PT789581E - Metodo de prevencao e tratamento da mastite bovina - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO ” MÉTODO DE PREVENÇÃO E TRATAMENTO DA MASTITE BOVINA” O presente invento diz respeito ao uso de Galidermina e Epidermina, ou um seu sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável, para a preparação de um medicamento destinado à prevenção e tratamento da mastite bovina (fármaco anti-mastite). São incluídos fármacos de imersão nas tetas de gado bovino. A mastite é uma doença inflamatória da glândula mamária dos mamíferos. Em medicina veterinária, a mastite mais importante e mais frequentemente encontrada é a de vacas leiteiras. O gado leiteiro está altamente especializado na produção de leite.

Eles produzem muito mais leite do que aquele que é necessário para alimentar um vitelo. Esta sobre-produção e o costume de ordenhar as vacas leiteiras 2 ou até 3 vezes em 24 horas, toma as glândulas mamárias susceptível de infecções bacterianas. Adicionalmente, elas são ordenhadas por aparelhos mecânicos que passam de vaca para vaca, e assim a infecção é transmitida de um animal para outro. A glândula mamária tem alguns mecanismos de defesa natural contra bactérias patogénicas (Cullor et al., 1990). Estes podem ser ultrapassados por níveis altos de ataque dos organismos patogénicos ou por cedência destes mecanismos de defesa. Esta cedência pode ser devida a má gestão ou a mudanças -2-

físiológicas que ocorrem em certos períodos do ciclo de lactação (Cullor et al., 1990). Os períodos de parto e secagem do leite estão associados com uma incidência relativamente alta da mastite. A mastite pode ser devida a muitas espécies de bactérias diferentes. As espécies mais comuns que estão implicadas na mastite bovina estão incluídas nas categorias I e II: A Categoria I abarca organismos patogénicos do hospedeiro como a Staphvlococos aureus e Streptoccocus agalactiae. Estes vivem na pele do úbere ou no próprio úbere e determinadas vacas podem ser a fonte de infecção de outras, no rebanho. A Categoria I abarca organismos patogénicos ambientais tais como o Streptococos uberis e a Escherichia colli. Como os seus nomes sugerem, estas bactéria da categoria II são encontradas no meio ambiente da vacaria e constituem um risco constante (Cullor et al., 1990). A mastite causada pelas bactérias caracterizadas acima, pode manifestar-se como uma doença clínica ou sub-clínica (Cullor et al., 1990). A doença clínica pode variar de quartos medianamente afectados com alterações no leite, até quartos gravemente infectados com perda eventual desse quarto, até uma vaca doente sistemicamente que pode morrer. As representações mais suaves são as mais comuns. A mastite sub-clínica, como o nome sugere, não é obviamente detectável. É, contudo, muito prevalecente em muitas manadas de vacas leiteiras. Os quartos afectados sub-clinicamente contêm bactérias e o conteúdo em células do leite é maior que o normal. Este síndroma é acompanhado por uma produção menor. De facto, foi estimado que até cerca de 70% das perdas económicas suportadas pelos lavradores devido à mastite, podem ser atribuídas à perda de produção devido à doença sub-clínica (Philips, W.N., 1984).

Neste momento, a mastite é controlada através do exercício de higiene escrupulosa na ordenha, pela detecção de vacas infectadas sub-clinicamente de forma crónica e, quer ordenhando-as depois das vacas não infectadas ou mesmo eliminando-as da manada. Os casos clínicos são, sempre que ocorrem, geralmente tratados com antibióticos como os da Tabela 4. Isto significa que o leite deve ser tirado de venda, entre cerca de 4 a 8 ordenhas e consequentemente origina perdas económicas para o lavrador. A terapia antimicrobiana da mastite sub-clínica deve ser feita no período após secagem do leite. Consequentemente, durante o período entre o estabelecimento da infecção e a secagem do leite, a vaca infectada é um perigo para as suas companheiras.

Os agentes anti-microbianos peptídeos oferecem uma solução potencial para muitos destes problemas. O facto de serem peptídeos significa que eles serão digeridos pelo consumidor e isto dá-lhes um perfil não tóxico para animais de sangue quente. Um grande número de peptídeos anti-microbianos que exibem um largo espectro de actividade, são descritos na literatura, mas isso não quer dizer que possam ser utilizados para controlar a mastite bovina. Péptidos contendo lantionina representam um grupo interessante de agentes anti-microbianos porque exibem um largo espectro de actividades contra organismos patogénicos bacterianos. São representantes típicos a Subtilina, Cinamicina, Nisina, Duramicina, Ancovenina, Ro 09-0198, pep5, Lacticina 481, Gallidermina e Epidermina. Alguns destes peptídeos são altamente activos contra bactérias que causam a mastite bovina. Vários dos péptidos que contêm lantionina, com a lisina como o mais notável, são já utilizados como conservantes na indústria de alimentos e em preparações cosméticas.

