エキス ０．２５％酸性第一燐酸カ
リウム ０．１％ 硫酸マグネシウム ０．０５％ρＩ＋＝６．
８ １（ＩＱジャーファーメンタ−に培地Ａ８Ｑを投入して
１２０℃、１０分間加熱殺菌後、３７℃まで冷却して、
前培養液ＩＱを接種し、３７℃、１５．５時間、ｐＨ６
、８，３００回転／分で攪拌しなから嫌気的に培養する
。次いでペニシリン０ １０００単位／ ｍ Ｑ培養液
になるように添加して、培養を更に５時間継続した。
得られた培養液を遠心分離にかけて菌体を除去した。
培養濾液には硫酸アンモニウムを添加し、５０〜９０％
飽和度で沈澱する画分を分取した。この硫安塩析標品を
Ｉ Ｘｌ０−”Ｍ．ｐｕ ７．０の燐酸緩衝液（ＫＨ２
ＰＯ．−Ｎａ２１１ＰＯ４） ３００ｍＱに溶解し、こ
の水溶液をＤＩＥＡＩＥセルロースカラム（ ５ Ｘ
７０ｃｍ）に吸着させた後、０，３Ｍ塩化ナトリウムを
含む上記燐酸緩衝液を用いて１段階的に溶出させ、アン
スロン硫酸法による呈色反応陽性でかつ培養細胞Ｌ １
２１０の生育を阻害する活性画分を分取した。
飽和度で沈澱する画分を分取した。この硫安塩析標品を
Ｉ Ｘｌ０−”Ｍ．ｐｕ ７．０の燐酸緩衝液（ＫＨ２
ＰＯ．−Ｎａ２１１ＰＯ４） ３００ｍＱに溶解し、こ
の水溶液をＤＩＥＡＩＥセルロースカラム（ ５ Ｘ
７０ｃｍ）に吸着させた後、０，３Ｍ塩化ナトリウムを
含む上記燐酸緩衝液を用いて１段階的に溶出させ、アン
スロン硫酸法による呈色反応陽性でかつ培養細胞Ｌ １
２１０の生育を阻害する活性画分を分取した。
この活性画分をＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラム
（２．６ Ｘ ７０ｃｍ）に吸着させ、次いで上記燐酸
緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線的に上昇させて溶
出を行い、培養細胞Ｌ１．２１０に対して活性のある部
分を分取する。この溶出曲線は第３図に示される。第３
図において点線部分は非吸着部分で、実線部分は塩化ナ
トリウム添加部分である。Ａは培養細胞Ｌ １２１０生
育阻害活性画分で、ＭＰ−２（特開昭６Ｏ−３０６８９
）生育阻害非活性画分であり、Ｂは培養細胞Ｌ １２１
０生育阻害非活性画分で、ＭＰ−２生育阻害活性画分で
ある。
（２．６ Ｘ ７０ｃｍ）に吸着させ、次いで上記燐酸
緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線的に上昇させて溶
出を行い、培養細胞Ｌ１．２１０に対して活性のある部
分を分取する。この溶出曲線は第３図に示される。第３
図において点線部分は非吸着部分で、実線部分は塩化ナ
トリウム添加部分である。Ａは培養細胞Ｌ １２１０生
育阻害活性画分で、ＭＰ−２（特開昭６Ｏ−３０６８９
）生育阻害非活性画分であり、Ｂは培養細胞Ｌ １２１
０生育阻害非活性画分で、ＭＰ−２生育阻害活性画分で
ある。
Ａの活性画分の溶出液を硫酸アンモニウムを９０％飽和
度まで添加し沈Ａ画分とし、上記燐酸緩衝液に溶解し透
析膜を用いて脱塩後凍結乾燥する。
度まで添加し沈Ａ画分とし、上記燐酸緩衝液に溶解し透
析膜を用いて脱塩後凍結乾燥する。
この凍結乾燥標品を燐酸緩衝液に溶解しトヨパールＩＩ
Ｗ ５０ Ｆカラム（２，６Ｘ １００ｃｍ）に吸着さ
せ、次いで、上記燐酸緩衝液中に塩化す１−リウム０．
ＩＭを含む溶液で溶出させ、アンスロン硫酸法による呈
色反応陽性の画分を分取した。この溶出曲線は第４図に
示される。第４図において実線は全体の溶出曲線を示し
、点線はアンスロン硫酸法による呈色反応陽性部分の溶
出曲線を示している。ここではＣをアンスロンａ酸法に
よる呈色反応陽性画分とした。
Ｗ ５０ Ｆカラム（２，６Ｘ １００ｃｍ）に吸着さ
せ、次いで、上記燐酸緩衝液中に塩化す１−リウム０．
ＩＭを含む溶液で溶出させ、アンスロン硫酸法による呈
色反応陽性の画分を分取した。この溶出曲線は第４図に
示される。第４図において実線は全体の溶出曲線を示し
、点線はアンスロン硫酸法による呈色反応陽性部分の溶
出曲線を示している。ここではＣをアンスロンａ酸法に
よる呈色反応陽性画分とした。
Ｃの画分は燐酸緩衝液に対して透新説塩後ハイドロキシ
アバタイ１〜カラム（２，６４Ｘ ４５ｃｍ）に吸着さ
せ、最初１×１０−”Ｍ燐酸緩衝液で溶出し、次いでｌ
Ｘ１０−”Ｍ燐酸緩衝液で溶出した。この溶出曲線は第
５図に示される。第５図において実線は全体の溶出曲線
を示し１点線はアンスロン硫酸法による呈色反応陽性部
分の溶出曲線を示している。
アバタイ１〜カラム（２，６４Ｘ ４５ｃｍ）に吸着さ
せ、最初１×１０−”Ｍ燐酸緩衝液で溶出し、次いでｌ
Ｘ１０−”Ｍ燐酸緩衝液で溶出した。この溶出曲線は第
５図に示される。第５図において実線は全体の溶出曲線
を示し１点線はアンスロン硫酸法による呈色反応陽性部
分の溶出曲線を示している。
ここでＤの画分をＳＰＦ ｔｏ ＣＡＰ １ とし、Ｅ
の画分をＳＰＦＩＯＣＡＰ２ とした。
の画分をＳＰＦＩＯＣＡＰ２ とした。
Ｅの画分を凍結乾燥した。この凍結乾燥標品は抗腫瘍性
