JPH0356426A - ウシ乳房炎予防および治療用抗体含有材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〉 本発明はウシ乳房炎の予防または治療に用いるのに好適
な、ウシ乳房炎原因菌に対する特異的抗体を含有する材
料に関する． （従来の技術） ウシの乳房炎は乳腺の炎症性の変化であり、般には乳管
内、さらには乳槽内に侵入した微生物の定着と増殖によ
って起きる乳管系や乳腺＆ｎＩａの炎症をいう．このた
めに乳汁の合成機能が阻害され、乳汁を分泌する細胞壁
の透過性が冗進して異常乳を分泌したり、体細胞数、特
に白血球が増加する．さらに、乳汁分泌細胞の損害、萎
縮並びに結合組織の増殖などをきたして泌乳量が減少あ
るいは停止する． 乳房炎の原因菌として最も重視されているものとしては
、スタフィロコッカス（Ｓ　ｔａｐｈｙ　Ｉｏｃｏｃｃ
ｕｓ）　，ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ）　＊　アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ
ｓ）　＊　エシェリヒｘ．　（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｉａ
）　，　　シェードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ）
　，クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｓ＋）お
よび真菌が知られている． 乳房炎の感染あるいは発症の機序は複雑であり、菌側の
病原因子としては菌の侵入性、乳腺上皮への定着性、さ
らにそこでの増殖性あるいは組織侵襲性などがあげられ
る．誘因としては遺伝、体質あるいは気候、牛舎構造、
環境、飼養頭数、飼料、搾乳の方法、乳頭口の損傷等が
あるが、実際的にはミルカーの適正な取り扱いを含む搾
乳衛生が最も重要とされている． 乳房炎による実際的な被害は乳量の減少、乳質の低下、
乳汁の廃棄、盲乳さらに供用年数の短縮、治療費の増大
、健康牛への感染源となることなどであり、その経済的
損失は甚大である．このような状況下において、乳房炎
についてはは過去２００年間各国で活発に研究が行われ
、その膨大な成果が本病の予防、治療に活用されてきた
が、一向にその発生は減少せず、地域によっては増加し
ているところもある．乳房炎は微生物感染による乳腺の
炎症性変化であることから、その対策としては抗生物質
製剤並びに合威抗菌剤の乳房内注入が一般的に行われて
いる．この目的のために使用される薬剤として、以下の
ものがある． く抗生物質製剤〉 テトラサイクリン系 塩酸オキシテトラサイクリン ペニシリン系 クロキサシリンベンザチン テトラサイクリン合剤系 クロキサシリンナトリウム、塩酸オキシテトラサイクリ
ン、リン酸オレアンドマイシンペニシリン合剤系 硫酸カナマイシン、べ冫ジルペニシリンプロカイン、ベ
ンジルペニシリンブロカイン、硫酸ジしドロストレプト
マイシン、ベンジルペニシリンプロカイン、ノボビオシ
ンナトリウム、ベンジルペニシリンプロカイン、硫酸フ
ラジオマシン く合成抗菌剤〉 スルファニルアミド系 スルファメトキシピリダジン スルファニルアミド合剤系 スルファチアゾール、スルファジアジンこれらの抗生物
質製剤および合成抗菌剤は、各成分ごとに投与後の乳汁
の使用禁止期間が設定されていて、ヒトの健康をそこな
う恐れがないように配慮されている．しかしながら、使
用禁止期間中に搾乳された乳汁は市乳としての価値は全
くないため、経済的な損失は莫大である．また、診療現
場では薬物の用法、用量を守ることは当然ではあるが、
その都度原因菌の薬剤感受性試験を行わないで、勘に頼
って薬物を選択する場合もある．その結果、原因菌が多
剤耐性を獲得することから、適切な治療方針が設定でき
ないことも多い．このようなことから、抗生物質および
合戒抗菌剤に依存しない新しい試みとして、ワクチンの
開発が行なわれているが、実用化に至るまでには多くの
難関が予想されている． （発明が解決しようとする課題〉 乳房炎の予防、治療には前記の抗生物質製剤並びに合威
抗菌剤が使用されているが、このような方法では、抗生
物質製剤並びに合成抗菌剤使用禁止期間に伴う乳汁の経
済的損失をまねき、さらに多剤耐性菌による薬物療法の
障害あるいは多剤耐性菌による飼育環境の汚染等が危惧
される．一方、ワクチンの実用化技術についてもワクチ
ンの接種経路、接種時期等解決すべき問題点が多数存在
する． 本発明の目的は、上記問題点を解決し、乳汁への薬剤の
残留、菌の薬剤耐性化を生じることなく、経済的で実用
化の簡単な乳房炎の予防ないし治療方法、およびこの方
法に使用する材料を提供することである． （課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記目的を達成するために、乳房炎の原
因菌に対する抗体含有材料を製造することに着目し、種
々の検討を行なった．本発明者は、先に出願した特願昭
６１−２１８５５９号（特開昭６２−２１５５３４号）
および特願昭６２−２５１３６５号（特開平１−９３５
３９〉において、予め抗原を鶏に接種し、免疫獲得後に
産卵した卵より、該抗原に特異的な抗体を含有する材料
を得ることを提案した．本発明者は、この鶏卵より抗体
を得る方法が乳房炎原因菌に対する抗体の製造に有効で
あり、得られた抗体含有材料により乳房炎を効果的に予
防または治療しうろことを見出し、本発明を完威した． 本発明の要旨は、産卵鶏に免疫原を接種することにより
免疫を獲得させた産卵鶏の鶏卵から回収された、ウシ乳
房炎原因菌および／または該原因菌が産生ずる免疫原性
を有するコンポーネントに特異的な抗体を含有する材料
にある． 本発明によれば、上記抗体含有材料を含有する、ウシ乳
房炎予防および／または治療剤も提供される． さらに、本発明により、上記抗体含有材料を搾乳牛の乳
房に注入することからなる、ウシ乳房炎の予防および／
または治療方法も提供される。

