MX2007008512A - Antibiotico 107891, sus factores a1 y a2, sales y composiciones farmaceuticamente aceptables, y uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a una sustancia antibiotica de origen microbiano denominada arbitrariamente antibiotico 107891, la cual se produce por fermentacion de Microbispora sp. ATCC PTA-5024, sales y composiciones farmaceuticas aceptables de la misma y su uso como agente antibacteriano teniendo actividad inhibidora frente a microbios susceptibles. El antibiotico 107891, el cual es un complejo que comprende dos Factores denominados Factores A1 y A2, tiene una estructura peptidica que contiene lantionina y metillantionina como constituyentes que son caracteristicas tipicas de los antibioticos del grupo lantibioticos. El antibiotico 107891 y sus Factores A1 y A2 muestran una buena actividad antibacteriana frente a bacterias Gram-positivas, incluyendo cepas resistentes a meticilina y a vancomicina, y tambien es activo frente a algunas bacterias Gram-positivas como por ejemplo M. catharralis, la especie Neisseria y H. influenzae y Micobacteria.

Description

ANTIBIÓTICO 107891. SUS FACTORES A1 Y A2. SALES Y COMPOSICIONES FARMACÉUTICAMENTE ACEPTABLES. Y USO DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una sustancia antibiótica de origen microbiano, denominada arbitrariamente antibiótico 107891 , el cual es un complejo que comprende los Factores A1 y A2, las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, composiciones farmacéuticas de los mismos y su uso como agente antibacteriano.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El antibiótico 107891 es un agente antimicrobiano novedoso con una estructura peptídica que contiene como constituyentes lantionina y metillantionina. Estas son las características típicas de los lantibióticos y, en particular, del subgrupo que actúa principalmente en la biosíntesís de la pared celular.

Los lantibióticos son péptidos que contienen el aminoácido con función tioéter lantionina así como otros diversos aminoácidos modificados (H. G. Sahl y G. Bierbaum, (1998) "Lantibiotics: biosynthesis and biological activities of uniquely modified peptides from gram-positive bacteria", Ann. Rev. Microbiol. 52: 41-79). La mayor parte de los lantibióticos conocidos tienen actividad antibacteriana, aunque se ha visto que algunos son activos sobre diferentes dianas farmacológicas. Los lantibióticos antibacterianos pueden dividirse ampliamente en dos grupos en base a su estructura: los lantibióticos de tipo A son péptidos anfifílícos alargados, mientras que los lantibióticos de tipo B son compactos y globulares (O. McAuliffe, R. P. Ross y C. Hill (2001 ): "Lantibiotics: structure, biosíntesis and mode of action",. FEMS Microb. Rev. 25: 285-308). La nisina es el típico lantibiótico representativo de tipo A, mientras que la actagardina (gardimicina) y la mersacidina pertenecen a la subclase de lantibióticos de tipo B. Los lantibióticos de tipo nisina y de tipo mersacidina interaccionan con el lípido II como precursor de peptidoglicano unido a membrana, aunque las dos clases difieren en los efectos que producen en el proceso de proliferación bacteriana. Los lantibióticos de tipo nisina matan bacterias principalmente por permeabilízación de la membrana cítoplasmática (H. Brotz, M. Josten, I. Wiedemann, U. Schneider, F. Gotz, G. Bierbaun y H. G. Sahl, (1998): "Role of lipid-bound peptidoglycan precursors in the formation of pores by nisin, epidermis and other lantibiotics", Mol. Microbiol. 30: 317-27), mientras que los lantibióticos de tipo mersacidina matan las células bacterianas principalmente inhibiendo la biosíntesis de la pared celular (H. Brotz, G. Bierbaun, K. Leopold, P. E. Reynolds y H. G. Sahl, (1998): "The lantibiotic mersacidin inhibits peptidoglycan synthesis by targeting lipid II", Antimicrob. Agents Chemother. 42: 154-60).

Los antibióticos producidos por la cepa de Microbispora Corallina NRRL 30420, identificados como antibióticos MF-BA-1768a, y MF-BA-1768ß! respectivamente, se describen en el documento US 6.551.591 B1. Los datos físico-químicos recogidos en la patente identificada anteriormente (por ejemplo datos de espectroscopia de masas, peso molecular, contenido de aminoácidos) y la comparación de los tiempos de retención en los análisis experimentales por CL-EM muestran claramente que el complejo del antibiótico 107891 así como sus componentes Factor A1 y Factor A2 son entidades químicas distintas de los antibióticos MF-BA-1768a! y MF-BA-1768ß,.

El documento EP 0592835A2 describe los antibióticos antitumorales BU-4803TA!, A2, B, d, C2 y D. Los antibióticos BU-4803TA!, A2 y B se recuperan a partir del caldo de fermentación de Microbispora 55327 (AA 9966), mientras que los antibióticos BU-4803TC!, C2 y D son productos de transformación de los antibióticos BU-4803TA,, A2 y B respectivamente, cuando estos productos se almacenan en sulfóxido de dimetilo. Los datos físico-químicos recogidos en el documento EP 0592 835 A para los antibióticos anteriores (por ejemplo aspecto, absorción U.V., peso molecular, actividad antitumoral) muestran claramente que son sustancia distintas del complejo del antibiótico 107891 y de sus Factores A1 y A2.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una sustancia antibiótica de origen microbiano, denominada arbitrariamente antibiótico 107891 , el cual es un complejo que comprende los Factores A1 y A2, las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, composiciones farmacéuticas de los mismos y su uso como agente antibacteriano.

Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para preparar el antibiótico 107891 , el cual incluye cultivar Microbispora sp. 107891 (de aquí en adelante identificada como Microbispora sp. ATCC PTA-5024) o una de sus variantes o mutantes manteniendo la capacidad para producir dicho antibiótico, recuperando el antibiótico de la invención a partir del micelio y/o a partir del caldo de fermentación, aislando la sustancia pura por medios cromatográficos y separando los Factores A1 y A2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1A (espectro de barrido completo de baja resolución) y 1 B (espectro de barrido aumentado de alta resolución) representa los espectros de masas del antibiótico 107891 , mostrando un ion doblemente protonado a m/z 1124 y a m/z 1116.

La Figura 2 representa el espectro de absorción en el IR del antibiótico 107891 disperso en KBr.

La Figura 3 representa el espectro UV del antibiótico 107891 disuelto en metanol:H20.

La Figura 4 representa el espectro de RMN-1H registrado en la mezcla metanol-d4:H20 (HCl pH 4,3) 40:10 (volumen:volumen) a 40°C en un espectrómetro Bruker AMX 600 aplicando una secuencia de supresión de agua.

La Figura 5 representa el espectro de RMN-13C registrado en la mezcla metanol-d4:H20 (HCl pH 4,3) 40:10 (volumen:volumen) a 40°C en un espectrómetro Bruker AMX 600.

La Figura 6A (espectro de barrido completo de baja resolución) y 6B (espectro de barrido aumentado de alta resolución) representa los espectros de masas del Factor 1 del antibiótico 107891 , mostrando iones doblemente protonados [M+2H]2+ a m/z 1124.

La Figura 7A (espectro de barrido completo de baja resolución) y 7B (espectro de barrido aumentado de alta resolución) representa los espectros de masas del Factor 2 del antibiótico 107891 , mostrando iones doblemente protonados [M+2H]2+ a m/z 1116.

La Figura 8 representa el espectro de RMN-1H del Factor 1 del antibiótico 107891 registrado en la mezcla CD3CN:D20 (1 :1 ) a 298 K en un espectrómetro Bruker AMX 600 aplicando una secuencia de supresión de agua.

La Figura 9 representa el espectro de RMN-1H del Factor 2 del antibiótico 107891 registrado en la mezcla CD3CN:D20 (1 :1 ) a 298 K en un espectrómetro Bruker AMX 600 aplicando una secuencia de supresión de agua.

La Figura 10 representa el espectro de RMN-13C del Factor 1 del antibiótico 107891 registrado en la mezcla CD3CN:D20 (1:1) a 298 K en un espectrómetro Bruker AMX 600.

La Figura 1 1 representa el espectro de RMN-13C del Factor 2 del antibiótico 107891 registrado en la mezcla CD3CN:D20 (1:1 ) a 298 K en un espectrómetro Bruker AMX 600.

La Figura 12 representa el espectro de absorción en el IR del Factor 1 del antibiótico 107891 disperso en KBr.

La Figura 13 representa el espectro UV Factor 1 del del antibiótico 107891 disuelto en metanol:H20.

La Figura 14 representa el espectro de absorción en el IR del Factor 2 del antibiótico 107891 disperso en KBr.

La Figura 15 representa el espectro UV Factor 2 del del antibiótico 107891 disuelto en metanol:H20.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El antibiótico 107891 es un agente antimicrobiano novedoso con una estructura peptídica que contiene como constituyentes lantionina y metillantionina. Estas son las características típicas de los lantibióticos y, en particular, del subgrupo que actúa principalmente en la biosíntesis de la pared celular.

CEPA Y FERMENTACIÓN Se aisló Microbispora sp. 107891 en el ambiente y se depositó el 27 de febrero de 2003 con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, American Type Culture Collection), 10801 University BIvd., Manassas VA, 20110-2209 EE.UU., al amparo del Tratado de Budapest. Se acordó como número de adquisición de la cepa el PTA-5024.

La producción de antibiótico 107891 se logró cultivando una cepa de Microbispora sp. capaz de producirlo, es decir, Microbispora sp. ATCC PTA-5024 o una de sus variantes o mutantes manteniendo la capacidad para mantener dicho antibiótico; aislando el antibiótico resultante a partir del caldo de cultivo completo y/o a partir del micelio separado y/o a partir del caldo de fermentación filtrado; y purificando el antibiótico aislado por medios cromatográficos. En cualquier caso, se prefiere producir antibiótico 107891 en condiciones aeróbicas en un medio acuoso rico en nutrientes que contenga fuentes fácilmente asimilables de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas. Pueden usarse muchos de los medios ricos en nutrientes empleados normalmente en el campo de la fermentación, sin embargo se prefieren ciertos medios.

Son fuentes de carbono preferidas la sacarosa, fructosa, glucosa, xilosa y similares. Son fuentes de nitrógeno preferidas harina de semilla de soja, peptona, extracto de carne, extracto de levadura, triptona, aminoácidos, caseína hidrolizada y similares. Entre las sales inorgánicas que pueden incorporarse en los medios de cultivo se encuentran las sales solubles habituales capaces de proporcionar sodio, potasio, hierro, zinc, cobalto, magnesio, calcio, amonio, cloruro, carbonato, sulfato, fosfato, nitrato e iones similares.

Preferiblemente, la cepa que produce antibiótico 107891 se cultiva previamente en un tubo de fermentación o en un matraz de agitación, usándose después el cultivo para inocular recipientes termentadores para la producción de cantidades sustanciales de sustancias. El medio usado para el cultivo previo puede ser el mismo que aquel empleado para fermentaciones más voluminosas, pero se pueden usar también otros medios. Puede cultivarse la cepa que produce antibiótico 107891 a temperatura entre 17°C y 37°C, estando las temperaturas óptimas alrededor de 28-30°C.

Durante la fermentación, puede seguirse la producción de antibiótico 107891 mediante ensayo biológico sobre microorganismos susceptibles y/o por análisis por HPLC. La producción máxima de antibiótico 107891 se da generalmente después de aproximadamente 90 horas y antes de las 200 horas de fermentación.

El antibiótico 107891 se produce cultivando Microbispora sp. ATCC PTA-5024 o una de sus variantes o mutantes capaz de producir antibiótico 107891 , y se encuentra en los caldos de cultivo y/o en el micelio.

En esta descripción y reivindicaciones, el término "antibiótico 107891", a menos que se especifique de otra forma, identifica el complejo de antibiótico 107891 comprendiendo los Factores A1 y A2.

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE Microbispora sp. ATCC PTA-5024 Microbispora sp. ATCC PTA-5024 crece bien en diversos medios sólidos convencionales.

Se midieron las dimensiones microscópicas usando el cultivo crecido sobre sales de ácido húmico a nivel de trazas en agar (composición en g/l: ácido húmico 0,5, FeS04*7H20 0,001 , MnCI2*4H20 0,001 , ZnS04*7H20 0,001 , NiS04*6H20 0,001 , MOPS 2, agar 20) añadido con 1 ml/l de solución rica en vitaminas (25 ing/l de clorhidrato de tiamina, 250 mg/l de pantotenato de calcio, 250 de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de biotina, 1 ,25 g/l de riboflavina, 6,25 mg/l de cianocobalamina, 25 mg/l de ácido paraminobenzoico, 500 mg/l de ácido fólico, 500 mg/l de clorhidrato de piridoxal).

En cultivo líquido (medio V6, composición en g/l: dextrosa 22, extracto de carne 5, extracto de levadura 5, caseína 3, NaCI 1 ,5) no se observa fragmentación del micelio después de 6 días de crecimiento a 28°C. El examen microscópico sobre sales de ácido húmico a nivel de trazas en agar (después de 21 días de incubación a 28°C) revela un micelio sustrato ramificado no fragmentado y un micelio aéreo monopodialmente ramificado; también quedan visibles muchas hifas aéreas largas, rectas y a penas ramificadas. Los pares de esporas longitudinales característicos nacen al surgir lateralmente pequeñas esporoforas a partir de ramas o directamente a partir de las principales hifas aéreas. Las esporas son globosas y no motiles. No se observan cuerpos del tipo esporangio u otras estructuras particulares.

CARACTERÍSTICAS DEL CULTIVO DE Microbispora sp. ATCC PTA-5024 Se creció Microbispora sp. ATCC PTA-5024 durante 6 días en un medio líquido de AF/MS (Véase Ejemplo 1 ) a 28°C y 200 rpm, después se transfirió (inoculo del 5%) a un nuevo medio líquido de AF/MS y se creció durante 6 días adicionales y finalmente se inoculó (inoculo del 7%) en 100 ml de medio líquido V6 (Véase Ejemplo 1). Después de 6 días de crecimiento a 28°C y 200 rpm, el micelio se recuperó por centrifugación y se lavó tres veces con solución salina estéril, diluyéndose después para proporcionar un inoculo adecuado. Se hendieron alícuotas de la suspensión en forma de raspaduras en forma de cruz sobre diversos medios recomendados por Shirling y Gottlieb (E. B. Shirling y D. Gottlieb, (1996): "Method for Characterization of Streptomyces species", Int. J. Syst. Bacterial. 16: 313-340), y medios recomendados por S. A. Waksman (1961 ): "The Actinomycetes", The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Vol. 2: 238-334.