成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２であり、０．８９ｇｒを得た。
成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２であり、０．８９ｇｒを得た。
実施例２
ストレプトコッカスパピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは３００単位／ｍＱ培養液
となるように添加し、更に培養を１０時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０ＣＡＰ２ ０．５ｇｒを得た。
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは３００単位／ｍＱ培養液
となるように添加し、更に培養を１０時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０ＣＡＰ２ ０．５ｇｒを得た。
実施例３
ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴｃｃ ２１０６０
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養
した。この場合、ペニシリンＧは３０００単位／ｍＱ培
養液となるように添加し、更に培養を３時間継続した。
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養
した。この場合、ペニシリンＧは３０００単位／ｍＱ培
養液となるように添加し、更に培養を３時間継続した。
この培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分
ＳＰＦ１０ＣＡＰ２ ０．７５ｇｒを得た。
ＳＰＦ１０ＣＡＰ２ ０．７５ｇｒを得た。
実施例４
ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第２表に示す培地Ｂを用いて実施例１と同様に培養した
。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ培養液
となるように添加し、更に培養を５時間継続した。この
培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分ＳＰ
Ｆ］０ＣＡＰ２ ０．６３ｇｒを得た。
第２表に示す培地Ｂを用いて実施例１と同様に培養した
。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ培養液
となるように添加し、更に培養を５時間継続した。この
培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分ＳＰ
Ｆ］０ＣＡＰ２ ０．６３ｇｒを得た。
第 ２ 表 培地Ｂ
マルトース ０．１ ％肉エキス
０．５％ボリペプ１、ン
１．０％酵母エキス ０．２５％塩化
ナトリウム ０．１％ ｐＨ＝７．２ 実施例５ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第３表に示す培地Ｃを用いて実施例１と同様に３５℃で
培養した。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍ
Ｑ培養液となるように添加し、更に培養を５時間継続し
た。この培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性
成分ＳＰＦ１．０ＣＡＰ２０．５７ｇｒを得た。
０．５％ボリペプ１、ン
１．０％酵母エキス ０．２５％塩化
ナトリウム ０．１％ ｐＨ＝７．２ 実施例５ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第３表に示す培地Ｃを用いて実施例１と同様に３５℃で
培養した。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍ
Ｑ培養液となるように添加し、更に培養を５時間継続し
た。この培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性
成分ＳＰＦ１．０ＣＡＰ２０．５７ｇｒを得た。
第 ３ 表 培地Ｃ
マルトース ０．１％
肉エキス ０．５％
ポリペプトン ０“５％
カザミノ酸 ０．３ ％酵母エキス
０．５％ 酸性第一燐酸カリウム ０．１％ 硫酸マグネシウム ０．０５％ｐＨ＝６．５ 実施例６ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第４表に示す培地りを用いて実施例１と同様に培養した
。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍｎ培養液
となるように添加し、更に培養を５時間継続した。この
