DE2510868B2

DE2510868B2 - Nanaomycin A und Verfahren zur Herstellung der Antibiotica Nanaomycin A und Nanaomycin B

Info

Publication number: DE2510868B2
Application number: DE19752510868
Authority: DE
Inventors: Juichi Souka Saitama Awaya; Toju Tokio Hata; Satoshi Tokio Omura; Haruo Maschida Tokio Tanaka
Original assignee: KITASATO INSTITUTE TOKIO
Current assignee: KITASATO INSTITUTE TOKIO
Priority date: 1975-03-13
Filing date: 1975-03-13
Publication date: 1979-06-21
Also published as: DE2510868C3; DE2510868A1

Description

2. Verfahren zur Herstellung der Antibiotica Nanaomycin A und Nanaomycin B, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Streptomyces rosa van notoensis FERM-P No. 2209 in einem üblichen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffqueüen enthält, unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 15—40°C und einem pH von 6—10 züchtet und anschließend die gebildeten Antibiotica aus der Kultur abtrennt.

H O

H H

20

25

Die Erfindung betrifft das Antibioticum Nanaomycin A der Formel

CH₃ H

HO θ'

COOH

H H

und ein Verfahren zur Herstellung der Antibiotica Nanaomycin A und Nanaomycin B.

Nanaomycin A ist eine Verbindung vom Chinontyp und ist auf Mycoplasma, gram-positive Bakterien und Trichophyton aktiv. Die akute Toxizität (LD50, ip) dieser Verbindung auf Mäuse beträgt 28,2 mg/kg. Die Verbindung wird durch Fermentation gewonnen, indem ein die Nanaomycine A und B erzeugender Stamm unter seroben Bedingungen in einem Medium gezüchtet wird, um die Nanaomycine A und B in der Kulturbrühe anzusammeln, von welcher die Nanaomycine A und B gewonnen werden. Dieser Stamm gehört zum Genus Streptomyces. Nanaomycin A ergibt therapeutische Wirkungen bei einigen Infektionskrankheiten, welche durch einen Trichophyton- oder Mycoplasmaparasiten und dergleichen verursacht werden.

Das Nanaomycin A wird auch als OS-3966-A oder als Rosanomycin A bezeichnet

Nanaomycin A ist von bekannten Antibiotica des Chinontyps, wie Frenolicin (Journal of the American Chemical Society, 90 [1968] 1325-1332), Deoxyfrenolicin (US-PS 34 52 051), Kalafungin bzw. Kalamycin (US-PS 36 32 607, US-PS 33 00 382) und Äthylkalafunginat bzw. Äthylkalamycinat (US-PS 35 24 868) in den Eigenschaften stark unterschieden.

Nanaomycin A hemmt das Wachstum von gram-positiven Bakterien wie beispielsweise Staphylococcus aureus bei einer Konzentration von 2,0 bis 8,0 μg/ml und bei einer Konzentration von nicht mehr als 3,1 μg/mI das Wachstum verschiedener Pilze einiger Spezies, wiche zum Genus Trichophyton gehören. Außerdem hat Nanaomycin A eine starke Aktivität auf Mycoplasma; beispielsweise wurde das Wachstum von Mycoplasma gallisepticum durch Nanaomycin A be«, einer Konzentration von nicht mehr als 0,1 pg/ml verzögert. Außerdem wurde eine starke antimikrobiell Aktivität von Nanaomycin A auf ein Spiramycin-resistentes Mycoplasma gallisepticum beobachtet.

Eine ausgezeichnete therapeutische Wirkung wird durch Nanaomycin A bei verschiedenen Infektionskrankheiten erreicht, welche durch das Vorhandensein eines Parasiten des Genus Trichophyton im Körper von Tieren verursacht v-ird. Wenn durch Trichophyton metagrophytes verursachte Dermatomycosis am Rükken von Guineaschweinen mit einer Lösung von 0,01 — 1% Nanaomycin A gelöst in Propylen Glycol-Äthanol (3:1, v/v) einmal täglich 8 Tage hintereinander behandelt wird, zeigt sich eine ausgezeichnete therapeutische Wirkung bei der Hautrötung und den Schuppen. Nanaomycin A hat außerdem eine therapeutische Wirkung bei verschiedenen Erkrankungen des Menschen und der Tiere; es wurde seine therapeutische Wirkung bei einer chronischen Erkrankung der Atmungswege bei Küken, verursacht durch Mycoplasma gallisepticum, festgestellt.

