EA012164B1 - Антибиотик 107891, его факторы а1 и а2, фармацевтически приемлемые соли и композиции и их применение - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к антибиотическому веществу микробного происхождения, произвольно названному 107891, продуцируемому путем ферментации Microbispora sp. PTA-5024, его фармацевтически приемлемым солям и композициям и их применению в качестве антибактериального агента, обладающего ингибирующей активностью против чувствительных микробов. Антибиотик 107891, представляющий собой комплекс, содержащий два фактора, обозначенные как факторы А1 и А2, имеет пептидную структуру, содержащую лантионин и метиллантионин в качестве составляющих, которые характерны для антибиотиков группы лантибиотиков. Антибиотик 107891 и его факторы А1 и А2 демонстрируют хорошую антибактериальную активность против грамположительных бактерий, включая штаммы, резистентные к метициллину и ванкомицину, и также активны против некоторых грамотрицательных бактерий, таких как М. catharralis, виды Neisseria и Н. influenzae и Mycobacteria.

Description

Настоящее изобретение относится к антибиотическому веществу микробного происхождения, произвольно обозначаемому как антибиотик 107891, представляющему собой комплекс, содержащий факторы А1 и А2, его фармацевтически приемлемым солям, фармацевтическим композициям и их применению в качестве антибактериального агента.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения антибиотика 107891, включающий культивирование М1егоЫкрога кр. 107891 (далее идентифицированного как М1егоЫкрога кр. АТСС РТА-5024) или его варианта или мутанта, с сохранением его способности продуцировать указанный антибиотик, выделение антибиотика по изобретению из мицелия и/или из ферментационного бульона, выделение чистого вещества при помощи хроматографических средств и отделение факторов А1 и А2.

Антибиотик 107891 представляет собой новый антимикробный агент, имеющий пептидную структуру, содержащую в качестве составляющих лантионин и метиллантионин. Они представляют собой типичные характеристики лантибиотиков и, в частности, подгруппы, действующей прежде всего на биосинтез клеточной стенки.

Лантибиотики представляют собой пептиды, содержащие тиоэфирную аминокислоту лантионин, а также несколько других модифицированных аминокислот (Н.О. 8ай1 апб О. ШегЬаит, (1998) ЬапбЬю!1ек: ЬюкупШебк апб Ью1оДеа1 аебуШек о! ипк|ие1у тобШеб рерббек Ггот дгат-рокЮуе Ьае1еба, Апп. Кеу. М1егоЬю1. 52: 41-79). Большая часть известных лантибиотиков обладает антибактериальной активностью, хотя о некоторых сообщалось, что они являются активными в отношении других фармакологических мишеней. Антибактериальные лантибиотики могут быть в общем виде разделены на две группы на основе их структур: лантибиотики типа-А представляют собой, как правило, удлиненные амфифильные пептиды, тогда как лантибиотики типа-В являются компактными и глобулярными (О. МеАибйе, К.Р. Кокк апб С. Н111, (2001): ЬапбЬюбек: кбиеФге, ЬюкупШебк апб тобе оГ аебоп, ЕЕМ8 МюгоЬ. Кеу. 25: 285308). Низин является типичным представителем лантибиотиков типа А, тогда как актагардин (гардимицин) и мерсацидин относятся к подклассу лантибиотиков типа В. Лантибиотики типа низина и типа мерсацидина взаимодействуют с липидом II, предшественником связанных с мембраной пептидогликанов, хотя эти два класса отличаются действиями, которые они оказывают в процессе бактериальной пролиферации. Лантибиотики низинового типа прежде всего убивают бактерии путем пермеабилизации цитоплазматической мембраны (Н. ΒιόΙζ, М. 1ок1еп, I. ^ебетапп, и. 8ейпе1бег, Е. Сок, О. В1егЬаит апб Н.О. 8а111 (1998): Ко1е оГ йр1б-Ьоипб рерббоДуеап ргееигкогк ш 1йе Гогтабоп оГ рогек Ьу πίδίπ, ер1бегтш апб оШег 1апбЬюбек, Мо1. М1егоЬю1. 30: 317-27), тогда как лантибиотики мерсацидинового типа прежде всего убивают бактериальную клетку путем ингибирования биосинтеза клеточной стенки (Н. Вгок, О. В1егЬаит, К. Ьеоро1б, Р.Е. Кеупо1бк апб Н.О. 8а111 (1998): Тбе 1апбЬюбе тегкае1бт ббиЬйк рерббод1уеап куп111ебк Ьу 1агдебпд 11р1б II, Апбт1егоЬ Адеп1к СйетоШег. 42: 154-60).

Два антибиотика, продуцируемых М1егоЫкрога еогаШпа штамм ΝΒΚ6Ε 30420, идентифицированные соответственно как антибиотик МЕ-ВА-1768а₁ и МЕ-ВА-1768в₁, описаны в И8 6551591 В1. Физикохимические данные, представленные в вышеуказанном патенте (например, данные масс-спектрометрии, молекулярная масса, содержание аминокислот) и сравнение времен удерживания в экспериментальных анализах путем жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ-МС) ясно демонстрируют, что антибиотический комплекс 107891, а также его компоненты фактор А1 и фактор А2 представляют собой химические соединения, отличающиеся от антибиотиков МЕ-ВА 1768αι и МЕ-ВА-176831. ЕР 0592835А2 описывает противоопухолевые антибиотики ВИ-4803ТА1, А₂, В, С₁, С₂ и Ό. Антибиотики ВИ-4803ТА1 А₂, и В выделяют из ферментационного бульона М1егоЫкрога АТСС 55327 (АА 9966), тогда как антибиотики ВИ4803ТС1 С₂ и Ό представляют собой продукты трансформации антибиотика ВИ 4803ТА_Ь А₂ и В соответственно, когда эти продукты хранят в диметилсульфоксиде. Физико-химические данные, о которых сообщается в ЕР 0592835 А для вышеприведенных антибиотиков (например, поглощение ультрафиолета (УФ), молекулярная масса, противоопухолевая активность) очевидно демонстрируют, что они представляют собой химические вещества, отличающиеся от антибиотического комплекса 107891 и его факторов А1 и А2.

Штамм и ферментация

М1егоЫкрога кр. 107891 выделили из окружающей среды и 27 февраля 2003 г. депонировали в Американской коллекции типовых культур (Атепеап Туре СиИше Собеебоп) (АТСС), 10801 Ишуегкйу В1уб, Мапаккак УА, 20110-2209 И8А, в соответствии с Будапештским договором. Штамму был присвоен номер РТА-5024.

Продукцию антибиотика 107891 осуществляют путем культивирования штамма М1егоЫкрога кр., способного продуцировать его, т.е. М1егоЫкрога кр. АТСС РТА-5024 или его варианта или мутанта, с

- 1 012164 поддержанием их способности продуцировать указанный антибиотик; выделения получающегося в результате антибиотика из цельного культурального бульона и/или из выделенного мицелия, и/или из профильтрованного ферментационного бульона; и очистки выделенного антибиотика при помощи хроматографических средств. В любом случае предпочтительно продуцировать антибиотик 107891 в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей легко ассимилируемые источники углерода, азота и неорганические соли. Может быть использовано множество питательных сред, обычно используемых в области ферментации, тем не менее, предпочтительны некоторые среды.

Предпочтительные источники углерода представляют собой сахарозу, фруктозу, глюкозу, ксилозу и т.п. Предпочтительные источники азота представляют собой соевую муку, пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, триптон, аминокислоты, гидролизованный казеин и т.п. Среди неорганических солей, которые могут быть включены в культуральные среды, имеются традиционные растворимые соли, способные к обеспечению ионами натрия, калия, железа, цинка, кобальта, магния, кальция, аммония, хлоридом, карбонатом, сульфатом, фосфатом, нитратом и подобными ионами.

Предпочтительно штамм, продуцирующий антибиотик 107891, предварительно культивируют в бродильной трубке или качалочной колбе, затем культуру используют для инокуляции ферментационных сосудов для продуцирования значительных количеств веществ. Среда, используемая для предварительного культивирования, может быть той же самой, что и используемая для более масштабных ферментаций, но также могут быть использованы другие среды. Штамм, продуцирующий антибиотик 107891, можно выращивать при температуре от 17 до 37°С, причем оптимальная температура составляет приблизительно 28-30°С.

Продуцирование антибиотика 107891 в ходе ферментации можно контролировать путем биоанализа на чувствительных микроорганизмах и/или посредством ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) анализов. Максимальная продукция антибиотика 107891 как правило имеет место приблизительно между 90 и 200 часами ферментации.

Антибиотик 107891 продуцируют путем культивирования МктоЫкрота кр. АТСС РТА-5024 или его варианта или мутанта, способного продуцировать антибиотик 107891, и он обнаружен в культуральных бульонах и/или в мицелии.

В этом описании и формуле изобретения термин антибиотик 107891, если не указано иначе, определяет антибиотический комплекс 107891, содержащий факторы А1 и А2.

Морфологические характеристики МкгоЫкрога кр. АТСС РТА-5024

МктоЫкрота кр. АТСС РТА-5024 хорошо растет в различных стандартных твердых средах. Микроскопические размеры измеряли с использованием культуры, выращенной на агаре с гуминовой кислотой и солями микроэлементов (состав в г/д: гуминовая кислота 0,5, Ре8О₄-7Н₂О 0,001, МпС1₂-4Н₂О 0,001, ΖηδΘ₄·7Η₂Θ 0,001, ΝίδΟ₄·6Η₂Ο 0,001, МОР8 2, агар 20) с добавлением 1 мл/л раствора витаминов (тиамина гидрохлорид 25 мг/л, пантотенат кальция 250 мг/л, никотиновая кислота 250 мг/л, биотин 0,5 мг/л, рибофлавин 1,25 г/л, цианокобаламин 6,25 мг/л, парааминобензойная кислота 25 мг/л, фолиевая кислота 500 мг/л, пиридоксаля гидрохлорид 500 мг/л).

В жидкой культуре (среда У6, состав в г/л: декстроза 22, мясной экстракт 5, дрожжевой экстракт 5, казеин 3, ΝαΟΊ 1,5) не обнаружена фрагментация мицелия после 6 дней роста при 28°С. Микроскопическое исследование на агаре с гуминовой кислотой и солями микроэлементов (через 21 день инкубации при 28°С) выявляет разветвленный нефрагментированный субстратный мицелий и моноподиально разветвленный воздушный мицелий; также различимо множество длинных, прямых и слаборазветвленных воздушных гиф. Характерные продольные пары спор закачанчиваются короткими спорофорами, латерально происходящими из ветвей или непосредственно из основных воздушных гиф. Споры сферические и неподвижные. Тельца, напоминающие спорангий, или другие особые структуры не обнаружены.

Культуральные характеристики МкгоЫкрога кр. АТСС РТА-5024

МктоЫкрота кр. АТСС РТА-5024 в течение шести дней выращивали в жидкой среде АР/М8 (см. пример 1) при 28°С и 200 об./мин, затем переносили (5% инокулюма) в новую жидкую среду АР/М8 и выращивали в течение еще 6 дней и затем инокулировали (7% инокулюма) в 100 мл жидкой среды У6 (см. пример 1). После выращивания в течение 6 дней при 28°С и 200 об./мин мицелий собирали путем центрифугирования и трижды промывали стерильным физиологическим раствором, затем разбавляли с получением подходящего инокулюма. Аликвоты суспензии поперечными штрихами наносили на различные среды, рекомендованные 8Ыт1шд и СоййеЬ (Е.В. 8Ыт1шд апб Ό. СоййеЬ, (1966): МеЫоб £от С11агас1епха1кп о£ 81гер1отусек крескк, Ιηΐ. 1. 8ук1. Васктю1. 16: 313-340), и среды, рекомендованные 8.А. ХУакктап (1961): Т1е Асбпотусекк, Т1е ^1Шатк апб ХУбктк Со., ВаЫтоге. Уо1.2: 328-334).

Способность использовать различные углеводы в качестве источника углерода и энергии определяли с использованием среды Ι8Ρ4 без крахмала с добавлением 1 мл/л описанного выше раствора витаминов в качестве базовой среды; каждый источник углерода добавляли в конечной концентрации 1% (мас./об.).

Устойчивость к №С1, диапазон рН для роста, а также способность расти при различных температурах определяли на среде Ι8Ρ2. Все среды инкубировали при 28°С в течение трех недель; если не указано

- 2 012164 иначе, описания относятся к 21 дню. Окраску оценивали при естественном свете с использованием Атласа окрашивания Мает/ и Раи1 (А. Мает/ апб М.К.. Раи1, 1950 - А ОкИоиагу οί Со1оиг, 2иб ебйюи. МсСгатеН111 Воок Со. 1ис., Ыете Уотк). Способность восстанавливать нитраты до нитритов оценивали в жидкой нитратной среде в соответствии со способом, описанным ^1Шаш8 е! а1. (8.Т. ^ИНашз, М. СообГе11о\у. С.А1бег8ои, Е.М.Н.^еШид1ои, Р.Н.А. 8иеа1й & М.1. 8аскш, 1983 - Ыитег1са1 с1а88Йтса1юи оГ 81тер1отусе5 апб ге1а!еб деиега - 1. Сеи. М1сгоЫо1. 129, 1743-1813).

Рост. появление колоний, окраска субстратного и воздушного мицелия и продукция пигмента для штамма МютоЬщрота §р. АТСС РТА-5024 представлены в табл. I. Вегетативный рост присутствует на большей части используемых сред в отличие от воздушного мицелия, который присутствует только на некоторых из них. На всех использованных средах пигментация отсутствовала. Физиологические характеристики штамма представлены в табл. II. Рост и продуцирование воздушного мицелия происходят при 17°С, но не при 43°С. Продуцирование воздушного мицелия на 18Р2 происходит при рН больше 6 и отсутствует в присутствии 1%№1С1.

Способность использовать различные углеводы для роста представлена в табл. III.

Таблица I

Характеристики роста МютоЬщрота §р. АТСС РТА- 5024

СРЕДА	РОСТ И МОРФОЛОГИЯ	Код обращения цвета
Ι8Ρ2 Агар на основе дрожжевого экстрактасолодового экстракта	Обильный рост, морщинистая поверхность; хорошая продукция розоватого (2А8) воздушного мицелия. Слабая продукция оранжевого/светлокоричневоГО растворимого пигмента.	5Е12 оранжевый/крас- ный
Ι8Ρ3 Агар на основе овсяной муки	Обильный рост; хорошая продукция розоватого (2А8) воздушного мицелия, в частности на перекрещивающихся штрихах сетки. Слабая продукция оранжевого растворимого пигмента.	11Н10 оранжевый/розо- ВЫЙ
Ι8Ρ4 Агар на основе неорганических солей-крахмала	Хороший рост; отсутствие продуцируемого воздушного мицелия. Отсутствие продуцируемых растворимых пигментов. Гидролизованный крахмал.	1119 оранжевый
С1и/Авр Глюкозоаспарагиновый агар	Дискретный рост, тонкий; продукция тонкого, бежевого/розоватого (9В4) воздушного мицелия на перекрещивающихся штрихах сетки. Отсутствие продуцируемых растворимых пигментов.	12К 12· оранжевый/светло- коричневый
Ι8Ρ6 Агар на основе пептонадрожжевого экстракта-жел еза	Скудный рост, с наличием розоватых единичных колоний, растущих в высоту, скрученных, с морщинистой поверхностью; отсутствие продукции воздушного мицелия. Отсутствие потемнения среды.	не определяли

- 3 012164

Ι8Ρ7 Тирозиновый агар	Слабый рост тонкого, оранжеватого/светлокоричневого субстратного мицелия; отсутствие продукции воздушного мицелия. Отсутствие потемнения среды.	не определяли
Ι8Ρ3+ΥΕ Агар на основе овсяной муки/ 1% дрожжевого экстракта	Обильный рост, морщинистая поверхность; очень скудная продукция тонкого, розоватого воздушного мицелия. Отсутствие продукции растворимых пигментов.	4 В 12 оранжевый/красный

(Ι8Ρ4 и глюкозо-аспарагиновый агар добавлен с 1 мл/л раствором витаминов)

Таблица II

Физиологические характеристики М1стоЬ18рога §р. АТСС РТА-5024

Тест	Реакция
Гидролиз крахмала	Положительная
Гидролиз казеина	Отрицательная
Расщепление малата кальция	Отрицательная
Пептонизация бактериологической среды с индикатором рН	Отрицательная
Коагуляция бактериологической среды с индикатором рН	Отрицательная
Разжижение желатина	От отрицательной до слабоположительной
Тирозиновая реакция	Отрицательная
Восстановление нитрата	Положительная
Диапазон рН для роста (14 дней)	отсутствие роста при 4,2, хороший при 5,5-8,8; не тестировали за пределами этого диапазона. Воздушный мицелий отсутствует при рН не больше 6,5
ХаС1, % толерантности	не больше 2; отсутствие воздушного мицелия при не менее 1
Диапазон температур для роста	от 17°С до 37°С. Присутствие воздушного мицелия во всем диапазоне; отсутствие роста при 43°С |

- 4 012164

Таблица III

Использование источников углерода М1сгоЬ18рога 8р. АТСС РТА-5024

Источник углерода	Рост (14 дней)
Арабиноза	+ -1-
Целлюлоза	-
Фруктоза	++
Инозит	+/-
Маннит	+4-4-
Раффиноза	-
Рамноза	-
Сахароза	4—Ы-
Ксилоза	+++
Глюкоза
Глицерин	4-4-
Отсутствие сахара	-

+++ обильный; ++ хороший рост; + умеренный рост; +/- ограниченный рост; - отсутствие роста; воздушный мицелий всегда отсутствует.