培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分ＳＰ
Ｆ］０ＣＡＰ２ ０．３６ｇｒを得た。
０．５％ 酸性第一燐酸カリウム ０．１％ 硫酸マグネシウム ０．０５％ｐＨ＝６．５ 実施例６ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第４表に示す培地りを用いて実施例１と同様に培養した
。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍｎ培養液
となるように添加し、更に培養を５時間継続した。この
培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分ＳＰ
Ｆ］０ＣＡＰ２ ０．３６ｇｒを得た。
第 ４ 表 培地Ｄ
フル１−−ス ０，２５％カザミノ酸
０．３％ 酵母エキス １．０％ 酸性第一燐酸カリウム ０．１％ 硫酸マグネシウム ０．０５％ＰＩＩ＝６．
９ 実施例７ ストレプトコッカス・エスピーＡＴＣＣ２１５９７を第
１表に示した培地へを用いて実施例１と同様に培養した
。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍ ｎ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０ＣＡｒ”２ ０．４５ｇｒを得た。
０．３％ 酵母エキス １．０％ 酸性第一燐酸カリウム ０．１％ 硫酸マグネシウム ０．０５％ＰＩＩ＝６．
９ 実施例７ ストレプトコッカス・エスピーＡＴＣＣ２１５９７を第
１表に示した培地へを用いて実施例１と同様に培養した
。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍ ｎ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０ＣＡｒ”２ ０．４５ｇｒを得た。
実施例８
ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１５４６を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ、培
養液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ、培
養液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。
この培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分
ＳＰＦ］０ＣＡＰ２０．５９ｇｒを得た。
ＳＰＦ］０ＣＡＰ２０．５９ｇｒを得た。
実施例９
ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１５４７を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０ＣＡＰ２ ０．６１ｇｒを得た。
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０ＣＡＰ２ ０．６１ｇｒを得た。
実施例１０
ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ，２１５４８
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養
した。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ培
養液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養
した。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ培
養液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。
この培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分
ＳＰＦ１０ＣＡＰ２ ０．３０ｇｒを得た。
ＳＰＦ１０ＣＡＰ２ ０．３０ｇｒを得た。
実施例１１
ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た、この場合、セファロスポリンＣは６００μｇ／ｍ
ｎ培養液となるように添加し、更に培養を５時間継続し
た。この培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性
成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２０．８ｇｒを得た。
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た、この場合、セファロスポリンＣは６００μｇ／ｍ
ｎ培養液となるように添加し、更に培養を５時間継続し
た。この培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性
成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２０．８ｇｒを得た。
実験例１
実施例１で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２の
インビトロ における抗腫瘍活性試験は、本文中に記載
した抗腫瘍活性の測定方法により行い、その結果を表−
５に示す。
インビトロ における抗腫瘍活性試験は、本文中に記載
した抗腫瘍活性の測定方法により行い、その結果を表−
５に示す。
表−５ＳＰＦ１０ＣＡＰ２の抗腫瘍活性の結果ＳＰＦ１
０ＣＡＰ２（ｍｇ／ ｍ Ｑ ） ＩＲ％０．５
１００．０ ０．２５ ９８．３ ０．１２５ ９１．０ 実験例２ 実施例１で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２の
インビボにおける抗腫瘍活性試験はＣＲＪ −ＣＤ −
１（ＩＣＲ系、雌性７週齢）マウスを使用して実施し腫
瘍細胞としてはＳａｒｃｏｍａ−１８０腹水癌細胞を用
いこれを生理食塩水に浮遊させ、マウスの腹腔内に５
Ｘ １０’ ｃｅｌｌｓ／マウス接種した。
０ＣＡＰ２（ｍｇ／ ｍ Ｑ ） ＩＲ％０．５
１００．０ ０．２５ ９８．３ ０．１２５ ９１．０ 実験例２ 実施例１で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２の
インビボにおける抗腫瘍活性試験はＣＲＪ −ＣＤ −
１（ＩＣＲ系、雌性７週齢）マウスを使用して実施し腫
瘍細胞としてはＳａｒｃｏｍａ−１８０腹水癌細胞を用
いこれを生理食塩水に浮遊させ、マウスの腹腔内に５
Ｘ １０’ ｃｅｌｌｓ／マウス接種した。
癌細胞接種２４時間後から１日１回５日間連続してＳＰ
ＦＩＯＣＡＰ２を腹腔内に投与してその生存数を観察し
その結果を表−６に示す。
ＦＩＯＣＡＰ２を腹腔内に投与してその生存数を観察し
その結果を表−６に示す。
表−６ＳＰＦ１０ＣＡＰ２の抗腫瘍活性−マウスの生存
数日数 ０ １０ １５ ２０ ２５ ３０対
照 ６／６６／６０／６０／６０／６０／６ＳＰ
Ｆ １．ＯＣＡＰ ２（５ｍｇ／マウス）６／６ ６／
６ ６／６ ６／６ ６／６ ６／６
数日数 ０ １０ １５ ２０ ２５ ３０対
照 ６／６６／６０／６０／６０／６０／６ＳＰ
Ｆ １．ＯＣＡＰ ２（５ｍｇ／マウス）６／６ ６／
６ ６／６ ６／６ ６／６ ６／６
第１図は抗腫瘍性成分ＳＰＦ １０ ＣＡＰ １の紫外
線吸収スペクトルを示し、第２図は同じく赤外線吸収ス
ペクトルを示す。第３図は実施例１における活性画分の
ｒｌＥＡＥセファデックスＡ−２５カラムの溶出曲線を
示す図で、第４図はこのＡ画分をトヨパールＨＷ ５０
Ｆカラムに吸着させ、０．ＩＭ ＮａＣＱ燐酸緩衝液
による溶出曲線を示す図で、第５図はこのＣ画分をハロ
イ１くロキシアパタイト力ラムに吸着させて、１×１０
−１Ｍ燐酸緩衝液及び１×１０−”Ｍ燐酸緩衝液によっ
て溶出させた溶出曲線を示す。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 第 １ 図 ・■ 第 ３ 図 第４１２１ 第 ５ 図
線吸収スペクトルを示し、第２図は同じく赤外線吸収ス
ペクトルを示す。第３図は実施例１における活性画分の
ｒｌＥＡＥセファデックスＡ−２５カラムの溶出曲線を
示す図で、第４図はこのＡ画分をトヨパールＨＷ ５０
Ｆカラムに吸着させ、０．ＩＭ ＮａＣＱ燐酸緩衝液
による溶出曲線を示す図で、第５図はこのＣ画分をハロ
イ１くロキシアパタイト力ラムに吸着させて、１×１０
−１Ｍ燐酸緩衝液及び１×１０−”Ｍ燐酸緩衝液によっ
て溶出させた溶出曲線を示す。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 第 １ 図 ・■ 第 ３ 図 第４１２１ 第 ５ 図
Claims (5)
- （１）下記の理化学的性質を有する抗腫瘍性成分ＳＰＦ
１０ ＣＡＰ ２ １、元素分析 Ｃ ４０．０〜４４．５％ Ｈ ５．８〜６．５％ Ｎ １２．９〜１５．４％ Ｏ ３１．１〜４０．０％ Ａｓｈ １．３〜２．５％ ２、分解点 本物質は１６５℃で褐変し２４０℃になる
と黒色となり分解する。 ３、比旋光度 〔α〕＾２＾０＿Ｄ＝−７２°〜−８８
°（Ｃ＝１．００） ４、紫外線吸収スペクトル 本物質０．１％の水溶液の
紫外線吸収スペトルは第１図に示される。 ２７５ｎｍに吸収極大がみられ２６０ｎｍまで同一吸収
値を示すことにより特徴的である。 ５、赤外線吸収スペクトル 第２図に示される。 ６、塩基性、酸性、中性の区別 本物質１．０％の水溶
液のｐＨは６．５である。 ７、物質の色 淡褐色 ８、呈色反応 ローリー反応 ＋ ビューレット反応 ＋ ニンヒドリン反応 ＋ アンスロン硫酸反応 ＋ モーリッシュ反応 ＋ システイン硫酸反応 ＋ オルシン塩酸反応 − ９、分子量 ゲル濾過法による測定では分子量約２×１
０＾４〜５×１０＾５である。 １０、溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノ
ール、エタノール、ｎ−プロパノール、アセトン、エチ
ルエーテル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル
等の溶剤には、難溶又は不溶である。 １１、イオン交換体に対する挙動ハイドロキシアパタイ
トに吸着され、１×１０＾−＾１Ｍリン酸緩衝液により
溶出される。 - （２）ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分ＳＰ
Ｆ１０ＣＡＰ２生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性成
分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２を採取することを特徴とする抗腫
瘍性成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２の製法。 - （３）ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分ＳＰ
Ｆ１０ＣＡＰ２生産菌を培養するに際し、培養中の適当
な時期にペニシリン又はその関連物質を添加して培養す
ることを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の抗腫
瘍性成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２の製法。 - （４）ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分ＳＰ
Ｆ１０ＣＡＰ２生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性成
分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２を採取するに当たり、培養細胞Ｌ
１２１０の生育を阻害し、又は／及びアンスロン硫酸
法による呈色反応陽性の画分を分取することを特徴とす
る特許請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍性成分ＳＰＦ１
０ＣＡＰ２の製法。 - （５）ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分ＳＰ
Ｆ１０ＣＡＰ２生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性成
分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２を採取するに当たり、培養細胞Ｌ
１２１０の生育を阻害し、かつ、アンスロン硫酸法に
よる呈色反応陽性でハイドロキシアパタイトに吸着され
、１×１０＾−＾１Ｍリン酸緩衝液により溶出される画
分を分取することを特徴とする特許請求の範囲第２項に
記載の抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０ＣＡＰ２の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60170575A JPS6233121A (ja) | 1985-08-03 | 1985-08-03 | 抗腫瘍性成分ｓｐｆ１０ｃａｐ２及びその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60170575A JPS6233121A (ja) | 1985-08-03 | 1985-08-03 | 抗腫瘍性成分ｓｐｆ１０ｃａｐ２及びその製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6233121A true JPS6233121A (ja) | 1987-02-13 |
| JPH0156076B2 JPH0156076B2 (ja) | 1989-11-28 |
Family
ID=15907377
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60170575A Granted JPS6233121A (ja) | 1985-08-03 | 1985-08-03 | 抗腫瘍性成分ｓｐｆ１０ｃａｐ２及びその製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6233121A (ja) |
-
1985
- 1985-08-03 JP JP60170575A patent/JPS6233121A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0156076B2 (ja) | 1989-11-28 |
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