Assim, esses agentes podem, em princípio, ser utilizados no tratamento da mastite e de quaisquer resíduos que permaneçam no leite não constituem qualquer risco para a saúde humana. -4-

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Contudo, um problema grave permanece, que é o que diz respeito à manufactura do queijo e iogurte. Estes processos são baseados na fermentação bacteriana do leite e portanto, agentes com propriedades anti-microbianas podem perturbá-los.

Foi estabelecido (Jung et al., 1992) que existe uma redução significativa do efeito anti-microbiano da Nisina na presença do leite [veja-se também as Tabelas 1 e 2], que resulta na dose terapêutica ter que ser tão alta que a actividade residual encontrada no leite de animais tratados, interfere fortemente com a capacidade desses microorganismos, que estão envolvidos na produção de queijo e iogurte, serem capazes de acidificar o leite.

Foi assim, uma necessidade sentida por longo tempo de encontrar um antibiótico peptídico que controlo totalmente a mastite bovina, que seja não tóxico para animais de sangue quente e não afecte as bactérias do leite que desempenhem um papel na produção de queijo e iogurte.

Surpreendentemente, foi descoberto no âmbito do presente invento, que do grupo de peptídeos contendo lantionina, dois compostos estreitamente relacionados não exibem as desvantagens mencionadas dos outros membros do grupo. Estes dois compostos são a Gallidermina e a estruturalmente semelhante Epidermina. Os referidos compostos e os seus sais de ácidos de adição farmaceuticamente aceitáveis, provaram ser, não só altamente eficazes contra organismos patogénicos que provocam a mastite bovina mas também não terem a sua actividade anti-patogénica inibida pela presença do leite. E o que é o mais importante, esta ausência de inibição na presença do leite, toma possível a redução da dose terapêutica de Galidermina e Epidermina ou os seus sais de adição farmaceuticamente aceitáveis, de tal modo que os problemas que dizem -5- -5-

r respeito à utilização do leite de vacas tratadas, na produção do leite e iogurte devido aos resíduos, é significativamente reduzido. Não é de esperar, encontrar entre os peptídeos contendo lantionina, representantes que exibam as vantagens referidas acima sobre outros membros da mesma classe de peptídeos. A eficácia da Galidermina e Epidermina no tratamento da mastite não foi ainda estudada, tanto quanto é do conhecimento do solicitante. A Gallidermina é um produto natural produzido pelo micro-organismo Staphvlococos gallinarum e têm a seguinte estrutura química. ch2-s —- ch2 .1 I . H-Ile-Ala-NH-CH-CO-Lys-Phe-Leu-NH-CH-CO-NH— -D- -L- CH3

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(ϋΗ2—-S --CH A Gallidermina, a sua estrutura, a sua produção e o seu uso em produtos farmacêuticos para tratamento de infecções bacterianas, tais como eczemas, impetico, celulite e acne, é descrito na Aplicação de Patentes Europeias EP-0’342’486.

Epidermina é um produto natural produzido pelo micro-organismo

Staphvlococos epidermis e têm a seguinte estrutura química. -6-

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CH2-;——s-—-CH A Epidermina, a sua estrutura, a sua produção e o seu uso em produtos farmacêuticos para tratamento de infecções bacterianas, tais como eczemas, impetico, celulite e acne, é descrito na Aplicação de Patentes Europeias ΕΡ-0Μ8Γ578. O presente invento é baseado no facto surpreendente de que a Galidermina e Epidermina e os seus sais de adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveis, podem ser utilizados para impedir ou tratar a mastite em gado leiteiro sem causar problemas no que respeita à utilização do leite na produção de queijo e iogurte, que são observados aquando da utilização de um ou mais dos antibióticos convencionais, tais como os mencionados na tabela 4, ou mesmo outros membros do grupo dos peptídeos contendo a Lantionina, tais como e por exemplo, nisina e lacticina 481. A actividade anti-microbiana destes últimos compostos é fortemente inibida pela presença do leite, o que faz com que a dose terapêutica seja 30 vezes maior que a aplicada quando se utilizam, de acordo com o invento, os compostos e os seus sais de adição de ácidos, farmaceuticamente aceitáveis.

As vantagens dos compostos, de acordo com o invento são ainda mais pronunciados se forem comparados com os antibióticos empregues convencionalmente no tratamento da mastite em gado leiteiro, tais como os mencionados na Tabela 6, que são aplicados em doses 300 vezes maiores que as da Galidermina e Epidermina, respectivamente. As muito pequenas dosagens requeridas dos compostos, de acordo com este invento, quando comparadas com as dos antibióticos convencionalmente empregues e o seu perfil não tóxico com respeito a animais de sangue quente devido à sua natureza peptídica, tomam-nos facilmente aceitáveis para o consumidor.

Um modelo de realização do presente invento é dirigido para o uso duma quantidade terapeuticamente efectiva de Galidermina e/ou Epidermina, ou um dos seus sais de adição farmaceuticamente aceitáveis, para a preparação de um fármaco para o tratamento ou prevenção da mastite num mamífero.