Хемотаксономические характеристики М1сгоЫ«рога «р. АТСС РТА-5024

М1егоЫ8рога 8р. АТСС РТА-5024 выращивали в среде СУМ (глюкоза 4 г/л; дрожжевой экстракт 4 г/л; солодовый экстракт 10 г/л) при 28°С на роторной качалке, мицелий собирали, дважды промывали стерильной дистиллированной водой и затем сушили замораживанием. Анализы аминокислот осуществляли в соответствии со способом 8!апеск и РоЬег18 (1.Ь. 8!апеск апб С.И. РоЬег18 (1974): 81трйГ1еб арргоасй 1о 1бепйГка!юп о! аегоЫс ас!шотусе!е8 Ьу 1йт-1ауег сйготаЮдгарйу. Арр1. МкгоЬю1. 28: 226-231). Менахиноны и полярные липиды экстрагировали в соответствии со способом Мтшкт е! а1. (Ό.Ε. М1пткт. А.С. О'Поппе11. М. СообГе11о\у. С. А1бег8оп. М. А1йа1уе, А. 8сйаа1 и Ι.Η. Раг1е!! (1984): Ап ткдгакб ргосебиге оГ 18оргепо1б с.|шпопе8 апб ро1аг Иртб8. I. МкгоЬю1. Ме!й. 2: 233-241). Полярные липиды анализировали соответственно посредством тонкослойной хроматографии (И.Е. Мшшкш. V. Ра!е1. Ь. А18йатаопу. апб М. СообГе11о\у (1977): Ро1аг Иртб сотро8Йюп т 1йе с1а88Шсайоп оГ Иосагб1а апб ге1а!еб Ьас!епа. 1п!. I. 8у81. Вас!егк1. 27: 104-117). менахиноны - посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (В.М. Кгорреп8!еб! (1982): 8ерагайоп оГ Ьас!епа1 тепас.|шпопе8 Ьу НРЬС и8тд геуегае рйа8е РР18 апб а 8буег 1оабеб юп ехсйапдег а8 8!а!юпагу рйа8е. I. Ыдшб. Сйгота!. 5: 2359-2367; В.М. Кгорреп8!еб! (1985): ЕаЬу ас1б апб тепас.|шпопе апа1у818 оГ ас!шотусе!е8 апб ге1а!еб огдат8т8. т: Сйет1са1 Ме1йоб8 ш Вас!епа1 8у8!ета!к8. Ио 20 8АВ Тесйтса1 8егк8 рр. 173-199. М. СообГе11о\у апб Ό.Ε. Мтшкт еб8. Асабетк Рге88. Еопбоп). а метиловые эфиры жирных кислот - посредством газожидкостной хроматографии (Ь.Т. МШег (1982): А 81пд1е бепуаЬ/а1юп те!йоб Гог Ьас!епа1 Гайу ас1б те!йу1 е81ег8 ίπс1ибтд йубгоху ас1б8. I. С1ш. МкгоЬю1. 16: 584-586; М. 8а88ег (1990): 'ТбепйГкайоп оГ Ьас!епа Ьу да8 сйгота!одгарйу оГ се11и1аг Гайу ас1б8. И8ЕСС Ие\У8 Ьейего 20: 1-6). Присутствие миколовых кислот проверяли с помощью метода. предложенного М1пшкш е! а1. (Ό.Ε. М1пп1кш. Ь. А18йатаопу. апб М. СообГе11о\у (1975): ИйГегепйайоп оГ МусоЬас!егшт. Иосагб1а апб ге1а!еб !аха Ьу !йш 1ауег сйготаЮдгарЫс апа1у818 оГ \уйо1е огдап18т те1йапо1уха1е8. I. Сеп. МкгоЬю1. 88: 200-204).

Гидролизаты целых клеток штамма М1сгоЬ18рога 8р. АТСС РТА-5024 содержат мезодиаминопимелиновую кислоту в виде диаминокислоты пептидогликана. Преобладающие менахиноны представляют собой МК-9 (III. νΐΙΙ-Η₄). МК-9 (Н₂) и МК-9 (Н₀). Картина полярных липидов характеризуется наличием фосфолипида. содержащего фосфатидилэтаноламин. метилфосфатидилэтаноламин. фосфатидилглицерин. дифосфатидилглицерин. фосфатидилинозит. фосфатидилинозитманнозиды и Νацетилглюкозамин. т.е. фосфолипида IV типа в соответствии с ЬесНеуайег е! а1. (Н.А. ЬесйеуаНег. С. Эе Впеге апб М.Р. Ьесйеуайег (1977): Сйето!ахопоту оГ аегоЫс ас!шотусе!е8: рйо8рйойр1б сотро8Йюп. Вюсйет. 8у8!. Есо1. 5: 246-260). Основные компоненты паттерна жирных кислот представляют собой ап!е18о 15:0. 18о 16:0. п-16:0. ап!е18о 17:0 и 10-метилгептадекановую (10-Ме-17:0) кислоты. т.е. 3с 8еп8и Кгорреп8!еб! (В.М. Кгорреп8!еб! (1985): Гайу ас1б апб тепас.|тпопе апа1у818 оГ ас!шотусе!е8 апб ге1а!еб огдаш8т8. ш: Сйетка1 Ме!йоб8 т Вас!епа1 8у8!етайс8. Ио 20 8АВ Тесйшса1 8егк8 рр. 173-199. М. СообГейотс апб Ό.Ε. Мшпкт еб8. Асабетк Рге88. Ьопбоп). Миколовые кислоты не обнаружены.

Определение последовательности 168 рДНК МкгоЫзрога «р. АТСС РТА-5024

Частичную последовательность гена 16 рРНК (168 рДНК). т.е. 1443 нуклеотида. соответствующей 95% полноразмерной рРНК штамма МкгоЬ18рога 8р. АТСС РТА-5024. получили в соответствии с опуб

- 5 012164 ликованными методами (Р. Μαζζα, Р. Мопщагйшц Ь. Сауа1ейи Μ. 8окю апй 8. Όοηαάίο (2003): Э|уегкйу оГ Ас!шор1апек апй ге1а!ей депега 1ко1а!ей Ггот ап Иайап кой. МюгоЫа1 Есо1. 5: 362-372). Она приведена в 81Т) ГО N0 1.

Эту последовательность сравнивали с последовательностью штамма МюгоЫкрога согаШпа ΝΒΒΕ 30420 (МЕ-ВА-1768). которая приведена в И8 6551591 В1. Две последовательности выравнивали и различия обнаружили в 3.1 из 1456 выровненных позиций. что составляло общее различие в последовательности 2.13%. Любые два штамма. имеющие менее чем 97.5%-ную идентичность последовательностей. обычно относятся к различным видам (81аскеЬгапй1. Е. апй ЕтЫеу. М.Т. (2000) Э|уегкйу оГ Ипсийегей Мюгоогдашктк т !1е Епуйоптеп!. 1п: №псиЙигаЫе Мюгоогдашктк ш Фе Епуиоптеп!. В.В. Со1^е11 апй Ό.Ε Оптек (ейк). А8М. Ргекк. ^а§Ыпд!оп ЭС. рр. 57-75). Таким образом. 2%-ный уровень различия последовательностей является весьма высоким (Вокке11о-Мога. В.. апй Атапп. В. (2001). Т1е 8реаек Сопсер! Гог Ргокагуо!ек. ЕЕМ8 МюгоЬюк Веу. 25: 39-67) и указывает на то. что МюгоЫкрога кр. АТСС РТА5024 и МюгоЫкрога согаШпа ΝΒΒΕ 30420 (МЕ-ВА-1768) представляют собой различные штаммы.

Идентификация штамма Мюго1йхрога хр. АТСС РТА-5024

Штамм. продуцирующий антибиотик 107891. относят к роду МюгоЫкрога. семейство 81гер!окрогапд1асеае. в силу следующих хемотаксономических и морфологических характеристик:

присутствие мезодиаминопимелиновой кислоты в клеточной стенке;

большое количество МК-9 (III. νΐΙΙ-Η₄) и фосфолипидов IV типа в соответствии с Ьесйеуайег е! а1. (Н.А. Ьесйеуайег. С. Эе Впеуе апй М.Р. Ьесйеуайег (1977): СТетоЮхопоту оГ аегоЫс асйпотусе!ек: р1юкр1юйр|й сотрокйюп. Вюсйет. 8ук!. Есо1. 5:246-260);

профиль жирных кислот 3с кепки Кгоррепк!ей! (В.М. Кгоррепк!ей! (1992): Т1е депик №сагйюрк1к. 1п: Т1е Ргокапо!ек. νο1. II. рр. 1 139-1156. А. Ва1о\гк. Н. Тгирег. М. 0\гогкй1. XV. Нагйег апй К.Н. 8сН1е1Гег ейк; Νο\ν Уогк. 8рппдег^ег1ад);

отсутствие миколовых кислот;

образование характерных продольных пар спор на верхушках коротких спорофоров. латерально ветвящихся от воздушных гиф. Неподвижные споры;

частичная последовательность гена 16 рРНК (168 рДНК). т.е. 1443 нуклеотидов. соответствующая 95% полноразмерной рРНК. представленная в 8ЕС ГО Νο. 1. демонстрирующая более чем 97%-ную идентичность с последовательностями 168 рДНК описанных видов МюгоЫкрога.

Как с другими микроорганизмами. характеристики штамма. продуцирующего антибиотик 107891. подвержены вариации. Например. искусственные варианты и мутанты штамма могут быть получены путем обработки различными известными мутагенами. такими как ультрафиолетовые (УФ) лучи. химические вещества. такие как азотистая кислота. №метил-№-нитро-№нитрозогуанидин. и множество других. Все природные и искусственные варианты и мутанты штамма МюгоЫкрога кр. АТСС РТА-5024. способные продуцировать антибиотик 107891. считаются эквивалентными ему для целей данного изобретения и. таким образом. входят в объем изобретения.

Экстракция и очистка антибиотика 107891

Как упомянуто выше. обнаружено. что антибиотик 107891 почти равным образом распределен как в мицелии. так и в профильтрованной фракции ферментационного бульона.

Собранный бульон может быть подвергнут отделению мицелия от супернатанта ферментационного бульона. и мицелий может быть экстрагирован смешивающимся с водой растворителем с получением раствора. содержащего антибиотик 107891. после удаления истощенного мицелия. Этот экстракт мицелия затем может быть обработан отдельно или вместе с супернатантом в соответствии со способами. которые приведены далее для фракции супернатанта. Когда смешивающийся с водой растворитель может оказывать влияние на операции выделения антибиотика из экстракта мицелия. этот смешивающийся с водой растворитель может быть удален путем отгонки или может быть разбавлен водой до концентрации. которая не оказывает влияния.

Используемый в данной заявке термин смешивающийся с водой растворитель имеет значение. в настоящее время присвоенное в области техники этому термину и относится к растворителям. которые в условиях применения смешиваются с водой в достаточно широком диапазоне концентраций. Примеры смешивающихся с водой органических растворителей. которые могут быть использованы в экстракции соединений по изобретению. представляют собой низшие алканолы. например (С1-С₃)алканолы. такие как метанол. этанол и пропанол; фенил(С1-С3)алканолы. такие как бензиловый спирт; низшие кетоны. например (С₃-С₄)кетоны. такие как ацетон и этилметилкетон; циклические эфиры. такие как диоксан и тетрагидрофуран; гликоли и их продукты частичной этерификации. такие как этиленгликоль. пропиленгликоль и монометиловый эфир этиленгликоля. низшие амиды. такие как диметилформамид и диэтилформамид; диметилсульфоксид уксусной кислоты и ацетонитрил.

Выделение соединения из супернатанта ферментационного бульона продуцирующего микроорганизма осуществляют в соответствии с известными методами. включающими экстракцию растворителями. осаждение путем добавления нерастворителей или путем изменения рН раствора. путем распределительной хроматографии. распределительной хроматографии с обращенной фазой. ионообменной хроматографии. молекулярной вытеснительной хроматографии и т.п. или комбинации двух или более чем двух

- 6 012164 из указанных способов. Процедура выделения соединений по изобретению из отфильтрованного ферментационного бульона включает экстракцию антибиотика 107891 смешивающимися с водой органическими растворителями с последующим осаждением из концентрированных экстрактов, возможно путем добавления осаждающего агента.

Также в этом случае используемый в этой заявке термин несмешивающийся с водой растворитель имеет значение, в настоящее время присвоенное в области техники указанному термину и относится к растворителям, которые в условиях применения слабо смешиваются или практически не смешиваются с водой в достаточно широком диапазоне концентраций, подходящих для предполагаемого применения.

Примеры несмешивающихся с водой органических растворителей, которые могут быть использованы в экстракции соединений по изобретению из ферментационного бульона, представляют собой алканолы, состоящие по меньшей мере из четырех атомов углерода, которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими, такие как н-бутанол, 1-пентанол, 2-пентанол, 3-пентанол, 1-гексанол, 2гексанол, 3-гексанол, 3,3-диметил-1-бутанол, 4-метил-1-пентанол, 3-метил-1-пентанол, 2,2-диметил-3пентанол, 2,4-диметил-3-пентанол, 4,4-диметил-2-пентанол, 5-метил-2-гексанол, 1-гептанол, 2-гептанол, 5-метил-1-гексанол, 2-этил-1-гексанол, 2-метил-3-гексанол, 1-октанол, 2-октанол, циклопентанол, 2циклопентилэтанол, 3-циклопентил-1-пропанол, циклогексанол, циклогептанол, циклооктанол, 2,3диметилциклогексанол, 4-этилциклогексанол, циклооктилметанол, в-метил-5-гептен-2-ол, 1-нонанол, 2нонанол, 1-деканол, 2-деканол и 3-деканол; кетоны, состоящие по меньшей мере из пяти атомов углерода, такие как метилизопропилкетон, метилизобутилкетон, метил-н-амилкетон, метилизоамилкетон и их смеси.

Как известно в области техники, экстракция продукта из профильтрованного ферментационного бульона может быть улучшена путем доведения рН до подходящего значения и/или путем добавления подходящей органической соли, образующей ионную пару с антибиотиком, растворимым в экстрагирующем растворителе.

Как известно в области техники, фазовое разделение может быть улучшено путем высаливания водной фазы.

Когда после экстракции выделенная органическая фаза содержит большое количество воды, может быть удобным азеотропно отгонять из нее воду. Как правило, для этого требуется добавление растворителя, способного образовывать минимальные азеотропные смеси с водой, с последующим добавлением осаждающего агента для осаждения при необходимости желаемого продукта. Типичные примеры органических растворителей, способных образовывать минимальные азеотропные смеси с водой, представляют собой н-бутанол, бензол, толуол, бутиловый эфир, тетрахлорид углерода, хлороформ, циклогексан, 2,5-диметилфуран, гексан и м-ксилол; предпочтительный растворитель представляет собой н-бутанол.

Примеры осаждающих агентов представляют собой петролейный эфир, низшие алкиловые эфиры, такие как этиловый эфир, пропиловый эфир и бутиловый эфир, и низшие алкилкетоны, такие как ацетон.

В соответствии с предпочтительным способом выделения антибиотика 107891 отфильтрованный ферментационный бульон может быть приведен в контакт с адсорбирующей матрицей с последующей элюцией полярным смешивающимся с водой растворителем или их смесью, концентрированием до маслянистого остатка при пониженном давлении и осаждением осаждающим агентом, имеющим тип, уже упомянутый выше.

Примеры адсорбирующих матриц, которые могут быть удобным образом использованы при выделении соединений по изобретению, представляют собой полистирольные или смешанные полистиролдивинилбензольные смолы (например, М112 или 8112, Ωο\ν Сйетюа1 Со.; АтЬетШе® ΧΑΌ2 или ΧΑΌ4, Войт & Наак; Ωίαίοη НР 20, МйкиЫкЫ), акриловые смолы (например, ΧΑΌ7 или ΧΑΌ8, Войт & Наак), полиамиды, такие как поликапролактамы, нейлоны и поперечно-сшитые поливинилпирролидоны (например, полиамид-СС 6, полиамид-8С 6, полиамид-СС 6.6, полиамид-СС 6АС и полиамид-8С 6АС, Масйегеу-№ще1 & Со., Сеттапу; РА 400, М. \Уое1т АС, Сегтапу); и поливинилпирролидоновую смолу РУР-СЬ (А1ЙГ1СЙ Сйет1е СтЬН & Со., КС, Сегтапу) и поперечно-сшитые декстраны с контролируемыми порами (например, 8ерйайех® ЬН-20, Рйаттааа Рте Сйетюак, АВ). Предпочтительно используют полистирольные смолы, особенно предпочтительна смола П1аюп НР 20.

В случае полистирольных смол, полистирол-дивинилбензольных смол, полиамидных смол или акриловых смол предпочтительный элюент представляет собой смешивающийся с водой растворитель или его водные смеси. Водные смеси могут содержать буферы при подходящем значении рН.

Также в этом случае используемый в этом описании и формуле изобретения термин смешивающийся с водой растворитель имеет значение, присвоенное в настоящее время в области техники указанному термину как описано выше.

Успешные процедуры выделения и очистки антибиотика могут быть осуществлены в объединенных экстрактах из супернатанта бульона и из мицелия. Например, когда часть антибиотического продукта, содержащегося в отфильтрованном ферментационном бульоне или супернатанте, выделяют путем абсорбции на абсорбирующей смоле, а часть антибиотического продукта, содержащегося в мицелии, экстрагируют из него смешивающимся с водой растворителем с последующей адсорбцией на абсорби

- 7 012164 рующей смоле, элюированные фракции с каждого из двух наборов абсорбирующих смол могут быть объединены, возможно после концентрирования, и затем дополнительно обработаны в виде единой партии. Альтернативно, когда два набора абсорбирующих смол, использованных для отдельных стадий экстракции, имеют одинаковый тип и обладают одинаковыми функциональными характристиками, они могут быть объединены вместе и смесь может быть подвергнута единой стадии элюции, например, смешивающимся с водой растворителем или его смесью с водой.

В любом случае, не зависимо от того, какая процедура адаптирована для выделения сырого антибиотика 107981, успешную стадию очистки обычно осуществляют из смеси сырых веществ, являющейся результатом объединения продуктов с отдельных стадий экстракции.

Очистка сырого антибиотика 107891 может быть осуществлена при помощи любого из известных способов, но предпочтительно ее осуществляют при помощи хроматографических процедур. Примеры этих хроматографических процедур представляют собой способы, о которых сообщали в связи со стадией выделения, и включают также хроматографию на стационарных фазах, таких как хроматография на силикагеле, оксиде алюминия, активированном силикате магния и т.п., или хроматографию с обращенной фазой на силанизированном силикагеле, имеющем различные функциональные дериватизации, и элюцию смешивающимися с водой растворителями или водной смесью смешивающихся с водой растворителей, имеющих упомянутый выше тип.

Например, может быть использована препаративная ВЭЖХ хроматография с использованием ЯР-8 или ЯР-18 в качестве стационарной фазы и смеси буфера ΗΟΟΟΝΗ^ΟΗβΟΝ в качестве системы элюции.

Активные фракции, выделенные на стадии очистки, объединяют, концентрируют в вакууме, осаждают путем добавления осаждающего агента упомянутых выше типов и сушат или лиофилизируют в единичном или повторяющихся циклах. В случае, когда продукт содержит остаточные количества формиата аммония или других буферных солей, они могут быть удалены путем абсорбции антибиотика 107891 на колонке для твердофазной экстракции, например колонке с обращенно-фазовой смолой, такой как 8РЕ 8ирегс1еап ЬСР18 8ире1ео (Ве11еГои1е РА, И8А), с последующей промывкой дистиллированной водой и элюцией подходящей водной смесью растворителей, например этанол:вода. Затем антибиотик выделяют путем удаления элюирующих растворителей.

Соответственно получают высушенный препарат очищенного антибиотического комплекса 107891 в виде белого порошка.

Как обычно в этой области техники, стадию продуцирования, а также выделения и очистки можно контролировать при помощи различных аналитических процедур, включающих ингибиторный анализ против чувствительных микроорганизмов и аналитический контроль с использованием ВЭЖХ или ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией.

Предпочтительный аналитический метод ВЭЖХ осуществляют на аппарате Аа1егк (Аа1егк Сйготабюдгарйу. МИГогй, МА), оборудованном колонкой Аа1егк 8ппте1гу-51ие1й ЯР8, 5 мкм (250x4,6 мм), элюируя со скоростью потока 1 мл/мин при температуре 50°С.

Элюцию осуществляли в соответствии с многостадийной программой: время=0 (30% фаза Б); время=8 мин (30% фаза Б); время =28 мин (40% фаза Б). Фаза А представляла собой ацетонитрил: 100 мМ буфер формиата аммония (рН:5,0) 5:95 (об./об.), и фаза Б представляла собой ацетонитрил. УФ детектор установлен на 282 нм.

Вытекающий поток с колонки разделяли в отношении 5:95 и большую часть (приблизительно 950 мкл/мин) направляли в детектор на основе фотодиодной матрицы. Оставшееся количество (50 мкл/мин) направляли в интерфейс Е81 (электрораспылительная ионизация) масс-спектрометра с ионной ловушкой Ешшдаи БСО (Тйеттодией, Ешшдаи МАТ, 8ап 1оке СА).

Масс-спектрометрический анализ осуществляли в следующих условиях.

Условия при введении образца:

Струя газа (Ν₂) 413,7 кПа (60 фунт-сила/кв.дюйм);

Вспомогательный газ (Ν₂) 34,45 кПа (5 фунт-сила/кв.дюйм);

Нагрев капилляра 250°С;

Установки потенциала при введении образца:

Полярность положительная и отрицательная;

Потенциал ионораспыления +/-5 кВ;

Капиллярный потенциал +/-19 В;

Условия сканирования: максимальное ионное время 200 мс;

Ионное время 5 мс;

Полное микросканирование 3;

Сегмент: длительность 30 мин, сканы положительные (150-2000 т/ζ) и отрицательные (150-2000 т/ζ).

В этих аналитических условиях ВЭЖХ факторы А1 и А2 антибиотика 107891 демонстрировали времена удерживания, соответственно, 13,2 мин и 13,9 мин. В той же самой системе ВЭЖХ фактор А2 рамопланина (Ь. Са81а1йо, Я. СааЬаиЕ Е.АккЕ Е. Яе81еШ, 1.К. КеЕеипид, Ь.Е. 2егШ1, С. Яотаио, М. Иеиаго аий В. С’ауа11еп (1992): ИоШюи, ЧгисШге йе1егттаОоп апй Ью1ощса1 асйуйу оГ А-16686 ЕасЮгк А'1, А'2 и

- 8 012164

А'3 д1усо11ройер81рер11йе αηΐίόίοΐίοδ. 1. Ιηά. М1сгоЫо1. 11: 13-18), элюировался с временем удерживания 7,5 мин.

Факторы А1 и А2 антибиотика 107891 могут быть выделены из очищенного образца антибиотического 107891 комплекса посредством препаративной ВЭЖХ.

Фактор А1 выделяли и очищали на колонке 8утте1гу Ргер. С18 из очищенного антибиотического комплекса 107891, растворенного в смеси диметилсульфоксид (ДМСО):муравьиная кислота 95:5 (об./об.) с использованием линейного градиента элюции длительностью 25 мин от 30 до 45% фазы Б со скоростью потока 3,5 мл.

Фаза Б представляла собой ацетонитрил. Фаза А представляла собой смесь 25 мМ буфер формиата аммония рН 4,5:ацетонитрил 95:5 (об./об.). Элюируемые фракции, содержащие чистый фактор А1 антибиотика 107891, объединяли и концентрировали в вакууме. Оставшийся раствор лиофилизировали с получением чистого фактора А1 в виде белого порошка.

Фактор А2 выделяли и очищали посредством изократической элюции на колонке 8утте1гу Ргер. С18 из образца очищенного антибиотичского комплекса 107891, растворенного в смеси уксусная кислота:ацетонитрил:100 мМ буфер формиат аммония (рН 4) 50:120:80 (об./об.). Изократическую элюцию осуществляли со скоростью потока 7 мл смесью 100 мМ буфер формиат аммония рН 4:ацетонитрил в отношении 82,5:17,5 (об./об.). Элюированные фракции, содержащие чистый фактор А2 антибиотика 107891, объединяли и концентрировали в вакууме. Оставшийся раствор лиофилизировали с получением чистого фактора А2 в виде белого порошка.

Поскольку в соответствии с результатами кислотного/основного титрования в смеси 2метоксиэтаноле(МС8):Н₂О 12:3 (об./об.) антибиотик 107891 и его факторы А1 и А2 содержат основную функцию, они способны образовывать соли с подходящими кислотами в соответствии с обычными способами и могут существовать также в форме свободного основания.

Антибиотик 107891 и его факторы А1 и А2, полученные в форме свободного основания, могут быть превращены с использованием кислот в соответствующие соли, включающие нетоксичные фармацевтически приемлемые соли. Подходящие соли включают соли, образованные путем стандартной реакции с органическими и неорганическими кислотами, такими как, например, соляная, бромисто-водородная, серная, ортофосфорная, уксусная, трифторуксусная, трихлоруксусная, янтарная, лимонная, аскорбиновая, молочная, малеиновая, фумаровая, пальмитиновая, холевая, памоевая, муциновая, глутамовая, камфорная, глутаровая, гликолевая, фталевая, винная, лауриновая, стеариновая, салициловая, метансульфоновая, бензолсульфоновая, сорбиновая, пикриновая, бензойная, коричная кислоты и т. п. Соли присоединения кислот антибиотика 10789.1 и его факторов А1 и А2 могут быть получены в соответствии с обычными способами. В качестве примера антибиотик 107891 или его фактор А1 или его фактор А2 в форме свободного основания растворяют в минимальном количестве подходящего растворителя, типично низшего алканола или смеси низший алканол/вода, стехиометрическое количество подходящей выбранной кислоты постепенно добавляют к полученному раствору и полученную соль осаждают путем добавления нерастворителя. Образовавшуюся соль присоединения затем выделяют путем фильтрации или выпаривания растворителей.

Альтернативно, эти соли могут быть получены, по существу, в безводной форме путем лиофилизации; в этом случае соль антибиотика 107891 или его фактора А1 или его фактора А2 с летучей кислотой растворяют в подходящем количестве нелетучей кислоты. Затем из раствора отфильтровывают все нерастворимые вещества и раствор лиофилизируют в течение единичного или повторяющихся раундов.

Конкретная соль присоединения также может быть получена из раствора другой солевой формы антибиотика 107891 или его фактора А1 или его фактора А2, если желаемая соль осаждается при добавлении подходящего аниона.

Превращение несолевого соединения по изобретению в соответствующие соли присоединения и наоборот, т.е. превращение соли присоединения соединения по изобретению в несолевую форму, находятся в пределах знаний специалиста в данной области техники и охвачены настоящим изобретением.

Образование солей антибиотика 107891 и его факторов А1 и А2 может решать несколько задач, включая выделение, очистку указанного антибиотика 107891 и его факторов А1 и А2 и их применение в качестве терапевтических агентов или промоторов роста животного. Для терапевтических задач обычно используют фармацевтически приемлемые соли.

Термин фармацевически приемлемые соли относится к нетоксичным солям, которые могут быть использованы в терапии теплокровных животных.

Антибиотический комплекс 107981, его факторы А1 и А2 и смесь указанных факторов в любом соотношении могут быть введены сами по себе или в смесях с фармацевтически приемлемыми носителями и также могут быть введены в сочетании с другими антимикробными агентами, такими как пенициллины, цефалоспорины, аминогликозиды и гликопептиды.

Таким образом, комбинированная терапия включает последовательное, одновременное и раздельное введение активного соединения таким образом, что терапевтические эффекты первого вводимого соединения полностью не исчезают к тому моменту, когда вводят последующее.

Соединения по изобретению или их фармацевтически приемлемые соли присоединения могут быть

- 9 012164 приготовлены в формах, подходящих для парентерального, перорального или местного введения. Для внутривенного (в.в.) введения при лечении любой инфекции, включающей микроорганизм, чувствительный к антибиотику, препарат для парентерального введения находится, например, в воде с подходящим солюбилизирующим агентом, таким как полипропиленгликоль или диметилацетамид и поверхностноактивный агент (например, полиоксиэтиленсорбитана моноолеат или полиэтокилированное касторовое масло) или в композициях на основе циклодекстринов или фосфолипидов в стерильной воде для инъекции. Инъецируемый препарат также может быть приготовлен с подходящим циклодекстрином.

Антибиотический комплекс 107981, его факторы А1 и А2 и смесь указанных факторов в любом соотношении также могут быть использованы в подходящей фармацевтической форме, такой как капсула, таблетка или водная суспензия для перорального введения, или с обычными кремами или гелями для местных применений. Помимо применения в качестве лекарственных средств в терапии и ветеринарии, соединения по изобретению также могут быть использованы в качестве промотора роста животных. Для этой задачи соединение по изобретению вводят перорально в подходящем корме. Точная используемая концентрация представляет собой концентрацию, которая требуется для обеспечения активного агента в количестве, эффективном для стимуляции роста, когда потребляют нормальные количества корма.

Добавление активного соединения по изобретению в корм животных предпочтительно осуществляют путем приготовления подходящего кормового премикса, содержащего активное соединение в эффективном количестве, и включения премикса в полный рацион. Альтернативно, промежуточный концентрат или пищевая добавка, содержащая активный ингредиент, может быть смешана с кормом. Способ, при помощи которого такие кормовые премиксы и полные рационы могут быть приготовлены и введены, описаны в книгах (таких как АррНеб Ашша1 Νυίπΐίοη, \\'.Н. Ргеебтаи аиб СО., 8. Ргаисксо, и. 8.А., 1969 или Ыуе^Юск Реебк аиб Реебшд 0 и В Ьоокк, СогуаШз, Оге., И8А, 1977).

Физико-химические характеристики антибиотика 107891

A) Масс-спектрометрия.

В экспериментах с использованием масс-спектрометрии (МС) на аппарате ТйегшоДишдаи ЬСО беса, оборудованном источником электрораспыления, с использованием калибровочной смеси ТйегшоГшшда1'1 антибиотик 107891 давал два дважды протонированных иона с т/х=1124 и с т/х=1116. соответствующие наименьшей изотопной композиции факторов А1 и А2 комплекса соответственно. Условия электрораспыления: напряжение при распылении: 4,7 кВ; температура капилляра: 220°С; капиллярное напряжение: 3 В; режим введения 10 мкл/мин. Спектры регистрировали в растворе 0,2 мг/мл в смеси метанол/вода 80/20 (об./об.) с трифторуксусной кислотой 0,1%, и они представлены на фиг. 1А (спектр низкого разрешения при полном сканировании) и 1Б (спектр высокого разрешения при сканировании с масштабированием).

Б) Инфракрасный спектр антибиотика 107891, снятый в КВг с использованием спектрофотометра для инфракрасной спектрометрии с преобразованием Фурье Вгикег РТ-ΙΚ. модель ΙΡ8 48, демонстрирует максимумы абсорбции при (см^-1): 3263; 2929; 1661; 1533; 1402; 1114; 1026. Инфракрасный спектр представлен на фиг. 2. Полосы абсорбции при 1631, 1596 и 1346 относятся к остаточным количествам формиата аммония.

B) УФ спектр антибиотика 1087891 в смеси метанол/Н₂О (в отношении 80:20) с использованием спектрофотометра Регкш-Е1тег ЬатЬба 16 демонстрирует два плеча при 226 и 267 нм. УФ спектр представлен на фиг. 3.

Г) Спектр ¹Н-ядерного магнитного резонанса (ЯМР) регистрировали в смеси метанол-б4:Н₂О (рН 4,3 НС1) 40:10 (об./об.) при 40°С на спектрометре Вгикег АМХ 600 с применением последовательности вытеснения воды. В качестве внутреннего стандарта рассматривали остаточный сигнал метанол-б4 при 3,31 м. д.

¹Н-ЯМР спектр антибиотика 107891 представлен на фиг. 4. ¹Н-ЯМР спектр антибиотика 107891, растворенного в смеси метанол-б4:Н₂О (0,01н. НС1) 40:10 (об./об.) демонстрирует следующие группы сигналов (в м.д.) при 600 МГц с использованием МеОН-б4 в качестве внутреннего стандарта (3,31 м.д.) [5=м.д. мультиплетность; (соотнесение)]:0.93 б (СН₃), 0.98 б (СН₃), 1.07 I (перекрывающиеся СН₃), 1.18 I (перекрывающиеся СН₃), 1.26 5 (СН₃), 1-30 I (перекрывающиеся СН₃), 1.62-1.74 т (СН₂), 1.78 б (СН₃), 1.80 б (СН₃), 2.03 т (СН₂), 2.24 т (СН), 2.36 т (СН₂), 2.72-3.8 т (пептидные альфа СН), 3.8-5.2 т (пептидные альфа-СН), 5.53-6.08 5 (СН₂), 5.62 б (СН двойной связи), 6.42 т (СН), 6.92 б (СН двойной связи), 7.0-7.55 т (ароматические СН), 7.62-10.4 б и т (ароматические и пептидные N4).

Д) ¹³С-ЯМР спектр регистрировали в смеси метанол-б4:Н₂О (рН 4,3 НС1) 40:10 (об./об.) при 40°С на спектрометре Вгикег АМХ 600, с использованием в качестве внутреннего стандарта остаточного сигнала метанол-б4 при 49,15 м.д. ¹³С-ЯМР ЬЬ-несвязанный спектр антибиотика 107891, представлен на фиг. 5.

¹³С-ЯМР спектр антибиотика 107891, растворенного в смеси метанол-4:Н₂О (0,01н. НС1) 40:10 (об./об.) демонстрирует следующие группы сигналов (в м.д.) при 600 МГц с использованием МеОН-б4 в качестве внутреннего стандарта (49,15 м.д ), [5=м.д.; (соотнесение)]: 13.6-23.2 (алифатические СН₃), 26.16-73 (алифатические СН₂ и пептидные альфа СН), 105-136 (ароматические СН и СН двойных связей и четвертичные атомы углерода), 164.3-176.3 (пептидные карбонилы).

- 10 012164

Е) Антибиотический комплекс 107891 растворяли в смеси 2-метоксиэтанол (МС8):Н₂О 12:3 (об./об.), содержащем молярный избыток 0,01 М соляной кислоты. Раствор затем вновь титровали раствором 0,01н. гидроксида калия. Получающаяся в результате кривая титрования демонстрировала одну основную ионизируемую функцию.

Аминокислотный состав антибиотика 107891 и его факторов А1 и А2

А) Определение кислотоустойчивых аминокислот в антибиотическом комплексе 107891.

Антибиотик 107891 подвергали полному кислотному гидролизу (НС1 6н., 105°С, 24 ч) и идентифицировали аминокислотные компоненты антибиотика, устойчивые к обработке кислотой. Кислотолабильные аминокислоты при использовании этого подхода не обнаружимы. Гидролизат исследовали при помощи анализа путем ВЭЖХ-МС и газовой хроматографии/масс-спектрометрии (ГХ-МС) после соответствующей дериватизации в сравнении со смесью стандартных аминокислот, дериватизированных аналогичным образом. Для анализа путем ВЭЖХ гидролизованный образец обрабатывали б-аминохинолил-Νгидроксисукцинимидилкарбаматом (набор реагентов АссО-Тад™ Г1иог), для анализа путем ГХ - смесью 3 н. НС1 в безводном метаноле и трифторуксусном ангидриде.

Количественный анализ путем ВЭЖХ осуществляли на системе жидкостной хроматографии с одновременной детекцией с помощью диодной матрицы (ДДМ) и МС.

Условия для ВЭЖХ:

Колонка: АссО-Тад™ (\Уа1ег5 С18 ΝονοΡαΚ 4 мкм 3,9x150 мм);

Температура колонки: 37°С;

Поток: 1 мл/мин.

Фаза А: Ацетат аммония 140 мМ рН 5 (уксусная кислота).

Фаза Б: вода: ацетонитрил 60:40 (об./об.).

Программа элюции:

Время (мин)	0	5	30	35	40	41
%Б	5	5	80	95	95	5

УФ детекция: 254 нм;

Условия МС:

Спектрометр: Гшшдаи БС'О Веса, оборудованный стандартным источником электрораспыления. Температура капилляра: 250°С.

Напряжение источника: 4,70 кВ.

Ток источника: 80 мкА.

Капиллярное напряжение: -15 В.

Количественный анализ путем ГХ осуществляли на газовом хроматографе с МС-ЭИ (электрораспыление) детекцией.

Условия ГХ:

Колонка: 1 & 8с1епОПс ΌΒ-5, 30 мх0,254 мм внутренний диаметр (В.Д.)х0,25 мкм ГТ;

Газ-носитель: гелий;

Режим инъекции: без разделения;

Температура инжектора: 200°С;

Температура трубок: 300°С;

Температурная программа: от 50 до 100°С со скоростью 2,5°С/мин (10 мин), от 100 до 250°С со скоростью 10°С/мин (15 мин), 15 мин при 250°С;

Инъецируемый объем: 1 мкл.

Условия МС:

Спектрометр: Гшшдаи Т8О700;

Режим ионизации: электронный удар.

Параметры напряжения:

Ток накала: 400 мА;

Электронный умножитель: 1400 В;

Энергия электрона: 70 эВ;

Режим положительных ионов.

Условия сканирования:

Диапазон сканирования: 40-650 ати.

Время сканирования: 1 с.

В хроматограммах ЖХ/МС и ГХ/МС, полученных на гидролизате антибиотика 107891, вместе с другими неидентифицированными пиками были идентифицированы следующие аминокислоты: лантионин, метиллантионин, глицин, пролин, валин, аспарагиновая кислота (исследования путем ЯМР указывают на то, что она представляет собой продукт превращения аспарагина, приводящего к образованию аспарагиновой кислоты путем гидролиза), фенилаланин и лейцин.

- 11 012164

Факторы А1 и А2 антибиотика 107891 подвергали полному кислотному гидролизу в тех же самых условиях (дериватизация и ВЭЖХ-МС), которые приведены для комплекса. Анализ путем ГХ-МС проводили на приборе для ГХ/МС ТНегто Ρίηηίβηη Тгасе, оборудованном инжектором-испарителем с программируемой температурой (РТУ).

Способ путем ГХ осуществляли в следующих условиях:

Колонка: КеЧек КТХ-5М8, 15 мх0,25 мм В.Д.х0,25 мкм РТ.

Газ-носитель: гелий.

Температура границы: 250°С.

Температурная программа: 1,5 мин при 50°С, от 50 до 100°С при 20°С/мин, 1 мин при 100°С, от 100 до 135°С при 20°С/мин, 1 мин при 135°С, от 135 до 250°С при 20°С/мин, 1 мин при 250°С.

Инъецируемый объем: 1 мкл.

Инжектор: режим без разделения, базовая температура 50°С, температура переноса 280°С, скорость увеличения температуры 14,5°С/мин.

Условия МС:

Режим ионизации: электронный удар.

Установки напряжения:

Ток накала: 149 мкА.

Электронный умножитель: 200 В.

Энергия электрона: 70 эВ.

Режим положительных ионов.

Условия сканирования:

Диапазон сканирования: 33-500 ати.

Время сканирования: 0,6 с.

В гидролизате фактора А1 антибиотика 107891 хроматограммы ВЭЖХ/МС и ГХ/МС демонстрировали вместе с другими неидентифицированными пиками присутствие следующих аминокислот: лантионина, метиллантионина, глицина, пролина, валина, аспарагиновой кислоты (исследования путем ЯМР указывают на то, что она представляет собой продукт превращения аспарагина, приводящего к образованию аспарагиновой кислоты путем гидролиза), фенилаланина и лейцина.

Вышеприведенный способ, использованный для фактора А2, выявил вместе с другими неидентифицированными пиками присутствие следующих аминокислот: лантионина, метиллантионина, глицина, пролина, валина, аспарагиновой кислоты (исследования путем ЯМР указывают на то, что она представляет собой продукт превращения аспарагина, приводящего к образованию аспарагиновой кислоты путем гидролиза), фенилаланина и лейцина.

Б) Определение 5-хлортриптофана в антибиотическом комплексе 107891 и в его факторе А1 и факторе А2.

Полный гидролиз очищенного комплекса 107891 и его отдельных факторов А1 и А2 осуществляли в соответствии со способом, описанным δίιηρδοη К.Э., №иЬетдет М.К., Ыи Т.У., Сотр1е1е Атшоашб Лпа1у515 οί Рго1еш8 Ггот а 8шд1е Нубго1у§а1е. 1оита1 Вю1. СНет (Ипйеб 81а1е5), Аргй 10, 1976, 251 (7), 1936-40.

Эта процедура гидролиза позволяет предотвратить деградацию аминокислот, обычно нестабильных во время расщепления неорганическими кислотами, и таким образом дает возможность для определения этих аминокислот, включающих триптофан, из гидролизата пептида. Стандартный образец 5-хлор-ЭЬтриптофана был приобретен в Вюкуи! АС, 81ааб, 8\уЩег1апб и его структура подтверждена при помощи анализа путем ЯМР; ОЬ-триптофан был приобретен в Мегск КСаА, ЭапШабк Сегтаиу.

Фактор А1 (1,5 мг) суспендировали в 0,6 мл 4н. метансульфоновой кислоты, содержащей 0,2% (мас./об.) 3-(2-аминоэтил)индола в качестве катализатора для гидролиза. Гидролиз осуществляли при 115°С в течение 16 ч. Гидролизат затем нейтрализовали 5н. ИаОН и разбавляли равным количеством дистиллированной воды. 100 мкл этого раствора анализировали путем ЖХ/МС. Разделение осуществляли на колонке 8утте1ту С₁₈ (5 мкм) 4,6x250 мм (Аа1ет8 Со. МПГотб М.А., И8А), оборудованной предколонкой 8утте1ту С18 (5 мкм) 3,9x20 мм. Элюцию осуществляли при скорости потока 1 мл/мин в течение 25 мин. Линейный градиент от 0 до 50% фазы Б. Фаза А представляла собой смесь 25 мМ буфер НСООИН₄ рН 4,5:СНзСИ 95:5 (об./об.), и фаза Б представляла собой СН₃СЫ. УФ-обнаружение проводили при 280 нм. Оборудование для ВЭЖХ находилось в тандеме с масс-спектрометром с ионной ловушкой Ршшдаи БС’О (Тйеттодиек!, Ршшдаи МАТ, 8аи 1о§е, СА, И8А). 50 мкл/мин вытекающего потока с колонки направляли в интерфейс ионизации электрораспылением (ИЭР) масс-спектрометра БС.'О. Анализ путем МС осуществляли в следующих условиях: ввод образца: газ-носитель (Ν₂) 413,7 кПа (60 ф.сила/кв.дюйм); нагрев капилляра 210°С; полярность напряжения при вводе образца: положительная и отрицательная; напряжение распыления ионов ±4,5 кВ; напряжение капилляра ±21 В; условия сканирования: максимальное время ионов 50 мс; полный микро: скан 3.

Стандарты триптофана и 5-хлортриптофана элюировали с временами удерживания 8,1 и 11,5 мин, соответствующими М+Н⁺ с т/ζ 205 и 239 соответственно. В гидролизате фактора А1 антибиотика

- 12 012164

107891 присутствие пика на 11,5 мин для т/ζ с 238,97 указывало на присутствие 5-хлортриптофана.

Стандарт триптофана обнаруживали при помощи хроматографической системы с пределом обнаружения 0,3 мкг/мл. Это значение было ниже значения, которое указывало бы на присутствие указанной аминокислоты в тестируемом образце антибиотика. Триптофан не был обнаружен выше указанного предела на хроматограмме гидролизата фактора А1 антибиотика 107891. Идентичные результаты были получены в результате анализа путем ЖХ/МС гидролизата фактора А2 и гидролизата очищенного образца антибиотического комплекса 107891.

Масс-спектрометрия фактора А1 и фактора А2 антибиотика 107891

Фактор А1 антибиотика 107891 дает дважды протонированный ион с ιη/ζ=1124. а фактор А2 - с т/ζ 1116, соответствующим композиции с наименьшей изотопной массой, в экспериментах МС на приборе Тйеттойпшдап БСО йеса, оборудованном источником электрораспыления, с использованием калибровочной смеси Тйеттойпшдап. Условия электрораспыления: напряжение распыления: 4,7 кВ; температура капилляра: 250°С; напряжение капилляра: 8 В; режим введения 10 мкл/мин. Спектры регистрировали в растворе 0,1 мг/мл в смеси ацетонитрил:вода 50:50 (об./об.) с 0,5% уксусной кислоты, и они представлены на фиг. 6А (полный спектр низкого разрешения) и 6Б (масштабированный спектр высокого разрешения), а также на фиг. 7А (полный спектр низкого разрешения) и Б (масштабированный спектр высокого разрешения).

Точную массу фактора А1 и фактора А2 антибиотика определяли путем использования спектрометра Вгикег ЭаИошск АРЕХ II, 4.7 Те§1а, оборудованного источником электрораспыления. На основе этих данных для фактора А1 установлена молекулярная масса 2246,7110,06, рассчитанная моноизотопная масса от [М+2Н]²⁺ с т/ζ 1124,36124 (точность 30 м.д.), определенная при помощи ИЭР-массспектрометрии с преобразованием Фурье (МСПФ). Для фактора А2 установлена молекулярная масса 2230,71±0,06, рассчитанная моноизотопная масса от [М+2Н]²⁺ с т/ζ 1116,36260 (точность 30 млн^-1), определенная при помощи ИЭР-МСПФ.

Сравнение факторов А1 и А2 антибиотика 107891 с антибиотиками ΜΕ-ΒΑ-'1768α.| и ΜΕ-ΒΑ-1768β₁

А) МютоЫкрога сотаШпа ΝΝΚΕ 30420 (МЕ-ВА-1768), описанная в И8 6551591 В1, приобрели из коллекции ΝΝΚΕ. В пробном эксперименте штамм М. сотаШпа ΝΝΚΕ 30420 (МЕ-ВА-1768) ферментировали в колбе Эрленмейера в условиях, описанных в ϋδ 6551591 В1. Собранный бульон экстрагировали путем разбавления метанолом. После центрифугирования мицелия супернатант наносили на полистирольную абсорбирующую смолу НР20, элюируя смесью метанол:вода 70:30, объем которой уменьшали до небольшого объема и затем лиофилизировали.

На хроматограмме два пика демонстрировали сигналы 1091 и 1108 [М+2Н]²⁺, соответствующие [М+2Н]²⁺, о которых сообщали в И8 6551581 В1 для ΜΕ-ΒΛ-1768β, и МЕ-ВА-1768О.! соответственно.

В вышеприведенный экстракт затем добавляли факторы А1 и А2 антибиотика 107891 и смесь анализировали путем ЖХ/МС. Обнаружили, что пики антибиотиков МЕ-ВА-176831 и МЕ-ВА-1768о,1 и факторов А1 и А2 антибиотика 107891 обладают различными временами удерживания и различными фрагментами МС [М+2Н]²⁺.

Б) В еще одном эксперименте ферментацию МютоЬщрота §р. штамм ΝΚΚΕ 30420 (МЕ-ВА-1768) проводили в тэнке объемом 30 л и собранный бульон обрабатывали в соответствующим с описанием ϋδ 6551591 В1. После стадий последовательной очистки на полистирольной смоле НР20 и полиамидной смоле СС 6 0,1-0,3 мм (Масйегеу-Ыаде1) получали два индивидуальных вещества в чистой форме при помощи препаративной ВЭЖХ на колонке С18 Рйепошепех (Тоггапсе СА, И8А) Йипа (250x12,2 мм) с размером частиц 10 мкм, элюируя при скорости потока 27 мл/мин в соответствии со следующей многостадийной программой: Время=0 мин (32% фазы Б); Время=8 мин (32% фазы Б); Время=20 мин (36% фазы Б); Время=32 мин (90% Фазы Б). Фаза А представляла собой 0,05%-ную (об./об.) муравьиную кислоту в воде, фаза Б представляла собой СН₃СЫ.

Эти вещества демонстрировали антибактериальную активность против стафилококков и энтерококков, как представлено в табл. IV. В экспериментах с использованием ЖХ/МС эти два вещества продемонстрировали сигналы для двойных протонированных ионов [М+2Н]⁺⁺, соответствующие антибиотику МЕ-ВА-1768о,1 и МЕ-ВА-176831, как описано в патенте США 6551591 В1.

- 13 012164

Таблица IV

Штамм	Минимальная ингибирующая концентрация МИК (мкг/мл)
МГ-ВА- 1768а1	МР-ВА- 1768β	107891 А1	107891 А2	107891 комплекс
1400 81арку1ососсиз аигеих кл.изол. Ме1 г	0,13	0,5	0,13	0,13	0,13
568 Еп1егососсиз /аесчит кл.изол.	4	16	1	2	3
569 Еыегососсиз /аесгит кл.изол. Уал А	4	8	1	2	2
559 ЕпТегососсиз /аесгит кл.изол.	4	8	1	2	1
560 Етегососсиз /аесшт кл.изол. Уап А	4	8	0,5	1	0,5

Экспериментальные условия антимикробных тестов были теми же, что и используемые для тестов, представленных в табл. VI ниже.

Анализы путем ЖХ/МС выделенных антибиотиков ΜΡ-ΒΑ-1768αι и ΜΡ-ΒΑ-1768βι проводили на колонке 8утте!гу С₁₈ (5:м) 4,6x250 мм (\Уа1ег5; Μίΐίοτά ΜΑ, И8А), оборудованной предколонкой 8уттс1гу С₁₈ (5:м) 3,9x20 мм (обе держали в термостате при температуре 50°С). Элюцию осуществляли при скорости потока 1 мл/мин со следующей многостадийной программой элюции: время=0 мин (30% фазы Б); время=8 мин (30% фазы Б); время=20 мин (45% фазы В); время=24 мин (90% фазы Б) и время=28 мин (90% фазы Б). Фаза А представляла собой смесь 25 мМ буфер Ηί'ΌΘΝΗ₄ рН 4,5:СН₃СЫ 95:5 (об./об.), и фаза Б представляла собой СН₃СК Оборудование ВЭЖХ находилось в тандеме с масс-спектрометром с ионной ловушкой Ршшдаи БС’О (Т11егтос.|ие51. Ршшдап ΜΑΤ, 8аи 1о5е СА, И8А). 100 мкл/мин выходного потока из колонки направляли в ИЭР интерфейс масс-спектрометра БС'О. Анализ путем МС осуществляли в следующих условиях: ввод образца: газ-носитель (Ν₂) 172,375 кПа (25 фунт-сила/кв.дюйм); поток вспомогательного газа 34,475 кПа (5 фунт-сила/кв.дюйм); нагрев капилляра 210°С; полярность напряжения при вводе образца: положительная и отрицательная; напряжение распыления ионов ±4,5 кВ; напряжение капилляра ±12 В; условия сканирования: максимальное время ионов 50 мс; полный микро: скан 3.

Индивидуальные антибиотические факторы ΜΡ-ΒΑ-1768αι и ΜΡ-ΒΑ-1768βι и факторы А1 и А2 антибиотика 107891 анализировали индивидуально и в смеси. Результаты собраны в следующей табл. V.

Таблица V

	Время удерж, (мин) ’	[М+2Н]2+
ΜΕ-ΒΑ-1768β1	12,86	1091
Антибиотик 107891 А1	16,3	1124
Антибиотик 107891 А2	16,81	1116
МР-ВА-1768а1	18,1	1108

В той же самой хроматографической системе фактор А2 рамопланина (Ь. Са81а1йо, В. С1аЬай1, Р. Αδδί, Е. ВейеШ, Ι.Κ. Кейепгшд, Ь.Р. 2ег1Ш, О. Вотапо, Μ. Эепаго апй Β. СауаЛеп, (1992): 18о1айоп, Чгис1иге йе1егтта1юп апй Ь1о1од1са1 асйуйу οί Α-16686 Рас1ог§ Α'1, Α'2 и А'3 дКсокройермрерОйе апйЬюйск, I. 1пй. ΜκτοΜοΙ. 11: 13-18) элюировали с временем удерживания 11,00 мин.

ЯМР-Спектроскопия фактора А1 и фактора А2 антибиотика 107891 'Н-ЯМР спектры фактора А1 и фактора А2 антибиотика 107891 регистрировали в смеси СП₃С№Э₂О (1:1) при 24,85°С (298 К) на спектрометре Егикег ΑΜΧ 600 с применением последовательности вытеснения воды. В качестве внутреннего стандарта рассматривали остаточный сигнал ацетонитрил-й3 при 1,94 м.д.

А) ¹ Н-ЯМР спектр фактора А1 антибиотика 107891 представлен на фиг. 8.

'Н-ЯМР спектр фактора А1 антибиотика 107891, растворенного в смеси ί'ΌΑ’ΝΠΠΟ (1:1), демонстрирует следующие группы сигналов (в м.д.) при 600 МГц с использованием ΟΩ₃ΟΝ в качестве внутреннего стандарта (1,94 м.д.) [5=м.д. мультиплетность; (соотнесение)]: 0.84 й (СН₃), 0.89 й (СН₃), 0.94 I

- 14 012164 (перекрывающиеся СН₃), 1.1 й (СН₃), 1.13 й (СН₃), 1.15 ΐ (перекрывающиеся СН₃), 149 т (СН₂), 1.69 й (СН₃), 1.75 т (СН₂), 2.11 т (СН), 2.26 т (СН), 2.5 т (СН₂), 2.68-3.8 т (пептидные СН_Р), 3.8-5.0 т (пептидные СН_а), 5.45-6.17 8 (СН₂), 5.58 й (СН двойной связи), 6.36 т (СН), 6.86 й (СН двойной связи), 7.07.45 т (ароматические СН). В качестве примесей также присутствуют сигнал для диметилсульфоксида при 2,58 м.д. и сигнал для формиата при 8,33 м.д.

Б) ¹Н ЯМР ЬЬ несвязанный спектр фактора А2 антибиотика 107891 представлен на фиг. 9.

¹Н ЯМР спектр фактора А2 антибиотика 107891, растворенного в смеси ί'Ό₃,ί’ΝΌ₂Ο (1:1), демонстрирует следующие группы сигналов (в м.д.) при 600 МГц с использованием ΓΌ₃Γ'Ν в качестве внутреннего стандарта (1,94 м.д.), [5=м.д., мультиплетность; (соотнесение)]: 0.84 й (СН₃), 0.88 й (СН₃), 0.94 й (СН₃), 1.06 й (СН₃), 1.14 й (СН₃), 148 т (СН₂), 1.65-1.75 т (СН₂), 1.67 й (СН₃), 2.15 т (СН_а), 2.25 т (СН), 2.5 т (СН₂), 2.77-3.8 т (пептидные СН_р), 3.8-4.9 т (пептидные СН_а), 5.45-6.14 8 (СН₂), 5.59 й (СН двойной связи), 6.34 т (СН), 6.84 й (СН двойной связи), 7.0-7.42 т (ароматические СН). В качестве примесей также присутствуют сигнал для диметилсульфоксида при 2,58 м.д. и сигнал для формиата при 8,32 м.д.

¹³С-ЯМР спектры фактора А1 и фактора А2 антибиотика 107891 регистрировали в смеси ί'Ό₃Γ’Ν: Ό₂Ο (1:1) при 24,85°С (298 К) на спектрометре Вгикег АМХ 600 с применением в качестве внутреннего стандарта остаточного сигнала ацетонитрил-й3 при 1,39 м.д.

В) ¹³С-ЯМР спектр фактора А1 антибиотика 107891 представлен на фиг. 10.

¹³С ЯМР спектр фактора А1 антибиотика 107891, растворенного в смеси ί'Ό₃Γ’ΝΌ_;Ο (1:1), демонстрирует следующие группы сигналов (в м.д.) при 600 МГц с использованием ΓΌ₃Γ'Ν в качестве внутреннего стандарта (1,39 м.д.). [5=м.д.; (соотнесение)]: 13.6-23.03 (алифатические СН₃), 25.69-77.9 (алифатические СН₂ и пептидные СН_а), 105-137.3 (ароматические и двойные связи СН и четвертичные атомы углерода), 165.6-176.6 (пептидные карбонилы).

Г) ¹³С-ЯМР ЬЬ несвязанный спектр фактора А2 антибиотика 107891, представлен на фиг. 11.

¹³С-ЯМР спектр фактора А2 антибиотика 107891, растворенного в смеси ί'Ό₃Γ’ΝΌ_;Ο (1:1), демонстрирует следующие группы сигналов (в м.д.) при 600 МГц с использованием ΓΌ₃Γ'Ν в качестве внутреннего стандарта (1,39 м.д.), [5=м.д.; (соотнесение)]: 13.6-22.9 (алифатические СН₃), 25.65-73 (алифатические СН₂ и пептидные СН_а), 105-137.3 (ароматические СН и СН двойных связей и четвертичные атомы углерода), 165.7-176.1 (пептидные карбонилы).

УФ и инфракрасные (ИК) спектры фактора А1 и фактора А2 антибиотика 107891

A) Инфракрасный спектр фактора А1 антибиотика 107891, зарегистрированный в КВг с использованием спектрофотометра Вгикег ΓΤ-ΙΒ модели ΙΓ8 48, демонстрирует максимумы абсорбции при (см^-1): 3294; 3059; 2926; 1661; 1529; 1433; 1407; 1287; 1114; 1021. Инфракрсный спектр представлен на фиг. 12.

Б) УФ спектр фактора А1 антибиотика 107891, зарегистрированный в смеси метанолШ^ 80:20 (об./об.) с использованием спектрофотометра Реткт-Е1тет ЬатЬйа 16, демонстрирует два плеча при 226 и 267 нм. УФ спектр представлен на фиг. 13.

B) Инфракрасный спектр фактора А2 антибиотика 107891, зарегистрированный в КВг с использованием спектрофотометра Вгикег ΓΤ-ΙΒ, модели ΙΓ8 48, демонстрирует максимум абсорбции при (см^-1): 3296; 3060; 2928; 1661; 1529; 1433; 1407; 1288; 1116. Инфракрасный спектр представлен на фиг. 14.

Г) УФ спектр фактора А2 антибиотика 107891, зарегистрированный в смеси метанол:Н₂О 80:20 (об./об.) с использованием спектрофотометра Реткт-Е1тет ЬатЬйа 16, демонстрирует два плеча при 226 и 267 нм. УФ спектр представлен на фиг. 15.

На основе вышеприведенных физико-химических данных для антибиотика 107891 может быть установлена следующая структурная формула:

- 15 012164 где X представляет собой галоген (Е, С1, Вг, I), и где Κι, К₂, К₃, К₄, К₅, К₆, К₇ и К₈ независимо могут представлять собой Н, ОН, алкил (разветвленный или неразветвленный, замещенный или незамещенный) или арил (замещенный или незамещенный).

В альтернативном воплощении К_ь Κ₂, Κ₃ и Κ₄ могут представлять собой Н или ОН. Таким образом, возможные комбинации Κι, Κ₂, Κ₃ и Κ₄ включают следующие.

К)	Κι	Кз	к,
н	н	н	н
он	н	н	н
н	он	н	н
н	н	он	н
н	н	н	он
он	он	н	н
он	н	он	н
он	н	н	он
н	он	он	н
н	н	он	он
н	он	н	он
он	он	он	н
ой	он	н	он
он	н	он	он
н	он	он	он
он	он	он	он

Аналогично, Κ₅, Κ₆, Κ₇ и Κ₈ могут представлять собой Н или ОН. Таким образом, возможные комбинации Κ₅, Κ₆, Κ₇ и Κ₈ включают следующие.

К,	Кб	к7	Не
н	н	н	н
он	н	н	н
н	он	Η н
н	н	он	н
н	н	н	он
он	он	н	н
он	н	он	н
он	н	н	он
н	он	он	н
н	н	он	он
н	он	н	он
он	он	он	н
он	он	н	он
он	н	он	он
н	он	он	он
он	он	он	он

Кроме того, на основе представленных выше физико-химических данных для фактора А1 антибиотика 107891 может быть установлена следующая структурная формула, где X представляет собой С1, Κι представляет собой Н, Κ2 представляет собой ОН, Κ3 представляет собой Н, и Κ4, Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 представляют собой Н, представляющая собой предпочтительное воплощение по изобретению вместе с его фармацевтически приемлемыми солями:

- 16 012164

Дополнительно, на основе вышеприведенных физико-химических данных для фактора А2 антибиотика 107891 может быть установлена следующая структурная формула, где X представляет собой С1, К| представляет собой ОН, К₂ представляет собой ОН, К₃ представляет собой Н, и К₄, К₅, Кб, К₇ и К₈ представляют собой Н, представляющая собой предпочтительное воплощение по изобретению вместе с его

Биологическая активность антибиотика 107891 ΐν νίίτο

Антимикробную активность антибиотика 107891 определяли при помощи способа микроразведения питательной среды в соответствии с рекомендациями Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам (ΝΟΟΕ8, документ М7-А5).

Используемые штаммы представляли собой клинические изоляты или штаммы из Американской коллекции типовых культур (АТСС). Результаты тестов представлены в табл. У1 и УЛ.

Антибиотик 107891 растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) для получения концентрированного раствора 1000 мкг/мл и затем разбавляли водой для получения рабочего раствора. Используемые среды представляли собой катионо-регулируемую среду Мюллера-Хинтона (САМНВ) для 81арйу1ососс1, М. са1аггйа11к, ЕЫегососа и Ь. топосуЮдепек; среду Тодда-Хевитта (ТНВ) для 81герЮсосс1; среду СС+1% |коуйа1ех +1% гемина для №йкепа крр.; сердечно-мозговую вытяжку + добавка 1% С для Н. тПиепхае; среду ЬасЮЬасШик для ЬаскЬааШ; М1бб1еЬгоок 7Н9, обогащенную М1бб1еЬгоок ОАЭС для М. ктедтаίίκ; среду КРМ1 1640 для С. а1Ь1сапк, среду Вилкинса-Шалгрена+оксираза (1:25 об./об.) для С1ок1г1б1а; среду Вгисе11а, содержащую цистеин (0,5 г/л) для РгорюшЬаЫепа.

Инокулюмы для бактерий составляли 10⁵ колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл. Инокулюм С. а1Ь1сапк составлял 1 х 10⁴ КОЕ/мл. Все тесты проводили в присутствии 0,02% бычьего сывороточного альбумина (БСА). Культуры инкубировали при 35°С на воздухе за исключением штаммов С1оЧпб1а и Ргор1ошоЬаЫепа, которые требовали анаэробной атмросферы. Через 18-24 ч осуществляли визуальные наблюдения и определяли МИК. МИК определяли как наименьшую концентрацию антибиотика, при кото

- 17 012164 рой визуальный рост отсутствовал.

Таблица VI

Антимикробная активность антибиотика 107891

Микроорганизм	МИК (мкг/мл) Антибиотик 107891
119	81арк. аигеиз δπιΐΐΗ. АТСС 19636	не более 0,13
4061	8ιαρΡ. аигеиз ΙΛΜΙ	не более 0,13
1798	8ίαρΕ аигеиз клин, изолят νΐ8Α	2
1400	8!арк. аигеиз клин, изолят Ме1-К.	не более 0,13
613	81арк. аигеиз клин, изолят Ме1-К	не более 0,13
3797	5ίαρη. аигеиз клин, изолят У'КА Ме	2
4764	8ίαρΡ аигеиз ЫМ2 СИЗА Ме1-К.	0,5
1729	8ίαρ1ι. И(лето1у[1Ск5 Ме1-К	8
1730	Ме1-8	2
167	81арк. ериЛгтиНз АТСС 12228	не более 0,13
1139		4
44	81арк. рпеитотае Реп-8	не более 0,13
2868	Реп-1	не более 0,13
49	81гер. руо^епез	не более 0,13
559 ’	Ет. /аесаНз Уап-8	1
560	Еп1. /аесаИз Уап-А	0,5
А533	Ет. /аесаИз Уап-А	I
568	Еп1. /аесшт Уап-8	2
569	Ет. /аесшт Уап-А	1
Β5Ι8	Ет. /аесшт Уап-А	2
А6345	Επί. /аесшт Уап-А Εηζ-Κ	4
3754	МусоЬааетип зтертаке	32
384	Из1епа ^апиае	не более 0,13
148	1Лз1епа с/е^Ьгиеет! АТСС4797	4
1450	1лз1епа топосуЮрепез	0,125
833	НаеторкИиз ίηβαεηζαε	32
970	НаеторкИиз ίηβιιεηζαε АТСС 19418	32
3924	МогахеИа саАаггаИз	1
76	МогахеИа смкаггаНз АТСС6176	0,25
1613	Νείίχεηα тетп^ШЛз АТСС 13090	0,5
997	Νείινεπα уопоггкаее	0,25
47	ЕзскегкЫа соИ	более 128
145	СапсНда а1Ысапз	более 128 |

Таблица VII

Антимикробная активность антибиотика 107891 против анаэробных бактерий

Микроорганизм	МИК (мкг/мл) Антибиотик 107891
АТСС27520 РгорюшЬас/епит ИтркоркИит АТСС25564 РгорютЬааепит %гапи1а1ит АТССΪ4157 Ргорюп/Ьас1епитргорюпкиз Р9 Рг0рютЬас1ег1ит аспез 1329 Ргор1опгЬас!енит аспез АТСС25746 РгорютЬасСегшт аспез АТСС6919 РгорютЬас1епит аспез АТСС6922 Ргор!отЬас1егшт аспез АТСС 1348 Ргор1отЬас1ег1ит аспез	0,015
0,03
4
0,125
0,5
0,015
0,125
не более 0,0039
0,25
4018 С1оз1гнЛит (ΙίβιείΙε	не более 0,125
4025 С1оз(гМит ββίείΐε	не более 0,125
4022 С1оз1гкНит сН/рсНе	не более 0,125
4022 С1оз1гиИит раи/ппуепз	не более 0,125
4043 С1оз1псИит ЬаГуг>сит	не более 0,125
4009 С1озСг1сИит ЬекегтсеН	не более 0,125
4052 С1озМсИит зерНсит	не более 0,125
60601 Рер(оз1гер(ососсиз апаегоЫаз	более 128

- 18 012164

Антибиотик 107891 демонстрирует хорошую антибактериальную активность против грамположительных бактерий.

Диапазон МИК против 8!арйу1ососсик крр., включая штаммы, резистентные к метициллину (МК8А) и гликопептидным промежуточным соединениям (С18А), составляет 0,13-4 мкг/мл, а против полученных недавно клинических изолятов Еп!егососси8 крр., включая резистентные к ванкомицину (УКЕ), составляет 0,5-4 мкг/мл. МИК против 8!гер!ососсик крр. составляют не более 0,13 мкг/мл.

Антибиотик 107891 также активен против анаэробных грамположительных штаммов; величины МИК составляют не более 0,13 мкг/мл против С.’1ок1пб1а и не более 0,004-4 мкг/мл против РгорюшЬас!епа. Антимикробные активности продемонстрированы против Ь.топосу!одепек (МИК 0,125 мкг/мл) и штаммов Еас!оЬасШ1 (диапазон МИК не более 0,13-4 мкг/мл).

Некоторые грамотрицательные бактерии чувствительны к антибиотику 107891; МИК составляют 10,25 мкг/мл против М. саШаггайк, 0,5-0,25 мкг/мл против №1ккепа крр. и 32 мкг/мл против Н. шПиеп/ае.

Антибиотик 107891 не активен против тестированных штаммов Е. сой и С. а1Ысапк.

В экспериментах с киллингом в зависимости от времени антибиотик 107891 демонстрирует бактерицидную активность против штамма 8. аигеик С18А и Е. ГаесаНк УапА; через 24 ч бактерицидная концентрация представляет собой значение МИК в среде Мюллера-Хинтона.

8. аигеик может вызывать угрожающие жизни инфекции, и МК8А имеет особенную клиническую значимость, поскольку он резистентен ко всем пенициллинам и цефалоспоринам, а также ко множеству других антибиотиков; дополнительно он легко передается от пациента к пациенту, вызывая вспышку инфекции с серьезными осложнениями для здравоохранения (XV. XVШе (1999): АпЕЬюЕс гек1к1апсе ш Сгат-рокЮуе Ьас!епа: ер1бетю1одюа1 акрес!к, 1оита1 оГ Ап!1т1сгоЫа1 СйетоШегару 44: 1-9). Центр по контролю за заболеваниями (СЭС) Национальной системы по контролю за нозокомиальными инфекциями (ΝΝΙ8) сообщает от том, что резистентность к метициллину у 8. аигеик в госпиталях США увеличилась с 2,4% в 1975 до 29% в 1991, с большей степенью резистентности в отделениях интенсивной терапии (Ъ. АгсЫЬа1б, Ь. РЫНрк, Ό. Мопие!, РЕ. 1г Мс Со\\'ап. Г. Тепоуег, К. Саупек, (1997): АпЕт1сгоЬ1а1 гемЧапсе ш 1ко1а!ек Ггот шрабегИк апб опфабегИк ш (Не Ипбеб 81а1ек: тсгеактд ппроПапсе оГ (Не ш1епк1уе саге ипб, С11шс 1пГес!. Όίκ. 24: 211-5). Нозокомиальные стафилококковые инфекции ассоциируются со значительной заболеваемостью и смертностью, увеличивая длительность пребывания в госпитале и повышая стоимость госпитализации. Большая часть штаммов МК8А резистентна к нескольким из наиболее часто используемых антимикробных агентов, включающих используемые в настоящее время макролиды, аминогликозидные и β-лактамовые антибиотики, включая самое последнее поколение цефалоспоринов.

Приобретаемые в госпитале резистентные к ванкомицину патогены, ответственные за инфекции (такие как эндокардит, менингит и септицемия), составляют прогрессирующую терапевтическую проблему (Υ. Себпкауа, Р. Еа1к апб С.С. МауНа11 (2000): Уапсотуст - гек1к!ап! ейегососсГ', С1ш. МюгоЬю1. Кеу. 13: 686-707; Ь.В. Кюе (2001): Етегдепсе оГ тапсотуст-гек1к1ап1 еШегососс!, Етегд. 1пГес. Όίκ. 7: 183-7).

8. рпеитошае и М. са!аггЬаНк представляют собой известные серьезные патогены людей. Они являются распространенной причиной инфекций респираторного тракта, в частности отита среднего уха у детей и инфекций нижнего отдела респираторного тракта у пожилых людей. М. са!аггЬа11к и 8. рпеитошае недавно были признаны самыми распространенными патогенами респираторного тракта (М.С. Еппд1и апб Н. МсКепху (1997): Могахе11а (ВгапНате11а) са!аггЬа11к. Сйшса1 апб то1еси1аг акрес! оГ а геб1ксоуегеб раЛодеп, I. Меб. МюгоЬюР 46: 360-71).

С1ок!пб1а ответственны за различные заболевания: газовую гангрену и родственные раневые инфекции, столбняк, ботулизм, диарею, ассоциирующуюся с антибиотиками (ΟΌΑΌ) и псевдомембранозный колит. Большая часть этих микроорганизмов продуцирует экзотоксины, играющие важную роль в патогенезе заболеваний. С. бййсйе представляет собой возбудитель, ответственный за 25% случаев ΟΌΑΌ и, по существу, за все случаи псевдомембранозного колита. В течение последних нескольких лет случаи коинфекции С. бййсйе наблюдали у пациентов, страдающих от резистентной к ванкомицину энтерококковой инфекции или колонизации (РС. ВагИей (1992): АпбЬюбс аккоаа1еб б1аггйеа, Сйшс. 1пГес! ϋΐδ. 15: 573-581).

Биологическая активность факторов А1 и А2 антибиотика 107891 ΐη υϊΙιό

В табл. VIII представлены антимикробные активности индивидуальных факторов А1 и А2 антибиотика 107891. МИК определяли при помощи способа микроразведения среды, как описано выше.

- 19 012164

Таблица VIII

Антимикробная активность факторов А1 и А2 антибиотика 107891

Микроорганизм	МИК (мкг/мл)
Фактор А1	Фактор А2
819	81арИ.аигеив Ме1-8	не больше 0,03	не больше 0,03
1524	81арк.аигеи.ч Ме1-К.	не больше 0,03	не больше 0,03
2235	3;αρ1ι.άΐΐΓΒΐι$ Ме1-К.	0,06	0,06
3894	З/арк.ерШегпшНз Ме1-К	не больше 0,03	0,06
3881	Зшрк.ерМегпйсИз МеьК.	0,06	не больше 0,03
602	81арк.каето1у11сив Ме1- К.	0,25	0,25
3919	81герг.рпеитогнае Реп-К	не больше	не больше
		0,0015	0,0015
3915	81гер!.рпеитошае Реп- 8	не больше 0,0015	не больше 0,0015
4323	Εηί./аесаНз УапА	не больше 0,03	не больше 0,03
Л	Εηί./аесаИз УапА	1	1
4341	Εηΐ./аесаНз Уап В	0,5	0,5
4397	Εηί./аесаИз УапВ	1	1
4341	ЕМ./аесаНз УапВ	2	2
6349	Еп1./аесшт Уап Α ΕΝΖ- К.	2	2
4	ЕпМаесшт Уап А	1	1
3	Ет./аесшт Уап А	0,5	0,5
Ώ561	Еп1./аес1ит Уап. А	2	2
А8	Εηί./аесшт УапА	0,5	0,5
4339	Εηΐ./аесйт УапВ	0,25	0,25
4174	Еп1.£а11тагит	1	1
997	Νείί^ϊία §опогг!1аее	0,5	0,25
1613	Мекзепа тепгпдИиНз	0,25	0,25
1016	РгорютЬааепит. аспев	не больше 0,03	0,06

Биологическая активность антибиотика 107891 ΐη νίνο

Самок мышей 1СВ (Наг1ап Пайа 8рА - 8. Р1е!то а1 Майкопе, Па1у) массой 23-25 г использовали в экспериментах с острой летальной инфекцией у иммунокомпетентных мышей или мышей, страдающих нейтропенией. Нейтропению вызывали путем интраперитонеальных введений циклофосфамида, 200 и 100 мг/кг, за четверо и одни сутки перед инфицированием мышей соответственно.

- 20 012164

Инфекцию вызывали путем интраперитонеальной инокуляции иммунокомпетентных мышей (8 животных/дозу/обрабатываемую группу) бактериальной суспензией клинического изолята стафилококка, резистентного к метициллину (8(ар11. аигеик 8А3817), или стандартного штамма, чувствительного к метициллину (8(ар11. аигеик 8ιηί11ι АТСС19636), или путем инокуляции мышей, страдающих нейтропенией, клиническим изолятом энтерококка, резистентного к гликопептидам (ЕпГ Гаесайк А533). Бактериальные инфицирующие дозы (приблизительно 10⁶ клеток/мышь) давали в виде суспензии в 0,5 мл 5% бактериологического муцина (ЭГсо). Необработанные животные погибали в течение 24-72 ч после инфицирования. Обработку антибиотиком начинали в течение 10-15 мин после инфицирования. Антибиотик 107891 вводили один раз внутривенно или подкожно в различных водных препаратах. 50%-ную эффективную дозу (ЭД₅₀) и 95%-ные доверительные интервалы рассчитывали методом Спирмана-Карбера (8реагтапКагЬег) (Ό.Τ Е1ппеу (1952): Тйе 8реагтап-КагЬег те!йой, ш 81айкйса1 те!йойк т Ью1ощса1 аккау, рр. 524-530, С11аг1ек СпГГт & Со., Пй., Ьопйоп), исходя из процентной доли животных, выживших на 7-е сутки. Результаты представлены в следующей табл. IX.

Антибиотик 107891 не токсичен вплоть до максимальной тестируемой дозы 200 мг/кг.

Таблица IX

ЭД₅₀ антибиотика 107891 при острых летальных инфекциях у мышей

Препарат	Штамм	Путь	ЭДж мг/кг	95%-ные доверительные интервалы
А	М88А	в.в.	2,1	1,7-2,7
п.к.	2,1	1,7-2,7
А	УапА	в.в.	3,2	2,7-3,9
п.к.	11,1	9,2-13,5
Б	МЯ8А	п.к.	4,2	3,5-5,1
В	УапА	в.в.	3,7	2,8-4,9
п.к.	12,7	10,7-15,0

Препараты.

А: 10% (об./об.) ДМСО, 10% (мас./об.) β-гидроксипропилциклодекстрин (81дта), 80% (об./об.) 5% (мас./об.) глюкозы в Н₂О.

Б: 10% (об./об.) ДМСО, 40% (об./об.) полиэтиленгликоль ПЭГ 400 в 0,1 М водной СН₃СООН.

В: 50% (об./об.) ПЭГ 400 в Н₂О.

Штаммы.

I. М88А: 81арй. аигеик 8тйй 819 АТСС19636.

II. МЯ8А: 81арй. аигеик 3817, клинический изолят.

III. УапА: ЕпГ Гаесайк А533, клинический изолят, у мышей с нейтропенией.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1А (спектр низкого разрешения при полном сканировании) и 1Б (масштабированный спектр высокого разрешения) представляют масс-спектры антибиотика 107891, демонстрирующие дважды протонированный ион с т/ζ 1124 и т/ζ 1116;

фиг. 2 - спектр ИК абсорбции антибиотика 107891, диспергированного в КВг;

фиг. 3 - УФ спектр антибиотика 107891, растворенного в смеси метанол:Н2О;

фиг. 4 - ¹ Н-ЯМР спектр, зарегистрированный в смеси метанол-й4: Н₂О (рН 4,3 НС1) 40:10 (об./об.) при 40°С на спектрометре Вгикег АМХ 600 с применением последовательности вытеснения воды;

фиг. 5 - ¹³С-ЯМР спектр, зарегистрированный в смеси метанол-й4: Н₂О (рН 4,3 НС1) 40:10 (об./об.) при 40°С на спектрометре Вгикег АМХ 600;

фиг. 6А (спектр низкого разрешения при полном сканировании) и 6Б (масштабированный спектр высокого разрешения) - масс-спектры фактора А1 антибиотика 107891, демонстрируя дважды протонированные ионы [М+2Н]²⁺ с т/ζ 1124;

фиг. 7 А (спектр низкого разрешения при полном сканировании) и 7Б (масштабированный спектр высокого разрешения) - масс-спектры фактора А2 антибиотика 107891, демонстрируя дважды протонированные ионы [М+2Н]²⁺ с т/ζ 1116;

фиг. 8 - 'Н-ЯМР спектр фактора А1 антибиотика 107891, зарегистрированный в смеси ί.Ό₃ί.’ΝΌ₃Ο (1:1) при 298 К на спектрометре Вгикег АМХ 600 с применением последовательности вытеснения воды;

фиг. 9 - ¹Н-ЯМР спектр фактора А2 антибиотика 107891, зарегистрированный в смеси ί.Ό₃ί.’ΝΌ₃Ο (1:1) при 298 К на спектрометре Вгикег АМХ 600 с применением последовательности вытеснения воды;

фиг. 10 - ¹³С-ЯМР спектр фактора А1 антибиотика 107891, зарегистрированный в смеси ί'Ό₃ί.’ΝΌ₃Ο (1:1) при 298 К на спектрометре Вгикег АМХ 600;

фиг. 11 - ¹³С-ЯМР спектр фактора А2 антибиотика 107891, зарегистрированный в смеси ί'Ό₃ί.’ΝΌ₃Ο

- 21 012164 (1:1) при 298 К на спектрометре Вгикег АМХ 600;

фиг. 12 - спектр ИК абсорбции фактора А1 антибиотика 107891, диспергированного в КВг; фиг. 13 - УФ спектр фактора А1 антибиотика 107891, растворенного в смеси метанол:Н₂О; фиг. 14 - спектр ИК абсорбции фактора А2 антибиотика 107891, диспергированного в КВг; фиг. 15 - УФ спектр фактора А2 антибиотика 107891, растворенного в смеси метанол:Н₂О.

Примеры

Пример 1. Способ ферментации МкгоЬщрога §р. АТСС РТА-5024.

МкгоЬщрога §р. штамм АТСС РТА-5024 поддерживали на косяках из агара на основе овсяной муки в течение 2-3 недель при 28°С. Содержимое с микробами с одного косяка смывали 5 мл стерильной воды и инокулировали в колбы Эрленмейера объемом 500 мл, содержащие 100 мл посевной среды (АЕ/М8), состоящей из (г/л): дектроза - 20, дрожжевой экстракт - 2, соевая мука - 8, №1С1 - 1 и карбонат кальция 4. Среду готовили в дистиллированной воде и рН доводили до 7,3 перед стерилизацией при 121°С в течение 20 мин. Инокулированное содержимое колб выращивали при 28°С на роторной качалке, функционирующей при 200 об./мин. Через 4-6 дней 5% этой культуры инокулировали во вторую серию колб, содержащих ту же самую ферментационную среду. После инкубации в течение 72 ч 200 мл переносили в биореактор объемом 4 л, содержащий 3 л той же самой вегетативной среды.

Ферментацию осуществляли при 30°С с перемешиванием при 700 об./мин и аэрации 0,5 уут (отношение количества подводимого воздуха к емкости реактора). Через 72 ч культуру (1,5 л) переносили в биореактор объемом 20 л, содержащий 15 л той же самой вегетативной среды. Ферментацию осуществляли в течение 48 ч при 30°С при перемешивании при 500 об./мин и аэрации 0,5 уут и затем переносили в производственный танк.

Продукцию антибиотика 107891 проводили в ферментаторе объемом 300 л, содержащем 200 л продуцирующей среды М8, состоящей из (г/л): крахмал - 20, глюкоза - 10, дрожжевой экстракт - 2, гидролизованный казеин - 4, мясной экстракт - 2 и карбонат кальция - 3. Среду готовили в деионизированной воде, рН доводили до 7,2 перед стерилизацией при 121°С в течение 25 мин. После охлаждения ферментатор инокулировали приблизительно 14 л (7%) предкультуры. Ферментатор запускали при 29°С, при перемешивании 180 об./мин и аэрации 0,5 уут при давлении на выходе 36 КПа (0,36 бар). Содержимое ферментатора собирали после 98 ч ферментации.

Продукцию антибиотика 107891 контролировали путем ВЭЖХ как описано ранее, после экстракции цельной культуральной жидкости таким же объемом метанола. Экстракцию проводили при комнатной температуре при перемешивании в течение 1 ч.

Пример 2. Альтернативный способ ферментации МкгоЬщрога §р. АТСС РТА-5024.

МкгоЬщрога §р. АТСС РТА-5024 инокулировали в колбы Эрленмейера объемом 500 мл, содержащие 100 мл ростовой среды (С1), состоящей из г/л: глюкоза - 10, мальтоза - 10, соевое масло - 10, соевая мука - 8, дрожжевой экстракт - 2 и карбонат кальция - 4. Среду готовили в деионизированной воде и стерилизовали при 120°Сх20 мин без доведения рН. Инокулированные колбы инкубировали в течение 120168 ч при 28°С с перемешиванием при 200 об./мин до тех пор, пока не будет обнаружен хороший рост. Колбы затем использовали для инокуляции (3%) биореактора объемом 4 л, содержащего 3 л посевной среды АЕ/М8, приготовленной как описано в примере 1. После ферментации в течение 120 ч при 30°С с перемешиванием при 700 об./мин и аэрацией 0,5 уут 1,5 л культуры переносили в биореактор объемом 20 л, содержащий 15 л такой же вегетативной среды. Ферментацию осуществляли в течение 96 ч при 30°С при перемешивании при 600 об./мин и аэрации 0,5 уут и затем переносили в производственный танк.

Продукцию антибиотика осуществляли в ферментаторе объемом 300 л, содержащем 200 л продуцирующей среды (ν6), состоящей из (г/л): дектроза - 20, дрожжевой экстракт - 5, мясной экстракт - 5, гидролизованный казеин - 3, пептон - 5 и №1С1 - 1,5. Среду готовили в деионизированной воде с рН, доведенным до 7,5 с помощью №ОН, и стерилизовали при 121°С в течение 20 мин.

Ферментатор инокулировали 14 л посевной культуры (7%) и ферментацию осуществляли при 29°С, перемешивали при 180 об./мин, аэрировали 100 л обычного воздуха в минуту (0,5 уут). Продукцию антибиотика 107891 контролировали путем ВЭЖХ, как описано ранее. Ферментационную среду собирали приблизительно через 160 ч.

Пример 3. Выделение антибиотика 107891.

Ферментационный бульон, описанный в примере 1, фильтровали при помощи системы тангенциальной фильтрации (размер пор мембраны 0,1 мкм, Кос11 СагЬо-Сог, Кос11 А11тшд1оп, И8А) с получением 170 л супернатанта и 30 л концентрированного мицелия. Антибиотический комплекс 107891 был обнаружен в фильтрате (А) и в мицелии (Б).

(А) Профильтрованный бульон перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в присутствии полистирольной смолы О|аюп НР-20 (4 л). Смолу затем отделяли, промывали 10 л смеси метанол:вода 4:6 (об./об.) и партиями элюировали сначала 10 л смеси метанол:вода 9:1 (об./об.), а затем 10 л смеси метанол:бутанол:вода 9:1:1 (об./об.). Объединенные элюированные фракции, содержащие антибиотик 107891, концентрировали до небольшого объема на роторном испарителе и затем сушили замораживанием с получением 32 г неочищенного материала. Этот неочищенный материал растворяли в н

- 22 012164 бутаноле (1 л) и затем трижды последовательно экстрагировали 800 мл воды. Органический слой концентрировали при пониженном давлении до маслянистого остатка, который растворяли в метаноле. После добавления петролейного эфира путем осаждения получали 5 г неочищенного препарата антибиотика.

(Б) После добавления 25 л метанола порцию ретентата, содержащего мицелий, перемешивали в течение 1 ч и фильтровали с получением 45 л экстракта мицелия. Этот раствор затем разбавляли водой (20 л) и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре с полистирольной смолой П1аюи НР-20 (1 л). Затем смолу отделяли, промывали 2 л смеси метанол:вода 40:60 (об./об.) и партиями последовательно элюировали 3 л смеси метанол:вода 85:15 (об./об.) и затем 2 л смеси метанол:вода 90:10 (об./об.). Элюируемые фракции контролировали в отношении присутствия антибиотика 107891 при помощи анализа диффузии на агаре с 81арНу1ососси5 аигеик и при помощи способа аналитической ВЭЖХ, о чем сообщали ранее.

Элюированные фракции, содержащие антибиотик 107891, объединяли, концентрировали при пониженном давлении и сушили замораживанием с получением 8,1 г неочищенного антибиотика 107891.

Пример 4. Альтернативное выделение антибиотика 107891.

Собранную среду из описанного в примере 2 ферментационного танка объемом 200 л доводили до рН 6,8 и среду фильтровали путем тангенциальной фильтрации (размер пор мембраны 0,1 мкм, КосН СагЬо-Сог). Фильтрат (180 л) партиями перемешивали в течение ночи при комнатной температуре с 2 л смолы П1аюи НР20 (МйзиЬкЫ СБеш1са1) и смолу затем собирали.

К порции ретентата, содержащего концентрированный мицелий, в аппарате для тангенциальной фильтрации (приблизительно 20 л) добавляли метанол (25 л). Эту суспензию перемешивали в течение 1 ч и затем фильтровали при помощи системы микрофильтрации до остаточного объема ретентата приблизительно 20 л. Затем добавляли дополнительную порцию метанола (25 л) и вышеприведенный способ последовательно повторяли в течение в общей сложности 5 циклов. Объединенные метанольные экстракты (приблизительно 125 л) разбавляли 160 л деионизированной воды и партиями в течение ночи перемешивали при комнатной температуре с 3 л смолы П1аюи НР 20. Смолу затем собирали и объединяли со смолой П1аюи НР 20, использованной для экстракции фильтрата среды в соответствии с вышеописанным способом. Объединенную смолу промывали в хроматографической колонке 20 л смеси вода:метанол 6:4 (об./об.). Антибиотик 107891 элюировали 23 л смеси метанол:50 мМ буфер формиата аммония рН 3,5:н-бутанол 9:1:1 (об./об.). Этот элюат затем концентрировали в вакууме до конечного объема 3 л. Затем концентрированный раствор при рН 4,5 наносили на колонку 2,5 л полиамида СС 6 0,1-0,3 мм (Масйегеу-Ыаде1), уравновешенную смесью вода:метанол 7:3 (об./об.). Колонку промывали смесью вода:метанол 7:3 (об./об.) и затем смесью 25 мМ буфер формиата аммония рН 3,5:метанол 7:3 (об./об.). Антибиотик элюировали смесью вода:метанол 3:7 (об./об.) и затем смесью 1:9 (об./об.). Элюцию завершали смесью 25 мМ буфер формиата аммония рН 2,8:метанол в отношении 1:9 (об./об.). Элюаты, содержащие антибиотик 107891, объединяли и концентрировали в вакууме до конечного объема 1 л. рН концентрированного раствора доводили до величины от 4 до 5,7 с использованием 7 М гидроксида аммония и затем смесь центрифугировали для сбора осадка. Это твердое вещество суспендировали в воде и сушили замораживанием с получением 6,96 г препарата антибиотика 107891.

Пример 5. Очистка антибиотика 107891.

Неочищенный антибиотик 107891 (3,6 г), полученный в соответствии с описанным в примере 3, очищали путем хроматографии среднего давления на 100 г частиц размера 40-70 мкм обращенной фазы С8 (ЕС), размер пор 60 А, КТ (Щегиайоиа! 8огЬеШ ТесНно^у, М^бС1атο^даη, ИК) путем использования системы хроматографии среднего давления ВисЫ В-680 (ВисЫ 1аЬогаЮпшп5-1ес11шк АС, Е1аГО1 8\\'Цхег1аиб), оборудованной градиентообразователем В-687, коллектором фракций В-684, стеклянной колонкой В-685 70x460 мм. Смолу предварительно уравновешивали смесью фаза А:фаза Б 8:2 (об./об.) и затем элюировали при скорости 25 мл/мин с использованием линейного градиента от 20% до 60% фазы Б в течение 60 мин.

Фаза А представляла собой смесь ацетонитрил:20 мМ буфер формиата аммония (рН 6,6) 10:90 (об./об.); а фаза Б представляла собой смесь ацетонитрил:20 мМ буфер формиата аммония (рН 6,6) 90:10 (об./об.).

Фракции, содержащие антибиотик 107891, объединяли, концентрировали в вакууме и дважды лиофилизировали из воды с получением 430 мг очищенного антибиотика 107891.

Пример 6. Очистка антибиотика 107891 путем препаративной ВЭЖХ.

Антибиотик 107891 дополнительно очищали путем препаративной ВЭЖХ на колонке ΚΤ Н1Ьаг, предварительно упакованной лихросорбом ПР8 (размер частиц 7 мкм) 250-25 мм, Мегск, путем использования линейного элюирующего градиента от 30 до 45% фазы Б при скорости 30 мл/мин в течение 25 мин. Фаза А представляла собой смесь 25 мМ буфер формиата аммония рН 4,5:ацетонитрил 95:5 (об./об.), а фаза Б представляла собой ацетонитрил.

Образец антибиотика 107891 по примеру 5 (300 мг) растворяли в 1,5 мл 350 л смеси ДМСО: муравьиная кислота 95:5 (об./об.) и 300 мкл подвергали хроматографическому разделению. Антибиотик 107891, как правило, элюировали в течение 15-16 мин. Элюируемые фракции с 5 хроматогра

- 23 012164 фических разделений, содержащих антибиотик 107891, объединяли и концентрировали в вакууме. Оставшийся раствор последовательно трижды лиофилизировали из воды с получением 31 мг антибиотика 107891 в виде белого порошка.

Пример 7. Разделение и очистка индивидуальных факторов А1 и А2 антибиотика 107891.

Факторы А1 и А2 разделяли и очищали из антибиотического комплекса 107891 по примеру 5 при помощи препаративной ВЭЖХ на колонке 8утте1гу Ргер С18 (размер частиц 7 мкм) 7,8x300 мм Vаΐе^8 (М11бГо1б И8А) с использованием различных программ элюции.

А) Фактор А1 очищали при помощи линейного элюирующего градиента от 30 до 45% фазы Б при скорости потока 3,5 мл в течение 25 мин. Фаза А представляла собой 25 мМ буфер формиата аммония рН 4,5: ацетонитрил 95:5 (об./об.), а фаза Б представляла собой ацетонитрил. Очищенный антибиотический комплекс 107891 (15 мг) растворяли в 350 мкл смеси ДМСО: муравьиная кислота 95:5 (об./об.) и подвергали хроматографическому разделению. Факторы А1 и А2, как правило, элюировали во временном интервале 11-13 мин. Элюированные фракции затем анализировали при помощи ВЭЖХ в вышеописанных аналитических условиях. Фракции после 14 хроматографических разделений, содержащие чистый фактор А1 антибиотика 107891, объединяли и концентрировали в вакууме. Оставшийся раствор трижды последовательно лиофилизировали из воды с получением 15 мг чистого фактора А1 в виде белого порошка.

Б) Фактор А2 очищали путем изократической элюции при скорости потока 7 мл смесью 100 мМ буфер формиата аммония рН 4:ацетонитрил 82,5:17,5 (об./об.). Очищенный антибиотитический комплекс 107891 (5 мг) растворяли в 250 мкл смеси уксусная кислота:ацетонитрил:100 мМ буфер формиата аммония рН 4 50:120:80 (об./об.) и подвергали хроматографическому разделению. Факторы А1 и А2 как правило элюировали в течение временного интервала 9-10 мин. Элюированные фракции затем анализировали путем ВЭЖХ в вышеописанных аналитических условиях. Фракции после 20 хроматографических разделений, содержащие чистый фактор А2 антибиотика 107891, объединяли и концентрировали в вакумме. Оставшийся раствор дважды лиофилизировали из воды с получением 8 мг чистого фактора А2 в виде белого порошка.

Claims (33)

1. где К₁, В₂, В₃, В₄, В₅, В₆, Е- и В₈ независимо выбраны из группы, состоящей из Н и ОН.
2. 2. Соединение по п.1, где X представляет собой С1, В₂ представляет собой ОН и К₁, В₃, В₄, В₅, В₆, В₇ и В₈ представляют собой Н.
3. 3. Соединение по п.1, где X представляет собой С1, Щ представляет собой ОН, В₂ представляет собой ОН и В₃, В₄, В₅, В₆, В₇ и В₈ представляют собой Н.
4. 4. Соединение по п.1, где В₄, В₅, В₆, В₇ и В₈ представляют собой Н.
5. 5. Соединение по п.4, где Щ представляет собой Н, В₂ представляет собой Н и В₃ представляет собой Н.
6. 6. Соединение по п.4, где Щ представляет собой Н, В₂ представляет собой Н и В₃ представляет собой ОН.
7. 7. Соединение по п.4, где Щ представляет собой Н, В₂ представляет собой ОН и В₃ представляет собой ОН.
8. 8. Соединение по п.4, где В! представляет собой ОН, В₂ представляет собой ОН и В₃ представляет собой ОН.

   - 24 012164
9. 9. Соединение по п.4, где Κι представляет собой ОН, К₂ представляет собой Н и К₃ представляет собой Н.
10. 10. Соединение по п.4, где К| представляет собой ОН, К₂ представляет собой Н и К₃ представляет собой ОН.
11. 11. Соединение формулы
12. 12. Соединение формулы
13. 13. Антибиотический комплекс 107891, содержащий фактор А1 и фактор А2, представляющий собой белый порошок, обладающий следующими характеристиками:

    (A) масс-спектр, регистрируемый в растворе 0,2 мг/мл в смеси метанол:вода 80/20 (об./об.) с 0,1% трифторуксусной кислоты на аппарате Тйегтойпшдап ЬС'О йеса, оборудованном источником электрораспыления, с использованием калибровочной смеси Тйегтойпшдап в следующих условиях электрораспыления: напряжение распыления - 4,7 кВ; температура капилляра - 220°С; капиллярное напряжение 3В; режим инфузии - 10 мкл/мин, демонстрирующий два дважды протонированных иона с т/ζ 1124 и т/ζ 1116, соответствующих наименьшей изотопной композиции фактора А1 и А2 соответственно;

    (Б) инфракрасный спектр, зарегистрированный в КВг с использованием спектрофотометра для инфракрасной спектрометрии с преобразованием Фурье Вгикег ΕΤ-ΙΚ модель ΙΕ8 48, демонстрирует максимумы абсорбции при (см^-1): 3263; 2929; 1661;1533; 1402; 1114; 1026;

    (B) ультрафиолетовый (УФ) спектр в смеси метанол:Н₂О 80:20 (об./об.) с использованием спектрофотометра Регкш-Е1тег ЬатЬйа 16 демонстрирует два плеча при 226 и 267 нм;

    (Г) спектр ¹Н-ядерного магнитного резонанса (ЯМР), зарегистрированный при 600 МГц в смеси метанол-й4:Н₂О (рН 4,3 НС1) 40:10 (об./об.) при 40°С на спектрометре Вгикег АМХ 600 с применением последовательности вытеснения воды и с использованием в качестве внутреннего стандарта остаточного сигнала метанол-й4 при 3,31 м.д., демонстрирует следующие сигналы [5=м.д. мультиплетность; (соотнесение)]: 0.93 й (СН₃), 0.98 й (СН₃), 1.07 ΐ (перекрывающиеся СН₃), 1.18 ΐ (перекрывающиеся СН₃), 1.26 8 (СН₃), 1.30 ΐ (перекрывающиеся СН₃), 1.62-1.74 т (СН₂), 1.78 й (СН₃), 1.80 й (СН₃), 2.03 т (СН₂), 2.24 т (СН), 2.36 т (СН₂), 2.72-3.8 т (пептидные альфа СН), 3.8-5.2 т (пептидные альфа СН), 5.53-6.08 8 (СН₂),

    - 25 012164

    5.62 б (СН двойной связи), 6.42 т (СН), 6.92 б (СН двойной связи), 7.0-7.55 т (ароматические СН), 7.6210.4 б и т (ароматические и пептидные ΝΗ);

    (Д) ¹³С-ЯМР спектр, зарегистрированный в смеси метанол-б4:Н₂О (рН 4,3 НС1) 40:10 (об./об.) при 40°С на спектрометре Вгикег АМХ 600, с использованием в качестве внутреннего стандарта остаточного сигнала метанола-б4 при 49,15 м.д., демонстрирует следующие сигналы: [5=м.д.; (соотнесение)]: 13.623.2 (алифатические СН₃), 26.16-73 (алифатические СН₂ и пептидные альфа СН), 105-136 (ароматические СН и СН двойных связей и четвертичные атомы углерода), 164.3-176.3 (пептидные карбонилы);

    (Е) кислотный гидролизат в 6н. НС1 (105°С, 24 ч) демонстрирует присутствие следующих аминокислот наряду с другими неидентифицированными пиками после дериватизации с использованием 6аминохинолил-№гидроксисукцинимидилкарбамата: лантионин, метиллантионин, глицин, пролин, валин, аспарагиновая кислота (продукт гидролиза аспарагина), фенилаланин и лейцин;

    (Ж) кислотный гидролизат в 4н. метансульфоновой кислоте, содержащей 0,2% (мас./об.) 3-(2аминоэтил)индола в качестве катализатора (115°С, 16 ч), демонстрирует присутствие 5-хлортриптофана; и (З) основная ионизируемая функция, обнаруживаемая путем кислотного/основного титрования, осуществляемого 0,01н. гидроксидом калия в смеси 2-метоксиэтанол (МС8):Н₂О 12:3 (об./об.), содержащей молярный избыток 0,01н. соляной кислоты.
14. 14. Фактор А1 антибиотика 107891, представляющий собой белый порошок, обладающий следующими характеристиками:

    A) дважды протонированный ион с т/ζ 1124, соответствующий наименьшей изотопной композиции в масс-спектре, зарегистрированном в 0,1 мг/мл растворе в смеси ацетонитрил:вода 50:50 (об./об.) с 0,5% уксусной кислоты на аппарате ТйеппоПппщап БСС беса, оборудованном источником электрораспыления, с использованием калибровочной смеси ТйегтоПппщап в следующих условиях электрораспыления: напряжение распыления - 4,7 кВ; температура капилляра - 250°С; капиллярное напряжение - 8В; режим введения - 10 мкл/мин;

    Б) точная масса антибиотика, определенная с использованием 4,7 Т спектрометра Вгикег Эа11оп1С5 АРЕХ II, оборудованного источником электрораспыления, соответствует молекулярной массе 2246,71±0,06, рассчитанной моноизотопной массе из [М+2Н]²⁺ с т/ζ 1124,36124 (точность 30 м.д.);

    B) при растворении в смеси ί'Ό₃,ί’ΝΌ_;Ο (1:1) ¹Н ЯМР спектр демонстрирует следующие группы сигналов (в м.д.) при 600 МГц с использованием ΕΟ^Ν в качестве внутреннего стандарта (1,94 м.д.), [5=м.д., мультиплетность; (соотнесение)]: 0.84 б (СН₃), 0.89 б (СН₃), 0.94 I (перекрывающиеся СН₃), 1.1 б (СН₃), 1.13 б (СН₃), 1.15 I (перекрывающиеся СН₃), 149 т (СН₂), 1.69 б (СН₃), 1.75 т (СН₂), 2.11 т (СН), 2.26 т (СН), 2.5 т (СН₂), 2.68-3.8 т (пептидные СНр), 3.8-5.0 т (пептидные СН,), 5.45-6.17 8 (СН₂), 5.58 б (СН двойной связи), 6.36 т (СН), 6.86 б (СН двойной связи), 7.0-7.45 т (ароматические СН);

    Г) при растворении в смеси ί.Ό₃ί’ΝΌ₃Ο (1:1), ¹³С ЯМР спектр демонстрирует следующие сигналы (в м.д.) при 600 МГц с использованием ί.Ό3ί.'Ν в качестве внутреннего стандарта (1,39 м.д.), [5=млн^-1; (соотнесение)]: 13.6-23.03 (алифатические СН3), 25.69-77.9 (алифатические СН₂ и пептидные СН,.). 105137.3 (ароматические СН и СН двойной связи и четвертичные атомы углерода), 165.6-176.6 (пептидные карбонилы);

    Д) инфракрасный спектр, зарегистрированный в КВг с использованием спектрофотометра Вгикег ЕТ-ΙΒ модель ΙΕ8 48, демонстрирует максимумы абсорбции при (см^-1): 3294; 3059; 2926; 1661; 1529; 1433; 1407; 1287; 1114; 1021;

    Е) ультрафиолетовый (УФ) спектр в смеси метанол:Н₂О 80:20 (об./об.) с использованием спектрофотометра Регкш-Итег ЬатЬба 16 демонстрирует два плеча при 226 и 267 нм;

    Ж) кислотный гидролизат в 6н. НС1 (105°С, 24 ч) демонстрирует присутствие следующих аминокислот наряду с другими неидентифицированными пиками после дериватизации с использованием 6аминохинолил-№гидроксисукцинимидилкарбамата: лантионин, метиллантионин, глицин, пролин, валин, аспарагиновая кислота (продукт гидролиза аспарагина), фенилаланин и лейцин; и

    З) кислотный гидролизат в 4н. метансульфоновой кислоте, содержащей 0,2% (мас./об.) 3-(2аминоэтил)индола в качестве катализатора (115°С, 16 ч), демонстрирует присутствие 5-хлортриптофана.
15. 15. Фактор А2 антибиотика 107891, представляющий собой белый порошок, обладающий следующими характеристиками:

    А) дважды протонированный ион с т/ζ 1116, соответствующий наименьшей изотопной композиции в масс-спектре, зарегистрированном в 0,1 мг/мл растворе в смеси ацетонитрил:вода 50:50 (об./об.) с 0,5% уксусной кислоты на аппарате ТйеппоПппщап БСС беса, оборудованном источником электрораспыления, с использованием калибровочной смеси Тйегшойпшдап в следующих условиях электрораспыления: напряжение распыления - 4,7 кВ; температура капилляра - 250°С; капиллярное напряжение - 8В; режим введения - 10 мкл/мин;

    Б) точная масса, определенная с использованием 4,7 Т спектрометра Вгикег Оа11ошс8 АРЕХ II, оборудованного источником электрораспыления, соответствует молекулярной массе 2230,71±0,06, рассчитанной моноизотопной массе из [М+2Н]²⁺ с т/ζ 1115,36260 (точность 30 м.д.);

    - 26 012164

    В) при растворении в смеси ΟΌ₃0’ΝΌ₂Ο (1:1) ¹Н ЯМР спектр демонстрирует следующие группы сигналов (в м.д.) при 600 МГц с использованием 0Ό₃0'Ν в качестве внутреннего стандарта (1,94 м.д.), [5=м.д., мультиплетность; (соотнесение)]: 0.84 б (СН₃), 0.88 б (СН₃), 0.94 б (СН₃), 1.06 б (СН₃), 1.14 б (СН₃), 148 т (СН₂), 1.65-1.75 т (СН₂), 1.67 б (СН₃), 2.15 т (СН), 2.25 т (СН), 2.5 т (СН₂), 2.77-3.8 т (пептидные СНр), 3.8-4.9 т (пептидные СН_а), 5.45-6.14 к (СН₂), 5.59 б (СН двойной связи), 6.34 т (СН), 6.84 б (СН двойной связи), 7.0-7.42 т (ароматические СН);

    Г) при растворении в смеси 0Ό₃0’ΝΌ_;Ο (1:1), ¹³С ЯМР спектр демонстрирует следующие сигналы (в м.д.) при 600 МГц с использованием 0Ό₃0’Ν в качестве внутреннего стандарта (1,39 м.д.), [5=м.д..; (соотнесение)]: 13.6-22.9 (алифатические СН₃), 25.65-73 (алифатические СН₂ и пептидные СН_а), 105137.3 (ароматические СН и СН двойной связи и четвертичные атомы углерода), 165.7-176.1 (пептидные карбонилы);

    Д) инфракрасный спектр, зарегистрированный в КВг с использованием спектрофотометра Вгикег ЕТ4К модель !Е8 48, демонстрирует максимумы абсорбции при (см^-1): 3296; 3060; 2928; 1661; 1529; 1433; 1407; 1288; 1116;

    Е) ультрафиолетовый (УФ) спектр в смеси метанол:Н2О 80:20 (об./об.) с использованием спектрофотометра Регкш-Е1тег ЬатЬба 16 демонстрирует два плеча при 226 и 267 нм;

    Ж) кислотный гидролизат в 6н. НС1 (105°С, 24 ч) демонстрирует присутствие следующих аминокислот наряду с другими неидентифицированными пиками после дериватизации с использованием 6аминохинолил-Ы-гидроксисукцинимидилкарбамата: лантионин, метиллантионин, глицин, пролин, валин, аспарагиновая кислота (продукт гидролиза аспарагина), фенилаланин и лейцин; и

    З) кислотный гидролизат в 4н. метансульфоновой кислоте, содержащей 0,2% (мас./об.) 3-(2аминоэтил)индола в качестве катализатора (115°С, 16 ч), демонстрирует присутствие 5-хлортриптофана.
16. 16. Способ получения антибиотика 107891 и его факторов А1 и А2 и их солей с кислотами, включающий стадии культивирования культуры М1егоЫкрога кр. АТСС РТА-5024 или его варианта или мутанта с сохранением способности продуцировать указанный антибиотик в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей ассимилируемый источник углерода, азота и неорганических солей;

    выделения получающегося в результате антибиотика из мицелия и/или профильтрованного ферментационного бульона и очистки выделенного антибиотика 107891.
17. 17. Способ по п.16, при котором штамм М1егоЫкрога кр. АТСС РТА-5024 или его вариант или мутант, продуцирующий антибиотик 107891, подвергают предварительному культивированию.
18. 18. Способ по п.16, при котором выделение антибиотика 107891 осуществляют путем фильтрования ферментационного бульона и антибиотик выделяют из профильтрованного ферментационного бульона методом, выбранным из группы, состоящей из экстракции не смешивающимся с водой растворителем, осаждения путем добавления нерастворителя или путем изменения рН раствора, абсорбционной хроматографии, распределительной хроматографии, распределительной хроматографии с обращенной фазой, ионообменной хроматографии, молекулярной вытеснительной хроматографии и комбинации двух или более указанных методов.
19. 19. Способ по п.16, при котором выделение антибиотика 107891 осуществляют путем отделения мицелия от супернатанта ферментационного бульона и мицелий экстрагируют смешивающимся с водой растворителем, посредством чего после удаления отработанного мицелия получают смешивающийся с водой раствор, содержащий неочищенный антибиотик, который может быть обработан отдельно или вместе с профильтрованным ферментационным бульоном для выделения антибиотика 107891 методом, выбранным из группы, состоящей из экстракции растворителем, осаждения путем добавления нерастворителя или путем изменения рН раствора, абсорбционной хроматографии, распределительной хроматографии, распределительной хроматографии с обращенной фазой, ионообменной хроматографии и молекулярной вытеснительной хроматографии и комбинации двух или более указанных методов.
20. 20. Способ по п.19, при котором концентрацию смешивающегося с водой растворителя в экстракте мицелия понижают до того, как его подвергают обработке для выделения из него антибиотика.
21. 21. Способ по п.18, при котором профильтрованный ферментационный бульон приводят в контакт с абсорбирующей смолой и указанную смолу подвергают элюции полярным смешивающимся с водой растворителем или его смесью с водой, в результате чего получают раствор, содержащий неочищенный антибиотик 107981.
22. 22. Способ по п.21, при котором абсорбирующая смола выбрана из группы, состоящей из полистирола, смешанного полистирола-дивинилбензола и полиамидной смолы.
23. 23. Способ по п.19, при котором мицелий экстрагируют С1-С₃алканолом и экстракт мицелия приводят в контакт с абсорбирующей смолой и элюируют из нее полярным смешивающимся с водой растворителем или его смесью с водой, в результате чего получают раствор, содержащий неочищенный антибиотик 107891.
24. 24. Способ по п.18, при котором растворы, содержащие неочищенный антибиотик 107891, объеди

    - 27 012164 няют и обрабатывают для дополнительной очистки указанного антибиотика 107891.
25. 25. Способ по п.21, при котором раствор, содержащий неочищенный антибиотик 107981, концентрируют и затем сушат замораживанием с получением твердого продукта неочищенного антибиотика 107891.
26. 26. Способ по п.21, при котором объединяют абсорбирующие смолы, содержащие абсорбированный антибиотик, и их смесь элюируют полярным смешивающимся с водой растворителем или его смесью с водой.
27. 27. Способ по п.16, при котором антибиотик 107981 очищают при помощи хроматографии, предпочтительно путем препаративной жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) или хроматографии среднего давления.
28. 28. Способ по п.16, при котором фактор А1 и фактор А2 при помощи препаративной ЖХВД выделяют из очищенного антибиотика 107891.
29. 29. Фармацевтическая композиция, содержащая антибиотик, выбранный из антибиотика 107891, фактора А1 антибиотика 107891, фактора А2 антибиотика 107891 и смеси указанных факторов в любом соотношении или их фармацевтически приемлемой соли с кислотой, и фармацевтически приемлемый носитель.
30. 30. Антибиотик 107891, его фактор А1, его фактор А2 или смесь указанных факторов в любом соотношении или их фармацевтически приемлемая соль с кислотой для применения в качестве лекарственного средства.
31. 31. Применение антибиотика 107891, его фактора А1, его фактора А2 или смеси указанных факторов в любом соотношении или их фармацевтически приемлемой соли с кислотой для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения бактериальных инфекций.
32. 32. Применение антибиотика 107891, его фактора А1, его фактора А2 или смеси указанных факторов в любом соотношении и их нетоксичной соли с кислотой в качестве стимулятора роста животного.
33. 33. Штамм МюгоЬЦрога §р. АТСС РТА-5024, или его вариант, или мутант, сохраняющий способность продуцировать антибиотик 107891 при выращивании культуры в глубинных аэробных условиях в присутствии ассимилируемых источников углерода, азота и неорганических солей.