Die Wirkung von Nanaomycin A wurde gegenüber Dermatomycose, die bei Rindern durch Masseninfektion von Trichophyton veruucosum verursacht worden war, geprüft. Das Nanaomycin A wurde in Olivenöl suspendiert und direkt auf die befallenen Stellen aufgetragen, wobei die Schuppen entfernt werden können oder auch belassen bleiben können. Als therapeutisches Kontrollmittel wurde ein zur Bekämpfung der Dermatomycose bei Rindern bekanntes, besonders wirkungsvolles handelsübliches Lösungspräparat (mit 2% Methylenblau als Aktivwirkstoff) verwendet. Die therapeutische Wirkung wurde 4 Wochen hindurch geprüft. Die nach Bestreichen der befallenen Stellen mit den Testsubstanzen nach einmaliger Anwendung bzw. nach einer ersten und einer zweiten, eine Woche später erfolgten Anwendung erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I bzw. 2 angegeben.

Tabelle

Geprüfte Verbindung

I Nanaomycin Λ
Nanaomycin A

0,1

Konz. Probe Ergebnis nach

mg/ml I Woche 2 Wochen .1 Wochen 4 Wochen

Fortsetzung

Geprüfte Verbindung

Konz. Probe Ergebnis nach

mg/ml I Woche 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen

Nanaomycin A Kontrollmittel (handelsüblich) Nanaomycin A Nanaomycin A Nanaomycin A Kontrollmittel (handelsüblich)

10 0,3

0,1

1 10

Tabelle 2

Geprüfte Verbindung	Konz. F
	mg/ml
Nanaomycin A	0,1 1
Nanaomycin A	1 1
Nanaomycin A	10 1
Kontrollmittel	0,3 1
(handelsüblich)
Nanaomycin A	0,1 I
Nanaomycin A	1 1
Nanaomycin A	10 I
Kontrollmittel	0,3
(handelsüblich)

Probe Ergebnis nach

1 Woche 2 Wochen

3 Wochen

4 Wochen

In den obigen Tabellen bedeuten:

I = direkter Auftrag auf die befallene Stelle

II = Auftrag nach Entfernung der Schuppen von der befallenen Stelle

Konz. = Konzentration des Wirkstoffes

+++ = vollständige Entfernung der Schuppen und Gesundung

++ = noch geringe Schuppenbildung

+ = Entfernung eines Teiles der Schuppen

- = keine Schuppenentfernung und keine Gesundung

Das Ergebnis über die Wirkung des Nanaomycins A gegenüber verschiedenen Mikroorganismen ist in der nachfolgenden Tabelle 3 zusammengestellt.

Tabelle 3

Tcsl-Organismcn

Medium*)

Minimale llemmkon/entrationcn

('g/ml) Test-Organismen

Bacillus subtilis PCI 219 N 7,8

Sliiphylococcus aurcus N 3,9

FDA 209 P(JCI)

Sliiphylococcus aurcus N 2,0

FDA 209

Sarcina lutca PCI I(XIi N 2,(!

Myconaclcrium smegmiit'¹» N 62,5

r.scherichiii cnli NIIIJ N 31,3

f'schcrichia coli NIHJ (JC-2) Klebsiclla pneumorvac PCI 602

Salmonella typhimurium Shigella flcxneri
Xiinthomonas oryzae N-5824 Pscudomonab nerughosa Candida albicans
Sacehuromyces sake Aspergillus nigcr ATCC 6275 Aspergillus fumigatur IAM 2612
Piricularia oryzae
Mycrosporum gypseum 704

Medium*)	Minimale
	Hemm·
	kon/cntra
	tioncn
	(!ig/ml)
N	250
N	31.3
N	62,5
N	3 1,3
N	62,5
N	500
P	.'1,2
P	31,2
P	62,5
P	12,5
P	7,8
P	0.8

Fortsetzung

Test-Organismen

Medium*)

Minimale Hcmmkonzcnlra- tionen

Trichophyton

Trichophyton
Trichophyton
Trichophyton
Trichophyton
Trichophyton
Trichophyton
Trichophyton
Trichophyton

asteroides

ferrugineuni

interdigitalc

mentagrophytes

pedis 804

purpureum

roseum

rubrum

schoenleini

Mycoplasina gallisepticum KP-13

Mycoplasma gallisepticum S-6

Mycoplasma gallisepticum 333P (Spiramycin resistant) Mycoplasma gallinarum Mycoplasma iners
Mycoplasma pneumoniae Acholeplasma laidlawii (Λ) PG 8