本発明の抗体含有材料、その製造方法およびその使用法
について、以下に具体的に説明する。

まず、乳房炎原因菌に対する特異的抗体を形威させるた
め産卵鶏に接種するのに使用する免疫原を調製する． 免疫原としては、ウシ乳房炎原因菌の菌体または菌体威
分と、該原因菌が産生ずる免疫原性を有するコンポーネ
ントの一方もしくは両方が用いられる． ウシ乳房炎原因菌には、スタフィロコッカス・アウレウ
ス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ，黄
色ブドウ状球菌、以下Ｓ．　ａｕｒｅｕｓと略称する〉
、ストレプトコッカス・アガラクチェ（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）　、コリネバク
テリウム・ピオゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ＋ｕ
ｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）　、エシエリヒア１コリ（［！
．ｃｏｌ　ｉ　）等の各種の菌が挙げられるが、Ｓ，　
ａｕｒｅｕｓが乳房炎の最も重要な起因菌であるので、
少なくともこの菌を菌体抗原として用いることが好まし
い。

上記原因菌の菌体を抗原として産卵鶏に接種する場合、
全菌体を用いてもよいが、原因菌の乳腺上皮細胞への付
着に関与する外膜威分あるいは乳腺組織を破壊する菌体
威分等、乳房炎の発症や炎症に関与する威分が既知の場
合には、それらを抗原として用いればよい． 上記原因菌が産生ずる免疫原性（抗体を産生ずる性質）
を有するコンポーネントとは、該閑により産生され、乳
房炎に関する生物活性を有しかつ免疫原性を有する物質
をいい、例えば該菌が産生じ、菌体外に放出する毒素な
どがある．このような毒素を抗原として用いる場合、そ
のサブユニットを用いてもよい，　Ｓ，　ａｕｒｅｕｓ
の場合には炎症に関与する毒素としてα−ヘモリジンを
産生しているので、このトキソイド（ｌ毒素、すなわち
、免疫原性を維持させながら無毒化したもの）を抗原と
して用いることができる．抗原としてα−へモリジント
ヰソイドの使用が有効であるのは、乳房炎が乳房の炎症
を特徴とし、その病状発生にばαーヘモリジンのような
毒素が重要な役割を果たしていることが予想されるため
である． 本発明において、産卵鶏にＳ．　ａｕｒｅｕｓを接種す
る場合には、この菌体抗原とα−ヘモリジンのトキソイ
ドの両方を免疫原として使用することが好ましい． 産卵鶏への接種量は、免疫獲得後に所望の抗体価を有す
る卵が得られるように適宜戊定され、菌種やトキソイド
の種類により異なるが、Ｓ．　ａｕｒｅｕ３とα−へモ
リジンのトキソイドとを接種する場合で、Ｓ．　ａｕｒ
ｅｕｓ菌体抗原２　〜５　Ｘ　１０”　ＧＦＵ／羽、ト
キソイド１〜５＋ｍｇＮ／羽程度でよい，本発明の抗体
含有材料の製造において、産卵鶏に接種する抗原として
、乳房炎原因菌の菌体および該菌が産生ずる免疫原性を
有するコンポーネントとの混合物を用いた場合、菌体自
体に対する特異的抗体とコンボー不ントに対する特異的
抗体の両方が、鶏の体内および卵中に形成され、いずれ
か一方のみを使用した場合には、それに対する特異的抗
体が形威される． Ｓ．　ａｕｒｅｕｓを菌体抗原として接種する場合には
、この菌の全菌体を免疫原として用いることが好ましい
。これは、搾乳牛にＳ．　ａｕｒｅｕｓを乳腺内に接種
すると、実験的な乳房炎が再現され、病理変化が起こる
前に接種菌がまず乳腺上皮細胞に付着することが、形態
学的研究によって明らかにされているからである（Ｇｕ
ｄｄｉｎｇ，　Ｒ．＋　ＰａＬｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏ
ｆＳＬａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ｍａ
ｓｔｉｔｉｓ：　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃ．　ｈｉ
ｓｔｏｌｏｇｉｃ，　ａｎｄ　ｕｌｔｒａｓＬｒｕｃｔ
ｕｒａｌ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ　ｆｉｎｄｉｎｇｓ，
　Ａｌｌ．　Ｊ．　Ｖｅｔ．　Ｒｅｓ．　４５：　２５
２５−２５３１．１９８４参照）．すなわち、この菌体
抗原に対する抗体は、Ｓ．　ａｕｒｅｕｓの乳腺上皮へ
の付着を阻止するのに有効であると考えられる． 上記のようにＳ．　ａｕｒｅｕｓの全菌体とこの菌が産
生ずる毒素であるα−ヘモリジンのトキソイドとの混合
物を用いて本発明方法に従って製造した抗体含有材料は
、菌体に対する抗体とα−へモリジンに対する抗体の両
方を含有し、菌体に対する抗体によって乳房炎原因菌の
乳腺上皮細胞への付着が防止され、また該菌が増殖して
も、α−ヘモリジンに対する抗体によって、増殖により
産生されたα−へモリジンが乳腺内で中和されることに
より、乳房炎が抑えられると考えられる。

菌体抗原としては、鶏に過度の毒性を与えないように不
活化抗原を用いることが好ましい。例えば、菌をホルマ
リン等の薬剤で処理することにより不活化する。

α−ヘモリジン（α一溶血素）など毒素のトキソイドを
免疫原として使用する場合、その抽出、精製およびトキ
ソイド化は常法により行うことができる．トキソイド化
は通常は加熱又はホルマリン処理により行われる，　Ｓ
．ａｕｒｅｕｓの毒素であるα−へモリジンの抽出、精
製、トキソイド化は、例えばＣｏｕｌＬｅｒ　ＪＲ，　
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ＋
ａｎｄ　ｃｏａ＋ｐｏＳｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔａｐｂ
ｙｌｏｃｏｃｃａｌ　α−ｔｏｘ　ｉ　ｎＪ　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏ＋　９２：１６５５−１６６２　（１９６６）
の方法に準して実施できる． 上述した原因菌の菌体抗原、原因菌が産生ずるヘモリジ
ンのトキソイド、あるいは菌体抗原とトキソイドとの混
合物を、所望によりこれにアジュバント　（免疫増強剤
）を混合して、産卵鶏に接種する。接種は皮下、腹膣内
、筋肉内、静脈内注射などの適宜経路で可能である。

アジュバントの使用により、鶏の体内、したがってその
産生卵に長期間にわたって高い抗体価を維持することが
できる． 接種量は、接種物およびアジュバントの種類に応して、
所望の抗体が鶏の体内に適当量形威され、過度の毒性が
発揮されないよう選択する。この選択は実験により適宜
行うことができる。

通常、菌の投与から数週間以内に鶏は接種された菌に対
する免疫を獲得し、その体内に接種菌に特異的な抗体が
形威され、その鶏が産生ずる卵にこの抗体が含まれるよ
うになる（すなわち、免疫卵となる）。

高力価の抗体が持続するように適当な間隔（通常、２〜
１０週間）で同じ菌をブスターとして１回ないし数回追
加接種することもできる。その際にも、アジュバントを
使用することが好ましい。