La capacidad para usar una serie de hidrocarburos como fuente de carbono y energía se determinó usando el medio ISP4 sin almidón, añadido con 1ml/l de la solución rica en vitaminas descrita anteriormente como medio base; cada fuente de carbono se añadió a la concentración final de un 1% (peso/volumen).

Se determinaron la tolerancia a cloruro sódico, intervalo de pH de crecimiento así como la capacidad para crecer a diferentes temperaturas sobre un medio ISP2. Todos los medios se incubaron a 28°C durante tres semanas; las descripciones se refieren a 21 días a menos que se especifique de otra forma. El color se determinó a la luz natural del día usando el atlas de color de Maerz y Paul (A. Maerz y M. R. Paul, 1950 - A Dictionary of Colour, 2a edición. McGraw Hill Book Co.lnc, New York). La capacidad para reducir nitratos a nitritos se evaluó en un medio de nitrato casi líquido según el procedimiento descrito por Williams y cois. (S. T. Williams, M. Goodfellow, G. Alderson, E. M. H. Wellington, P. H. A. Sneath & M. J. Sackin, 1983 - Numerical classification of Streptomyces and related genera - J. Gen. Microbiol. 129, 1743-1813).

En la Tabla I se recogen el crecimiento, apariencia de la colonia, color del micelio sustrato y aéreo y producción de pigmentos para la cepa Microbispora sp. ATCC PTA-5024. El crecimiento vegetativo está presente en la mayoría de los medios usados, diferencia del micelio aéreo que está presente solamente en algunos de ellos. No se muestra pigmentación evidente en ninguno de los medios usados. Las características fisiológicas de la cepa se presentan en la Tabla II. El crecimiento y la producción de micelio aéreo están presentes a 17°C pero no a 43°C. La producción de micelio aéreo en ISP2 está presente a un pH superior a 6, mientras que está ausente en presencia de NaCI al 1%.

La capacidad para usar diversos hidrocarburos para el crecimiento se muestra e la Tabla lll.

Tabla I: características de crecimiento de Microbispora sp. ATCC PTA-5024.

(ISP4 Y Glucosa-Asparagina en agar añadidos con 1 ml/l de solución con vitaminas).

Tabla II características fisiológicas de Microbispora sp ATCC PTA-5024 Tabla lll: utilización de fuentes de carbono por Microbispora sp. ATCC PTA-5024. +++ abundante; ++ buen crecimiento; + crecimiento moderado; +/- crecimiento escaso; - sin crecimiento; micelio aéreo siempre ausente.

CARACTERÍSTICAS QUIMIOTAXONÓMICAS DE Microbispora sp. ATCC PTA-5024. Se creció Microbispora sp. ATCC PTA-5024 en un medio GLM (4g/l de glucosa; 4 g/l de extracto de levadura; 10 g/l de extracto de malta) a 28°C en un agitador rotatorío y el micelio se recuperó se lavó dos veces con agua destilada estéril y posteriormente se secó por congelación. Los análisis de aminoácidos se llevaron a cabo según el procedimiento de Staneck y Roberts (J. L. Staneck y G. D. Roberts, (1974): "Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin-layer chromatography", Appl. Microbíol. 28: 226-231). Se extrajeron menaquinonas y lípidos polares siguiendo el procedimiento de Minnikin y cois. (D. E. Minnikin, A. G. O'Donnell, M. Goodfellow, G. Alderson, M. Athalye, A. Schaal y J. H. Parlett, (1984): "An integrated procedure of isoprenoid quiñones and polar lipids", J. Microbiol. Meth.2: 233-241 ). Los lípidos polares se analizaron por cromatografía en capa fina (D. E. Minnikin, V. Patel, L. Alshamaony y M. Goodfellow, (1977): "Polar lipid composition in the classification of Nocardia and related bacteria", Int. J. Syst. Bacteriol. 27: 104-117), las menaquinonas por HPLC (R. M. Kroppenstedt, (1982): "Separation of bacterial menaquinones by HPLC using reverse phase RP18 and a silver loaded ¡on exchanger as stationary phase", J. Liquid. Chromat. 5:2359-2367; R. M. Kroppenstedt, (1985): "Fatty acid and menaquinone análisis of actinomycetes and related organisms", en: Chemical Methods in Bacterial Systematics, No20 SAB Technical Series pp. 173-199, ediciones M. Goodfellow y D.E. Minnikin, Academia Press, Londres) y los esteres metílicos de ácidos grasos por cromatografía gas-líquido respectivamente (L. T. Millar, (1982): "A single derívatization method for bacteríal fatty acid methyl esters including hydroxy acids", J. Clin. Microbíol. 16: 584-586; M. Ser, (1990): "Identification of bacteria by gas chromatography of cellular fattyacids", USFCC News Letters 20: 1-6). Se comprobó la presencia de ácido micólico mediante el procedimiento de Minnikin y cois. (D. E. Minnikin, L. Alshamaony y M. Goodfellow, (1975): "Differentiatíon of Mycobacterium Nocardia and related taxa by thin layer chromatography analysis of whole organism methanolyzates", J. Gen. Microbiol. 88: 200-204).

Los hidrolizados de células completas de la cepa Microbispora sp. ATCC PTA-5024 contienen ácido meso-diaminopimélico como el diaminoácido del peptidoglícano. Las menaquinonas predominantes son MK-9 (lll, Vlll-H4), MK-9 (H2) y MK-9 (H0). El modelo de lípido polar se caracteriza por la presencia de fosfatidiletanolamina, metilfosfatidiletanolamina, fosfatidil-glicerol, difosfatidil-glicerol, fosfatidil-ínositol, fosfatidil-inositolmanósidos y N-acetilglucosamina que contiene fosfolípido, es decir, fosfolípído de tipo IV según Lechevalier y cois. (H. A. Lechevalier, C. de Briéve y M. P. Lechevalier, (1977): "Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: phospholipid composition", Biochem. Syst. Ecol. 5: 246-260). La mayor parte de los componentes del modelo de ácido graso son anteiso 15:0, iso 16:0, p-16:0, anteiso 17:0 y 10-metil-heptadecanoico (10-Me-17:0), es decir 3c sensu Kroppenstedt, (R. M. Kroppenstedt, (1985): "Fatty acid and menaquinone análisis of actinomycetes and related organisms", en: Chemical Methods in Bacterial Systematics, No20 SAB Technical Series pp. 173-199, ediciones M. Goodfellow y D.E. Minnikin, Academia Press, Londres). No se detectan ácidos micólicos.

SECUENCIACIÓN de ADNr 16S de MICROBISPORA sp. ATCC PTA-5024 La secuencia parcial del gen ARNr 16 (ADNr 16S), es decir, 1443 nucleótidos, correspondiente a un 95% del ARNr completo de la cepa Microbispora sp. ATCC PTA-5024, se alcanzó siguiendo los procedimientos publicados (P. Mazza, P. Moncíardini, L. Cavaletti, M. Sosio y S. Donadío, (2003): "Díversity of Actinoplanes and related genera isolated from an Italían soil", Microbial. Ecol. 5: 362-372). Se recoge en el n° de identificación de secuencia 1.

Esta secuencia se comparó con aquellas de la cepa Microbispora Corallina NRRL 30420 (MF-BA-1768), tal y como se recoge en el documento US 6.551.591 B1. Las dos secuencias se alinearon y se encontraron diferencias en 31 fuera de las 1456 posiciones alineadas, explicando una divergencia general de secuencia de un 2,13%. Cualesquier dos cepas que compartan menos de un 97,5% de identidad de secuencia generalmente pertenecen a especies diferentes (Stackebrandt, E. y Embley, M. T. (2000) "Diversity of Uncultured Microorganisms ¡n the Enviroment". En: Nonculturable Microorganisms in the Environment, R. R. Colwell y D. J. Grimes (ediciones), ASM, Press, Washington DC, páginas 57-75). Por lo tanto un nivel de un 2% de divergencia en la secuencia es bastante elevado (Roselló-Mora, R. y Amann, R. (2001). "The Species Concept for Prokaríotes". FEMS Microbiol. Rev. 25: 39-67), e indica que Microbispora sp. ATCC PTA-5024 y Microbispora Corallina NRRL 30420 (MF-BA-1768) son cepas diferentes.

IDENTIDAD DE LA CEPA MICROBISPORA sp. ATCC PTA-5024 La cepa que produce el antibiótico 107891 se incluye en el género Microbispora, familia Streptosporangiaceae en virtud de las siguientes características quimiotaxonómicas y morfológicas: - presencia de ácido meso-diaminopimélico en la pared celular; - cantidad mayoritaria de MK-9 (lll, Vlll-H4) y fosfolípído de tipo IV según Lechevalier y cois. (H. A. Lechevalier, C. de Briéve y M. P. Lechevalier, (1977): "Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: phospholipid composítion", Biochem. Syst. Ecol. 5: 246-260); - perfil de ácido graso de 3c sensu Kroppenstedt, (R. M. Kroppenstedt, (1992): "The Genus Nocardiopsis", en: The Prokariotes, Vol II, páginas 1139-1156, ediciones A. Balows, H. Truper, M.

Dworkin, W. Harder y K. H. Scheleifer; Nueva York, Springer-Verlag); - ausencia de ácidos micólicos; - formación de pares longitudinales característicos de esporas en los extremos de pequeñas esporoforas ramificándose lateralmente a partir de hifas aéreas. Esporas no motiles; - secuencia parcial del gen ARNr 16 (ADNr 16S), es decir, 1443 nucleótidos, correspondiente a un 95% del ARN completo, recogida en el n° de identificación de secuencia 1 , mostrando una identidad superior a un 97% respecto a las secuencias de ARNr 16 de la especie Microbispora descrita.

De igual modo que con otros microorganismos, las características de la cepa que produce el antibiótico 107891 están sujetas a variación. Por ejemplo, pueden obtenerse variantes artificiales y mutantes de la cepa por tratamiento con diversos mutágenos conocidos, como por ejemplo rayos U.V., y especies químicas como por ejemplo ácido nitroso, ?/-metil-? '-nitro-/V-nitrosoguanidina y muchos otros. Todas las variantes naturales y artificiales y mutantes de la cepa Microbispora sp. ATCC PTA-5024 capaces de producir el antibiótico 107891 son considerados equivalentes a la misma para el propósito de esta invención, y por lo tanto dentro del alcance de la invención.

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ANTIBIÓTICO 107891 Tal y como se ha mencionado anteriormente, el antibiótico 107891 se encuentra casi igualmente distribuido en el micelio y en la fracción filtrada del caldo de fermentación.

El caldo recuperado puede ser procesado para separar el micelio del sobrenadante del caldo de fermentación y el micelio puede extraerse con un disolvente míscible con agua para obtener una solución que contenga el antibiótico 107891 , después de la retirada del micelio gastado. Puede procesarse entonces este extracto de micelio por separado o en combinación con el sobrenadante según los procedimientos recogidos a continuación para la fracción sobrenadante. Cuando el disolvente miscible con agua pueda provocar interferencias con las operaciones a la hora de recuperar el antibiótico del extracto de micelio, puede eliminarse el disolvente miscible con agua por destilación o puede diluirse con agua hasta una concentración que no interfiera.

El término "disolvente miscible con agua" tal y como se usa en esta solicitud, pretende tener el significado dado actualmente en la técnica de este término y se refiere a disolventes que, en las condiciones de uso, son miscibles con agua en un intervalo de concentración razonablemente amplio. Son ejemplos de disolventes orgánicos miscibles con agua que pueden usarse en la extracción de los compuestos de la invención: alcanoles inferiores, por ejemplo alcanoles (C C3) como por ejemplo metanol, etanol y propanol; fenilalcanoles (CrC3) como por ejemplo alcoholbencílico; cetonas inferiores, por ejemplo cetonas (C3-C4) como por ejemplo acetona y etilmetilcetona; éteres cíclicos como por ejemplo díoxano y tetrahidrofurano; glicoles y sus productos de eterificación parcial como por ejemplo etilenglicol, propilenglicol y etilenglicol monometil éter, amidas inferiores como por ejemplo dímetilformamída y dietilformamida; ácido acético dimetilsulfóxido y acetonitrilo.

La recuperación del compuesto a partir del sobrenadante del caldo de fermentación del microorganismo productor se lleva a cabo según las técnicas conocidas per se, las cuales incluyen extracción con disolventes, precipitación por adición de no disolventes o por cambio del pH de la solución, por cromatografía de reparto, cromatografía de reparto en fase inversa, cromatografía de intercambio ¡ónico, cromatografía de exclusión molecular y similares o una combinación de dos o más de dichas técnicas. Un procedimiento para recuperar los compuestos de la invención a partir del caldo de fermentación filtrado incluye la extracción del antibiótico 107891 con disolventes orgánicos inmiscibles con agua, seguido de precipitación de los extractos concentrados, posiblemente añadiendo un agente precipitante.

También en este caso, el término "disolvente inmiscible con agua" tal y como se usa en esta solicitud, pretende tener el significado dado actualmente en la técnica de este término y se refiere a disolventes que, en las condiciones de uso, son ligeramente míscibles o prácticamente inmiscibles con agua en un intervalo de concentración razonablemente amplio, adecuado para el uso pretendido.