Um modelo de realização preferido do presente invento é dirigido para o uso duma quantidade terapeuticamente efectiva de Galidermina e/ou Epidermina, ou um dos seus sais de adição farmaceuticamente aceitáveis, para a preparação de um fármaco para o tratamento da mastite num mamífero.

Num outro modelo de realização, o presente invento é dirigido para o uso duma quantidade terapeuticamente efectiva de Galidermina e/ou Epidermina que pode ser obtido de uma fonte natural, por síntese química ou por meio de tecnologias do ADN recombinante, ou um dos seus sais de adição farmaceuticamente aceitáveis, para a preparação de um fármaco para o tratamento ou prevenção da mastite numa vaca. A administração pode ser feita quer antes ou depois da infecção. -8- i ' V ι / c

Assim, o aspecto principal do presente invento é o fornecimento de Galidermina e/ou Epidermina, ou um dos seus sais de adição farmaceuticamente aceitáveis, para a preparação de um fármaco para o tratamento ou prevenção da mastite em mamíferos. Um modelo de realização preferido do presente invento é o fornecimento de Galidermina e/ou Epidermina, ou um dos seus sais de adição farmaceuticamente aceitáveis, para a preparação de um fármaco para o tratamento ou prevenção da mastite no gado. O presente invento contempla o fornecimento de qualquer forma da Galidermina e/ou Epidermina, ou um dos seus sais de adição farmaceuticamente aceitáveis, quer sozinhas ou em combinação. Visto que a produção de peptídeos recombinantes tem vantagens substanciais relativamente à purificação de peptídeos nativos, os modelos de realização preferidos utilizam peptídeos recombinantes. São também consideradas as formas sintéticas da Gallidermina e Epidermina e “muteínas”, as quais apresentam diferenças estruturais mínimas em relação aos produtos nativos, como pertencendo ao âmbito deste invento.

Como foi indicado, o presente invento diz respeito ao tratamento ou prevenção da mastite. O termo “tratamento” quer significar a cura ou as melhoras de um animal que contraiu a mastite. A “prevenção” da mastite significa o impedimento da ocorrência da infecção, ou temperar a gravidade da infecção, se a mesma for contraída.

Os agentes activos do presente invento são usualmente preparados e armazenados como formulações líquidas, prontas a usar. A solução aquosa é geralmente aplicável, mas a formulação pode ser adaptada ao tipo específico da administração. As formulações de Gallidermina e Epidermina podem também conter surfactantes não iónicos que não têm cargas especificas quando dissolvidos em meios aquosos e são seleccionados de ésteres etoxilados de ácidos gordos e triglicéridos. As formulações de Gallidermina e Epidermina podem também conter EDTA para melhorar o espectro anti-microbiano e agentes estabilizadores tais como a metionina, ácido ascórbico e conservantes tais como o propilenoglicol.

Tipicamente, os agentes activos do presente invento são administrados por injecção intra-mamária; contudo, podem ser administradas dosagens efectivas parenteralmente, percutaneamente por implante, ou por imersão. Num modelo de realização preferido do preferido invento a administra é levada a cabo por via de injecções intramusculares, subcutâneas ou intravenosas. Quando preparados como injectáveis, os agentes activos, de acordo com o presente invento, são geralmente administrados utilizando um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Veículos adequados são, por exemplo, água, solução salina, manitol, dextrano, aminoácidos, glicerol ou combinações semelhantes. Adicionalmente, se tal for desejado, o veículo pode conter substâncias auxiliares tais como agentes humidificadores ou emulsificantes, conservantes e agentes de tampão de pH. O ingrediente activo existirá tipicamente numa gama de cerca de 1% a 95% (p/p) da composição administrada, ou ainda maior ou mais pequena se tal for apropriado. A administração parenteral pode ser conseguida convencionalmente através de injecções subcutâneas, intradermais, intramusculares e mesmo intravenosas. A administração parenteral é bem conhecida na arte e pode ser levada a cabo de maneiras comuns à arte da medicina veterinária ou humana. A acção sustentada do agente activo para prolongar a libertação (a que se chama “libertação lenta”) pode ser obtida pela formulação da proteína -10-

49*. Π '1 c } numa matriz que iria inibir fisicamente a dissolução rápida. A matriz formulada é injectada no corpo do animal onde permanece como um depósito do qual a proteína é libertada lentamente. Adjuvantes comuns a este respeito são os polímeros e copolímeros de lactideos e glicosídeos. Adicionalmente, agentes gelificantes, como o monoestearato de alumínio, de cálcio, ou magnésio, ou carbohidratos (derivados de celulose, pectina, ou dextrano), polissiloxanos ou proteínas (gelatina, colagénio) podem ser utilizados para aumentar o tempo de libertação do agente activo do presente invento, depois da aplicação parenteral. A administração percutânea também quer significar a implantação de mecanismos de libertação controlada, e.g., feitos de silicone ou cera ou outras matrizes implantáveis de materiais poliméricos que possam ser utilizados subcutaneamente para difundir o composto no período de tempo requerido. Isto também pode ser utilizado pela implantação de mini-bombas contendo soluções aquosas da proteína. Tais técnicas de implantação são também bem conhecidas na arte e usadas muitas vezes em tratamentos médicos.