卵中の特異的抗体の含有は、抗原一抗体反応を利用した
既知の検査法により確認できる。抗体価の定量的測定は
、例えばＥＬＩＳＡ　（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉ
−ｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）のような酸素
免疫測定法により行うことができる． このようにして免疫を獲得し、卵に特異的抗体が含有さ
れるようになった後、その鶏が産生ずる免疫卵を採取す
る．好ましくは　それぞれの抗原に対する抗体価がプラ
トーに達した後の免疫卵を集める。

この免疫卵から本発明の抗体含有材料とするには、例え
ば、次のようにして抗体含有画分を回収する．すなわち
、卵白を除去した卵黄に対して２．５倍量の蒸留水を加
えて准合した後、これに等遺の０．５％オイドラキッド
Ｌ３０Ｐを加えて撹拌する。

この混合物から遠心操作によって上清を得る．この上清
に対してあらかしめ−２０″Ｃに冷却したエタノールを
２倍量加えて攪拌する。沈渣を得るために遠心しその沈
渣をＰＢＳで溶解する。抗体を含有する濃縮物を０．４
５ｎ＋ｍおよび０．２２ｎｍのフィルターを通して濾過
滅菌した後、凍結乾燥法、噴霧乾燥法等の方法によって
抗体粉末を得る． もちろん、乾燥粉末に加工せずに、上記の抗体含有画分
をそのまま使用することもできる．また、それぞれ異な
る原因菌を鶏に接種して上記方法で得た、異なる抗体を
含有する２種以上の抗体含有材料を混合して使用するこ
とも可能である。あるいは、あまり好ましくはないが、
鶏の免疫時に２種以上の原因菌を接種して、対応する２
種以上の抗体を含有する免疫卵を得、これを上記のよう
に粉末化することもできる． 本発明の抗体含有材料は、ウシの乳房炎に対する予防効
果ならびに治療効果がすぐれており、ウシの乳房炎の予
防剤または治療剤として使用できる． 乳房炎の予肪のためにウシに投与する方法としては、乳
房内注入によるのが効果的であり、具体的には、例えば
乳頭管を用いて乳頭口から乳槽内に注入する方法を採用
できる．注入には、上述のようにして得られた抗体含有
粉末を、適当な賦形剤を用いてペースト化したものを用
いることができ、またその際、乳腺の深部に抗体を到達
させるため番二発泡剤を併用することも可能である．予
防用の投与量は、その抗体含有ｊ５）末に含まれる抗体
の種類や抗体価により変化するが、一般にＳ．　ａｕｒ
ｅｕｓ菌体およびα−ヘモリジンのトキソイドの接種に
より上記方法で得た猜製抗体含有粉末で１回に１分房当
たり１〜２０ｍｇ、好ましくはｌＯ〜２０ａ＋ｇ程度で
あり、必要に応した回数投与する．乳房炎の治療のため
のウシへの投与も、上記の予防の場合と同様に実施でき
る。治療用の投与量はやはり抗体の種類や抗体価により
異なるが、上記の精製抗体含有粉末で、ｌ回に１分房当
たり２０〜４０ｍｇ程度であり、これを１日に１回ない
し２回投与する．治療用の投与は、症状が完全に消失す
るまで続けることが好ましい。上記のＳ．ａｕｒｅｕｓ
およびα−ヘモリジンのトキソイドの接種により得た抗
体含有材料の場合には、通常は数日の投与で乳房炎が治
癒する。

本発明による抗体含有材料は、その精製抗体標品の、マ
ウスを用いた経口ルートによる急性毒性、亜急性毒性並
びに慢性毒性試験では投与可能な最大ｉ１　（０．　１
ｇ／マウス）でも異常は認められなかった．次に、本発
明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明は
それらに制限されるものではない。

乳房炎山来Ｓ．ａＬＩｒｅｌｌｓホンゴウ９０２Ａ菌株
（道立新得畜産，ｔｆｌ：験場より入手）を５％馬血液
加プレインハートインヒューノヨン寒天培地に接種して
３７゜Ｃで約１８時間培養した。出現したコロニーは明
瞭な冷血性を示し、コアグラーゼを産生し、マンニノト
分解性であった。このコロニーをｌＯ−のプレインハー
トインヒエージョンに接種し、３７゜Ｃで杓８時間振盪
培養した。この培養菌液０．５一を４００　ｄのプレイ
ンハートインヒュージョン培地に接種し、３７“Ｃで約
１６時間振盪培養した（２００ｒｐｎ＋）。集菌後、菌
体をＰＢＳ　（ｐ｝１７．２）に５　Ｘ　１０”　ＣＦ
ＩＪ／ｄになるように浮遊させ、０．５％ホルマリンを
加えて不活化し、免疫用菌体抗原とした。

一方、α−ヘモリジンの抽出、猜製、トキソイド化は、
ＣｏｕｌＬｅｒ，　ＪＲ　（１９６６）の方法（Ｐｒｏ
ｄｕｃｔｉｏｎｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，　　ａｎｄ
　　ｃｏｍｐｏｓｉＬｉｏｎ　　ｏｒ　　ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃａｌ　α−ｔｏｘｉｎ．　Ｊ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏ１　９２：ｌ６５５−１６６２）に準じて、次の
ように行った。

すなわち、Ｓ，　ａｕｒｅｕｓの４８時間振とう培養菌
を遠心した上清を出発材ギ４とした。約０゜Ｃに冷；ｊ
＋　Ｌた上７ｉｌｔに氷酢酸をＰＲが４．０にｔζるま
で加え、次に３０゜Ｃに冷却したメタノールを最Ｐ．４
度が２５％Ｃこなるように加えた。２〜３時間後に遠心
し′ζ上清を除去した後、沈渣に０．１５Ｍ酢酸ナトリ
ウムを加えζ３〜４回抽出した。この抽出戚を０．＋５
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液で平衡化したセファデックスＧ
ｌ００を用いてカラムクロマトグラフィーを行った。

溶出パターンは３ｌｂ！認められ、αヘモリジン活性は
第２ｌｌｌＩに検出された。この分画をプールしてαヘ
モリジン分画とした。次にトキソイド化するため６０゜
Ｃ，３０分の加熱処理を行った。トキソイド化抗原の濃
度はケルダール窒素法によって測定しｍｇＮ／＋ｍｌで
表示した． ５　ＸｌＯ’ＯＧＦＩＩ／ｄに調整した菌体抗原と、０
．５６Ｎ／ａｆｆｉに調整したα−ヘモリジンのトキソ
イドとを体積で等量づつ混合することによって抗原を調
整した。

免疫原の調製は以下のようにして行った．たとえば、１
００−の免疫原を作る時は、Ｏｆｌ　ｐｈａｓｅ（６５
％−ｉｎｅｒａ１　０１１％　５％Ａｒｌａｃｅｌ　８
０）７０１１１にＴｗｅｅｎ８０を０．マ絨、抗原を２
９．３１１１１加えて攪拌するとエマルジョンができる
．このようにして得た免疫原を１羽あたりｌｍずつ約５
０羽の産卵鶏に免疫した．６週後、同し抗原と油性アジ
ュバントとの混合物を同量、ブスター（追加免疫）とし
て再接種した．接種前および接種後にこの鶏が産生した
卵について、卵黄中のＳ．　ａｕｒｅｕｓ菌体に対する
抗体とα一ヘモリジンに対する抗体の両者の抗体価の推
移を第１図に示した．抗体価は、抗原一抗体反応を利用
した酵素免疫測定法の１種であるｆｌＬＩｓ＾により測
定し、１０羽の平均値である．　ＥＬＩＳ＾に用いた抗
原の調製並びに反応術式はＯｐｄｅｂｅｅｃｋ，Ｊ．Ｐ
とＮｏｒｃｒｏｓｓ　Ｎ．Ｌ．　（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　
ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｉｎ　ｌａｃｔｅａｌ　ｓｅｃｒｅ
ｔｉｏｎｓ　　ｏｆ　　ｃｏｗｓ　　ａｆｔｅｒ　　ｉ
＋ｓ＋ｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　　ｗｉｔｈ　　ｖａｒｉ
ｏｕｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　ａｎｄ　ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃａｌ　　ａｎｔｉｇｅｎｓ．　　＾一　Ｊ　　Ｖｅ
ｔ　　Ｒｅｓ　　４３：　　１７７０−１７７５　１９
８２）の方法を参考にして次のように行った。

［ＥＬＩＳＡ用抗原ｌ ■Ｓ．　ａｕｒｅｕｓ菌体抗原 約１８時間３７℃で振とう培養した培養液２ｌを遠心し
て菌体を得た．菌体を食塩水で３回洗浄した後５０絨に
浮遊した．超音波処理をした後１７，０００Ｘｇで１時
間遠心して上清を得た。この上清を菌体抽出抗原として
ＥＬＩＳＡに用いた．■Ｓ．　ａｕｒｅｕｓ　α−ヘモ
リジン免疫用抗原と同じものをＥＬＩＳＡ用抗原として
使用した． ■および■の抗原は０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液　（Ｐ１１
９．６）で透析した後、０．４５μのフィルターを通し
て適当量に分けて−２０゜Ｃに保存した．［術式１ ■５．ａｕｒｅｕｓ菌体抽出抗原あるいはα−ヘモリジ
ン抗原を０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液で最適濃度になるよう
に調整した後、マイクロプレート　（ダイナテックイム
ロン２）のウエルにｌＯＯｕｌずつ分注した．テープで
シールした後、４゜Ｃで１８時間＠着させた． ■０．０２％Ｔｗｅｅｎ加生理食塩水でウェルを３回洗
浄した。

■３％ウシ血清アルブミン加ＰＢＳを各ウェルに１５０
μｌずつ加えてテープでシールした後３７’Ｃに１時間
放置した． ■０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０加生理食塩水でウェルを３
回洗浄した． ■０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳでｔ：ｔｏｏに希
釈した被検材料を各ウエルに１００ＩＪｆｆｉずつ加え
、テープでシールした後、３７℃で１時間反応させた．
なお、被検材料は次のように調製した． 免疫卵から卵黄を分離し、等量のＰＢＳを加えて撹拌し
た．さらに、この混合物に等量のクロロホルムを加えて
再び攪拌した。その後、４，００Ｑｒｐｍ　２０分間の
遠心操作を行い、水溶性タンパク分画を被検材料とした
． ■０．０２％ツィン２０加生理食塩水でウェルを３回洗
浄した。

■各ウエルに抗ニワトリ　ＩｇＧ−ベルオキシダーゼ標
識抗体（約８，０００倍に希釈したもの）を１００μｌ
ずつ加え、テープでシールして２５“Ｃ３０分間反応さ
せた。

■０．０２％ツイン２０加生理食塩水でウェルを５回洗
浄した。

■各ウエルに反応基質液を１００μｉずつ加え、アルく
ホイルで被った後２５゜Ｃで２０分反応させた。

［相］各ウエルに３Ｎ　ｉｉ．ｓｏ．溶液を１００　μ
ｌず・っ加えて酵素反応を停止させた後、各検体の０．
０値を４９２ｒｖで測定した。

抜止坐且塁 第１図から明らかなように、プスター２週後から両者の
抗体価は急激に上昇し、４週後にはプラトーに達した。

そのためプスクー４週目からの免疫卵を集めてプールし
、以下に示すような方法で抗体を回収した．まず、免疫
卵をグルコン酸クロルヘキシジンで消毒した後、割卵し
て卵黄のみを採取した．卵黄重量の２．５倍量の蒸留水
を加えて乳化した後、得られたエマルジョンに等量の０
．５％オイドラギッドＬ３０Ｄを加えて撹拌し、遠心に
よって上清を得た．この上清から抗体を精製するため、
約２倍量の−２０℃に冷却したエタノールを徐々に加え
て攪拌した。これによって、抗体の白濁沈澱物が生じた
ので遠心操作によって回収した．沈渣を適当量のＰＢＳ
で溶解した後、０．４５ｎ−および０．２２ｎ＋ｍのフ
ィルターを通して濾過滅菌した．最終的には、凍結乾燥
法によってＳ．　ａｕｒｅｕｓおよびαヘモリジンの両
者に対する抗体を含有する粉末状の精製杭体標品を得た
． 以下の実施例は、実施例１で得られた抗体含有乾燥粉末
（精製抗体標品）の、ウシ乳房炎に対する予防効果およ
び治療効果を実証するものである．夫嵐班主 ０の　　に　　る ホルスタイン種の搾乳牛３頭を実験に供した．実験開始
前７日間、乳汁からのＳ．ａｕｒｅｕｓの分離をしたが
、すべての分房とも陰性であった，Ｎｏ．１とＮａ２の
搾乳牛には、実施例ｌで得られた抗体含有粉末約５０ｍ
ｇをＰＢ３　２０１ｍ２に溶解し、その５ｄづつを乳頭
管を用いて２頭の計８分房全部の乳頭口から約４０−の
乳槽内に注入した．漱３はＰＢＳのみを全分房に５絨づ
つ注入した対照牛とした．この注入の約２時間後、ｉｏ
”ｃＦｕ／５−に調整したＳ．ａｕｒｅｕｓホンゴウ９
０２Ａの攻撃菌を全分房の乳頭口から各５一注入するこ
とによって攻撃した．なお、攻撃菌液は次に述べる方法
によって調製した。５％馬血液寒天平板に発育したコロ
ニーを３　ｔｔｒｌのプレインハートインフユージョン
培地に移植し、３７℃で約１８時間培養した後、この培
養菌を４００　ｄの上と同じ培地にｌＩｄ当り約１０’
　ＣＦＵになるように接種した。３７゜Ｃで約ｌ８時間
振盪培養し（２０Ｏｒｐｍ）、集菌した後Ｐ［ｌＳで２
回洗浄し、最終的に５Ｘ１０”ＣＦＵ／ｄになるように
ｌＯ％スキムミルクに浮遊させ、攻撃に使用するまで−
８０゜Ｃで保存した．攻撃する時には、牛乳培地で所定
の菌数になるように調整して用いた． 攻撃後の観察は５日間とし、（１）体温、（２）食欲、
（３）乳房の疼痛、腫張並びに乳汁の凝固物の状態を観
察した．同時にこの期間中に毎日、（４）Ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉａ　Ｍａｓｔｉｔｉｓ　Ｔｅｓｔ　（ＣＭ？）に
よる乳房炎の程度を調べ、さらに（５）乳汁からの攻撃
菌の分離を行った．ＣＭＴは約３０年前に考案され今日
なお世界各国で乳房炎診断のための簡便で信頼される方
法として用いられている番この原理は陰イオン系界面活
性剤と乳汁が反応すると体細胞数に比例して凝集が起こ
ることを利用したものである． 攻撃後の観察結果は次の通りである．漱３の対照搾乳牛
は攻撃１日後には体温が４０″Ｃ前後に上昇し、食欲は
廃絶し、急性乳房炎特有の症状が認められ、４分房全部
の乳汁中に多量の凝固物が混合していた，Ｎａｌおよび
ＮＩｌ２の搾乳牛は、ＮＱ３とは異なり、体温、食欲と
もに正常であり、乳房炎の症状は全く認められなかった
。

Ｃ）ＩＴの結果を第１表に示す。

Ｎｌ１３の対照牛では、 全期間を通じて全分房で強陽性を示したのに対し、Ｎａ
ｌおよび恥２では攻撃後１日目に軽度な反応が認められ
た分房もあったが、翌日には全分房で陰性となった。

乳汁からの菌分離の結果は第２表に示した通りである．
攻撃後１日目では、供試牛３頭の全分房からＳ．　ａｕ
ｒｅｕｓが分離されたが、ＮｌｌｌおよびＮｌｌＬ２で
は、漱３に比較して菌量は少なかった。ＮαｌおよびＮ
ｔ１２では、攻撃後２日目には計４分房からわずかな菌
量でＳ，ａｕｒｅｕｓが検出されたのみとなり、３日目
以降は全く菌が分離されなくなった．これに対して、Ｎ
ｌｌ３では、５日間の観察期間を通して全分房から多量
の菌が検出された． 以上の結果から、予め本発明の抗体含有材料を乳房内注
入することによって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる乳房炎に
予防効果があることが実証された．なお、Ｎ［Ｌ１およ
びＮａ２の搾乳牛について、副作用は認められなかった
． Ｏ ｌ ２ ３ ４ ５ （陽性） ト＋＋（強陽性） ０ ｌ ２ ３ ４ ５ 菌を分離せず、　十　菌を分離 実ｉｆＬ史 ”の　　　に　　る ホルスタイン種の搾乳牛２頭を実験に供した。

実験開始前７日間、乳汁からのＳ．ａｕｒｅｕｓの分離
を行ったが、すべての分房とも陰性であった。そこで、
実施例２で用いたと同じ攻撃菌を１０”ＣＦＵ／５一に
なるように牛乳培地で調整して、その５１ｎ１ツつを乳
頭管を用いて全分房の乳頭口から乳槽内に注入した。翌
日には、２頭共に、実施例２に示したＮα３の牛と同様
の典型的な急性乳房炎の症状を示した。これらの発症牛
を用いて治療効果を検討するために、Ｎｎ４の牛には実
施例ｌで得られた精製抗体標品約１００ｍｇを２０ｍの
ＰＢＳで溶解した後、その５醜づつを４分房全部の乳槽
内に注入してよくもんだ。Ｎα５の牛には４分房の乳槽
内にＰＢＳを５成づつ〆主入し、対照とした。治療は朝
と夕の２回ずつ３日間連用した。この治療開始から５日
間症状をａ！察すると共に、実施例２と同様に、ＣＭＴ
によって乳房炎の程度を調べ、また乳汁からの攻撃菌の
分離を行った。

第３表はＣＭＴの結果を示す。治療開始時にはＮα４お
よびＮα５共に急性症状を呈していたが、阻４の牛は治
療翌日には反応の程度が軽減し、２日後にはほぼ正常に
、３日以降は全く正常に回復したこれに反し、Ｎα５の
対照牛は、４日目まで強度の陽性を示し、５日目でもご
く僅かな回復しか示さず、急性症状が持続した。

第４表は、乳汁からのＳ．ａｕｒｅａｓの分離状況を示
している。治療開始時にはＮ［ｌ４およびＮα５共に多
量の接種菌が検出された。Ｎｏ．　４の治療牛は、治療
後３日目には２分房のみから攻撃菌が検出されたが、４
日目には検出されなくなった。これに対し、対照牛阻５
は観察期間中ずっと多量の攻撃菌が検出された。以上の
ことから、本発明の抗体含有材料の乳槽内注入によって
Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる乳房炎の治療の効果が実証され
た。

なお、Ｎｌ１４の牛について副作用はＬ’ｌめられなか
った。

菌を分離せず、 ＋ 菌を分離 以上、乳房炎の主要な原因菌であるＳ．ａｕｒｅｕｓに
に起因する乳房炎について説明したが、他の乳房炎原因
菌についても本発明方ｌ去により抗体含有材料を製造で
き、牛の乳房炎の予肪または治療に有効である。

（発明の効果） 以上の説明から明らかなように、本発明によれば、鶏卵
より比較的簡単な手段で抗体含有材ギ４を多量かつ安価
に、しかも時期を選ばずに、ウシ乳房炎の原因菌および
／またはそのヘモリジンに対する抗体を含有する抗体含
有材料を製造することができ、これはウシの乳房炎の予
防並びに治療に大きな効果を発揮することが確かめられ
た。従って、本発明の方法および材料により、実用的で
簡便な乳房炎の予防および治療方法が確立することにな
る． 本発明によるウシ乳房炎の予肪および治療は、抗生物質
、合成抗菌剤に依存していた従来の方法と異なり、乳汁
への薬剤の残留、菌の薬剤耐性化と耐性化した菌の蔓延
等の問題も避けることができ、安全性の面でも非常に有
利である．さらに、従来の抗生物質や合威抗菌剤による
予防・治療では、その投与中および投与後のかなりの期
間、乳汁の市販が禁じられているため、経済的な損失が
大きいが、本発明の抗体含有材料では上記の経済的損失
が実質的に避けられる．このように、本発明は、ウシ乳
房炎の予防・治療効果が高く、しかも簡便、安全かつ経
済的である点で、今後の＃１農業に貢献する技術である
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｓ．　ａｕｒｅｕｓの全菌体およびα−ヘモ
リジンのトキソイドを産卵鶏に接種した時の、接種前お
よび接種後に得られた卵の卵黄中のＳ．　ａｕｒｅｔｔ
ｓおよびα−ヘモリジンに対する各抗体の抗体価の推移
を示すグラフである。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）産卵鶏に免疫原を接種することにより免疫を獲得
   させた産卵鶏の鶏卵から回収された、ウシ乳房炎原因菌
   および／または該原因菌が産生する免疫原性を有するコ
   ンポーネントに特異的な抗体を含有する材料。
2. （２）前記免疫原が、不活化されたウシ乳房炎原因菌の
   菌体または菌体成分と、該原因菌が産生する免疫原性を
   有するコンポーネントの一方もしくは両方である、請求
   項１記載の抗体含有材料。
3. （３）前記免疫原が、不活化スタフィロコッカス・アウ
   レウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）
   の全菌体とα−ヘモリジンのトキソイドの両者である、
   請求項２記載の抗体含有材料。
4. （４）前記抗体含有材料が、該鶏卵の卵黄から分離・精
   製された抗体含有画分からなる、請求項１〜３のいずれ
   か１項記載の抗体含有材料。
5. （５）請求項１〜４のいずれか１項記載の抗体含有材料
   を含有する、ウシ乳房炎の予防および／または治療剤。
6. （６）請求項１〜４のいずれか１項記載の抗体含有材料
   をウシの乳房内に注入することからなる、ウシ乳房炎の
   予防および／または治療方法。