Son ejemplos de disolventes orgánicos inmiscibles con agua que pueden usarse en la extracción de los compuestos de la invención a partir del caldo de fermentación: alcanoles de al menos cuatro átomos de carbono que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos como por ejemplo n-butanol, 1-pentanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 1-hexanol, 2-hexanol, 3-hexanol, 3,3-dimetil-1-butapol, 4-metil-1-pentanol, 3-metil-1-pentanol, 2,2-dimetil-3-pentanol, 2,4-dimetil-3-pentanol, 4,4-dimetil-2-pentanol, 5-metil-2-hexanol, 1-heptanol, 2-heptanol, 5-metil-1-hexanol, 2-etil-1-hexanol, 2-metil-3-hexanol, 1 -octanol, 2-hectanol, ciclopentanol, 2-ciclopentiletanol, 3-ciclopentil-1 -propanol, ciclohexanol, cícloheptanol, ciclooctanol, 2,3-dimetil-ciclohexanol, 4-etilcíclohexanol, cicloctilmetanol, 6-metil-5-hepten-2-ol, 1-nonanol, 2-nonanol, 1-decanol, 2-decanol y 3-decanol; cetonas de al menos cinco átomos de carbono como por ejemplo metilisopropilcetona, metilisobutilcetona, metil-n-amilcetona, metilisoamilcetona y mezclas de los mismos.

Tal y como se conoce en la técnica, puede mejorarse la extracción del producto a partir del caldo de fermentación filtrado ajustando el pH a un valor apropiado, y/o añadiendo una sal orgánica apropiada formando un par iónico con el antibiótico, el cual es soluble en el disolvente de extracción.

Tal y como se conoce en la técnica, puede mejorarse la separación de fases añadiendo sales a la fase acuosa.

Cuando, después de una extracción, se recupera una fase orgánica que contiene una cantidad sustancial de agua, puede ser conveniente destilar agua azeotrópicamenete a partir de ella. Generalmente, esto requiere añadir un disolvente capaz de formar un número mínimo de mezclas azeotrópicas con agua, seguido de la adición de un agente precipitante para precipitar el producto deseado si fuera necesario. Son ejemplos representativos de disolventes orgánicos capaces de formar un número mínimo de mezclas azeotrópicas con agua: n-butanol, benceno, tolueno, butiléter, tetracloruro de carbono, cloroformo, ciciohexano, 2,5-dimetilfurano, hexano y m-xileno, siendo el p-butanol el disolvente preferido.

Son ejemplos de agentes precipitantes el éter de petróleo, alquiléteres inferiores como por ejemplo etiléter, propiléter y butiléter, y alquilcetonas inferiores como por ejemplo acetona.

Según un procedimiento preferido para recuperar el antibiótico 107891 , el caldo de fermentación filtrado puede ponerse en contacto con una matriz de adsorción seguido de elución con un disolvente polar soluble en agua o una de sus mezclas, concentración hasta un residuo oleoso a presión reducida, y precipitación con un agente precipitante del tipo ya mencionado anteriormente.

Son ejemplos de matrices de adsorción que pueden usarse convenientemente en la recuperación de los compuestos de la invención resinas de poliestireno o de mezcla de poliestireno-divinilbenceno (por ejemplo M112 o S112, Dow Chemical Co.; Amberlite® XAD2 o XAD4, Rohm & Haas; Diaion HP 20, Mitsubishi), resinas acrílicas (por ejemplo XAD7 o XAD8, Rohm & Haas), poliamidas como por ejemplo policaprolactamas, nylons y polivinilpirrolidonas entrecruzadas (por ejemplo Poliamida-CC 6, Poliamida-SC 6, Poliamida-CC 6,6, Poliamida-CC 6AC y Poliamida-SC 6AC, Macherey-Nagel & Co., Alemania; PA400, M. Woelm AG, Alemania); y la resina de polivinilpirrolidona PVP-CL, (Aldrich Chemie GMBH & Co., KG, Alemania) y dextranos entrecruzados de poro controlado (por ejemplo Sephadex® LH20, Pharmacia Fine Chemicals, AB). Preferiblemente se emplean resinas de poliestireno, siendo particularmente preferida la resina Diaion HP 20.

En el caso de las resinas de poliestireno, resinas de poliestireno-divinilbenceno, resinas de poliamida o resinas acrílicas, un eluyente preferido es un disolvente miscible con agua o sus mezclas acuosas. Las mezclas acuosas pueden contener tampones a un valor apropiado de pH.

También en este caso, el término "disolvente miscible con agua" tal y como se usa en esta descripción y reivindicaciones, pretende tener el significado dado actualmente en la técnica a este término tal y como se describe anteriormente.

Los sucesivos procedimientos para el aislamiento y purificación del antibiótico pueden llevarse a cabo sobre los extractos acumulados a partir del sobrenadante del caldo y del micelio. Por ejemplo, cuando la parte del producto antibiótico contenida en el caldo de fermentación filtrado o sobrenadante se recupera por absorción sobre una resina de absorción y la parte del producto antibiótico contenida en el micelio se extrae a partir del mismo con un disolvente miscible con agua, seguido de absorción sobre una resina de absorción, pueden combinarse las fracciones eluidas de cada uno de los dos grupos de resinas de absorción opcíonalmente después de concentración, y después procesarse adicionalmente como un cultivo unitario. Alternativamente, cuando los dos grupos de resinas de absorción utilizados para las etapas de extracción por separado son del mismo tipo y tienen las mismas características funcionales, pueden agruparse juntas y la mezcla puede someterse a una etapa de elución unitaria, por ejemplo, con un disolvente miscible con agua o una de sus mezclas con agua.

En cualquier caso, sea cual sea el procedimiento adoptado para recuperar el antibiótico 107891 bruto, la sucesiva etapa de purificación se lleva a cabo normalmente sobre una mezcla de los materiales brutos resultante de la combinación de los productos que se originan a partir de las diferentes etapas de extracción.

La purificación del antibiótico 107891 bruto puede llevarse a cabo por cualquiera de las técnicas conocidas per se, pero se lleva a cabo preferiblemente por medio de procedimientos cromatográfícos. Ejemplos de estos procedimientos cromatográficos son aquellos recogidos en relación a la etapa de recuperación e incluyen también cromatografías sobre fases estacionarias como por ejemplo gel de sílice, alúmina, silicato de magnesio activado y similares o cromatografía en fase inversa sobre gel de sílice silanizado que tiene diversas derivatizaciones funcionales, y eluyendo con disolventes míscibles con agua o una mezcla acuosa de disolventes míscibles con agua del tipo mencionado anteriormente.

Por ejemplo, puede emplearse cromatografía preparativa por HPLC usando RP-8 o RP-18 como fase estacionaria y una mezcla de tampón HCOONH4:CH3CN como sistema eluyente.

Las fracciones activas recuperadas a partir de la etapa de purificación se disponen juntas, se concentran a vacío, se precipitan por adición de un agente precipitante del tipo mencionado anteriormente y se secan o liofilizan en turnos individuales o iterativos. En el caso de que el producto contenga cantidades residuales de formiato de amonio u otros sales tamponadoras, éstas pueden eliminarse por absorción del antibiótico 107891 sobre una columna de extracción en fase sólida, por ejemplo una columna con resina en fase inversa como por ejemplo SPE Superclean LCP18 Suplco (Belefonte PA, EE.UU.), seguido de un lavado con agua destilada y elución con una mezcla apropiada de disolventes acuosos, por ejemplo etanohagua. El antibiótico se recupera entonces eliminando los disolventes de elución.

Según esto, una preparación seca de complejo de antibiótico 107891 purificado se obtiene en forma de un polvo blanco.

Como es habitual en esta técnica, las etapas de producción, así como la de recuperación y purificación, pueden seguirse por una serie de procedimientos analíticos que incluyen ensayo inhibidor frente a microorganismos susceptibles y control analítico usando la HPLC o HPLC acoplada con espectrometría de masas.

Una técnica analítica por HPLC preferida se lleva a cabo en un instrumento Waters (Waters Chromatography, Milford, MA) equipado con una columna Waters Simmetry-shield RP8, 5µ (250 x 4,6 mm) que eluye a razón de un caudal de 1 ml/min y a una temperatura de 50°C.

La elución fue con un programa de diversas etapas: tiempo = 0 (30% de fase B); tiempo = 8 min (30% de fase B); tiempo = 28 min (40% de fase B). La fase A era acetonitrílo: tampón formiato de amonio 100 mM (pH: 5,0) 5:95 y la fase B era acetonitrilo. El detector UV fue a 282 nm.

El efluente de la columna se separó en una proporción de 5:95 y la mayor parte (aproximadamente 950 µl/min) fue desviada hacia un detector de conjunto de fotodiodos. Los 50 µl/min restantes se desviaron hacia un interfaz ESI de un espectrómetro de masas de trampa iónica Finnigan LCQ (Thermoquest, Finnigan MAT, San José CA).

El análisis por espectrometría de masas se llevó a cabo en las siguientes condiciones: Condiciones de entrada de la muestra: gas de arrastre (N2) 414 kPa; gas auxiliar (N2) 34,5 kPa; estufa capilar 250°C; ajustes de potencial a la entrada de la muestra: polaridad positiva y negativa; potencial de nebulización iónica +/- 5 kV; potencial del capilar +/- 19 V; condiciones de barrido: tiempo iónico máximo 200 ms; tiempo iónico 5 ms; microbarrido completo 3; segmento: 30 minutos de duración, casos de barrido positivos (150-2000 m/z) y negativos (150- 2000 m/z).

En estas condiciones analíticas de HPLC, los Factores A1 y A2 del antibiótico 107891 mostraron tiempos de retención de 13,2 minutos y 13,9 minutos respectivamente. En la misma HPLC se eluyó el sistema factor A2 Ramoplanina (L. Gastaldo, R.Ciabatti, F. Assi, E. Restellí, J. K.

Kettenring, L. F. Zerilli, G. Romanó, M. Denaro y B. Cavalleri, (1992): "Isolation, structure determination and biological activity of A-16686 Factors A'1 , A'2 y A'3 glycolipodepsipeptide antibiotics", J. Ind. Microbiol. 11 : 13-18) con un tiempo de retención de 7,5 minutos.

Los Factores A1 y A2 del antibiótico 107891 pueden separarse de una muestra purificada de complejo de antibiótico 107891 por medio de HPLC preparativa.

El Factor A1 se separó y se purificó en una columna C18 Symmetry Prep. a partir del complejo de antibiótico 107891 disuelto en DMSO:ácido fórmico 95:5 usando un gradiente de elución lineal durante 25 minutos desde un 30% hasta un 45% de fase B a un caudal de 3,5 ml.

La fase B era acetonitrilo. La fase A era tampón de formiato de amonio 25 mM a pH 4,5:acetonitrilo 95:5 . Las fracciones eluídas que contenían el Factor A1 puro del antibiótico 107891 se juntaron y concentraron a vacío. La solución residual se liofilizó dando el Factor A1 puro en forma de un polvo blanco.

El Factor A2 se separó y se purificó por elución ¡socrática en una columna C18 Symmetry Prep. a partir de una muestra de complejo de antibiótico 107891 dísuelto en una mezcla de ácido acético:acetonitrilo:tampón formiato de amonio 100 mM (pH 4) 50:120:80 . Las fracciones eluidas que contenían el Factor A2 puro del antibiótico 107891 se juntaron y concentraron a vacío. La solución residual se liofilizó dando el Factor A2 puro en forma de un polvo blanco.

Como el antibiótico 107891 y sus Factores A1 y A2, tal y como se muestra por valoración ácido/base en 2-metoxietanol (MCS):H20 12:3 contienen una función básica, son capaces de formar sales con ácidos adecuados según procedimientos convencionales y pueden existir también en forma de base libre.

El antibiótico 107891 y sus Factores A1 y A2, cuando se obtienen en forma de base libre, pueden convertirse con ácidos en las correspondientes sales, las cuales incluyen sales farmacéuticamente aceptables no tóxicas. Las sales adecuadas incluyen aquellas sales formadas por reacción convencional con ácidos orgánicos e inorgánicos tal y como por ejemplo clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, trifluoroacético, tricloroacético, succínico, cítrico, ascórbico, láctico, maleico, fumárico, palmítico, cólico, pamoico, músico, glutámico, canfórico, glutámico, glicólico, itálico, tartárico, láurico, esteárico, salicílico, metanosulfónico, bencenosulfónico, sórbico, pícrico, benzoico, cinámico y ácidos similares. Las sales de adición del antibiótico 107891 y sus Factores A1 y A2 con ácidos pueden prepararse según los procedimientos habituales comúnmente empleados. Como ejemplo, se disuelve el antibiótico 107891 o su Factor A1 o su Factor A2, en la forma de base libre, en la mínima cantidad de un disolvente adecuado, típicamente un alcanol inferior o una mezcla de alcanol inferior/agua, se añade de forma gradual a la solución obtenida la cantidad estequiométrica de un ácido adecuado seleccionado y la sal obtenida se precipita por la adición de un no disolvente. La sal de adición que se forma se recupera entonces por filtración o evaporación de los disolventes.

De forma alternativa, estas sales pueden prepararse en una forma sustancialmente anhidra a través de liofilización; en este caso una sal de antibiótico 107891 o de su Factor A1 o de su Factor A2 con ácido volátil se disuelve con una cantidad adecuada de ácido no volátil. La solución se filtra entonces de cualesquier insolubles y se liofiliza en turnos individuales o iterativos.

Puede obtenerse también una sal de adición específica a partir de una solución de otra forma salina de antibiótico 107891 o de su Factor A1 o de su Factor A2 cuando la sal deseada precipita tras la adición del anión apropiado.

La transformación del compuesto no salino de la invención en las sales de adición correspondientes, y a la inversa, es decir, la transformación de una sal de adición de un compuesto de la invención en la forma no salina, están dentro de la pericia técnica ordinaria y son abarcadas por la presente invención.

La formación de sales del antibiótico 107891 y de sus Factores A1 y A2 puede servir para diferentes propósitos, incluyendo la separación, purificación de dicho antibiótico 107891 y de sus Factores A1 y A2 y su uso como agentes terapéuticos o promotores de crecimiento animal. Habitualmente se emplean las sales farmacéuticamente aceptables con fines terapéuticos.

El término "sales farmacéuticamente aceptables" identifica aquellas sales no tóxicas que pueden utilizarse en la terapia de animales de sangre caliente.

El complejo de antibiótico 107891 , sus Factores A1 y A2 y una mezcla de dichos factores en cualquier proporción pueden ser administrados como tales o en mezclas con vehículos farmacéuticamente aceptables y también pueden ser administrados junto con otros agentes antimicrobíanos como por ejemplo penicilinas, cefalosporinas, amínoglicósidos y glicopéptidos.