Acholeplasma laidlawii (B) BmI

P P P P P P P P

Il E II E II E H H E H E II E

1,6

1.6 1,6 0,8 0,2 3,1 0,4 <0,l 0,2

η

< 0,013 0,05

< 0,013 0,10

< 0,013

< 0,013 1,56 3,12 0,013

>25

25

>25

*) Die Abkürzungen bedeuten: N, Nähr-Agar (pH 7,0, 2 Tage. 37 C); P, KartofTel-Agar (pH 6,4, 4 Tage, 27 C); H. Hokken PPLO-Agar (pH 7,8, 8 Tage, 37 C); E, Eiken PPLO-Agar (pH 7,8, 8 Tage, 37 C).

In weiteren Vergleichsversuchen wurde die fungizide Aktivität und die Antimycoplasma-Aktivität von Nanaomycin A gegenüber dem bekannten Deoxyfrenolicin und Äthylkalafunginat (Äthylkalamycinat) geprüft. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 4 bzw. 5 zusammengestellt.

Tabelle 4
Fungizide Aktivität

Test-Organismen

Minimale Hemmkonzentration ■jg/ml

Nanomycin AY Z

Candida albicans	50	50	>100
Saccharomyces sake	12,5	6,3	>100
Aspergillus fumigatus	6,3	6,3	>100
Aspergillus niger	25	>100	>100
Microsporum	0,8	<C,2	>100
gypseum
Trichophyton	0,8	<0,2	>100
asteroides
Trichophyton	0,8	3,1	>100
ferrugineum
Trichophyton	! 6	0,4	>!00
interdigitale
Trichophyton	<0,2	<0,2	>100
rubrum

Minimale llemmkon/cnlralion
yg/ml

Nanomycin AY /.

Trichophyton
schoenleini
Trichophyton
violaseum

<0,2
3,1

<0,2 >100
0,8 >100

Anmerkung:

Die minimale Hemm-Konzentratkin wurde durch die Agar-Dilutionsmethodc (KartofTelagar, pH 6,4, 27 C, 4 Tage) geprüfl.
i'i Y = Dco.xyfrcnolicin.

/ Äthylkalafunginal (Äthylkalamycinat).

T;:bei!e S
Antimycoplasma-Aktivität

Antibioticum	Konzentration	llemmbereich
	(;/.g/ml)	(mm)
Nanaomycin A	10 100	20,4 28,7
Deoxyii'enolicin	10 100	14,6 21,8
in Athylkalafunginat	10 100	0 0

Anmerkung:

Der llemmbereich wurde durch die Papierscheiben-Methode (Eiken PPLO-Agar, pH 7.8. .17 C. 1 Tag) geprüft.

Im Vergleich zu Deoxyfrenolicin besitzt Nanaomycin A etwa die gleiche fungizide Aktivität und ist hierin dem Äthylkalafunginat überlegen.

Das Nanaomycin A stellt ein hellgelbes Pulver mit folgenden physikalischen und chemischen Charakteristiken dar:

1. Gewichtsanalyse in % I
gefunden: C - 63.35; H - 4.47
berechnet: C - 63.57: H - 4,66.

2. Molekulargewicht:

m/e. durch Massespektrum bestimmt, ist 302 084. und der theoretische Wert von m/e für C^HmO₆ ist 302 079.

3. Schmelzpunkt: !78-180⁰C.

4. Spez. Rotation:[«.]? -27,5° (C= 1,0in Methanol).

5. Ultraviolett-Absorptions-Spektrum:

λ £<"' nm (ε): 250 (0385 χ ΙΟ⁴), 274 (1.22 χ ΙΟ⁴). 423(0,404 χ ΙΟ⁴) (Fig. \\

6. Infrarot-Absorptions-Spektnim:

Relativ starke Absorption bei 3150, 2960, 2910, 1725, 1640, 1610, 1450, 1370, 1320, 1270, 1220, 1160 cm-' (durch KBr-Methode)(Fi g. 2).

7. Löslichkeit:

Leicht löslich in Methanol, Äthanol, Äthylacetat. Chloroform, Aceton und Äther, Unlöslich in η-Hexan, Petroläther und Wasser.

8. Farb-Reaktion:

Positiv in den Reaktionen mit Ferrichlorid und

Reduktions-Katalysator ( Fe ig I, N., Anal. Chem., 28, 397 [1956]). Negativ in Ninhydrin-Reaktion, Sakaguchi-Reaktion, Ehrlich-Reaktion, Fchling-Reaktion und Molish-Reaktion.

Der aus einer Bodenprobe in Nanao-shi auf der Halbinsel Noto, Japan, isolierte Mikroorganismus Strejj'.omyces rosa var. notoensis, der uneingeschränkt beim Fermentation Research Institute in Chiba-shi, Japan, unter FERM-P No. 2209 (und bei der American Type ("ubture Collection in Rockville, Maryland, USA. unter ATCC No. 31135) hinterlegt worden ist, besitzt folgende biologische Eigenschaften:

in

1. Morphologische Charakteristiken:

Bildung von Mycel vollständig an der Luft sowohl auf einem synthetischen als auch auf einem natürlichen Agar-Agar-Medium, deren Beendigung unter Bildung einer massiven oder unregelmäßigen Spirale erfolgt. Konidienträger, gebildet auf dem belüfteten Mycel. Die Konidiensporen sind oval (0,6—1,0 μ) und in einer Kette von IO oder mehr. Die Sporen haben glatte Oberflächen.

2. Kultur-Charakteristiken:

Die Kultur-Charakteristiken sind in der nachfolgenden Tabelle 6 wiedergegeben:

Tabelle 6

Kultur-Charaklcrisliken von S. rosa var. notoensis FERM-P No. 2709

Warhstum

Sacchamscnitrat-Agar

(ilukoscnitrat-Agar

Glycerin-Asparagin-A gar

Anorganische Salze
Stärk.-Agar

Tyrosin-Agar

gut, leicht clfenbcin bis leicht melonengclh

gut, stäubig gelb bis goldbraun

gut. leicht melonengclb bis orangerostfarben

mittelmäßig, leicht mclonengelb

gut, leicht weizenbis bernstein-topasfarben

Nährstoff-Agar mittelmäßig, farblos

bis perl rosafarben

Glukose-Pepton-Agar mittelmäßig, farblos

bis goldbraun

Hefe-Extrakt-Malz- gut, farblos bis Extrakt-Agar goldbraun

Hafcrmehl-Agar mittelmäßig, farblos

bis leicht melonenfarbig

Pepton-Hefe-Extrakt- mittelmäßig, creme Eisen-Agar bis leicht weizen-

farben

Trypton-Hefe-Extrakt-Oberflächenwachs-Brühe turn, mittelmäßig,

schwach elfenbeinfarben

Milch
Gelatine

Nitratbrühe

Cellulose

leicht melonengelb bis apricotfarben

goldbraun bis schokoladenbraun

apricotfarben

perl rosafarben bis goldbraun

leicht melonengelb bis lohfarben

fruchtsaftgelb bis hellgelb

goldbraun bis sepiabraun

goldbraun bis orange-rostfarben

leicht melonengelb bis lohfarben

kolonialgelb

schwach elfenbeinfarben leicht apricotfarben

weiß bis perlrosa
leicht apricotfarben

weiß bis fleischrosa

leicht melonengelb
bis perlrosa

weiß, schwach
weiß

leicht melonengelb
bis leicht apricotfarben

kärglich, weiß bis
kolonialgelb

weiß

perlrosa bis leicht melonengelb

leicht weizen- bis sepiabraun

melonengelb bis apricotfarben

dunkel kofferlohfarben bis sepiabraun

leicht weizen- bis melonengelb

nichts

efeu- bis dunkellorbeerfarben

efeufarben

schwach lohfarben

nichts

perlrosafarben	perlrosafarben bis	nichts	leicht apricotfarben
	CiiärtrCüSciärbCil		bis perlrosa
Oberflächenwachs-	schwach elfenbein	weiß bis meergrün	lorbeerfarben
iiirn, giii	farben	grau
Oberflächenwachs	nichts	weiß	nichts
tum, mittelmäßig
nichts	nichts	nichts

3. Physiologische Charakteristiken: Wachstumstemperatur: 15—45°C, Verflüssigung der Gelatinierung: positiv, Hydrolysierung der Stärke: positiv. Coagulierung von Magermilch: positiv,

Peptonisierung von Magermilch: positiv,
Bildung von Melanoid-Pigment: negativ.
Bildung von Tyrosinase: negativ,

Reduktion von Nitrat: positiv,

Bildung von Schwefelwasserstoff: negativ,

Zersetzung von Cellulose: negativ.

4. Verwendbarkeit von verschiedenen
Kohlenstoffqnellen:

Arabinose, Xylose, Glukose, Fruktose, Rhamnose, Mannit, Glycerin, Maltose und Mannose können brauchbar sein, während Saccharose, Innosit und Raffinose unbrauchbar sein können.

Die mikrobiologischen Charakteristiken dieses Stammes sind zusammengefaßt die folgenden:

Conidiophore sind spiralförmig und Conidiospore sind glatt. Das Wachstum auf synthetischem Medium ist gefärbt in gelblichgrau oder orangegrau oder rötlichbraun, und das gebildete belüftete Mycel ist in weiß oder orangegrau oder rosa gefärbt. Es ist ein lösliches Pigment gebildet, das in gelblichbraun oder stark röthchbraun gefärbt ist. Wenn ein organisches Medium verwendet wird, ist der Zuwachs im allgemeinen farblos oder in orangegrau oder braun gefärbt, und das gebildete Mycel ist in weiß oder orangegrau oder rosa gefärbt. Oftmals wird das lösliche Pigment nicht gebildet, während ein grünlich graues oder gräulich schwarzes Pigment in einigen Medien gebildet wird. Dieser Stamm ist nicht chromogen und hat eine relativ hohe Aktivität in Hinsicht auf die Zersetzung von Protein und Stärke.

Eine Untersuchung an Stämmen, die analoge Charakteristiken zu dem verwendeten Stamm haben [vergl. S. A. Waksman »The Actinomycetes«. Bd. 2 (1961) und E. B. Shirling.D. Gottlieb »Cooperative Description of Type Strains of Streptomyces« in »International Journal of Systematic Bacteriology«, Bd. 18, No. 2, S. 69-189 (1968); Bd. 18, No. 4, S. 279-392 (1969); Bd. 19, No. 4, S. 391 -512 (1969) und Bd. 22. No. 4, S. 265-394 (1972)], hat einige Spezies ergeben, die als »fradiae« bezeichnet wurden, z. B. Streptomyces fradiae, Streptomyces luridus, Streptomyces roseus, Streptomyces fuscus, Streptomyces roseoluteus und Streptomyces rosa. Unter diesen sind Streptomyces roseoluteus und Streptomyces rosa fast analog. Jedoch ist einerseits Streptomyces roseoluteus von dem Nanaomycin-produzierenden Stamm unterscheidbar, weil die Farbe an der Rückseite von der Streptomyces roseoluteus-Kolonie gelblichorange bis gelb wird, z. B. in Medien, die aus Hefeextrakt-Malzextrakt, Hafermehl-Agar, sowohl anorganischem Stärke-Agar, als auch Glycerin-Asparagin-Agar bestehen, unter gleichzeitiger Bildung eines gelblichen, löslichen Pigmentes. Andererseits ist Sirentomyces rosa im allgemeinen gleich dem Nanaomycinproduzierenden Stamm mit der Abweichung, daß die Produktion an löslichem Pigment in Medien, die z. B. aus Hefe-Extrakt-Malz-Extrakt-Agar, Glukose-Pepton-Agar bestehen, eintritt und daß die Reduktion des Nitrats im Falle von Streptomyces rosa nicht zu beobachten ist. Der Nanaomycin-produzierende Stamm ist für eine Variante von Strcptornyces rosa zu halten. Dieser Stamm wird daher als Streptomyces rosa var. notoensis bezeichnet.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Antibiotica Nanaomycin A und Nanaomycin B ist dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Streptomyces rosa var. notoensis FERM-P No. 2209 in einem üblichen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, un'er aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 15—40⁰C und einer-, r>H von 6—10 züchtet und anschließend die gebildeten AntibioMca aus der Kultur abtrennt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird gleichzeitig das Nanaomycin A der oben angegebenen Formel und das Nanaomycin B der Formel

ί ί ti Λ ,,,,

COOH

gebildet. Dieses Nanaomycin B. welches einen Schmelzpunkt von 84 —86°C und eine akute Toxizität (LD*», ip) auf Mäuse von 169 mg/kg besitzt, wird aufgrund seiner im übrigen dem Nanaomycin A sehr ähnlichen Eigenschaften zu demselben Zweck wie das Nanaomycin A verwendet.

Für das erfindungsgemäße Verfahren kann ein zum Züchten eines Mikroorganismus übliches Kulturmedium verwendet werden. Vorzugsweise wird ein flüssiges Medium verwendet, aber auch ein festes Medium ist verwendbar. Die Fermentierung wird aerob unter Schütteln und/oder getauchten Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 15 und 40°C und einem dargestellten pH-Wert von 6— IO etwa 2 — 8 Tage lang durchgeführt. Als Nährmedium eignet sich ein übliches synthetisches oder organisches Medium mit üblichen als Kohlenstoffquelle und .Stickstoffquelle zu verwendenden Stoffen und üblichen anorganischen Nährstoffen. Als Kohlenstoffquellen eignen sich z. B. Glukose. Glycerine, Fruktose, Maltose, Mannit, Xylose, Galaktose, Laktose. Ribose, Stärke und Stärke-hydrolysat. Die Konzentration der Kohlenstoffquelle ist vorzugsweise 0.5 — 5,0% (wenn als Glukose berechnet), bezogen auf das Medium. Auch organische Säuren, wie Glukonsäure. Brenztraubensäure. Milchsäure, Essigsäure und Aminosäuren, wie Glykokoll. Glutaminosäurc, Alan η können verwendet werden. Als Stickstoffquelle eignen sich z. B. Ammoniak, verschiedene anorganische und organische Ammonsalze. wie Ammonchlorid. Ammonphosphat. Ammonsulfat. Ammonnitrat: stickstoffhaltige organische Materialien, wie Harnstoff, Pepton. Fleischextrakt. Trockenhefe. Hefeextrakt. Maiswasser. Caseinhydrolysat. Fischmehl, ein daraus extrahiertes Produkt. Sojabohnenmehl, daraus digerierte Produkte, entfettete Sojabohnen, deren digerierte Produkte, insektenlarven-Hydrolysat: und Aminosäuren, wie Glykokoll. Glutaminsäure. Alanin.

Dem Nährmedium können als anorganische Substanzen z. B. verschiedene Phosphate, Magnesiumsulfat zugegeben werden. Falls gewünscht, können Spuren eines Schwennetallsalzes zugesetzt werden, jedoch ist das nicht immer wesentlich, sofern das verwendete Medium natürliche Materialien enthält.

Man arbeitet im allgemeinen wie nachstehend beschrieben.

Ein entsprechendes Kulturmedium (100 ml) wird in eine 500ml Sakaguchi-Flasche eingefüllt und bei einer Temperatur von 120⁰C 15 Minuten sterilisiert. Anschließend wird das sterilisierte Medium mit Sporen und/oder iem Mycel von Streptomyces rosa var. notoensis FERM-P No. 2209 geimpft und die Fermentierung unter Schütteln (110 U/Min.) bei einer Temperatur von 27"C während einer ausreichenden Zeitspanne von beispiels-

weise 3 Tagen durchgeführt, wobei sich große Mengen von Nanaomycin A und B in der Kulturbrühe bilden.

Man kann auch ein entsprechendes Kulturmedium (20 I) in einen 30-l-Fermenter einfüllen und bei einer Temperatur von 120⁰C 15 Minuten lang sterilisieren. Anschließend wird mit dem betreffenden Mikroorganismus beimpft und die Fermentierung bei einer Temperatur von 27°C 3 Tage unter Schütteln (300 U/Min.) und Belüftung (10 l/Min.) durchgeführt. Bevorzugt wird auch ein entsprechendes Kulturmedium (2001) in einem Tank-Fermenter (Fassungsvermögen 4001) bei einer Temperatur von 27"C 3 Tilge unter Schütteln (200 U/Min.) und Belüftung (100 l/Min.) fermenliert. Gute Resuliate können in allen Fällen erzielt werden, wenn als Kohlenstoff bzw. Stickstoffquelle Glycerin und Sojabohnenmehl verwendet werden. Besonders vorteilhaft ist ein Medium mit 2,0% Glycerin, 2,0% Sojabohnenmehl und 0,3% NaCl mit einem pH-Wert

y ei wci'iuiii'ig cii'tcS SuiCmcm ivicuiümS

wurde nach einer 70stündigen Züchtung bei einer Temperatur \on 27"C in einem Tank-Fermenter bei einer Probe der obenstehenden Flüssigkeit, die einen pH-Wert von 5,2 aufwies, eine Hemmzone von 30 mm Durchmesser gegenüber dem Mikroorganismus Mycoplasma gallisepticum KP-13 festgestellt. Sowohl in den fermentierten Flüssigkeiten als auch in den fermentierten Feststoffen sind Nanaotrnnn A und B zu finden, jedoch enthält die fermentierte Flüssigkeit gewöhnlich größere Mengen an Nanaomycn A und B als die fe-mentierten Feststoffe.

Testverfahren für Nanaomycin A und B

Das in der Fermentationsflüssigkeit gebildete Nanaomycin A und B wird beispielsweise durch die Papierscheiben-Methode geprüft, welche von Itoh und Mitarbeitern im journal of Antibiotics, 24, Seite 885-859(l97l)beschriebenwird.

Zur Isolierung von Nanaomycin A und B nach beendeter Fermentierung aus der Kulturbrühe wird die Brühe in die feste und die flüssige Phase in üblicher Weise z. B. durch Fillrierung, Zentrifugierung getrennt. Die flüssige Phase, d. h. das Filtrat wird z. B. mit Salzsäure auf einen sauren pH-Wert von vorzugsweise 2 bis 4 eingestellt, welches dann der Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel wie Äthylacetat oder Butylacetat unterworfen wird. Danach werden Nanaomycin A und B durch Reinigung der extrahierten Substanz auf übliche Weise erhalten. Man kann auch Nanaomycin A und B von der extrahierten Lösung in alkalischem Zustande isolieren, jedoch soll ein übermäßig hoher pH-Wert vermieden werden, da Nanaomycin B in Nanaomycin A in alkalischem Zustande umgewandelt wird. Um aus dem Extrakt sehr schnell Nanaomycin A und B zu eluieren, wird beispielsweise eine l%ige wäßrige Natriumbicarbonatlösung verwendet. Unmittelbar danach wird das Nanaomycin A und B enthaltende Eluat beispielsweise mit Salzsäure auf einen sauren pH-Wert eingestellt und dann die wäßrige Lösung mit einem organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat oder Butylacetat, extrahiert. Der erhaltene Extrakt wird zur Trockne konzentriert, wobei Nanaomycin A und B als Rohpulver erhalten wird, welches dann der Säulen-Chromatographie unter Verwendung von Silikagel unterworfen wird. Das Rohpulver wird zuerst mit einem Lösungsmittelgemisch von Benzol-Äthylacetat (4:1, v/v) entwickelt, wobei die das Nanaomycin A enthaltenden Fraktionen eluiert werden, und dann wird mit einem l.ösungsmittelgemisch von Benzol-Äthylacetat (3 :1, v/v) entwickelt, wobei die das Nanaomycin B enthaltenden Fraktionen eluiert werden. Die jeweils erhaltenen Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne konzentriert. Das Nanaomycin A enthal- > tende Trockenmaterial wird in Äthanol gelöst, dem dann eine geringe Menge an Wasser zugesetzt wird, wobei Kristallnadeln von Nanaomycin A ausfallen. Das Nanaomycin B kann auch in gleicher Weise aus den das Nanaomycin B enthaltenden Fraktionen erhalten ίο werden, wobei das entsprechende Trockenmaterial durch Silikagel-Säulenchromatographie gereinigt wird, und bei der in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben unter Verwendung von Benzol-Äthylacetat (2 : 1. v/v) als Elutionsmittel gearbeitet wird.

Beispiel I
Auf einer schrägen Kultur wurde mit Hilfe einer

r liiuFiCSc CiWäS VoH uCiTi οιαΓΠΓΠ otrCpiGiTiyCCS rOSu VSr.

:n notoensis FERM-P No. 2209 entnommen und damit ein Saatmedium beimpft, welches 2,0% Glycerol, 2,0% Sojabohnenmehl und 0,3% NaCl enthielt und auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt sowie 15 Minuten bei 120⁰C sterilisiert worden war. Das beimpfte Saatmedium

_'ΐ wurde dann 2 Tage bei 27"C und einem pH von 7 gezüchtet. Die anfallende Saatkultur wurde weiter in einer Menge von 1% auf ein Medium (201) geimpft, welches sich in einem 30-1-Fermenter-Gefäß befand und ebenfalls 2,0% Glycerol, 2,0% Sojabohnenmehl und 0,3% NaCI enthielt und auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt sowie 15 Minuten bei 120"C sterilisiert worden war. Dann wurde der Mikroorganismus 4 Tage bei 27°C unter Belüftung (10 l/Min.) und Rühren (300 U/Min.) gezüchtet. Nach Abschluß der Fermentierung betrug der pH-Wert der Kulturbrühe 4,8. Eine Probe der obenstehenden Schicht der Brühe ergab bei der Prüfung gegen Mycoplasma gallisepticum eine Hemmzone von 30 mm Durchmesser. Die Brühe (20 1) wurde zur Entfernung de? Mycel zentrifugiert, das Filtrat mit 6 η HCI auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und dann mit 4 I Butylacetat extrahiert. Der Butylacetatextrakt wurde nun mit 800 ml l%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die wäßrire Lösung wurde dann mit 6 η HCI auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und mit 160 ml Äthylacetat extrahiert. Dieser Extrakt wurde konzentriert und mit 30 m! Petroläther versetzt, wobei ein gelbbraunes Pulver (1,09 g) ausfiel. Das erhaltene Pulver wurde anschließend auf folgende Weise gereinigt.

Das Rohpulver, das Nanaomycin A und B enthielt, wurde in Äthylacetat (15 ml) gelöst, mit Silikagel (4 g) versetzt und im Vacuum getrocknet. Dann wurde das getrocknete Material in eine mit SÜikagel (55 g) vollgepackte Säule eingegeben und mit einem l.ösungsmittelgemisch aus Benzol-Äthylacetat (4 : 1, v/v)entwikkelt. Das Eluat wurde in einzelne Fraktionen von jeweils 15 ml aufgeteilt Jede Fraktion wurde nach der bereits erwähnten Papierscheibenmethode unter Verwendung von Mycoplasma gallisepticum KP-13 als Test Mikroorganismus geprüft. Der erste Teil des Eluats, und /war die Proben 8 bis 22 der Fraktionen enthielten Nanaomycin

A, wobei die Probe 14 Aktivität gegen den Test-Mikroorganisinus aufwies. Für die Fraktionen nach der Probe 30 wurde als Lösungsmittelgemisch zur Edition ein solches von Benzol-Äthylacetat (3:1, v/v) verwendet. Die Fraktionen 32 bis 60 enthielten das Nanaomycin

B, wobei die Aktivität der Nummer 46 gegenüber dem Tesi-Mikroorsanismus am höchsten war.

Die Fraktionen 8 bis 22 wurden vereinigt und im Vacuum getrocknet Der erhaltene Rückstand wurde in Äthanol gelöst und dann mit einer geringen Menge Wasser versetzt, wobei gelbe Kristallnadeln (31,7 mg) erhalten wurden. Die Kristalle wurden aus Äthanol unter Zugabe einer geringen Menge an Wasser umkristallisiert Man erhielt 253 mg gereinigtes Nanaomycin A mit einem Reinheitsgrad von über 99% und einem Schmelzpunkt von 178—180⁰C

Das UV-Absorptions-Spektrum der Verbindung ist in F i g. 1 dargestellt

λ iü,\^OH nm: 250,274 und 423

Das IR-Absorpt'.ons-Spektrum (KBr-Methode) der Verbindung ist in F i g. 2 dargestellt

Charakteristisch starke Absorption bei
1725.1640 und 1610 cm-'

Die Fraktionen 32 bis 60 wurden vereinigt und im Vacuum getrocknet, wobei ein blaßgelbes Pulver (450 mg) erhalten wurde. Das Pulver wurde weiter mittels Säulenchiomatographie an Silikage! i.nd unter Verwendung von Benzol-Äthylacetat (3:1, v/v) als Elütionsmiuel gereinigt Man erhielt 270 mg gereinigtes Nanaomycin B als Pulver mit einem Reinheitsgrad von 99% und einem Schmelzpunkt von 84-86°C.

UV-Absorptions-Spektrum der Verbindung:
λ UL'.⁰" nm: 23} und 352

IR-Absorptions-Spektrum (KBr-Methode) der Verbindung:

Charakteristich starke Absorption bei
1705,1648 und 1605 cm-'.

Beispiel 2

ίο Dem gemäß Beispiel 1 durch Zentrifugieren der Kulturbrühe erhaltenen Mycel wurden 5 Liter Äthylacetat unter Rühren zugesetzt Der erhaltene Extrakt wurde mit 2 Liter 1 %iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung (21) versetzt die wäßrige Schicht abgetrennt und diese mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,C eingestellt Dann wurde sie mit 500 ml Äthylacetai extrahiert und der Extrakt im Vacuum getrocknet Mar erhielt 521 mg eines gelbbraunen pulvrigen Rohproduktes, das wie im Beispiel 1 der Silikagel-Säulenchromatographie unterworfen wurde. Man erhielt die folgender Ergebnisse:

Ausbeute Schmelzpunkt Reinheitsgrad

Nanaomycin
Nanaomycin B

13 mg 85 mg

173-175 C
82- 84 C

95% 92%

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche;
1. Nanaomycin A der Formel
CH₃ H

IO

COOH

H O

H H

H H

15