Veículos de polissiloxano são descritos na arte para uma grande variedade de formas de distribuição hormonal e podem ser adaptados à libertação dos agentes activos do presente invento. É descrito um sistema de distribuição do colagénio para a libertação de antibióticos, na “Offenlegungsschrift” germânica DE-3429038. Este sistema pode também ser aplicado à distribuição da Gallidermina e Epidermina.

Formulações de libertação lenta e outras formulações veterinárias ou farmacêuticas de Gallidermina e Epidermina podem ser preparadas pela adaptação de, por exemplo, a formulações de Gallidermina e Epidermina, ou outras formulações de proteínas já descritas nesta arte.

Uma “quantidade terapeuticamente efectiva” de um agente activo do presente invento é uma dose suficiente para, quer impedir ou tratar a mastite num indivíduo ao qual é administrado o agente activo. As dosagens dos agentes activos do presente invento os quais podem tratar ou prevenir a mastite, podem ser determinados, tendo em conta esta descrição, por técnicos na arte medianamente dotados, através de testes de rotina com os controlos apropriados. A comparação dos grupos de tratamento apropriados com os controlos indicarão se uma dose específica é efectiva na prevenção ou tratamento da doença, utilizando um desafio controlado. Em geral, uma dosagem efectiva vai variar conforme o modo de administração. Foi demonstrado que no caso da injecção intramamária, utilizando a administração de Gallidermina e Epidermina numa dose na gama de 0,1 mg por quarto até 10 mg por quarto, de preferência, numa dose na gama de 0,5 mg por quarto até 5 mg por quarto, em maior preferência, numa dose na gama de 1 mg por quarto até 3 mg por quarto e na gama mais preferida de todas, de 1 mg por quarto, é suficiente para controlar a mastite devido ao Staphilococos aureus.

Se administradas íntramuscularmente, subcutaneamente ou intravenosamente, os doseamentos efectivas dependerão do peso do animal e serão efectuadas, tipicamente, numa gama de 20 pg/kg a 200 pg/kg. Mais tipicamente, o doseamento será pelo menos de cerca de 50 pg/kg mas menos de 150 pg/kg.

Para além do doseamento, a administração efectiva de um agente activo de acordo com o presente invento dependerá em parte do número e intervalos entre os doseamentos. Por exemplo, podem ser dados a um animal múltiplas administrações de uma dosagem, tipicamente com um intervalo de 12 -12- horas. Na maior parte das circunstâncias pode ser desejável administrar mais do que uma dosagem a um animal, tal como seis, sete, oito, ou mesmo nove num igual período de dias ou ainda mais tempo. Do mesmo modo, é entendido que a combinação precisa de dosagem e intervalo de tempo será sujeita a uma grande variação e que numerosas combinações no tratamento e prevenção duma doença podem ser estabelecidas por quem tenha conhecimentos medianos da arte, baseando-se na presente descrição.

Os agentes activos do presente invento podem ser administrados antes da infecção e assim servir como agentes profiláticos ou podem ser dados depois do indivíduo ter mostrado sinais da infecção. São descritos abaixo vários exemplos ilustrando o presente invento. Estes exemplos são dados somente para fins ilustrativos e não pretendem limitar o âmbito deste invento.

PARTE EXPERIMENTAL

Análise de MIC em placas

As MICs (Concentração mínima inibitória) da Gallidermina contra o Streptococos aureus e Streptococos diacetilactis foram determinados. S. aureus Newbold 305 é um agente causativo da Mastite e S. diacetilactis é utilizado na manufactura do iogurte e queijo.

Diluições apropriadas da Gallidermina (300, 100, 30, 10, 3, 1, 0,3 e 0,1 mpg/ml foram preparadas em leite e em caldo Ml7 (Merck) e deixadas repousar à temperatura ambiente durante 30 min. Depois, alíquotas de 10 ml das - 13 - $v Íça./1» * soluções foram postas em placas de agar Ml7 contendo 0,5% de glucose. Estas placas tinham sido recobertas com agar mole (0,5% de agarose), semeadas com 1% de A600=l cultura de quer S. aureus ou S. diacetilactis. As manchas foram deixadas secar e depois as placas foram incubadas a 30 °C durante a noite.

As MICs foram determinadas como as concentrações mínimas da proteína anti-microbiana que causam a formação de um halo bem definido na placa de bactérias. Os resultados apresentados na tabela 1 mostram que a Gallidermina tem actividades comparáveis contra o Streptococos diacetilactis. quer no leite ou no caldo.