Una terapia conjunta incluye por lo tanto una administración secuencial, simultánea y por separado del compuesto activo de un modo que los efectos terapéuticos del que se administra en primer lugar no desparecen por completo cuando se administra el siguiente.

Los compuestos de la invención o sus sales de adición farmacéuticamente aceptables pueden formularse en formas adecuadas para administración parenteral, oral o tópica. Para administración intravenosa en el tratamiento de cualquier infección que requiera un microorganismo susceptible al antibiótico, una formulación parenteral, por ejemplo, es en agua con un agente solubilizante apropiado como por ejemplo propilenglicol o dimetilacetamída y una agente tensioactivo (por ejemplo mono-oleato de polioxetilensorbitán o aceite de ricino polietoxilado) o formulaciones a base de cíclodextrinas o fosfolípídos en agua estéril para inyección. Se puede obtener también una formulación inyectable con una ciclodextrina apropiada.

El complejo de antibiótico 107981 , sus Factores A1 y A2 y una mezcla de dichos factores en cualquier proporción pueden ser usados también en una forma farmacéutica adecuada como por ejemplo una cápsula, un comprimido o una suspensión acuosa para administración oral o con cremas o ungüentos convencionales para aplicaciones tópicas. Además de uso como medicamentos en terapia humana y animal, los compuestos de la invención pueden usarse también como promotores de crecimiento animal. Para este propósito, se administra por vía oral un compuesto de la presente invención en un alimento adecuado. La concentración exacta empleada es aquella que se requiere para proporcionar el agente activo en una cantidad eficaz de promotor de crecimiento cuando se consumen cantidades normales de alimento.

La adición del compuesto activo de la invención al alimento animal se lleva a cabo preferiblemente preparando una premezcla apropiada del alimento que contenga el compuesto activo en una cantidad eficaz e incorporando la premezcla en la ración completa. De forma alternativa, puede mezclarse en el alimento un concentrado o suplemento de alimento que contenga el ingrediente activo. El modo en el que pueden prepararse y administrarse tales premezclas del alimento y raciones completas se describe en libros de referencia (como por ejemplo "Applied Animal Nutrition", W. H. Freedman and CO., San Francisco, EE.UU., 1969, o "Livestock Feeds and Feeding" libros 0 y B, Corvallis.Ore., EE.UU., 1977).

CARACTERÍSTICAS FISICOQUÍMICAS DEL ANTIBIÓTICO 107891 A) Espectrometría de masas: En experimentos de EM en un instrumento Thermofinnigan LCQ deca equipado con una fuente de electronebulización, usando una mezcla de calibrado Thermofinnigan, el antibiótico 107891 da dos iones doblemente protonados a m/z = 1124 y a m/z = 1116 correspondientes a la composición isotópica más baja de los Factores A1 y A2 del complejo respectivamente. Las condiciones de electronebulización fueron: potencial de nebulización: 4J kV; temperatura del capilar: 220°C; potencial del capilar: 3 kV; modo de infusión: 10 µl/minuto. Se registraron espectros a partir de una solución de 0,2 mg/ml en metanol/agua 80/20 con ácido trifluoroacético al 0,1% y se recogen en la Figura 1A (espectro de baja resolución de barrido completo) y 1 B (espectro de alta resolución de barrido aumentado).

B) El espectro de infrarrojos del antibiótico 107891 registrado en KBr con un espectrofotómetro Bruker FT-IR modelo IFS 48, muestra máxima absorción a (cm"1): 3263; 2929; 1661; 1533; 1402; 1114; 1026. El espectro de infrarrojos se recoge en la Figura 2. Las bandas de absorción a 1631 , 1596 y 1346 se atribuyen a cantidades residuales de formiato de amonio.

C) El espectro de UV del antibiótico 107891 , llevado a cabo en metanol/H20 (en una proporción 80:20) con un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 16 muestra dos hombros a 226 y 267 nm. El espectro de UV se recoge en la Figura 3.

D) El espectro de RMN-1H se registró en la mezcla metanol d4:H20 (pH 4,3 HCl) 40:10 a 40°C en un espectrómetro Bruker AMX 600 aplicando una secuencia de supresión de agua. Como patrón interno, se consideró la señal residual de metanol-d4 a 3,31.

El espectro de RMN-1H del antibiótico 107891 se recoge en la Figura 4. El espectro de RMN-1H del antibiótico 107891 disuelto en metanol d4:H20 (HCl 0.01N) 40:10 muestra los siguientes grupos de señales (en ppm) a 600 MHz usando MeOH-d4 como patrón interno (3,31 ppm), [d = ppm, multiplicidad; (atribución)]: 0,93 d (CH3), 0,98 d (CH3), 1 ,07 t (CH3 solapado), 1 ,18 t (CH3 solapado), 1 ,26 s (CH3), 1 ,30 t (CH3 solapado), 1 ,62-1 ,74 m (CH2), 1 ,78 d (CH3), 1 ,80 d (CH3), 2,03 m (CH2), 2,24 m (CH), 2,36 m (CH2), 2,72-3,8 m (CH alfa peptídíco), 3,8-5,2 m (CH alfa peptídico), 5,53-6,08 s (CH2), 5,62 d (doble enlace CH), 6,42 m (CH), 6,92 d (doble enlace CH), 7,0-7,55 m (CH aromático), 7,62-10,4 d y m (NH aromático y peptídico).

E) El espectro de RMN-13C se registró en la mezcla metanol d4:H20 (pH 4,3 HCl) 40:10 a 40°C en un espectrómetro Bruker AMX 600 usando como patrón interno la señal residual de metanol d4 a 49,15 ppm. El espectro de RMN-13C bb desacoplado del antibiótico 107891 se recoge en la Figura El espectro de RMN-13C del antibiótico 107891 disuelto en metanol d4:H20 (HCl 0,01 N) 40:10 muestra los siguientes grupos de señales (en ppm) a 600 MHz usando MeOH-d4 como patrón interno (49,15 ppm), [d = ppm; (atribución)]: 13,6-23,2 (CH3 alífátíco), 26,16-73 (CH2 alifático y CH alfa peptídico), 105-136 (CH en doble enlace y aromáticos y carbonos cuaternarios), 164,3-176,3 (carbonilos peptídicos) F) El complejo del antibiótico 107891 se disolvió en 2-metoxietanol (MCS):H20 12:3 conteniendo un exceso molar de ácido clorhídrico 0,01 M La solución se valoró por retroceso con una solución de hidróxido de potasio 0,01 N La curva resultante de la valoración mostró una función lonizable básica COMOSICIÓN EN AMINOÁCIDOS DEL ANTIBIÓTICO 107891 Y DE SUS FACTORES A1 Y A2 A) Determinación de aminoácidos "resistentes a ácido" en el complejo del antibiótico 107891 Se sometió al antibiótico 107891 a una hidrólisis acida completa (HCl 6N, 105°C, 24 h) y se identificaron los componentes ammoacidicos del antibiótico resistente a tratamiento con ácido Los aminoácidos lábiles frente a ácido no son detectables con este procedimiento El hidrolizado se estudió mediante análisis por HPLC-EM y CG-EM, después de una depvatización adecuada, en comparación con una mezcla de aminoácidos convencionales denvatizada de forma similar Para análisis por HPLC, la muestra hidrohzada se trató con carbamato de 6-am?noqu?nol?l-?/-hidroxisuccinimidilo (kit reactivo de AccQ-Tag™-flúor) para análisis por CG con una mezcla de HCl 3 N en metanol anhidro y anhídrido tnfluoroacético El análisis cualitativo por HPLC se llevó a cabo en un sistema de cromatografía líquida con detección simultanea de DAD y EM El procedimiento de HPLC tenia las siguientes condiciones Columna AccQ-Tag™ (Waters C18 NovoPak 4 µm 3,9 x 150 mm) Temperatura de la columna 37°C Caudal 1 ml/minuto Fase A acetato de amonio 140 mM pH 5 (ácido acético) Fase B agua acetonitplo 60 40 Programa de elución Detección UV 254 nm Las condiciones de EM fueron las siguientes Espectrómetro Finnigan LCQ deca equipado con una fuente de electronebulización Temperatura del capilar 250°C Potencial de la fuente 4,70 kV Corriente de la fuente 80 µA Potencial del capilar: -15 V.

El análisis cualitativo por CG se llevó a cabo en un cromatógrafo de gases equipado con un detector de EM-IE.

El procedimiento de CG tenía las siguientes condiciones: Columna: J & W Scientific DB-5, 30 m x 0,254 mm de D.l. x 0,25 µm E.P. Gas vehículo: helio. Modo de inyección: conjunta. Temperatura del inyector: 200°C. Temperatura en la línea de transferencia: 300°C. Programa de temperaturas: de 50°C a 100°C a razón de 2,5°C/minuto (10 minutos), de 100°C a 250°C a razón de 10°C/minuto (15 minutos), 15 minutos a 250°C. Volumen de inyección: 1 µl.

Las condiciones de EM fueron las siguientes: Espectrómetro: Finningan TSQ700 Modo de ionización: impacto electrónico. Ajustes de tensión: Corriente del filamento: 400 mA. Multiplicador electrónico: 1400 V Energía electrónica: 70 eV Modo de ion positivo: Condiciones de barrido: Intervalo de barrido: 40-650 urna. Tiempo de barrido: 1 segundo.

En los cromatogramas de CL/EM y de CG/EM obtenidos sobre el hidrolizado de antibiótico 107891 , se identificaron los siguientes aminoácidos junto con otros picos no identificados: lantionina, metillantionina, glicina, prolina, valína, ácido aspártico (estudios de RMN indican que es un producto de transformación de la asparagina, la cual genera ácido aspártico por hidrólisis), fenilalanina y leucina.

El antibiótico 107891 y sus Factores A1 y A2 fueron sometidos a una hidrólisis acida completa en las mismas condiciones (denvatizacion y HPLC-EM) recogidas para el complejo El análisis por CG-EM se llevó a cabo en un instrumento Termo Finnigan Trace GC-MS equipado con un inyector PTV El procedimiento de CG tenia las siguientes condiciones Columna Restek RTX-5MS, 15 m x 0,25 mm de D I x 0,25 µm de E P Gas vehículo helio Temperatura del interfaz 250°C Programa de temperaturas 1 ,5 minutos a 50°C, de 50°C a 100°C a razón de 20°C/m?nuto, 1 minuto a 100°C, de 100°C a 135°C a razón de 20°C/m?nuto, 1 minuto a 135°C, de 135°C a 250°C a razón de 20°C/m?nuto, 1 minuto a 250°C Volumen de inyección 1 µl Inyector modo conjunto, temperatura base de 50°C, temperatura de transferencia de 280°C, tasa de transferencia de 14,5°C/m?nuto Las condiciones de EM fueron las siguientes Modo de ionización impacto electrónico Ajustes de tensión Corriente del filamento 149 µA Multiplicador electrónico 200 V Energía electrónica 70 eV Modo de ion positivo Condiciones de barrido Intervalo de barrido 33-500 urna Tiempo de barrido 0,6 segundos En el hidro zado de Factor A1 del antibiótico 107891 , los cromatogramas de HPLC/EM y de CG/EM mostraron la presencia de los siguientes aminoácidos con otros picos no identificados lantionma, metillantionina, glicina, prohna, va na, ácido aspártico (estudios de RMN indican que es un producto de transformación de la asparagina, la cual genera ácido aspártico por hidrólisis), fenilalanina y leucina El procedimiento anterior llevado a cabo sobre el Factor A2 reveló la presencia de los siguientes aminoácidos con otros picos no identificados lantionina, metillantionina, glicina, prolina, valina, ácido aspártico (estudios de RMN indican que es un producto de transformación de la asparagina, la cual genera ácido aspártico por hidrólisis), fenilalanina y leucina B) Determinación de 5-clorotr?ptófano en el complejo de antibiótico 107891 y en su Factor A1 y Factor A2 La hidrólisis completa del complejo de antibiótico 107891 purificado y sus únicos factores A1 y A2 se llevó a cabo según el procedimiento descrito por Simpson R J , Neuberger M R , Liu T Y , "Complete Aminoacid Analysis of Proteins from a Single Hydro sate" JournalBiol Chem (EE UU ), 10 de abril de 1976, 251 (7), 1936-40 Este procedimiento de hidrólisis previene la degradación de aminoácidos normalmente inestables durante la digestión con ácidos minerales y de esta forma permite la determinación de estos aminoácidos, incluyendo triptófano, a partir de un hidro zado de un péptido. Se adquirió una muestra patrón de 5-cloro-DL-tr?ptófano de Biosynt AG, Staad, Suiza, y se confirmó su estructura por análisis de RMN, el DL-triptófano se adquirió en Merck KGaA, Darmstadt, Alemania El factor A1 (1 ,5 mg) se suspendió en 0,6 ml de ácido metanosulfónico 4N conteniendo como catalizador 3-(2-am?noet?l)?ndol al 0,2% (peso/volumen) para la hidrólisis La hidrólisis se llevó a cabo a 115°C durante 16 horas El hidrolizado se neutralizó entonces con NaOH 5N y se diluyó con una cantidad igual de agua destilada Se analizaron 100 µl de esta solución por CL-EM La separación se llevó a cabo en una columna Simmetry C18 (5µm) 4,6 x 250 mm (Waters Co , Milford, MA, EE UU ) equipada con una precolumna Simmetry C18 (5µm) 3,9 x 20 mm La elución se llevó a cabo con un flujo de 1 ml/minuto con un gradiente lineal durante 25 minutos desde un 0% hasta un 50% de fase B la fase A era tampón HCOONH4 25 mM a pH 4,5 CH3CN 95 5 y la fase B CH3CN era La detección en el UV fue a 280 nm El equipo de HPLC se acopló a un espectrómetro de masas por atrapamiento de iones Finnigan LCQ (Thermoquest, Finnigan MAT, San José, CA, EE UU ) Los efluentes de la columna se desviaron a razón de 50 µl/minuto hacia el interfaz de ionización por eletronebu zación (ESI, electrospray lonization) del espectrómetro de masas LCQ El análisis de EM se llevo a cabo en las siguientes condiciones gas de arrastre (N2) 414 kPa, estufa capilar 210°C, polaridad del potencial a la entrada de la muestra positiva y negativa, potencial de nebulización iónica +/- 4,5 kV; potencial del capilar +/- 21 kV; condiciones de barrido: tiempo iónico máximo 50 ms; microbarrido completo 3.

Los patrones de triptófano y de 5-clorotriptófano eluyeron a tiempos de retención de 8,1 minutos y 11 ,5 minutos correspondientes a un M+H* a m/z 205 y 239 respectivamente. En el hidrolizado del Factor A1 del antibiótico 107891 , la presencia de un pico a 11 ,5 minutos con m/z a 238,97 indicaba la presencia de 5-clorotriptófano.

El patrón de triptófano resultó detectable con el sistema cromatográfico usado con un límite de detección de 0,3 µg/ml. Este valor es inferior al valor que habría sido indicativo de la presencia de dicho aminoácido en la muestra de antibiótico analizada. No se detectó triptófano dentro del límite anteriormente mencionado en el cromatograma del hidrolizado del Factor A1 del antibiótico 107891. Se obtuvieron resultados idénticos a partir de los análisis por CL-EM de un hidrolizado del Factor 2 y de un hidrolizado de una muestra purificada del complejo de antibiótico 107891.

ESPECTROMETRÍA DE MASAS DEL FACTOR A1 Y DEL FACTOR A2 DEL ANTIBIÓTICO 107891 El Factor A1 del antibiótico 107891 proporciona un ion doblemente protonado a m/z = 1124 y el Factor A2 a m/z = 1116 correspondientes a la composición más baja de isótopos en los experimentos de EM en un instrumento Thermofinnigan LCQ deca equipado con una fuente de electronebulización, usando una mezcla de ccalibrado Thermofinnigan. Las condiciones de electronebulización eran: potencial de nebulización: 8 V; modo de infusión: 10 µl/minuto. Los espectros se registraron a partir de una solución de 10 mg/ml en acetonitrilo:agua 50:50 con ácido acético al 0,5% y se recogen en las Figuras 6A (espectro de baja resolución de barrido completo) y 6B (espectro de alta resolución de barrido aumentado) y en las Figuras 7A (espectro de baja resolución de barrido completo) y 7B (espectro de alta resolución de barrido aumentado).

La masa exacta del Factor A1 y Factor A2 del antibiótico 107891 se ha determinado usando un espectrómetro Bruker Daltonics APEX II, de 4J Tesla equipado con una fuente de electronebulización. En base a estos datos, al Factor A1 se le asigna un peso molecular de 2246,71 ± 0,06, masa monoisotópica calculada a partir de [M+2H]2* a m/z 1124,36124 (precisión 30 ppm), determinado por IEN-EMTF de alta resolución. Al Factor A2 se le asigna un peso molecular de 2230,71 ± 0,06, masa monoisotópica calculada a partir de [M+2H]2+ a m/z 1116,36260 (precisión 30 ppm), determinado por IEN-EMTF de alta resolución.

COMPARACIÓN DEL FACTOR A1 Y FACTOR A2 DEL ANTIBIÓTICO 107891 CON LOS ANTIBIÓTICOS MF-BA-17680! y MF-BA-1768P, A) Se adquirió Microbispora corallina NNRL 30420 (MF-BA-1768), descrita en el documento US 6.551.591 B1 de la colección de la NNRL. En un experimento exploratorio, la cepa de M. corallina NNRL 30420 (MF-BA-1768) se ha fermentado en un matraz erlenmeyer en las condiciones descritas en el documento US 6.551.591 B1. El caldo recuperado se extrajo por dilución con metanol. Después de la centrifugación del micelio, se cargó el sobrenadante en una resina de absorción poliestirénica HP20, se eluyó con una mezcla 70:30 de metanol:agua, lo que lo redujo a un pequeño volumen y entonces se liofilizó.

En el cromatograma dos picos mostraron señales a 1091 y a 1108 [M+2H]2+, correspondientes a [M+2H]2+ recogida en el documento US 6.551.591 B1 para MF-BA-1768ß! y MF-BA-1768CJ.! respectivamente. Se puso entonces en contacto el extracto anterior con los Factores A1 y A2 del antibiótico 107891 y la mezcla se analizó por CL-EM. Se encontró que los picos de los antibióticos MF-BA-1768ß! y MF-BA-1768Q, y de los Factores A1 y A2 del antibiótico 107891 tenían tiempos de retención distintos y distintos fragmentos [M+2H]2+ de EM.

B) Se llevó a cabo un experimento adicional en un tanque de fermentación de 30 I de Microbispora sp. NNRL 30420 (MF-BA-1768) y el caldo recuperado se recuperó siguiendo la descripción del documento US 6.551.591 B1. Después de la etapas de purificación secuencialmente en una resina poliestirénica HP20 y en una resina de poliamida CC 6 de 0,1-0,3 mm (Macherey-Nagel), se obtuvieron dos sustancia individuales en forma pura por HPLC preparativa sobre una columna C18 Phenomenex (Torrance CA, EE.UU.) Luna (250 x 12,2 mm) de 10 µ de tamaño de partícula y se eluyó a un caudal de 27 ml/minuto con el siguiente programa de diversas etapas: tiempo = 0 minutos (32% de fase B); tiempo = 8 minutos (32% de fase B); tiempo = 20 minutos (36% de fase B); tiempo = 32 minutos (90% de fase B). La fase A era un 0,05% de ácido fórmico en agua y la fase B era CH3CN.

Estas sustancias mostraron actividad antibacteriana frente a estafilococos y enterococos tal y como se muestra en la Tabla IV. En los experimentos de CL-EM las dos sustancias mostraron señales de iones doblemente protonados del tipo [M+2H]*+ correspondientes al antibiótico MF-BA-1768a, y MF-BA-1768ß, tal y como se describe en la patente de los EE UU 6 551 591 B1 Tabla IV Las condiciones experimentales de los ensayos antimicrobianos fueron los mismos que aquellos utilizados fueron los mismos que aquellos recogidos en la Tabla IV anterior Los análisis de CL-EM de los antibióticos aislados BA-1768a? y MF-BA-1768ß, se llevaron a cabo en una columna Simmetry C18 (5 µm) de 4,6 x 250 mm (Waters, Milford MA, EE UU ) equipado con una precolumna Simmetry C18 (5µm) de 3,9 x 20 mm (mantenidas ambas en una estufa a una temperatura de 50°C) La elución se llevó a cabo con un caudal de 1 ml/minuto con el siguiente programa de elución en diversas etapas tiempo = 0 minutos (30% de fase B), tiempo = 8 minutos (30% de fase B), tiempo = 20 minutos (45% de fase B), tiempo = 24 minutos (90% de fase B), tiempo = 28 minutos (90% de fase B) La fase A era tampón HCOONH4 25 mM a pH 4,5 CH3CN 95 5 y la fase B era CH3CN El equipamiento de HPLC se acopló a un espectrómetro de masas de trampa iónica Finnigan LCQ (Thermoquest, Finnigan MAT, San José CA) Se desviaron efluentes de la columna a razón de 100 µl/minuto hacia el interfaz ESI del espectrómetro de masas LCQ El análisis de EM se llevó a cabo en las siguientes condiciones entrada de muestra flujo de gas (N2) 172,5 kPa, flujo de gas auxiliar 5 psi, estufa capilar 210°C, polaridad del potencial de entrada de muestra positiva y negativa, potencial de Is nebulización electrónica ± 4,75 kV, potencial del capilar ± 12 V, condiciones de barrido tiempo iónico máximo 50 ms, microbarrido completo 3 Los factores individuales MF-BA-1768s.? y MF-BA-1768ß? del antibiótico y los Factores A1 y A2 del antibiótico 107891 se analizaron individualmente y en mezcla. Los resultados se resumen en la siguiente Tabla V.

TABLA V En el mismo sistema cromatográfico se eluyó el factor A2 de ramoplanina (L. Gastaldo, R.Ciabatti, F. Assi, E. Restelli, J. K. Kettenring, L. F. Zerilli, G. Romanó, M. Denaro y B. Cavalleri, (1992): "Isolatíon, structure determination and biological activity of A-16686 Factors A'1 , A'2 y A'3 glycolipodepsípeptide antíbíotics", J. Ind. Microbiol. 11 : 13-18) con un tiempo de retención de 11 minutos.

ESPECTROSCOPIA DE RMN DEL FACTOR A1 Y FACTOR A2 DEL ANTIBIÓTICO 107891 Los espectros de RMN-1H del Factor A1 y Factor A2 del antibiótico 107891 se registraron en la mezcla CD3CN:D20 (1 :1 ) a 298 K en un espectrómetro Bruker AMX 600 aplicando una secuencia de supresión de agua. Se consideró como patrón interno la señal residual de acetonitrilo-d3 a 1 ,94 ppm.

A) El espectro de RMN- H del Factor A1 del antibiótico 107891 se recoge en la Figura 8. El espectro de RMN-1H del Factor A1 del antibiótico 107891 , disuelto en CD3CN:D20 (1 :1), muestra los siguientes grupos de señales (en ppm) a 600 MHz usando CD3CN como patrón interno (1 ,94 ppm), [d = ppm, multiplicidad; (atribución)]: 0,84 d (CH3), 0,89 d (CH3), 0,94 t (CH3 solapados), 1 ,1 d (CH3), 1 ,13 d (CH3), 1 ,15 t (CH3 solapados), 1,49 m (CH2), 1 ,69 d (CH3), 1 ,75 m (CH2), 2,11 m (CH), 2,26 m (CH), 2,5 m (CH2), 2,68 - 3,8 m (CHP peptídicos), 3,8 - 5,0 m (CHa peptídicos), 5,45 - 6,17 s (CH2), 5,58 d (doble enlace CH), 6,36 m (CH), 6,86 d (doble enlace CH), 7,0 - 7,45 m (CH aromáticos). La señal de sulfóxido de dimetilo está presente a 2,58 ppm y la señal de formiato está presente también a 8,33 ppm en forma de impurezas.

B) El espectro de RMN-'H bb desacoplado del Factor A2 del antibiótico 107891 se recoge en la Figura 9.

El espectro de RMN-1H del Factor A2 del antibiótico 107891 , dísuelto en CD3CN:D20 (1 :1), muestra los siguientes grupos de señales (en ppm) a 600 MHz usando CD3CN como patrón interno (1 ,94 ppm), [d = ppm, multiplicidad; (atribución)]: 0,84 d (CH3), 0,88 d (CH3), 0,94 d (CH3), 1 ,06 d (CH3), 1 ,14 d (CH3), 1 ,48 m (CH2), 1 ,65 - 1 ,75 m (CH2), 1 ,67 d (CH3), 2,15 m (CH), 2,25 m (CH), 2,5 m (CH2), 2,77 - 3,8 m (CHß peptídicos), 3,8 - 4,9 m (CHa peptídicos), 5,45 - 6,14 s (CH2), 5,59 d (doble enlace CH), 6,34 m (CH), 6,84 d (doble enlace CH), 7,0 - 7,42 m (CH aromáticos). La señal de sulfóxido de dimetilo está presente a 2,58 ppm y la señal de formiato está presente también a 8,32 ppm en forma de impurezas.

Los espectros de RMN-13C del Factor A1 y del Factor A2 del antibiótico 107891 se registraron en la mezcla CD3CN:D20 (1 :1 ) a 298 K en un espectrómetro Bruker AMX 600 usando como patrón interno la señal residual de acetonitrilo-d3 a 1 ,39 ppm.

C) El espectro de RMN-13C del Factor A1 del antibiótico 107891 se muestra en la Figura 10. El espectro de RMN-13C del Factor A1 del antibiótico 107891 , disuelto en CD3CN:D20 (1:1), muestra los siguientes grupos de señales (en ppm) a 600 MHz usando CD3CN como patrón interno (1 ,39 ppm), [d = ppm; (atribución)]: 13,6 - 23,03 (CH3 alifáticos), 25,69 - 77,9 (CH2 alifáticos y CHa peptídicos), 105 - 137,3 (CH aromáticos y en dobles enlaces y carbonos cuatenarios), 165,6 - 176,6 (carbonilos peptídicos).

D) El espectro de RMN-13C del Factor A2 del antibiótico 107891 se muestra en la Figura 11. El espectro de RMN-13C del Factor A2 del antibiótico 107891 , disuelto en CD3CN:D20 (1:1), muestra los siguientes grupos de señales (en ppm) a 600 MHz usando CD3CN como patrón interno (1 ,39 ppm), [d = ppm; (atribución)]: 13,6 - 22,9 (CH3 alifáticos), 25,65 - 73 (CH2 alifáticos y CHa peptídicos), 105 - 137,3 (CH aromáticos y en dobles enlaces y carbonos cuatenarios), 165,7 -176,1 (carbonilos peptídicos).

ESPECTROS UV E IR DEL FACTOR A1 Y FACTOR A2 DEL ANTIBIÓTICO 107891 A) El espectro de infrarrojos del Factor A1 del antibiótico 107891 registrado en KBr con un espectrofotómetro Bruker FT-IR modelo IFS 48 muestra una absorción máxima a (cm 1) 3294, 3059, 2926 1661 , 1529, 1433, 1407, 1287, 1114, 1021 El espectro de infrarrojos se recoge en la Figura 12 B) El espectro de UV del Factor A1 del antibiótico 107891 registrado en metanol H20 80 20 con un espectrofotometro Perkm Elmer Lambda 16 muestra dos hombros a 226 y a 267 nm El espectro UV se recoge en la Figura 13 C) El espectro de infrarrojos del Factor A2 del antibiótico 107891 registrado en KBr con un espectrofotometro Bruker de FT-IR modelo IFS 48 muestra una absorción máxima a (cm 1) 3296, 3060, 2928, 1661 , 1529, 1433, 1407, 1288, 1116 El espectro de infrarrojos se recoge en la Figura 14 D) El espectro UV del Factor A2 del antibiótico 107891 registrado en metanol H20 80 20 con un espectrofotometro Perkm Elmer Lambda 16 muestra dos hombros a 226 y a 267 nm El espectro UV se recoge en la Figura 15 En base a los datos flsicoquimicos recogidos anteriormente, puede asignarse la siguiente formula estructural al antibiótico 107891 en la que X es un halógeno (F, Cl, Br, I), y en la que R^ R2, R3, R,,, R5, R6, R7 y R8 pueden ser independientemente H, OH, alquilo (ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido), o aplo (sustituido o no sustituido) En una realización alternativa, R1 t R2, R3 y R4 pueden ser H o OH. Por lo tanto, las combinaciones posibles de R,, R2, R3 y R incluyen las siguientes.

De forma similar, R5, R6, R7 y R8 pueden ser H o OH. Por lo tanto, las combinaciones posibles de R5, R6, R7 y R8 incluyen las siguientes.

Además, en base a los datos fisícoquímicos recogidos anteriormente, puede asignarse la siguiente fórmula estructural al Factor A1 del antibiótico 107891 , en la que X es Cl, R, es H, R2 es OH, R3 es H y R , R5, R6, R7 y R8 son H, lo cual es una realización preferida de la invención junto con las sales farmacéuticamente aceptables del mismo: Además, en base a los datos fisicoquímicos recogidos anteriormente, puede asignarse la siguiente fórmula estructural al Factor A2 del antibiótico 107891 , en la que X es Cl, R, es OH, R2 es OH, R3 es H y R , R5, R6, R7 y R8 son H, lo cual es una realización preferida de la invención junto con las sales farmacéuticamente aceptables del mismo: ACTIVIDAD BIOLÓGICA IN VITRO DEL ANTIBIÓTICO 107891 Se determinó la actividad antímicrobiana del antibiótico 107891 mediante el procedimiento de microdilución del caldo según las recomendaciones del Comité Nacional para Patrones de Laboratorios Clínicos (NCCLS, Nacional Comité for Clinical Laboratory Standards, documento M7-A5).

Las cepas usadas eran aislados de origen clínico o cepas procedentes de Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, American Type Culture Collection). El resultado de los ensayos se recogió en la Tabla VI y en la Tabla Vil.

El antibiótico 107891 se disolvió en DMSO para obtener una solución madre de 1000 µg/ml y se diluyó posteriormente en agua para obtener la solución de trabajo. Los medios usados fueron caldo con ajuste de nivel catiónico Mueller Hinton (CAMBH, cation-adjusted Mueller Hinton broth) para Staphylococci, M. catarrhalis, Enterococci y L menocytogenes; caldo de Todd Hewitt (THB, Todd Hewitt broth) para Streptococci; medio GC + Isovitalex al 1% + hemina al 1% para Neisseria spp; infusión de cerebro y tierra + suplemento de C al 1 % para H. influenzae; caldo de Lactobacillus para Lactobacilli; Middlebrook 7H9 con enriquecimiento de Míddlebrook OADC para M. smegmatis; medio RPMI 1640 para C. albicans; caldo de Wilkins Chalgren + oxirasa (1 :25 volumen/volumen) para Clostridia; caldo de brucilla que contiene cisterna (0,5 g/l) para Propionibacteria.

Los inóculos para bacterias fueron de 105 CFU/ml. El inoculo de C. albicans fue de 1 x 104 CFU/ml. Todos los ensayos se llevaron a cabo en presencia de un 0,02% de albúmina de suero bovino (BSA). Los cultivos se incubaron a 35°C en contacto con el aire excepto las cepas de Clostridia y Propioniobacteria que necesitaban atmósfera anaerobia. Después de 18-24 horas se llevaron a cabo lecturas visuales y se determinaron las MIC. La MIC se definió como la concentración más baja de antibiótico a la que no hay crecimiento visible.

TABLA VI: actividad antimicrobiana del antibiótico 107891 TABLA Vil actividad antimicrobiana del antibiótico 107891 frente a bacteria anaerobias El antibiótico 107891 muestra una buena actividad antimicrobiana frente a bacterias Gram-positivas El intervalo de MIC frente a Staphylococcus spp , incluyendo cepas resistentes a Metici na (MRSA) y resistentes a intermedio de tipo g copeptido (GISA), está entre 0,13 y 4 µg/ml y frente a aislados clínicos de reciente descubrimiento de Enterococcus spp , incluyendo cepas resistentes a Vancomicina (VRE), está entre 0,5 y 4 µg/ml Frente a Streptococcus spp las MIC son = 0,13 µg/ml El antibiótico 107891 es también activo frente a cepas anaeróbicas Gram-positivas, las MIC son = 0,13 µg/ml frente a Clostridia y = 0,004 - 4 µg/ml frente a Propionibactßna Se mostraron actividades antimicrobianas frente a cepas L monocytogenes (MIC de 0,125 µg/ml) y Lactobacilli (intervalo de MIC entre = 0,13 - 4 µg/ml) Algunas bacterias Gram-negativas son susceptibles del antibiótico 107891 , las MIC son 1 -0,25 µg/ml frente a M catharralis, 0,5 - 0,25 µg/ml frente a Neissena spp y 32 µg/ml frente a H mfluenzae El antibiótico 107891 no es activo frente a las cepas £ coli y C albicans analizadas En los experimentos tiempo-muerte el antibiótico 107891 muestra actividad bactericida frente a GISA de S aureus y a la cepa £ faecalis Van A, a las 24 horas la concentración bactericida es el valor de MIC en el caldo de Mueller Hinton S aureus puede provocar infecciones mortales y MRSA es de relevancia clínica particular porque es resistente a todas las penicilinas y cefalosponnas y también a otros múltiples antibióticos, además se extiende fácilmente de paciente a paciente provocando brotes de infección con importantes implicaciones para los servicios del cuidado de la salud (W Witte, (1999) "Antibiotic resistance in Gram-positive bacteria epidemiological aspects", Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44 1-9) El sistema nacional para la vigilancia de infección nosocómica (NNIS, Nacional Nosocomial Infection Surveillance System) de los Centros para el Control de Enfermedades (CCE) informaron que la resistencia a metici na entre S aureus en los hospitales de EE UU aumentó de un 2,4% en 1975 a un 29% en 1991 , con un grado más elevado de resistencia en unidades de cuidado intensivo (L Archibald, L Philips, D Monnet, J E Me Gowan Jr, F Tenover, R Gaynes, (1997) "Antimicrobial resistance in isolates from inpatients and outpatients in the United States increasmg importance of the intensive care unit", Clinic Infect Dis 24 211-5) Las infecciones nosocómicas están asociadas a una morbididad y mortalidad considerables, prolongando la duración de la estancia y aumentando los costes de hospitalización La mayoría de las cepas de MRSA son resistentes a diversos de los agentes antimicrobianos más comúnmente usados, incluyendo macro das, aminoglicósidos y los antibióticos de tipo ß-lactama en uso en la actualidad, incluyendo la ultima generación de cefalosponnas Los patógenos adquiridos en hospitales resistentes vancomicina responsables de infecciones (como por ejemplo endocarditis, meningitis y septicemia) están planteando un desafío terapéutico creciente (Y Cetinkaya, P Falk y C G Mayhall, (2000) "Vancomycin-resistant enterococci", Clin Microbiol Rev 13 686-707, L B Rice, (2001 ) "Emergence of vancomyan-resistant enterococci", Emerg Infec Dis 7 183-7) S. Pneumoniae y M. catarrhalis son reconocidos como importantes patógenos de seres humanos. Son una causa común de infecciones del tracto respiratorio, particularmente otitis media en niños e infecciones del tracto respiratorio inferior en los ancianos. Se han aceptado recientemente M. catarrhalis y S. Pneumoniae como los patógenos más comunes del tracto respiratorio (M. C. Enright y H. Mckenzy, (1997): "Moraxella (Branhamella) catarrhalis. Clinical and molecular aspect of the rediscovered pathogen", J. Med. Microbiol. 46: 360-71 ).

Clostridia es responsable de diferentes enfermedades: gangrena gaseosa e infecciones ulcerosas relacionadas, tétanos, botulismo, diarrea asociada a antibióticos (CDAD) y colitis pseudomembranosa. La mayoría de estos microorganismos producen exotoxinas que desempeñan un papel importante en la patogénesis de las enfermedades. C. difficile es el agente causante responsable del 25% de casos de CDAD y de virtualmente todos los casos de colitis pseudomembranosa. Durante los últimos años, se ha producido la infección conjunta por C. difficile en pacientes con infección o colonización por enterococos resistentes a vancomicina (J. G. Barlett, (1992): "Antibiotic associated diarrhea", Clinic. Infect. Dis. 15: 573-581 ).

ACTIVIDAD BIOLÓGICA IN VITRO DE LOS FACTORES A1 Y A2 DEL ANTIBIÓTICO 107891 La Tabla VIII recoge las actividades antimicrobianas de los Factores A1 y A2 del antibiótico 107891 por separado. Se determinaron las MIC por el procedimiento de microdilución del caldo tal y como se describe anteriormente.

TABLA VIII: actividad antimicrobiana de los Factores A1 y A2 del antibiótico 107891 ACTIVIDAD BIOLÓGICA IN VIVO DEL ANTIBIÓTICO 107891 Se usaron hembras de ratón ICR (Harían Italia SpA - S. Pietro al Natisone, Italia) que pesaban 23-25 g en experimentos de infección mortal aguda en ratones inmunocompetentes o neutropénicos. La neutropenía se indujo mediante dos administraciones intraperitoneales de ciclofosfamida, 200 y 100 mg/kg, cuatro días y un día, respectivamente, antes de que los ratones fueran infectados.

La infección se indujo inoculando intraperitonealmente en ratones inmunocompetentes (grupo de 8 animales/dosis/tratamiento) una suspensión bacteriana de cada aislado clínico de estafilococo resistente a meticilina (Staph. aureus SA3817) o una cepa convencional susceptible a meticilina (Staph. aureus Smith ATCC19636), o inoculando en ratones neutropénicos un aislado clínico de enterococo resistente a glicopéptidos (Ent. faecalis A533). Los desafíos bacterianos (aproximadamente 106 células/ratón) se dieron suspendidos en 0,5 ml de mucina bacteriológica al 5% (Disco). Los animales no tratados murieron a los 10-15 minutos después del desafío. Se administró antibiótico 107891 una vez por vía intravenosa o subcutánea en diferentes formulaciones acuosas. Se calcularon la dosis de un 50% de eficacia (DE50) y el límite de confianza de un 95% mediante el procedimiento de Spearman- Kárber (D. J. Finney, (1952): "The Spearman-Kárber method", en: Statistical methods in biological assay, páginas 524-530, Charles Griffin % Co, Ltd, Londres) a partir del porcentaje de animales que sobrevivieron al séptimo día. Los resultados se recogen en la siguiente Tabla IX.

El antibiótico 107891 no es tóxico a la dosis máxima probada de 200 mg/kg.

TABLA IX: DE50 del antibiótico 107891 en infecciones mortales agudas en ratones. Formulación Cepa Ruta DE50 mg/kg límites de confianza del 95% MSSA IV 2,1 1 ,7 - 2.7 SC 2,1 1.7 - 2,7 Van A iv 3,2 2,7 - 3,9 SC 11 ,1 9,2 - 13,5 B M MRRSSAA s SeC 4 4,,22 3,5 - 5,1 C V Vaann AA iivv 3 3,,77 2,8 - 4,9 SC 12,7 10,7 - 15,0 Formulaciones: A: 10% de DMSO, ?0% (peso/volumen) de beta hidroxipropilciclodextrina (Sígma), 80% de glucosa al 5% (peso/volumen) en agua. B: 10% de DMSO, 40% de PEG 400 en CH3COOH acuoso 0,1M.

C 50% de PEG 400 en H20 Cepas I MSSA Staph aureus Smith 819 ATCC19636 II MRSA aislado clínico de Staph aureus 3817 lll Van A aislado clínico de Ent faecalis A533 en ratones neutropenicos EJEMPLOS Ejemplo 1 : procedimiento de fermentación de Microbispora sp. ATCC PTA-5024 Se mantuvo la cepa de Microbispora sp ATCC PTA-5024 sobre medios inclinados de harina de avena y agar durante 2-3 semanas a 28°C El contenido microbiano de un medio inclinado se raspó con 5 ml de agua estéril y se inoculó en matraces Erlenmeyer de 500 ml que contenían 100 ml de medio de siembra (AF/MS) que está compuesto por (g/l) 20 de dextrosa, 2 de extracto de levadura, 8 de harina de semilla de soja, 1 de NaCI y 4 de carbonato de calcio El medio se preparó en agua destilada y el pH se ajustó a 7,3 antes de la esterilización a 121°C durante 20 minutos Los matraces inoculados se crecieron a 28°C en un agitador rotatorio que operaba a 200 rpm Después de 4-6 días, el 5% de este cultivo se inoculó en una segunda serie e matraces que contenían el mismo medio de fermentación Después de 72 horas de incubación, se transfirieron 200 ml a un biorreactor de 4 I que contenía 3 I del mismo medio vegetativo La fermentación se llevo a cabo a 30°C con agitación de 700 rpm y aireación de 0,5 vvm Después de 72 horas, el cultivo (1 ,5 I) se transfirió a un biorreactor de 20 I que contenía 15 I del mismo medio vegetativo La fermentación se llevó a cabo a 30°C durante 48 horas con agitación de 500 rpm y aireación de 0,5 vvm y después se transfirió al tanque de producción La producción del antibiótico 107891 se llevó a cabo en un fermentador de 300 I que contenía 200 I del medio de producción M8 compuesto por (g/l) 20 de almidón, 10 de glucosa, 2 de extracto de levadura, 4 de caseína hidro zada, 2 de extracto de carne y 3 de carbonato de calcio El medio se preparo en agua desionizada y el pH se ajustó a 7,2 antes de esterilización a 121°C durante 25 minutos Después de enfriar, se inoculó el fermentador con aproximadamente 14 I (7%) de precultivo Se puso en marcha el fermentador a 29°C con agitación de 180 rpm y aireación de 0,5 vvm con una presión en la parte superior de 0,36 bar Se recuperó el contenido del fermentador después de 98 horas de fermentación La producción del antibiótico 107891 se siguió por HPLC tal y como se describe previamente, después de la extracción de la totalidad del caldo de cultivo con el mismo volumen de metanol. La extracción se llevó a cabo a temperatura ambiente después de agitar durante 1 hora.

Ejemplo 2: procedimiento alternativo de fermentación de Microbispora sp. ATCC PTA-5024 Se inoculó Microbispora sp. ATCC PTA-5024 en matraces Erlenmeyer de 500 ml que contenían 100 ml de medio de crecimiento (G1 ) compuesto por g/l: 10 de glucosa, 10 de maltosa, 10 de aceite de semilla de soja, 8 de harina de semilla de soja, 2 de extracto de levadura y 4 de carbonato de calcio. El medio se preparó en agua desionizada y esterilizada a 120°C durante 20 minutos sin ajuste de pH. Los matraces inoculados se incubaron durante 120-168 horas a 28°C con agitación de 200 rpm hasta que se observó un buen crecimiento. Los matraces se usaron entonces para inocular (3%) un bíorreactor de 4 I que contenía 3 I de medio de siembra AF/MS, el cual está compuesto tal y como se describe en el Ejemplo 1. después de 120 horas de fermentación a 30°C, agitación de 700 rpm y aireación de 0,5 vvm, se transfirieron 1 ,5 I del cultivo a un biorreactor de 20 I que contenía 15 I del mismo medio vegetativo. La fermentación se llevó a cabo durante 96 horas a 30°C con agitación de 600 rpm y aireación de 0,5 vvm, y después se transfirió al tanque de producción.

La producción del antibiótico 107891 se llevó a cabo en un fermentador de 300 I que contenía 200 I del medio productivo (V6) compuesto por (g/l): 20 de dextrosa, 5 de extracto de levadura, 5 de extracto de carne, 3 de caseína hídrolizada, 5 de peptona y 1,5 de NaCl. El medio se preparó en agua desionizada a un pH ajustado con NaOH de 7,5, y se esterilizó a 121°C durante 20 minutos.

El fermentador se inoculó con 14 I de cultivo de siembra (7%) y la fermentación se llevó a cabo a 29°C, se agitó a 180 rpm, se aireó con 100 I aire convencional por minuto (0,5 vvm). La producción del antibiótico 107891 se siguió por HPLC tal y como se describe previamente. La fermentación se recuperó después de aproximadamente 160 horas.

Ejemplo 3: recuperación del antibiótico 107891 El caldo de fermentación descrito en el Ejemplo 1 se filtró mediante un sistema de filtración tangencial (membrana con un tamaño de poro de 0,1 µm, Koch Carbo-Cor, Koch Wílmington, EE.UU.) para obtener 170 I de sobrenadante y 30 I de micelio concentrado. El complejo de antibiótico 107891 se encontró en el filtrado (A) y en el micelio (B). (A) el caldo filtrado se agitó una noche a temperatura ambiente en presencia de resina poliestirénica Diaion HP-20 (4 I). Se recuperó entonces la resina, se lavó con 10 I de metano agua 4:6 y se eluyó por lotes inicialmente con 10 I de metanokagua 9:1 y después con 10 I de metanol:butanol:agua 9:1 :1 . Las fracciones eluidas agrupadas que contenían el antibiótico 107891 se concentraron hasta un pequeño volumen en un evaporador rotatorio y después se secaron por congelación dando 32 g de material bruto. Este material bruto se disolvió en n-butanol (1 I) y después se extrajo tres veces de forma secuencial con 800 ml de agua. La fase orgánica se concentró a presión reducida hasta un residuo oleoso, el cual se disolvió en metanol. Tras adición de éter de petróleo se obtuvieron 5 g de preparación bruta de antibiótico por precipitación. (B) Después de adición de 25 I de metanol, la porción retenida que contenía el micelio se agitó durante 1 hora y se filtró para obtener 45 I de extracto de micelio. Esta solución se diluyó entonces con agua (20 I) y se agitó una noche a temperatura ambiente con resina poliestirénica Diaion HP-20 (1 I). Se recuperó entonces la resina, se lavó con 2 I de metanol:agua 40:60 y se eluyó por lotes inicialmente con 3 I de metanokagua 85:15 y después con 2 I de metano agua 90:10 . Las fracciones eluídas se siguieron por la presencia de antibiótico 107891 por ensayo de difusión en agar en Streptococcus aureus y por procedimiento analítico por HPLC tal y como se recoge previamente.

Las fracciones eluidas que contenían el antibiótico 107891 fueron agrupadas, concentradas a presión reducida y secadas por congelación, dando 8,1 g de antibiótico 107891 bruto.

Ejemplo 4: recuperación alternativa del antibiótico 107891 El caldo recuperado del tanque de fermentación de 200 I descrito en el Ejemplo 2 se llevó hasta pH 6,8 y el caldo se filtró por filtración tangencial (membrana con un tamaño de poro de 0,1 µm, Koch Carbo-Cor). El permeato (180 I) se agitó por lotes durante una noche a temperatura ambiente con 2 I de resina Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical) y entonces se recuperó la resina.

Se añadió metanol (25 I) a la porción de retentato en el equipo de filtración tangencial (aproximadamente 20 I) que contenía el micelio concentrado. Esta suspensión se agitó durante 1 hora y después se filtró con el sistema de microfíltración hasta un volumen de retentato residual de aproximadamente 20 I. Se añadió entonces más metanol (25 I) y se repitió el procedimiento anterior de forma secuencial durante un total de cinco ciclos. Los extractos agrupados de metanol (aproximadamente 125 I) se diluyeron con 160 de agua desmineralizada y se agitaron por lotes durante una noche a temperatura ambiente con 3 I de resina Diaion HP-20. Entonces se recuperó la resina y se agrupó con la resina Díaion HP-20 usada para extraer el caldo permeato según el procedimiento anteriormente descrito. La resina agrupada se lavó en una columna cromatográfica con 20 I de agua:metanol 6:4 . El antibiótico 107891 se eluyó con 23 I de metanoktampón formiato de amonio 50 mM a pH 3,5:p-butanol 9:1:1 . Este eluato se concentró entonces a presión reducida hasta un volumen final de 3 I. la solución concentrada se cargó entonces a pH 4,5 sobre una columna de 2,5 I de poliamida CC 6 de 0,1-0,3 mm (Macherey-Nagel) acondicionada con agua:metanol 7:3 . La columna se lavó con agua:metanol 7:3 y después con tampón formiato de amonio 25 mM a pH 3,5:metanol 7:3 . El antibiótico se eluyó con agua:metanol 7:3 y después con una mezcla agua:metanol 1 :9 . La elución se completó con tampón formiato de amonio 25 mM a pH 2,8:metanol en la relación 1 :9 . Los eluatos que contenían el antibiótico 107891 se agruparon y se concentraron a vacío hasta un volumen final de 1 I. El pH de la solución concentrada se llevó de 4 a 5,7 con hidróxido de amonio 7 M y después la mezcla se centrifugó para recuperar el precipitado. Este sólido se suspendió en agua y se secó por congelación dando 6,96 g de preparación del antibiótico 107891.

Ejemplo 5: purificación del antibiótico 107891 El antibiótico 107891 bruto (3,6 g), preparado y descrito en el Ejemplo 3, se purificó por cromatografía a presión media sobre una columna C8 de fase inversa (EC) con tamaño de partícula de 40-70 µm y tamaño de poro 60A, IST (tecnología internacional de sorbentes) usando un sistema de cromatografía de presión media B?chi B-680 (B?chi laboratoriums-technik AG, Flawil, Suiza) equipado con un formador de gradiente B-687, un colector de fracciones B-684 y una columna de vidrio B-685 de 70 x 460 mm. La resina fue acondicionada previamente con una mezcla de fase A:fase B 8:2 y se eluyó entonces a razón de 25 ml/minuto con un gradiente lineal de 60 minutos desde un 20% hasta un 60% de fase B en 60 minutos.

La fase A era acetonitrilo:tampón formiato de amonio 20 mM (pH 6,6) 10:90 ; y la fase B era acetonitrílo tampón formiato de amonio 20 mM (pH 6,6) 90:10 .

Las fracciones que contenían el antibiótico 107891 fueron agrupadas, concentradas a vacío y liofilizadas dos veces a partir de agua dando 430 mg de antibiótico 107891 purificado.

Ejemplo 6: purificación del antibiótico 107891 por HPLC preparativa El antibiótico 107891 se purificó adicionalmente por HPLC preparativa sobre una columna Hibar pre-empaquetada lichrosorb RP8 (tamaño de partícula 7 µm) RT de 250-25 mm, Merck, usando una elusion por gradiente lineal durante 25 minutos desde un 30% hasta un 45% de fase B a razón de un flujo de 30 ml/minuto La fase A era tampón formiato de amonio 25 mM a pH 4,5 acetonitnlo 95 5 y la fase B era acetonitrilo Se disolvió una muestra de antibiótico 107891 del Ejemplo 5 (300 mg) en 1 ,5 ml 350 1 de DMSO ácido fórmico 95 5 y se procesaron 300 µl por ciclo cromatográf ico El antibiótico 107891 se eluyó típicamente en 15-16 minutos Se agruparon las fracciones eluidas de 5 ciclos cromatográficos que contenían el antibiótico 107891 y se concentraron a vacío La solución residual se ofilizo tres veces a partir de agua de forma secuencial, dando 31 mg de antibiótico 107891 en forma de un polvo blanco Ejemplo 7: separación y purificación por separado de los Factores A1 y A2 del antibiótico 107891 Los Factores A1 y A2 se separaron y purificaron del complejo de antibiótico 107891 del Ejemplo 5 por HPLC preparativa sobre una columna C18 Symmetry Prep (tamaño de partícula 7 µm) de 7,8 x 300 mm Waters (Milford, EE UU ) usando dos programas de elución diferentes (A) El Factor A1 se purifico mediante una elución en gradiente lineal durante 25 minutos desde un 30% hasta un 45% de fase B con un flujo de 3,5 ml La fase A era tampón formiato de amonio 25 mM a pH 4,5 acetonitrilo 95 5 y la fase B era acetonitrilo El complejo de antibiótico 107891 purificado (15 mg) se disolvió en 350 µl de DMSO ácido fórmico 95.5 y se procesó por ciclo cromatografico Los Factores A1 y A2 se eluyerop típicamente en un marco de tiempo de 11-13 minutos Las fracciones eluidas se analizaron entonces por HPLC en las condiciones analíticas descritas anteriormente Las fracciones de 14 ciclos cromatográficos que contenía Factor A1 del antibiótico 107891 puro fueron agrupadas y concentradas a vacío La solución residual se liofi zó tres veces a partir de agua de forma secuencial dando 15 mg de Factor A1 puro en forma de un polvo blanco (B) El Factor A2 se purifico por elución isocrática a razón de un flujo de 7 ml con tampón formiato de amonio 100 mM a pH 4 acetonitnlo 82,5 17,5 El complejo purificado de antibiótico 107891 (5 mg) se disolvió en 250 µl de una mezcla de ácido acético acetonitrilo tampón formiato de amonio 100 mM a pH 4 50 120 80 y se procesó por ciclo cromatográfico Los Factores A1 y A2 se eluyeron típicamente en un marco de tiempo de 9-10 minutos. Las fracciones eluidas se analizaron entonces por HPLC en las condiciones analíticas descritas anteriormente. Las fracciones de 20 ciclos cromatográficos que contenía Factor A2 del antibiótico 107891 puro fueron agrupadas y concentradas a vacío. La solución residual se liofilizó dos veces a partir de agua dando 8 mg de Factor A2 puro en forma de un polvo blanco.

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES Un compuesto de fórmula en el que X se selecciona del grupo constituido por F, Cl, Br y I; y en la que R,, R2, R3, R4, R5, Re, R7 y Rß se seleccionan independientemente del grupo constituido por H, OH, alquilo y arilo.
2. 2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que X es Cl, R2 es OH y R?, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son H.
3. 3. El compuesto de la reivindicación 1 , en el que X es Cl, R1 es OH, R2 es OH y R3,
4. El compuesto de la reivindicación 1 , en el que R4, R , R6, R7 y R8 son H.
5. 5. El compuesto de la reivindicación 4, en el que R, es H, R2 es H y R3 es H.
6. El compuesto de la reivindicación 4, en el que R-¡ es H, R2 es H y R3 es OH.
7. 7. El compuesto de la Reivindicación 4, en el que R, es H, R2 es OH y R3 es OH.
8. El compuesto de la reivindicación 4, en el que R^ es OH, R2 es OH y R3 es OH.
9. 9. El compuesto de la reivindicación 4, en el que Ri es OH, R2 es H y R3 es H.
10. 10. El compuesto de la reivindicación 4, en el que Ri es OH, R2 es H y R3 es OH.
11. 11. Un compuesto de fórmula
12. 12. Un compuesto de fórmula
13. 13. El complejo del antibiótico 107891 que comprende el Factor A1 y el Factor A2, siendo un polvo blanco que tiene las siguientes características: (A) espectro de masas registrado a partir de una solución de 0,2 mg/ml en metanol/agua 80/20 con ácido trifluoroacético al 0,1 % en un instrumento Thermofínnígan LCQ deca equipado con una fuente de electronebulización, usando una mezcla de calibrado Thermofinnigan las siguientes condiciones de electronebulización: potencial de nebulización: 4J kV; temperatura del capilar: 220°C; potencial del capilar: 3V; modo de infusión: 10 µl/minuto, mostrando dos iones doblemente protonados a m/z = 1124 y a m/z = 1116 correspondientes a la composición isotópica más baja de los Factores A1 y A2 respectivamente; (B) espectro de infrarrojos registrado en KBr con un espectrofotómetro Bruker de FT-IR modelo IFS 48, mostrando máxima absorción a (cm"1): 3263; 2929; 1661; 1533; 1402; 1 114; 1026; (C) espectro de UV llevado a cabo en metanol/H20 80:20 con un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 16, mostrando dos hombros a 226 y 267 nm; (D) espectro de RMN-1H registrado a 600 MHz en la mezcla metanol d4:H20 (pH 4,3 HCl) 40:10 a 40°C en un espectrómetro Bruker AMX 600 aplicando una secuencia de supresión de agua usando como patrón interno la señal residual de metanol-d4 a 3,31 ppm, mostrando las siguientes señales: [d = ppm, multiplicidad; (atribución)]: 0,93 d (CH3), 0,98 d (CH3), 1 ,07 t (CH3 solapados), 1 ,18 t (CH3 solapados), 1 ,26 s (CH3), 1 ,30 t (CH3 solapados), 1 ,62-1 ,74 m (CH2), 1 ,78 d (CH3), 1 ,80 d (CH3), 2,03 m (CH2), 2,24 m (CH), 2,36 m (CH2), 2,72-3,8 m (CH alfa peptídíco), 3,8-5,2 m (CH alfa peptídico), 5,53-6,08 s (CH2), 5,62 d (doble enlace CH), 6,42 m (CH), 6,92 d (doble enlace CH), 7,0-7,55 m (CH aromático), 7,62-10,4 d y m (NH aromático y peptídico); (E) espectro de RMN-13C registrado en la mezcla metanol d4:HzO (pH 4,3 HCl) 40:10 a 40°C en un espectrómetro Bruker AMX 600 usando como patrón interno la señal residual de metanol d4 a 49,15 ppm, mostrando las siguientes señales: [d = ppm; (atribución)]: 13,6-23,2 (CH3 alifático), 26,16-73 (CH2 alifático y CH alfa peptídico), 105-136 (CH aromáticos y de dobles enlaces y carbonos cuaternarios), 164,3-176,3 (carbonilos peptídíco); (F) el hidrolisado ácido en Hcl 6 N (105°C, 24 horas) mostrando la presencia de los siguientes aminoácidos, junto con otros picos no identificados, después de la derivatización con carbamato de 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidilo: lantionina, metillantíonina, glicina, prolina, valina, ácido aspártico (producto de hidrólisis de la asparagina), fenilalanina y leucina; (G) el hidrolisado ácido en ácido metanosulfónico 4 N que contiene 3-(2-aminoetil)-indol al 0,2% (peso/volumen) como catalizador (115°C, 16 horas) mostrando la presencia de 5-clorotr?ptofano, y (H) una función lonizable básica detectada por valoración ácido/base llevada a cabo con hidroxido de potasio 0,01 N en 2-metox?etanol (MCS) H 0 12 3 que contiene un exceso molar de acido clorhídrico 0,01 N
14. 14 El Factor A1 del antibiótico 107891 , siendo un polvo blanco que tiene las siguientes características (A) un ion doblemente protonado a m/z = 1124 correspondiente a la composición isotópica más baja en el espectro de masas registrado a partir de una solución de 0,1 mg/ml en acetonitrilo agua 50 50 con acido acético al 0,5% en un instrumento Thermofinmgan LCQ deca equipado con una fuente de electronebulización, usando una mezcla de calibrado Thermofinnigan con las siguientes condiciones de electronebulización potencial de nebulización 4J kv , temperatura del capilar 250°C, potencial del capilar 8 V, modo de infusión 10 µl/minuto, (B) la masa exacta de antibiótico determinada usando un espectrómetro Bruker Daltonics APEX II, de 4,7 Tesla equipado con una fuente de electronebulización, que corresponde a un peso molecular de 2246,71 ± 0,06, masa monoisotopica calculada a partir de [M+2H]2+ a m/z 1124,36124 (precisión 30 ppm) (C) cuando se disuelve en CD3CN D20 (1 1 ), el espectro de RMN-1H muestra los siguientes grupos de señales (en ppm) a 600 MHz usando CD3CN como patrón interno (1 ,94 ppm), [d = ppm, multiplicidad, (atribución)] 0,84 d (CH3), 0,89 d (CH3), 0,94 t (CH3 solapados), 1 ,1 d (CH3), 1 ,13 d (CH3), 1 ,15 t (CH3 solapados), 1 ,49 m (CH2), 1 ,69 d (CH3), 1 ,75 m (CH2), 2,11 m (CH), 2,26 m (CH), 2,5 m (CH2), 2,68 - 3,8 m (CHß peptídicos), 3,8 - 5,0 m (CHa peptidicos), 5,45 - 6,17 s (CH2), 5,58 d (doble enlace CH), 6,36 m (CH), 6,86 d (doble enlace CH), 7,0 - 7,45 m (CH aromáticos), (D) cuando se disuelve en CD3CN D20 (1 1), el espectro de RMN-13C muestra las siguientes señales (en ppm) a 600 MHz usando CD3CN como patrón interno (1,39 ppm), [d = ppm, (atribución)] 13,6 - 23,03 (CH3 alifáticos), 25,69 - 77,9 (CH2 a fáticos y CHa peptídicos), 105 - 137,3 (CH aromáticos y en dobles enlaces y carbonos cuaternarios), 165,6 - 176,6 (carbonilos peptidicos), (E) el espectro de infrarrojos registrado en KBr con un espectrofotómetro Bruker FT-IR modelo IFS 48 muestra una absorción máxima a (cm'1) 3294, 3059, 2926, 1661 , 1529, 1433, 1407, 1287, 1114, 1021 , (F) El espectro de UV registrado en metanol:H20 80:20 con un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 16 muestra dos hombros a 226 y a 267 nm; (G) el hidrolisado ácido en HCl 6 N (105°C, 24 horas), mostrando la presencia de los siguientes aminoácidos, junto con otros picos no identificados, después de la derivatización con carbamato de 6-aminoquínolil-?/-hidroxisuccinimidilo: lantionina, metillantionina, glicina, prolina, valina, ácido aspártico (producto de hidrólisis de la asparagina), fenilalanina y leucina; y (H) el hidrolisado ácido en ácido metanosulfónico 4 N conteniendo como catalizador 3-(2-aminoetil)indol al 0,2% (peso/volumen) (115°C, 16 horas), mostrando la presencia de 5-clorotriptófano.
15. 15. El Factor A2 del antibiótico 107891 , siendo un polvo blanco que tiene las siguientes características: (A) un ion doblemente protonado a m/z = 1116 correspondiente a la composición más baja de isótopos en el espectro de masas registrado a partir de una solución de 0,1 mg/ml en acetonitrilo:agua 50:50 con ácido acético al 0,5% en un instrumento Thermofinnigan LCQ deca equipado con una fuente de electronebulización, usando una mezcla de calibrado Thermofinnigan con las siguientes condiciones de electronebulización: potencial de nebulización: 4,7 kv; temperatura del capilar: 250°C; potencial del capilar: 8 V; modo de infusión: 10 µl/minuto; (B) la masa exacta determinada usando un espectrómetro Bruker Daltonics APEX II, de 4,7 Tesla equipado con una fuente de electronebulización, que corresponde a un peso molecular de 2230,71 ± 0,06, masa monoisotópica calculada a partir de [M+2H]2+ a m/z 1116,36260 (precisión 30 ppm): (C) cuando se disuelve en CD3CN:D20 (1 :1 ), el espectro de RMN-1H muestra las siguientes señales (en ppm) a 600 MHz usando CD3CN como patrón interno (1 ,94 ppm), [d = ppm, multiplicidad; (atribución)]: 0,84 d (CH3), 0,88 d (CH3), 0,94 d (CH3), 1 ,06 d (CH3), 1 ,14 d (CH3), 1,48 m (CH2), 1 ,65-1 ,75 m (CH2), 1 ,67 d (CH3), 2,15 m (CH), 2,25 m (CH), 2,5 m (CH2), 2J7 - 3,8 m (CHP peptídicos), 3,8 - 4,9 m (CHa peptídicos), 5,45 - 6,14 s (CH2), 5,59 d (doble enlace CH), 6,34 m (CH), 6,84 d (doble enlace CH), 7,0 - 7,42 m (CH aromáticos); (D) cuando se disuelve en CD3CN:D20 (1 :1 ), el espectro de RMN-13C muestra las siguientes señales (en ppm) a 600 MHz usando CD3CN como patrón interno (1 ,39 ppm), [d = ppm; (atribución)]: 13,6 - 22,9 (CH3 alifáticos), 25,65 - 73 (CH2 alífáticos y CHa peptidicos), 105 - 137,3 (CH aromáticos y en dobles enlaces y carbonos cuatenarios), 165,7 - 176,1 (carbonilos peptídicos); (E) el espectro de infrarrojos registrado en KBr con un espectrofotómetro Bruker de FT-IR modelo IFS 48 muestra una absorción máxima a (cm'1): 3296; 3060; 2928; 1661; 1529; 1433; 1407; 1288; 1116; (F) El espectro de UV registrado en metanol:H20 80:20 con un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 16 muestra dos hombros a 226 y a 267 nm; (G) el hidrolisado ácido en HCl 6 N (105°C, 24 horas), mostrando la presencia de los siguientes aminoácidos, junto con otros picos no identificados, después de la derivatización con carbamato de 6-aminoquinolil-?-hidroxisuccinimidilo: lantionina, metillantionina, glicina, prolina, valina, ácido aspártico (producto de hidrólisis de la asparagina), fenilalanina y leucina; y (H) el hidrolisado ácido en ácido metanosulfónico 4 N conteniendo como catalizador 3-(2-aminoetil)indol al 0,2% (peso/volumen) (115°C, 16 horas), mostrando la presencia de 5-clorotriptófano.
16. 16 Un procedimiento para producir antibiótico 107891 y sus Factores A1 y A2 y las sales de los mismos con ácidos que comprende las etapas de: cultivar Microbispora sp. ATCC PTA-5024 o una de sus variantes o mutantes, manteniendo la capacidad de producir dicho antibiótico, en condiciones aeróbicas, en un medio acuoso rico en nutrientes que contiene una fuente asimilable de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas; aislar el antibiótico resultante del micelio y/o del caldo de fermentación filtrado; y purificar el antibiótico 107891 aislado.
17. 17. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que se cultivan previamente la cepa Microbispora sp. ATCC PTA-5024 o el antibiótico 107891 que produce una de sus variantes o mutantes.
18. 18. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que el aislamiento del antibiótico 107891 se lleva a cabo filtrando el caldo de fermentación y se recupera el antibiótico del caldo de fermentación filtrado según una técnica seleccionada del grupo constituido por extracción con un disolvente inmiscible en agua, precipitación añadiendo un no disolvente o cambiando el pH de la solución, cromatografía de absorción, cromatografía de reparto, cromatografía de reparto en fase inversa, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión molecular, y una combinación de dos o más de dichas técnicas.
19. 19. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que el aislamiento del antibiótico 107891 se lleva a cabo separando el micelio del sobrenadante del caldo de fermentación y el micelio se extrae con un disolvente miscible en agua, por lo cual, después de la retirada del micelio gastado, se obtiene una solución miscible en agua que contiene el antibiótico bruto, la cual se puede procesar por separado o juntándolo con el caldo de fermentación filtrado para recuperar el antibiótico 107891 por medio de una técnica seleccionada del grupo constituido por extracción con un disolvente, precipitación añadiendo un no disolvente o cambiando el pH de la solución, cromatografía de absorción, cromatografía de reparto, cromatografía de reparto en fase inversa, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión molecular, y una combinación de dos o más de dichas técnicas.
20. 20. El procedimiento según la reivindicación 19, en el que la concentración del disolvente miscible en agua en el extracto de micelio se reduce antes de ser procesado para recuperar el antibiótico a partir del mismo.
21. 21. El procedimiento según la reivindicación 18, en el que el caldo de fermentación filtrado se pone en contacto con una resina de absorción, y dicha resina se eluye con un disolvente polar miscible en agua o en una mezcla del mismo con agua, por lo cual se obtiene una solución que contiene el antibiótico 107981 bruto.
22. 22. El procedimiento según la reivindicación 21 , en el que la resina de absorción se selecciona del grupo constituido por una resina de poliestireno, de una mezcla de poliestireno y divinilbenceno y de poliamida.
23. 23. El procedimiento según la reivindicación 19, en el que el micelio se extrae con alcanol C!-C3, y el extracto miceliar se pone en contacto con una resina de absorción y se eluye de la misma con un disolvente polar miscible en agua o en una mezcla del mismo con agua, por lo cual se obtiene una solución que contiene el antibiótico 107891 bruto. 24 El procedimiento según la reivindicación 18, en el que las soluciones que contienen el antibiótico 107891 bruto se agrupan y procesan para purificación adicional de dicho antibiótico 107891 25 El procedimiento según la reivindicación 21 , en el que la solución que contiene el antibiótico 107981 bruto se concentra y después se seca por congelación para dar el antibiótico 107891 bruto en forma de un producto sólido 26 El procedimiento según la reivindicación 21 , en el que se agrupan las resinas de absorción que contienen el antibiótico absorbido, y su mezcla se eluye con un disolvente polar miscible en agua o con una mezcla del mismo con agua 27 El procedimiento según la reivindicación 16, en el que el antibiótico 107981 se purifica por medio de un procedimiento cromatográfico, preferiblemente por HPLC preparativa o cromatografía de presión media 28 El procedimiento según la reivindicación 16, en el que el Factor A1 y el Factor A2 se separan por HPLC preparativa a partir del antibiótico 107891 purificado 29 Una composición farmacéutica que comprende un antibiótico seleccionado del antibiótico 107891 , Factor A1 del antibiótico 107891 , Factor A2 del antibiótico 107891 y una mezcla de dichos Factores en cualquier proporción o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos con un ácido 30 La composición farmacéutica según la reivindicación 28, comprendiendo además un vehículo farmacéuticamente aceptable 31 El antibiótico 107891 , su Factor A1 , su Factor A2 o una mezcla de dichos Factores en cualquier proporción o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos con un ácido para uso como medicamento 32 Uso del antibiótico 107891 , de su Factor A1 , de su Factor A2 o de una mezcla de dichos Factores en cualquier proporción o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos con un acido para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas 33 Uso del antibiótico 107891 , de su Factor A1 , de su Factor A2 o de una mezcla de dichos Factores en cualquier proporción y una sal no tóxica de los mismos con un ácido como promotor de crecimiento en animales 34 Un cultivo biológicamente puro de la cepa Microbispora sp ATCC PTA-5024 o una de sus vanantes o mutantes, manteniendo la capacidad de producir antibiótico 107891 cuando se cultiva sumergida en condiciones aeróbicas en presencia de fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas