JPS62164627A - 抗腫瘍性成分ｓｐｆ１０−１０及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１０及びそ
の製法に関するものである。

従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）の生菌体
を弱毒化して製剤化したものは、すてに制癌剤として使
用されている。

また、溶連菌の菌体を破砕接水または塩類溶液で有効成
分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍性成分を沈澱と
して、回収する方法（特公昭３８−１６４７）、溶連菌
を溶菌酵素リゾチーム、セルラーゼまたは蛋白質分解酵
素により、溶菌し、活性画分を水溶性区分として分画す
る方法（英国特許１１６３８６５号）、溶連菌の菌体を
破砕接水不溶性物質を採取し、核酸分解酵素および蛋白
分解酵素で処理する方法（特開昭５５−７０１４）など
が知られている。

このように、ストレプトコッカス属細菌そのものもしく
はその菌体成分に抗腫瘍活性があることは広く知られて
いるのであるが、従来知られたものは、菌体もしくは水
溶性もしくは水不溶性高分子細胞構成物質であるに過ぎ
なかった。菌体もしくは菌体内から有効成分を単離しよ
うとすれば、菌体を溶菌したり、機械的に破砕したりし
て全体を分画しなければならなかった。

このような処理では、精製は複雑となり、有効成分の単
離はきわめて困難であった。実際に分離し、有効成分と
して測定された例では分子量２００．０００の蛋白質（
特公昭４８−４３８４１、特開昭５ｌ−４４６１７）及
び分子量１５０，０００の糖蛋白質（特開昭５８−２２
０２６）が知られている程度である。

本発明者らは、先に溶連菌の培養液中に抗腫瘍性成分を
溶出させる方法を鋭意研究したところ。

培養中にペニシリン又はその関連物質を添加することに
よって抗腫瘍性成分が培養液中に溶出することを見出し
く特開昭６０−３０６７７号）、培養液中から生理活性
物質５ＰＦ−１を分離するに至ったのである。（特開昭
６０−３０６８９号） 本発明者らは、更に、溶連菌の培養濾液中からより有効
な成分を分離する目的で研究したところ、本発明におい
て、癌化白血球培養細胞Ｌ　１２１０（以下培養細胞Ｌ
　１２１０という）の生育を阻害し、かつ、アンスロン
硫酸法による呈色反応陽性の画分であることにより特徴
づけられる抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１０を分離するに
至った。

本発明の抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１０は元素分析、呈
色反応および赤外線吸収スペクトル等から糖を含むペプ
チド様物質と考えられるが、紫外線吸収スペクトルおよ
び赤外線吸収スペクトルから、既知の抗腫瘍性物質とは
、相違する新規な物質と認められるものである。

本発明は、ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分
ＳＰＦ１０−１０生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性
成分ＳＰＦ１０−１０を採取することを特徴とする抗腫
瘍性成分ＳＰＦ１０−１０の製造法を包含するものであ
る。

本発明においては、ストレプトコッカス属に属する抗腫
瘍性成分ＳＰＦ１０−１０生産菌が広く使用できる。次
に抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１０生産菌を記載する。

培養液は、肉エキス培地、酵母エキス培地、プレイン・
ハート・インフュージョン培地（ＢＨＩ培地）等の天然
培地がよく用いられるが、ストレプトコッカス属細菌の
生育に適した培地であれば任意の培地を使用できる。

培養は、ｐＨ５，０〜８．０、好ましくは、６．１〜７
．２であり、培養温度は、３０〜４０℃、好ましくは、
３５〜３７℃であり、嫌気的に静置培養または、攪拌培
養を行なうことができる。

本発明においては、培養中に適当な時期に、ペニシリン
または、その関連物質を添加することが。

抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１０の採取に重要な役割をは
だすことになる。

ペニシリンまたは、その関連物質の添加時期は、３５〜
３７℃の培養で、対数増殖期にかかつて後、３〜２０時
間の間、特に５〜１０時間が好ましい。その後１〜２０
時間、好ましくは３〜１５時間培養を継続することによ
り、培養中に抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１０を多量ＷＭ
させることができる。

ペニシリンまたはその関連物質としては、すでに知られ
たペニシリンと類似の作用をもつ関連物質であればいか
なるものでもよいが、ペニシリンＧが普通用いられる。

添加量は、ペニシリンＧで１００〜７０００単位／ｍＱ
、好ましくは、３００〜５０００単位／　ｍ　Ｑ培養液
程度で十分である。

ストレプトコッカス属細菌のペニシリンまたは、その関
連物質の添加培養によって得られた培養液は遠心分離に
よって菌体を除去し、濾液を得る。

濾液は、硫安を添加し、５０〜９０％飽和度の画分を分
取するか、もしくは、濾液は、限外濾過膜を用いて濃縮
する。

得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１０を含む硫安塩析
物は凍結状態で保存することもできる。

この硫安塩析物から抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１０を抽
出するには、塩析物を緩衝液に溶解して用いる。

又、限外濾過膜を用いて得た濃縮液を、そのまま用いる
こともできる。この水溶液をＤＥＡＥセルロースカラム
に吸着させ、燐酸緩衝液を用いて段階的に溶出させ、培
養細胞Ｌ　１２１０の生育を阻害する活性画分を分取し
、この活性画分をＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラ
ムに吸着させ、燐酸緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直
線的に上昇させつつ溶出し、その非吸着部分及び塩化ナ
トリウム低濃度部分を分取し、この分画部分を緩衝液に
対して透析し、ゲル濾過材トヨパールＨＶ−５０Ｆカラ
ムに吸着させ、０．ＩＭ　ＮａＣＱを含む燐酸緩衝液で
溶出させ、アンスロン硫酸法による呈色反応を調べる。

ＳＰＦ１０−１０は、トヨパー／Ｌ／　ＨＷ　５０　Ｆ
下の排除限界（以下ｖＯと略す）付近のアンスロン硫酸
法による呈色反応でピークを形成する画分として得るこ
とが出来る。

次に、実施例１で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１
０の凍結乾燥標品は、次の理化学的性質を示す。

１、元素元析　Ｃ３９，５〜４３．５％Ｈ５，８〜６．
７％ Ｎ　　７．３〜１０．４％ ０　　４６．９〜３７．５％ Ａｓｈ　　０．５〜１．９％ ２、　分解点　本物質は１６５℃で褐変し２４０℃にな
ると黒色となり分解する。

’１　　　　＋４−椋珈Ｌｍ　（−）”　−ＪＬ（’　
　　　Ｊ−Ｑ＾”　　（１”−Ｉ　　ＡＩ’ｌ）４、紫
外線吸収スペクトル　本物質０．１％の水溶液の紫外線
吸収スペクトルは第１図に示される。

５、赤外線吸収スペクトル　第２図に示される。

３３００ｃｍ−’付近および１６４０ｃｍ＋’″１付近
のペプチドによる吸収、又、８４０ｃｍ−”の糖による
吸収が認められ特徴的である。

６、塩基性、酸性、中性の区別　本物質０．１％の水溶
液のｐＨは５．５〜６．０である。

７、物質の色　淡褐色 ８、呈色反応 ローリ−反応　　　　　十 ピユーレフ１−反応　　　十 ニンヒドリン反応　　　十 アンスロン硫酸反応　　十 モーリッシュ反応　　　十 システィン硫酸反応　　十 オルシン塩酸反応　　　− ９、分子量　ゲル濾過法による測定では分子量約１０，
０００以上である。

ｌＯ０溶剤に対する溶解性　水に可溶であるが、メタノ
ール、エタノール、ｎ−プロパノール、アセ１−ン、エ
チルエーテル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチ
ル等の溶剤には難溶又は不溶である。

次にインビトロにおける培養細胞Ｌ１２１０に対する抗
腫瘍性活性の測定方法及びアンスロン硫酸法による呈色
反応の方法を示す。

抗腫瘍活性の測定方法 抗腫瘍活性の測定は、培養細胞Ｌ　１２１０の生ｒｆ阻
止率（Ｉｎｘ）の８１’ｌ定により行った。

Ｌ　１２１０細胞を１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ　１６４
０培地（５ｔａｇ／Ｑカナマイシン含有）に懸濁した。

この培養液０．５ｍｆｌをファルコン２０５８チューブ
に注加し、細胞数がＩ　Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ／　ｔ
ｕｂｅになるようにした。次いでこの培養液に所定量の
標品（抗腫瘍性成分５ＰＦｔｏ−１０）を目的濃度にな
るように培養液に溶解した０、５ｍＱを注加して、３７
℃で５％ＣＯ２存在下に培養した。標品を添加して４８
時間後にトリパンブルーによる染色をおこない、次式に
よりＩＲ（％）を算出した。

ここで（Ａ）とは対照群の生細胞数を示す。

対照は標品を含まない培養液０．５＋ｎＱを用い同時に
行った。

アンスロン硫酸法による呈色反応 脱イオン水に溶解し目的濃度にした標品１ｍＱに２ＩＩ
ＩＱのアンスロン試薬（０，２０ｇｒのアンスロンを１
００ｍＱの濃硫酸に溶解したもの）を注加し、混合３０
分後、標品１ｍ１２に代えて脱イオン水ｌｌ１ＩＱに２
ｎ＋Ｑのアンスロン試薬を注加した液を対照として６２
０ｎｍで吸収を測定する。定量値はグルコースを用いて
同様に測定して得た検量式より求める。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ ストレプトコッカス・ピオゲネス （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）　
ＡＴＣＣ２１０６０をＢＨＩ培地１００ｍ　ｆｌに接種
して３７℃、８時間静置培養をおこなって得た種培養液
を第１表に示す培地Ａ１１ｌｌに接種し、種培養と同一
条件で嫌気的に前培養を行つた・ 第１表　培地Ａ マルトース　　　　　　　　　０．２５％肉エキス　　
　　　　　　　　１．０％ポリペプトン　　　　　　　
１．０％ 酵母エキス　　　　　　　　０．２５％酸性第一燐酸カ
リウム　　　０．１　％硫酸マグネシウム　　　　　　
０．０５％ｐＨ＝６．１１１ １０Ｑジャーファーメンタ−に培地Ａ８Ｑを投入して１
２０°Ｃ１１０分間加熱殺菌後、３７℃まで冷却して、
前培養液ＩＱを接種し、３７℃、１５．５時間、ｐＨ６
，８，３００回転／分で攪拌しながら嫌気的に培養する
。次いでペニシリン０１０００単位／　ｍ　Ｑ培養液に
なるように添加して、培養を更に５時間継続した。

１１）られた培養液を遠心分離にかけて菌体を除去した
。

培養濾液は１分画分子量１０，０００の限外濾過膜（米
国、ロミコン社）を用いて、１．５Ｑに濃縮した。

この濃縮液を、　ＤＥＡＥセルロースカラム（５Ｘ　７
０ｃｍ）に吸着させた後、１０ｍＭ、　ｐＨ１，０の燐
酸１ｉｆｔ衝液を用いて、洗浄し、次いで０．３Ｍ塩化
ナトリウムを含む上記燐酸緩衝液を用いて、段階的に溶
出させ、アンスロン硫酸法による呈色反応陽性でかつ培
養細胞Ｌ１２１０の生育を阻害する活性画分を分取した
。

この活性画分をＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラム
（７，５Ｘ　５０ｃｍ）に吸着させ、次いで上記燐酸緩
衝液で洗浄後塩化ナトリウム濃度を直線的に上昇させて
溶出を行い、培養細胞Ｌ　１．２１０に対して活性のあ
る部分を分取する。この溶出曲線は第３図に示される。

第３図において点線部分は非吸着部分で、実線部分は塩
化ナトリウム添加部分である。

Ａは培養細胞Ｌ　１２１０生育阻害活性画分で、、　Ｍ
Ｐ−２（特開昭６Ｏ−３０６８９）生育阻害非活性画分
であり、Ｂは培養細胞Ｌ　１２１０生育阻害非活性画分
で、肝−２生育阻害活性画分である。

Ａの活性画分の溶出液を分画分子ｍｌＯ，０００の限外
濾過膜（ミリポア社）で３０ｍ　Ｑに濃縮する。この濃
縮液を１ヘヨパール）ＩＷ５０Ｆカラム（５，ＯＸ　１
００ｃｍ）に吸着させ、次いで、上記燐酸緩衝液中に塩
化ナトリウム０．ＩＭを含む溶液で溶出させ、アンスロ
ン硫酸法による呈色反応陽性の画分を分取した。この溶
出曲線は第４図に示される。第４図において実線は全体
の溶出曲線を示し、点線はアンスロン硫酸法による呈色
反応陽性部分の溶出曲線を示している。ここで、Ｃはア
ンスロン硫酸法による呈色反応陽性画分であるが、培養
細胞Ｌ１２１０に対する生育阻止活性を調べ活性の強い
Ｖｏ付近の、アンスロン硫酸法でピークを形成するＤ画
分を得る。Ｄの画分を凍結乾燥した。この凍結乾燥標品
は、゛抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１０であり１　、７０
ｇｒを得た。

実施例２ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは３００単位／ｍＱ培養液
となるように添加し、更に培養を１０時間継続した。こ
の培養濾液に硫安を添加し５０〜９０％飽和度の画分を
分取する。

透析により硫安を除き実施例１と同様に精製して抗腫瘍
性成分ＳＰＦ１０−１００，８６ｇｒを得た。

実施例３ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは３０００単位／ｌａｎ培
養液となるように添加し、更に培養を３時間継続した、
この培８濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分
ＳＰＦ１０−１０１，９３ｇｒを得た。

実施例４ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第２表に示した培地Ｂを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１０１，２３ｇｒを得た。

第２表　培地Ｂ マルトース　　　　　　　　０．１％ 肉エキス　　　　　　　　　　０．５％ポリペプトン　
　　　　　　１．０％ 酵母エキス　　　　　　　　０．２５％塩化ナトリウム
　　　　　　０．１％ ｐｎ＝７．２ 実施例５ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第３表に示した培地Ｃを用いて実施例１と同様に３５℃
で培養した。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／
ｍＱ培養液となるように添加し、更に培養を５時間継続
した。この培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍
性成分ＳＰＦ１０−１００，９２ｇｒを得た。

第３表　培地Ｃ マルトース　　　　　　　　　０．１％肉エキス　　　
　　　　　　０．５％ ポリペプトン　　　　　　　０．５％ カザミノ酸　　　　　　　　０．３％ 酵母エキス　　　　　　　　０．５％ 酸性第一燐酸カリウム　　　０．１％ 硫酸マグネシウム　　　　　０．０５％ｐＨ＝６．５ 実施例６ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第４表に示した培地りを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｒｔｒＱ
培養液となるように添加し、更に培養を５時間継続した
。この培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成
分ＳＰＦ１０−１００，７３ｇｒを得た。

第４表　培地Ｄ マルトース　　　　　　　　０．２５％カザミノ酸　　
　　　　　　０．３％ 酵母エキス　　　　　　　　　１．０％酸性第一燐酸カ
リウム　　　ｏ、ｉ％ 硫酸マグネシウム　　　　　　０．０５％ｐＨ＝６．９ 実施例７ ストレプトコッカス・エスピーＡＴＣＣ２１５９７を第
１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養した
。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ培養液
となるように添加し、更に培養を５時間継続した。この
培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分ＳＰ
Ｆ１０−１０１，３１ｇｒを得た。

実施例８ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１５４６を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１０１，４５ｇｒを得た。

実施例９ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１５４７を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは］、　ＯＯＯ単位／ｍＱ
培養液となるように添加し、更に培養を５時間継続した
。この培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成
分ＳＰＦ１０−１０１，４８ｇｒを得た。

実施例１０ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１５４８を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ＠養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１０１，２６ｇｒを得た。

実施例１１ ストレプトコンカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、セファロスポリンＣは６００μｇ／ｍＱ
、培養液となるように添加し、更に培養を５時間継続し
た。この培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性
成分ＳＰＦ１０−１０１，５７ｇｒを得た。

実験例１ 実施例１で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１０（以
下、　ＳＰＦ１０−１０という）のインビトロにおける
抗腫瘍活性試験は、本文中に記載した抗腫瘍活性の測定
方法により行い、その結果を第５表に示す。

第５表　ＳＰＦ１０−１０の抗腫瘍活性の結果ＳＰＦ１
０−４０（ｍｇ／ｍＱ）　　　　ＩＲ％１．０　　　　
　　　９４．０ ０．５　　　　　　　８１．６ ０．２５　　　　　　２５．５ 実験例２ 実施例１で得られたＳＰＦ１０−１０のインビボにおけ
る抗腫瘍活性試験は、Ｃｒｊ　；　ＣＤ−１（ＩＣＲ系
、雌性７週ｆ６）マウスを使用して実施した。

腫瘍細胞としては、Ｓａｒｃｏｍａ−１８０腹水癌細胞
を用いこれを生理食塩水に浮遊させ、マウスの腹膣内に
５　Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ／マウス接種した。

５ＰＦ１０−１０は、癌細胞接種２４時間後から、１日
１回５日間連続して腹膣内に投与し、その生存数をＭＱ
しその結果を第６表に示す。

第６表において、ＳＰＦ１０−１０を目的濃度に調整し
、その１／２量はそのまま使用し、残り１／２量は、沸
とう水中２０分間加熱処理後投与した場合を最下段に示
した。

第６表　５ＰＦＩ（）−１０の抗腫瘍活性−マウスの生
存数日数　　　　　Ｏｔｏ　　１５　２０　２５　３０
コントロール　　　　　１０／１０　９／１０　０／１
０　０／１０　０／ｌｏ　　Ｏ／１０ＳＰＦ１ｆ）−１
０（１，５ｍｇ／マウス）　　　　１０／＋０　　１０
／１０　　９／１０　　８／１０　　８／１０　　７／
１．０ＳＰＦ１０−１０，力Ｗ製り６徒用ＣＩＬ＞　　
　８／８　　　８／８　　８／８　　８／８　　８／８
　　８／８実験例３ 実施例２で得られたＳＰＦ１０−１０の抗体産生能促進
試験を下記の方法により行った。

ヒツジ赤血球（ＳＲＤＣ）　（以下、Ｓ　ＲＩＩ　Ｃと
いう）は、Ｃｒｊ　；　Ｃｏ−１（ＩＣＲ系雌性５週齢
）の尾静脈に２Ｘ１０７コ／マウス接種する。

５ＰＦ１０−１０は、５ＲＢＣ接種前３日目から１日１
回３日間及び５ＲＢＣ接種後１日目から１日１回３日間
合計６回Ｍｉ腟内に投与する。

抗血清は、　５ＲＢＣ投与１８日目にマウス心臓から採
血し調整する。

抗体産生活性は、５ＲＢＧとの凝集反応及び補体を加え
、　５ＲＢＣの溶血の２種類の方法で調へた。

それぞれ５ＲＢＣは、２Ｘ１０’コ／ｍＱを５０μＱを
用い、又、抗血清は５０μＱを用いた。

抗血清は、２倍階段希釈法により希釈し、それぞれの反
応の生じる最大希釈倍数を求め、希釈係数の平均値とし
て表示し、第７表に示す。

第７表　ＳＰＦ１０−１０の抗体産生能促進効果凝集反
応希釈係数　溶血反応希釈係数 コントロール　　　　　　５．７　　　　　　７．３Ｓ
ＰＦＩＯ−１０２０ｍｇ／ｋｇ　　　　　９．０　　　
　　　９．０ＳＰＦ１０−１０２ｍｇ／ｋｇ　　　　　
８．８　　　　　　８．６実験例４ 実験例２で得られたＳＰＦ１０−１０の固形癌に対する
抗腫瘍活性試験は、Ｃｒｊ　；　ＣＤ−１（ＩＣＲ系、
雌性５週齢）マウスを使用し実施した。

固形癌細胞としては、Ｓａｒｃｏｍａ　１８０を用い、
マウス左大腿部皮下に５　Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ／マ
ウス接種した。

５ＰＦ１０−１０は、癌細胞接種２４時間後から１日１
回５日間連続して腹腔内に投与し、癌細胞接種３２日ロ
ー、固形癌を切り取り、その重量を測定した。

その重量の平均値を第８表に示す。

第８表　ＳＰＦ、１０−１０の固形癌に対する作用固形
癌重量　抑制率 コントロール　　　　　７．９６ｇｒ ＳＰＦＩＯ−１０２０ｍｇ／ｋｇ　　　　２．２１　　
　７２．２％ＳＰＦ１０−１０２ｍｇ／ｋｇ　　　　２
．７４　　　６５．６％実験例５ 実施例２で得られたＳＰＦ１０−１０のＴＮＦ誘導活性
の測定は、原中勝征；　ｆｆＴＮＦＪ］日本医事新報社
（１９８４）を参考にして、下記の通り行った。

マウス（Ｃｒｊ　；　ＣＤ−１、ＩＣＲ系、雌性７週齢
）の腹腔にＢＣＧ　（日本ビーシージー製造協会）　５
　ｍｇを接種し、（１次感作）、２週間後、ＳＰＦ１０
−１０を尾静脈より投与し、（２次感作）、ＳＰＦ１０
−１０投与２時間後心臓から採血し、血清を調整する。

検定細胞は１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ　１６４０培地（
５ｍｇ／Ｑカナマイシン含有）で３〜４日間培養したＬ
９２９細胞を用いる。

Ｌ９２９細胞は、Ｉ　Ｘ　１０’ｃｅｌｌｓ／ｍＲの懸
濁液０　、５ｍＱをファルコン２４　ｗｅｌｌｓに注加
する。

ここに、上記血清を上記ＲＰＭＩ　１６４０培地で２０
倍希釈しその０．５１１ＩＱを注加温合後、３７℃５％
ＣＯ，存在下４８時間培養する。

ＴＮＦ誘導活性の測定は、Ｌ９２９細胞をトリパンブル
ーで染色し、色素排除法で生細胞数を計測した。

その結果を第９表に示す。

第９表　ＳＰＦ１０−１０のＴＮＦ誘導活性実験例６ 実施例１で得られたＳＰＦ１０−１０のマクロファージ
の培養細胞Ｊ−７７４−１（以下、Ｊ−７７４−１と略
す）に対する変形活性の測定は、下記の通り行った。

Ｊ−７７４−１は１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ　６４０培
地（５ｍｇ／Ｑカナマイシン含有）で３〜４日培養後、
１０　Ｘ　１０’コ／　ｍ　Ｑに調整する。

ｓｐｒ”ｔｏ−ｉｏは、生理食塩水で５ｍｇ／ｍＱとし
、０．２２μｍの除菌フィルターで濾過し、１０μＱず
つ９６穴のｗｅ’ｌｌ　（ファルコン）に２倍階段希釈
法により分注する。

各ｗｅｌｌに上記Ｊ−７７４−１１艷濁液１００　μＱ
注加し、９６時間３７℃５％ＣＯ□条件下で培養する。

変形活性の測定は、各ｗｅｌｌを倒立顕微鏡上観察し、
形態変化（球状から伸展し細長くなる）を誘起する最少
濃度を求めた。その結果を第１０表に示す。

変形誘起最少濃度 ＳＰＦ１０−１０２５，０μｇ／ｍＱ

【図面の簡単な説明】

第１図は抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１０の紫外線吸収ス
ペクトルを示し、第２図は同じく赤外線吸収スペクトル
を示す。第３図は実施例１における活性画分のＤＥＡＥ
セファデックスＡ−２５カラムの溶出曲線を示す図で、
第４図はこのＡ画分をトヨパールＨＷ５０Ｆカラムに吸
着させ、０．ＩＭ　ＮａＣｌ２燐酸Ｍ！衝液による溶出
曲線を示す図である。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 第　　１　　　図 ｎｍ 第　　３　　図 ２ｊ！４　　　図 □Ｆ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有する抗腫瘍性成分ＳＰＦ
   １０−１０。 １、元素元析　Ｃ　３９．５〜４３．５％ Ｈ　５．８〜６．７％ Ｎ　７．３〜１０．４％ Ｏ　４６．９〜３７．５％ Ａｓｈ　０．５〜１．９％ ２、分解点　本物質は１６５℃で褐変し２４０℃になる
   と黒色となり分解する。 ３、比旋光度〔α〕＾２＾０＿Ｄ＝＋５°〜＋３０°（
   Ｃ＝１．００）４、紫外線吸収スペクトル　本物質０．
   １％の水溶液の紫外線吸収スペクトルは第１図に示され
   る。 ５、赤外線吸収スペクトル　第２図に示される。 ３３００ｃｍ＾−＾１付近および１６４０ｃｍ＾−＾１
   付近のペプチドによる吸収、又、８４０ｃｍ＾−＾１の
   糖による吸収が認められ特徴的である。 ６、塩基性、酸性、中性の区別　本物質０．１％の水溶
   液のｐＨは５．５〜６．０である。 ７、物質の色　淡褐色 ８、呈色反応 ローリー反応　＋ ビューレット反応　＋ ニンヒドリン反応　＋ アンスロン硫酸反応　＋ モーリッシュ反応　＋ システイン硫酸反応　＋ オルシン塩酸反応　− ９、分子量　ゲル濾過法による測定では分子量約１０，
   ０００以上である。 １０、溶剤に対する溶解性　水に可溶であるが、メタノ
   ール、エタノール、ｎ−プロパノール、アセトン、エチ
   ルエーテル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル
   等の溶剤には、難溶又は不溶である。
2. （２）ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分ＳＰ
   Ｆ１０−１０生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性成分
   ＳＰＦ１０−１０を採取することを特徴とする抗腫瘍性
   成分ＳＰＦ１０−１０の製法。
3. （３）ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分ＳＰ
   Ｆ１０−１０生産菌を培養するに際し、培養中の適当な
   時期にペニシリン又はその関連物質を添加して培養する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍
   性成分ＳＰＦ１０−１０の製法。
4. （４）ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分ＳＰ
   Ｆ１０−１０生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性成分
   ＳＰＦ１０−１０を採取するに当たり、培養細胞Ｌ１２
   １０の生育を阻害し、又は／及びアンスロン硫酸法によ
   る呈色反応陽性の画分を分取することを特徴とする特許
   請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１
   ０の製法。