Tabela 1: MICs de Gallidermina (mug/ml)

Leite Ml 7 - 14-

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um precipitado celular, que foi lavado 2 vezes com 1 ml de 20 mM Tris-HCl, a pH 8,0 e re-suspenso em 1 ml do referido tampão. 100 ml das diluições apropriadas foram postas em placas de agar Ml7, contendo 0,5% de glucose e incubadas durante a noite a 37 °C. As unidades de formação de colónias (cfu) foram determinadas e foi calculada a percentagem de sobrevivência em relação ao controlo.

Os resultados são descritos na Tabela 2. Por estes dados, é claro que a Gallidermina no leite, retém um alta actividade contra o Streptococos aureus, enquanto que quer a Nisina ou a Lacticina 481 são inibidas fortemente na presença do leite.

Tabela 2: Efeito de Nisina, Lacticina 481 e Gallidermina contra o Streptococos aureus, no leite

Cone. (mpg/ml) Nisina % de Sobrevivência Lacticina 481 Gallidermina 100 0,2 12 30 1,8 30 10 15 36 0,01 3 65 51 1 1 74 12 0,3 29 Contr. 100 100

Está bem documentado que a Nisina é inibida na presença de leite (Jung et al., 1992). Claramente e de forma surpreendente a Gallidermina não mostra inibição semelhante na presença do leite. É esta propriedade particular que a toma tão adequada à utilização como agente terapêutico da mastite bovina, visto que a sua dose terapêutica pode ser baixada como conveniente.

Para avaliar o potencial da Gallidermina, Epidermina ou os seus - 15-

sais de adição farmaceuticamente aceitáveis, na mastite bovina subclínica causados pelo Streptococos aureus. pode ser utilizado o modelo de infecção descrito abaixo.

Exemplo 1: Experiências preliminares de avaliação do potencial da Gallidermina. Epidermina, ou dos seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis, na mastite bovina subclínica. São seleccionadas vacas não infectadas baseadas na irrecuperação do Streptococos aureus de duas amostras de leite tiradas em dias consecutivos de todos os quartos. Em seguida, 3 quartos são inoculados através da via intramamária, utilizando uma suspensão de Streptococos aureus. O 4o quarto serve de controlo. Durante as duas a quatro semanas depois da inoculação, as amostras de leite foram retiradas de todos os quartos, pelo menos três vezes para ver se o Streptococos aureus pode ser recuperado, e por consequência se o quarto foi infectado. Um quarto é definido como infectado se o for recuperado depois de pelo menos dois tratamentos do leite. Os tratamentos são atribuídos ao acaso aos quartos infectados através da via intramamária. As amostras de leite são tiradas diariamente até um mínimo de 14 dias depois do tratamento. Um quarto é considerado como curado se as amostras de leite desse quarto se tomarem negativas (i.e., se não for recuperado qualquer Streptococos aureus) num período de 7 dias depois do tratamento e permanecer negativo por 14 dias do período de amostragem.

Este modelo experimental é utilizado num esquema fixo em que os tratamentos são avaliados. A escolha do Streptococos aureus tem as vantagens desta ser a bactéria de Gram positivo mais difícil de tratar e uma das mais importantes bactérias causadoras da mastite bovina. Assim, esperam-se taxas de -16- /^t fo*. r h CL*—*·*' í ** cura mais baixas que de outras bactérias de Gram positivo, tais como Streptococci e Stafilococci de coagulase negativa.

Este modelo provou ser satisfatório desde que a taxa de infecção nos quartos atingiu 60%, ou 2 quartos por vaca. Em adição, a infecção é suave, como deve ser para a mastite subclínica.

Para optimizar o trabalho dos efectivos humanos, são destacadoas 8 a 16 vacas em cada ensaio. Os ensaios duram normalmente 5 semanas pelo menos.

GESTÃO DA MANADA É mantida uma manada de vacas leiteiras, para serem utilizadas nos ensaios.

As vacas são compradas a negociantes de gado locais. Estas vacas devem ter uma produção de leite mínimo de 15 1/dia. Duas amostras de leite são retiradas de todos os quartos, dia sim dia não, para examinação bacteriológica. Nenhuma das vacas nas quais se detectaram os organismos patogénicos da mastite são utilizadas nos testes.

Tabela 3: sumário dos resultados in vitro

Os resultados da Tabela 3 mostram que a percentagem de quartos positivos de grupos de tratamento diferentes durante o tratamento e num período de 14 dias depois do fim do tratamento.

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Grupo de tratamento Gallidermina 3x1 mg Ampiclox 3 x 1 mg Controlo de tratamento rápido Controlo de tratamento longo Gallidermina 14 x 0,1 mg dia % do grupo tratado positiva (27 quartos) Doses de ampiclox (68 quartos) % do grupo controlo positiva (45 quartos) % do grupo controlo positiva (13 quartos) % do grupo tratado positiva (24 quartos) 0 93 100 97,7 92 96 1# 37 19 75,6 92 88 2* 11 1 77,8 77 88 3 26 7 80 92 71 4 56 6 73,3 77 58 5 59 24 77,8 69 67 56 29 75,6 77 50 8 56 34 75,6 77 67 9 52 35 71,1 85 71 10 56 35 75,6 62 88 11 56 43 71,1 62 83 12 52 41 64,4 69 88 14 48 43 68,9 77 79 15 52 43 80 69 88 16 80 85 83 17 85 83 19 77 79 21 69 83 # para todos os grupos de tratamento, o tratamento começa no dia 1. * O tratamento acaba depois do dia 2 para a gallidermina (3x1 mg), o ampiclox (3 x 300 mg) e os grupos de controlo de tratamento rápido. ** O tratamento acaba depois do dia 7 para a gallidermina (14 x 0,1 mg) o grupo de controlo de tratamento longo, respectivamente.

IMERSÃO DAS TETAS E A PROFILAXIA DA MASTITE A imersão das tetas é uma das medidas mais efectiva e frequentemente usada para impedir a mastite das vacas leiteiras. Este procedimento, largamente utilizado, consiste em introduzir as 4 tetas de cada vaca, depois de cada ordenha, numa solução anti-bacteriana. Este procedimento deixa um revestimento de compostos anti-bacterianos na superfície da teta e uma gotícula da substância recobre a parte dependente da teta sobre o seu orifício. Depois da ordenha, a gota de leite que muitas vezes cobre o orifício das tetas é um bom meio para crescimento bacteriano. Desta posição, as bactérias podem facilmente penetrar no canal do bico das tetas. A imersão das tetas assegura a protecção contra tais possibilidades.

Em algumas manadas, as tetas são lavadas por imersão antes da ordenha, para matar os organismos patogénicos residentes na superfície da teta, antes da aplicação da máquina de ordenha. Para ser útil como uma solução de imersão das tetas antes da ordenha, os seus agentes activos têm que ser não tóxicos e não perturbadores da manufactura de queijo e iogurte.

Os produtos correntemente empregues na imersão das tetas, contém uma variedade de ingredientes activos, tais como iodoforos, clorhexidieno e o péptido contendo lantionina, a nisina. A Gallidermina e Epidermina e os seus sais de ácido farmaceuti-camente aceitáveis são muito adequados para utilização em imersão das tetas, devido ao seu efeito supressor rápido e actividade preferencial contra os mais comuns dos organismos patogénicos da mastite. O efeito supressor rápido é uma adequação preferencial como agente para a pre-imersão.

Protocolo da Imersão das Tetas

Para avaliar o potencial da Gallidermina e Epidermina e os seus sais de adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveis como agentes profiláticos na mastite bovina, pode ser utilizado o seguinte protocolo experimental.

Animais utilizados na experiência: são seleccionadas 50 vacas de acordo com o protocolo já descrito para testes destes agentes na terapia da mastite sub-clínica devido aos estafilococos. Esta experiência decorre segundo um protocolo reconhecido pelo “US National Mastitis Council” (NMC) (Hogan et al., 1990) para testar a eficácia dos germicidas das tetas durante a exposição experimental.

Durante o período do teste todas as tetas foram imersas numa suspensão bacteriana de teste, contendo 15 x 10 Streptococos aureus e 5 x 10 Streptococos agalactiae depois da ordenha da noite, nos dias da semana. As suspensões de teste são preparadas diariamente de soluções padrão que são preparadas uma vez por semana. As amostras da solução de teste são postas em placas diariamente para determinar a concentração real das bactérias presentes no momento do teste.

Depois de cada ordenha os quartos dianteiros da esquerda e os traseiros da direita são imersos nas preparações do germicida do teste, ficando as outras duas tetas como controlos negativos, as quais não são imersas. As amostras do colostro de rotina de todos os quartos são tiradas duas vezes por semana durante o teste, para examinação bacteriológica. Qualquer quarto, em que foi isolado qualquer um dos organismos de teste, é isolado, e é-lhe feita nova análise num período de 48 horas após a amostragem inicial. Se o mesmo organismo é isolado, então o quarto é considerado infectado. Do mesmo modo, um episódio de mastite clínica devido a qualquer dos organismos do teste, é considerado como uma nova infecção intra-mamária. (IMI).

No fim do período de teste, é comparado o número de novas infecções intra-mamárias entre os grupos de tratamento.

GALLIDERMINA E EPIDERMINA NO QUEIJO E IOGURTE

Para avaliar os efeitos da Gallidermina e Epidermina ou os seus sais de adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveis em estirpes de bactérias utilizadas na manufactura de queijo e iogurte, são efectuadas as seguintes experiências.

Experiência 1: Análise da cinética da reaccão de Delvoteste P em leite dos quartos tratados com Gallidermina. Epidermina ou os seus sais de adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveis.

Informação de base: O teste de Delvotest P é um kit de detecção de agentes anti-microbianos do leite, conseguido comercialmente e largamente utilizado. Ele testa a inibição do crescimento do Bacilus estearotermofilo. As bactérias indicadoras são suspensas numa rolha de agar num tubo de ensaio de plástico com um indicador de pH. O crescimento das bactérias resulta na produção de meio ácido e mudança de cor. O Bacilus estearotermofilo é um bom representante de bactérias utilizadas na manufactura de iogurte e queijo e assim utilizada largamente como indicador de estirpes na detecção de resíduos de antibióticos. Método experimental: Esta experiência é efectuada ao mesmo tempo e nos mesmos animais que os testes de cinética e eficácia. Durante o período seguinte à administração dos vários tratamentos, as amostras são tiradas nas ordenhas da manhã e da noite. Estas amostras são analisadas utilizando o

Delvotest P, segundo as recomendações dos seus fabricantes. Esta amostragem bi-diária é feita até todos os quartos apresentarem resultados negativos. Desta maneira, pode ser estabelecida a duração da eliminação do agente anti-bacteriano.

Tabela 4: Resultados do Delvoteste P no leite das glândulas mamárias dos quartos de gado bovino, tratado com diferentes concentrações de gallidermina

Agentes Dose N°de Regime de N° de ordenhas depois do utilizados (mg) quarto tratamento último tratamento em que o tratado Develtest P foi pos. ou +/-

Gallidermina 0 12 3 em 12 horas 0 Gallidermina 0,1 4 3 em 12 horas 0 Gallidermina 0,5 4 3 em 12 horas 1 Gallidermina 1 12 3 em 12 horas 2 Gallidermina 2 8 3 em 12 horas 2 Gallidermina 5 8 3 em 12 horas 3 Gallidermina 30 38 3 em 12 horas 8* $ todos menos dois dos 38 quartos tratados foram negativos durante 96 h depois do tratamento.

Experiência 2: Avaliação dos efeitos de várias concentrações de Gallidermina. Epidermina ou os seus sais de adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveis, na acidificação do leite por bactérias de formação de queijo.

Na manufactura do queijo e iogurte as diferentes estirpes de bactérias são fermentadas no leite e uma das mais importantes e imediatas mudanças resultantes desta fermentação é a produção de ácido. Este ácido é

responsável pelo controlo do crescimento de bactérias secundárias que podem causar a deterioração do produto ou, pior do que isso, doenças no consumidor. Fermentações posteriors do ácido láctico produzindo alterações na população bacteriana, produz mudanças noqueijo que variam com a estirpe das bactérias utilizadas e os métodos de manufactura. Estes factores são responsáveis pelas características físicas e o aroma de queijos diferentes. A acidificação é o passo mais importante no processo de manufactura quando o leite é fermentado. Se a acidificação decorrer normalmente é muito provável que os outros passos sejam também normais. Assim, pode-se investigar a capacidade de concentrações diferentes de Gallidermina, Epidermina ou os seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis na cinética da acidificação do leite por diferentes estirpes bacterianas utilizadas nestes processos de manufactura.

Protocolo: As experiências são feitas rotineiramente, utilizando uma das três estirpes seguintes de bactérias:

Streptococcus thermophilus Lactobacillus bulgaricus Lactococcus lactis - cremoris

Preparação das culturas mãe: Culturas liofilizadas, como utilizadas em condições comerciais, são obtidas por Rudolf Wittwer, CH-5002 Rombach, Aarau, Suiça. Estas culturas são reconstituídas de acordo com as recomendações dos fabricantes e reactivadas pela passagem por três vezes em leite desnatado estéril. Em cada passagem procede-se à incubação, durante 16-18 horas à temperatura óptima de cada estirpe de bactérias. A cultura obtida depois da terceira passagem é diluída a 2% com -23- Μ leite de esterilização total (UHT), e 10 ml de cada amostra são introduzidos em tubos de 10 ml e congelados a - 20°C, para utilização em experiências posteriores.

Preparação da cultura experimental: As culturas mãe, preparadas como descrito acima, são descongeladas a 40 °C e depois incubadas durante a noite a 37 °C e utilizadas para inocular as amostras a testar, numa concentração de 2% em leite de esterilização total (UHT).

Preparação das amostras a testar: O agente anti-microbiano a testar (Gallidermina, Epidermina ou um dos seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis) é diluído em leite de esterilização total (UHT), na gama de diluições adequada. Estas amostras são depois inoculadas com 2% em volume da cultura experimental da estirpe de bactérias a testar. As amostras são depois misturadas e incubadas à temperatura óptima para a estirpe de bactérias a analisar. O pH é medido em cada duas horas de um período de oito horas e depois, 18 horas depois da inoculação. A velocidade de acidifícação do leite, contendo concentrações diferentes do ingrediente activo, pode ser comparado com a velocidade sem qualquer ingrediente activo.

Experiência 3: Análise do efeito directo na manufactura do iogurte, do tratamento dos quartos da glândula mamária com diferentes doses de agentes antimicrobianos. São empregues nestes testes, vacas livres de infecção com organismos patogénicos da mastite, baseados na cultura bacteriana do leite. São administrados tratamentos idênticos aos quatro quartos de cada vaca. O leite de cada ordenha de cada vaca é depois mantido separadamente e utilizado na experiência. O leite das ordenhas da noite é refrigerado a 4 °C durante a noite para ser utilizado na manhã seguinte. Amostras de 500 ml do leite das ordenhas da noite e também o das ordenhas da manhã é aquecido a 80 °C num banho maria e depois arrefecido à temperatura ambiente. A inoculação com culturas de bactérias, a incubação e medida do pH é depois feito como descrito anteriormente.

Tabela 5: Tempo restringente (o período de tempo entre o último tratamento e a falta de efeito na acidificacão do leite em culturas lácteas primárias) depois do tratamento com quantidades várias de gallidermina.

Estirpe de bactérias Substância Frequência de aplicação N° de aplicações Dose Tempo restringente Lactobacilo Gallidermina 12 h 3 1 mg 24-36 h bulgarico 12h 3 2 mg >36 h 12 h 3 5 mg > 36 h S, Gallidermina 12 h 3 5 mg > 36h termofílo 12h 3 1 mg 24 - 36 h 12 h 3 2 mg 36 h Lactobacilo Gallidermina 12 h 3 0,5 mg 36 h bulearico 12h 3 0,1 mg Oh 12 h 3 1 mg 24 - 36 h S, Gallidermina 12 h 3 0,5 mg > 36 h termofilo 12h 3 0,11 mg Oh 12 h 3 1 mg 24 - 36 h -25- -25-

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Os tempos restringentes de alguns dos antibióticos empregues usualmente no tratamento da mastite são descritos na seguinte Tabela 6.

Tabela 6: Antibióticos de origem comercial, empregues no tratamento da mastite em gado leiteiro

Produto Companhia Horas de Retirada Tempos de Ordenha Ampiclox SBAH 48-72 4-6 Kloxerate Solvay 60 5 Plus Duphar Mastijet Intervet 96 8 Tetra Upjohn 72 6 Delta Synulox SBAH 48 4

REFERÊNCIAS

Hogan, J.S.; Galton, D.M., Hannon, R., Nickerson, S.C., Oliver, S.P., Pankey, J.W. (1990) Protocols for Evaluating efficacy of postmilking teat dips. J. Dairy Sei. 73, pp 2580-2585.

Jung, D.S., Bodyfelt, F. W., and Daeschel, M.A., (1992) Influence of fat and emulsifíres on the efficacy of nisin in inhibiting Lysteria monocytoge-nis in fluid milk. J. Dairy Science, 75, pp 387-393. -26-

Philpot, W .N., (1984) Economics of mastite control, Veterinary Clinics of North America; Large Animal Practice 6(2) pp 233-245.

Cullor,J.S., Tyler, J.W., Smith, B.P. (1990) Disorders of the mam-mary gland in large animal medicine, B.P. Smith, The C. V. Mosby Company, St Louis, Missouri 63146, USA., pp 1.047-1067.

Lisboa,, 22 de Agosto de 2001 ίζ C-t-k-í

ALBERTO CANELAS . Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (10)

1. _ 1 _ Μ REIVINDICAÇÕES 1. A utilização de Gallidermina, Epidermina ou um dos seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis que exibem actividade contra a mastite mum mamífero, para a preparação de um fármaco para tratamento ou prevenção da mastite do referido mamífero.
2. 2. Utilização, de acordo com a Reivindicação 1, em que o agente nativo é de origem natural, recombinante ou sintéctica ou é uma muteína, exercendo portanto uma actividade contra a mastite num mamífero.
3. 3. Utilização, de acordo com as Reivindicações 1 ou 2, em que o fármaco anti-mastite é fornecido como uma formulação liquida pronta a usar.
4. 4. Utilização, de acordo com as Reivindicações 1 ou 2, em que o fármaco anti-mastite é fornecido como uma formulação de libertação lenta.
5. 5. Utilização, de acordo com as Reivindicações 1 a 4, em que o fármaco anti-mastite é fornecido como uma composição farmacêutica para imersão das tetas.
6. 6. Utilização, de acordo com as Reivindicações 1 a 4, em que o fármaco anti-mastite é fornecido como uma composição farmacêutica para injecção intra-mamária.
7. 7. Utilização, de acordo com as Reivindicações 1 a 6, em que o mamífero referido é uma vaca, cabra ou ovelha. -2-
8. 8. Utilização, de acordo com as Reivindicações 1 a 7, em que o fármaco está numa forma adequada para utilização antes da infecção do mamífero saudável.
9. 9. Utilização, de acordo com as Reivindicações 1 a 7, em que o fármaco está numa forma adequada para utilização depois de se ter declarado a infecção.
10. 10. Utilização, de acordo com as Reivindicações 1 a 12, em que o medicamento está numa forma adequada para utilização numa dosagem de 20 μg/kg a 200 pg/kg. Lisboa, 22 de Agosto de 2001 ^Wv ^ c— ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industria! RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA