DE2833689A1 - Antibiotikum c-14482 a tief 1 und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Description

VON KREISLER SCHÖNWALD MEYER EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING

PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler + 1973

Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selling, Köln

5 KÖLN 1

DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF

1. August 1978 AvK/Ax

Takeda Chemical Industries, Ltd.

27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka, Japan

Antibiotikum C-14482 A₁
und Verfahren zu seiner Herstellung

90980 7/0928

Telefon: 102 21) 2345 41 - 4 Telex: 8882307 dopa d · Telegramm: Dompatent Köln

2833683

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum mit der Bezeichnung C-14482 A,. (nachstehend zuweilen kurz als C-14482 A₁ bezeichnet) und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Von der Anmelderin wurden Proben aus der Natur einschließlich einer großen Zahl verschiedener Bodenproben entnommen, und die von diesen Proben isolierten Mikroorganismen wurden einer Auswahluntersuchung bezüglich der von ihnen gebildeten Antibiotika unterworfen. Die Untersuchungsarbeit führte zu der Feststellung, daß ein bestimmter Mikroorganismus ein neues Antibiotikum zu bilden vermag, daß dieser Mikroorganismus zur Gattung Nocardia gehört und daß durch Kultivieren dieses Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium unter geregelten Fermentationsbedingungen dieses Antibiotikum im Kulturmedium angereichert wird. Auf diese Feststellungen folgte weitere Forschungsarbeit, die in der vorliegenden Erfindung gipfelte.

Die Erfindung ist demgemäß auf die folgenden Gegenstände gerichtet:

1) Das Antibiotikum C-14482 A. mit den folgenden Kennzahlen :

I) Elementaranalyse (%)

II) Schmelzpunkt: nicht weniger als 300⁰C

III) Spezifische Drehung:

r„i²⁴·- 4- 150°+ 30° Cc=O.05, Äthanol)

9 0 S ? Ί 7 / 0 9 2

C	58	,02	59,	18
H	5	,84	5,	70
N	16	,32	17,	14

-X-

IV) UV-Absorptionsspektrum:

I ^Me0H (E^ ) 214 nm ± 2 (505 ± 50) max ^v lern

j MeOH _fE19T ν 281 nm ± 2 (209 ± 10) ^A max ^v lcm^y

j MeOH /_El°/ ν 4₉₈ nm ± 2 (46.0 ± 5) ^Λ max lcnr

V) Infrarötabsorptionsspektrum (KBr): Hauptpeaks (cm ):

343Ο, 3175, 2940, 2890, 2850, 1680, Ι65Ο, 1625, 1600, 1455, I39O, I345, I25O, II70, 1140, 1110, 1075, 1025, 995, 935, 910, 825

VI) Löslichkeit:

Praktisch unlöslich: Hexan, Petroläther Schwerlöslich: Äthanol, Butanol, Äthylacetat,

Wasser.
Löslich: Methanol, Chloroform.

VII) Farbreaktionen:

Negativ: Sakaguchi-Reaktion, Barton-Reaktion. Kaliumpermanganat entfärbt.

VIII) Acidität, Neutralität oder Basizität: schwachbasisch .

IX) Farbe der Kristalle: dunkelrot bis rötlichbraun

X) Molekulargewicht: 460

(gemessen durch Dampfdruckosmometrie in ChUCOOCpHp.)

2) Die Herstellung von Antibiotikum C-14482 A^ nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen zur Gattung Nocardia gehörenden Mikroorganismus, der das Antibiotikum C-14482 A^ zu bilden vermag, in einem Nährmedium kultiviert.und hierdurch das Antibiotikum im Kulturmedium bildet und anreichert

90Ö'^: -V/0928

-K-

und das Antibiotikum isoliert.

3) Eine im wesentlichen reine Kultur des zur Gattung Nocardia gehörenden Mikroorganismus mit den Charakteristiken, die mit denen des Mikroorganismus ATCC-31309 identifizierbar sind, wobei diese Kultur in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen und verwertbare Stickstoffquellen enthält, eine gewinnbare Menge des Antibiotikums C-14482 A. zu bilden vermag.

Beim Verfahren zur Herstellung von Antibiotikum C-14482 A₁ können alle Mikroorganismen, die zur Gattung Nocardia gehören und das Antibiotikum C-14482 A. zu bilden vermögen, verwendet werden. In der vorliegenden Beschreibung werden diese Mikroorganismen im ganzen kurz als C-14482 A.-bildender Stamm bezeichnet.

Als typisches Beispiel der Mikroorganismen, die für das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung von Antibiotikum C-14482 A. verwendbar sind, ist der Stamm C-14482, der von der Anmelderin im Rahmen der Suche nach Antibiotikumbildnern isoliert wurde, zu nennen.

Die mikrobiologischen Merkmale des Stamms C-14482 wurden nach Methoden untersucht, die den von Schirling und Gottlieb (International Journal of Systematic Bacteriology 16 (1966) 313-340) beschriebenen Methoden analog sind. Die Kultivierung des Mikroorganismus während einer Zeit von 21 Tagen bei 28°C hatte die folgenden Ergebnisse:

1) Morphologische Eigenschaften

Das vegetative Mycel ist farblos bis blaßgelb oder orangegelb und entwickelt sich gut mit Verzweigungen sowohl auf Agar als auch in flüssigen Medien.

Das vegetative Mycel hat zum größten Teil einen Durch-

8 0 8 8 ,-7/0928

messer von 0,5 bis 1,2 um und teilt sich in den spaten Phasen der Kultivierung in Fragmente, die stäbchenförmigen Bakterien oder langgestreckten stäbchenförmigen Bakterien oder verzweigten Hyphen ähneln. Dieser Stamm zeigt gutes Wachstum auf verschiedenen taxonomischen Medien. Während das Luftmycel sich auf dem vegetativen Mycel gut entwickelt, zeigt das erstere in vielen Fallen ein Aussehen, als wäre es auf einer großen Zahl von coremia-artigen Körpern (50 bis 180 um χ 400 bis 1500 um) gewachsen. Ein großer Teil der Lufthyphen ist gewunden oder gerade, wobei in wenigen Fällen eine lose spiralförmige Gestalt oder Verzweigung festzustellen ist. Die Untersuchung gealterter Kulturen unter dem Mikroskop zeigt, daß die Sporen nur in wenigen Fällen in Ketten auftreten und nur wenig sog. Konidien oder Sporen vorhanden sind. Die Untersuchung von Zellen, die von der Oberfläche einer solchen Kultur entnommen wurden, unter dem Mikroskop zeigt die Anwesenheit vieler langgestreckter elliptischer Zellen (0,5-1,2 ,um χ 4,8-6,8 um) und elliptischer Zellen (0,8-1,2 um χ 1,5-4 um), die wie fragmentierte Zellen oder Arthrosporen aussahen und deren Oberflächen bei der Untersuchung durch Elektronenmikroskopie glatt waren.

Das Luftmycel ist im allgemeinen spärlich. Zwar wird ziemlich gutes Wachstum auf vielen Medien während einer Bebrütung für 3 bis 7 Tage festgestellt, jedoch verschwindet es zuweilen, wenn die Kultivierung 7 bis 10 Tage durchgeführt wird.

Bei der Kultivierung in flüssigen Medien zeigt der Mikro-Organismus Motilität in einer Wachstumsphase, wenn das Mycel Polymorphismus, d.h. die Form von Stäbchen, verzweigten Zellen oder langgestreckten Stäbchen, die entweder unabhängig als solche, in Ketten oder verzweigt vorliegen, zeigt. Die Untersuchung im Elektronenmikroskop ergibt eine große Zahl von langgestreckten Geißeln rings um die Zellen.

9 0 9 8 11 7 / Ö"9 2 8

_ Jf-_

2) Bestandteile der Zellen

Der Stamm wurde in modifiziertem ISP-Medium Nr. 1 66 bis 90 Stunden in der Schüttelkultur bei 28⁰C kultiviert. In der stationären Phase guten Wachstums wurden die Zellen abgetrennt und gespült. Sie wurden nach der Methode von B.Becker und Mitarbeitern (Applied Microbiology 12 (1964) 421) und nach der Methode von M.P. Lechevalier (Journal of Laboratory und Clinical Medicin 71 (1968) 934 auf Diaminopimelinsäure und Zuckerzusammensetzung untersucht. Es wurde festgestellt, daß die erstere in der meso-Form vorlag, während hinsichtlich der letzteren örtlich begrenzte Stellen, die Galactose und Arabinose entsprachen, festgestellt wurden. Nach der Methode von B.Becker und Mitarbeitern (Applied Microbiology 17 (1965) 236) wurden Zellwände isoliert und auf Diaminopimelinsäure, Zucker und Aminosäuren analysiert. Die Diaminopimelinsäure wurde in ihrer meso-Form festgestellt. Während jedoch eine große Menge Galactose als Zuckerbestandteil nachgewiesen wurde, wurde Arabinose nicht nachgewiesen. Als Aminosäuren wurden Glutaminsäure und Alanin eindeutig nachgewiesen, während Lysin und Glycin nur in Spuren gefunden werden konnten.

3) Kulturmerkmale auf taxonomischen Medien

Der Stamm zeigt stets verhältnismäßig gutes Wachstum auf verschiedenen Medien, wobei das vegetative Mycel in den Anfangsphasen der Kultur farblos bis blaßgelb und in den späteren Phasen blaßgelblichbraun (pale yellowish brow?B^S bis gelbbraun (yellow b^BwnO ist. Der Mikroorganismus bildet in den meisten taxonomischen Medien keine löslichen Pigmente, jedoch in einigen wenigen Medien ein schwachbraunes Pigment. Das Luftmycel ist mehlähnlich (powdery), im allgemeinen mäßig (moderate) und weiß bis gelb oder blaßgelblichbraun. Auf vielen Medien verschwindet das Luftmycel bei längerer Kultivierung (etwa 2 Wo-

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chen oder länger), wobei die Oberfläche des vegetativen Mycels glänzend zu werden beginnt. Die Kulturmerkmale dieses speziellen Stammes sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.

Tabelle 1

Kulturmerkmale des Stamms C-14482 auf taxonomischen Medien

A) Saccharosenitratagar

Wachstum (W): schlecht, dünn, farblos Luftmycel (LM): spärlich, weiß Lösliches Pigment (LP): nicht vorhanden

B) Glucosenitratagar

W: schlecht, dünn, farblos
LM: sehr spärlich, weiß
LP: nicht vorhanden

C) Glycerinnitratagar

W: mäßig, farblos bis Lt Melon Yellow oder Colonial Yellow Maize (3 ea oder 2 ga)* oder Brite Melon Yellow (3 ia)·; Bildung von coremiaartigen Körpern.

LM: sehr spärlich, weiß bis Lt Melon Yellow (3 ea)· LP: nicht vorhanden.

D) Glucose-Asparaginagar

W: mäßig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)* LM: spärlich, Lt Melon Yellow (3 ea)* LP: nicht vorhanden

E) Glycerin-Asparaginagar

W: mäßig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)· LM: mäßig, weiß bis Lt Wheat (2 ea)* LP: nicht vorhanden

F) Nähragar

W: mäßig, farblos bis Lt Ivory (2 ca)* oder Melon Yellow ( 3 ga)*

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AO

LM: nicht vorhanden
LP: nicht vorhanden

G) Calciummalatagar

W: mäßig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)* oder Brite Marigold (3 pa)*; Bildung von coremia-

artigen Körpern
LM: mäßig, weiß
LP: nicht vorhanden

H) Hefeextrakt-Malzextraktagar

W: üppig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)* oder

Brite Maize (3 la)*; Bildung von coremia-artigen Körpern.
LM: mäßig, weiß bis Pearl Pink (3 ca)* oder Lt Melon Yellow (3 ea)·
LP: blaßgelblichbraun

I) Hafermehl-Agar

W: mäßig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)· oder

Lt Ivory (2 ca)·

LM: mäßig, weiß bis Lt Melon Yellow (3 ea)· oder Pearl Pink (3 ca)*

LP: nicht vorhanden oder blaßgelblichbraun

J) Stärkeagar

W: mäßig, farblos bis Melon Yellow oder Colonial

Yellow Maize (3 ga oder 2 ga)· LM: spärlich, weiß bis Lt Melon Yellow (3 ea)· LP: nicht vorhanden

K) Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar

W: mäßig, farblos bis Beige Brown (3 ig)· oder

Brite Maize (3 la)·

LM: nicht vorhanden oder spärlich, weiß LP: blaßgelblichbraun .

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L) Tyrosin-Agar

W: mäßig, farblos bis Beige Brown (3 ig)· oder Brite Maize (3 la)·; Bildung von coremia-artigen Körpern
LM: spärlich, Pearl Pink (3 ca)· oder Brite Maize

(3 la)·
LP: hellgelblichbraun (mit einem Hauch von Purpur)

•Die Farbbzeichnungen entsprechen dem Color Harmony Manual, 4.Auflage (Container Corporation of America 1958).

4) Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften des Stamms sind in Tabelle 2 genannt. Temperaturbereich für das Wachstum: 12° bis 38°C. Der Temperaturbereich, in dem Wachstum des Luftmycels auf Agar (ISP Nr.2) stattfindet, ist 20 bis 35°C.

Tabelle 2 Physiologische Eigenschaften des Stamms C-14482

Wachstumstemperaturbereich 12 bis 38⁰C

Temperaturbereich für das Wachstum des

Luftmycels 20 bis 35°C

Verflüssigung von Gelatine sehr schwach

Hydrolyse von Stärke positiv

Reduktion von Nitraten positiv

Peptonisierung von Milch positiv

Gerinnung von Milch negativ

Zersetzung von Casein positiv

Bildung von schwarzen Pigmenten:
(Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar) negativ

(Tyrosinagar) negativ

Zersetzung von Tyrosin positiv

Zersetzung von Xanthin negativ

Zersetzung von Hypoxanthin negativ

Verträglichkeit mit Lysozym positiv

Verträglichkeit mit Natriumchlorid 2%

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5) Verwertung verschiedener Kohlenstoffquellen

Die Verwertung verschiedener Kohlenstoffquellen wurde nach der Methode von Pridham und Gottlieb (Journal of Bacteriology 56 (1948) 107) mit einem Basalmedium der gleichen Zusammensetzung plus 0,1% Hefeextrakt (Difco Co.) untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle genannt.

Tabelle 3 Verwertung von Kohlenstoffquellen durch den Stamm C-14482

Kohlenstoffquelle Wachstum

!»-Xylose ■ + ++*

L-Arabinose - +

_L_-Glucose + +- -m-

L-Galactose ++ ++

1,-Fructose +++

Jj-Ehamnose ++ +

!■-Mannose ++

Saccharose ++ ++

Lactose ±

Maltose + ++

Trehalose ++ ++

Eaffinose +

Melibiose ± ±

i-Inosit - ±

_P-Sorbit - ±

I_-Mannit ++ ++-

Glycerin ++ +++

Lösliche Stärke + ++

Kontrolle

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•Basalmedium mit 0,1% Hefeextrakt

+++ = üppiges Wachstum

++ = gutes Wachstum

+ = Wachstum

_+ = schlechtes Wachstum

- = kein Wachstum

6) Andere Merkmale

Die Zellen wurden auf die unter (2) "Bestandteile der Zellen" beschriebene Weise isoliert. Nach einem Verfahren analog dem Verfahren von J.Murmar und Mitarbeitern (Journal of Molecular Biology 3 (1961) 208) wurde DNA hergestellt. Der G-C-Gehalt (Guanin-Cytosin) des DNA wurde mit etwa 71 Mol.-% ermittelt.

Die Gram¹ Färbung des vegetativen Mycels dieses Stamms ergab eine positive Reaktion.

Die vorstehenden Merkmale des Stamms C-14482 wurden mit den Beschreibungen in "The Actinomycetes", Band 2 von S.A. Waksman (The Williams and Wilkins Co. 1961), R.E. Buchanan und N.E.Gibbons in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8.Auflage 1974 und anderen Literaturstellen verglichen.

Die vorstehend genannten Beobachtungen, daß 1) der Stamm in den späteren Phasen der Kultivierung in die Form von Stäbchen oder langgestreckten Stäbchen oder deren verzweigte Zellen zerfällt, 2) wenig wohldefinierte Konidien oder Sporen bildet, 3) die Oberflächen seiner Kolonien auf Agar lederartig und in vielen Fällen glänzend wie Bakterienkolonien sind und der G-C-Gehalt des Mycels etwa 71 Mol.-% beträgt, lassen zusammen mit den anderen Merkmalen darauf schließen, daß der Stamm zur Gruppe III der Gattung Nocardia gehört. Da es jedoch der Anmelderin unmöglich war, irgendwelche bekannten Stämme von Mikroorganismen zu finden, die alle vor-

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stehend genannten Kulturmerkmale, physiologischen Merkmale, Zellmotilität, Zellwandzusammensetzung usw. mit dem Stamm gemäß der Erfindung teilen, identifizierte die Anmelderin diesen Stamm als neue Spezies und bezeichnete ihn als Nocardia sp. C-14482. Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung wird Nocardia sp. C-14482 kurz als Stamm C-14482 bezeichnet.

Der Stamm C-14482 wurde beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO), Japan, unter der Zugangsnummer IFO-13725, beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technologie (FERM), Japan, unter der Zugangsnummer FERM-P 4130 und bei The American · Type Culture Collection (ATCC), USA, unter der Zugangsnummer ATCC-31309 hinterlegt.

Der das Antibiotikum C-14482 A. bildende Stamm unterliegt, wie Mikroorganismen der Gattung Nocardia im allgemeinen, Variationen und Mutationen entweder spontan oder unter dem Einfluß eines Mutagens. Beispielsweise können die zahlreichen Varianten des Stamms, die durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, Gammastrahlen, Ultraviolettlicht usw., durch Isolierung von Monozellen, durch Kultivierung auf Medien, die verschiedene Chemikalien enthalten, oder durch andere mutagene Behandlungen erzielbar sind, sowie die spontan vom Ursprungsstamm erhaltenen Mutanten nicht als andere grundsätzlich verschiedene Spezies angesehen werden. Vielmehr können alle diese Varianten und Mutanten für die Zwecke der Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie das Antibiotikum C-14482 A. zu bilden vermögen. Beispielsweise ergeben die verschiedensten mutagenen Behandlungen des C-14482 A. bildenden Stamms Mutanten, die hellgelbliche bis hellgelblichbraune oder braune lösliche Pigmente bilden, Varianten, die ein farbloses vegetatives Mycel bilden, Varianten, die ein rötlichbraunes bis orangerotes vegetatives Mycel bilden, Varian-

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ten, die ein gelblichgrünes Substratmycel oder lösliche Pigmente bilden, Varianten, die reichlich weißes Luftmycel bilden, oder Varianten deren Mycel zu Fragmentierung neigt.

Das für die Kultivierung des C-14482 A- bildenden Stamms verwendete Nährmedium kann ein beliebiges flüssiges oder festes Medium sein, vorausgesetzt, daß es die vom Stamm verwertbaren Nährstoffe enthält, jedoch wird ein flüssiges Nährmedium für die Großherstellung bevorzugt. Das Medium kann Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die der C-14482 A^. bildende Stamm assimilieren und digerieren kann, anorganische Stoffe, Spurennährstoffe usw. enthalten. Als Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannit, Sorbit und Fette und Öle (z.B. Sojabohnenöl, Schmalzöl, Hühneröl usw.) und η-Paraffine. Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Pepton, Baumwollsaatmehl, ausgebrauchte Melasse, Harnstoff, Ammoniumsalze. (z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und Ammoniumacetat) usw. Das Medium kann ferner Salze von Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium usw., Salze von Eisen, Mangan, Zink, Kobalt, Nickel uswJ und Salze mit organischen Säuren, z.B. Acetate und Propionate, enthalten. Ferner können dem Medium verschiedene Aminosäuren (z.B. Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin, Lysin, Methionin und Prolin), Peptide (z.B. Dipeptide und Tripeptide), Vitamine, z.B. B^, B^, Nicotinsäure, B^₂ ^un(3 Vitamin C , Nucleinsäuren (z.B. Purin, Pyrimidin und die entsprechenden Derivate) usw. zugesetzt werden. Zur Einstellung des pH-Werts des Mediums können anorganische oder organische Säuren, Alkali, Puffer o.dgl. zugesetzt werden. Öle und Fette, oberflächenaktive Mittel usw. können ebenfalls in geeigneten Mengen zur Schaumver-7 Salze von Phosphor- und Borsäure

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hütung zugesetzt werden.

Die Kultivierung kann in stationärer Kultur, Schüttelkultur, aerober Submerskultur und nach anderen Züchtungsverfahren durchgeführt werden. Für die Großherstellung wird natürlich die aerobe Submerskultur bevorzugt. Die Kultivierungsbedingungen hängen natürlich vom Zustand und von der Zusammensetzung des Mediums, vom Stamm, der Kultivierungsmethode und anderen Faktoren ab, jedoch wird vorzugsweise bei 15 bis 35°C, insbesondere bei 20 bis 32°C bei einem Anfangs-pH-Wert von etwa 5,0 bis 9,0, vorzugsweise bei etwa 7,0 gearbeitet. Besonders zweckmäßig ist eine Temperatur von 25° bis 28⁰C in einer Zwischenstufe der Kultivierung bei einem Anfangs-pH-Wert von 6,5 bis 7,5. Die Dauer der Kultivierung hängt ebenfalls von den vorstehend genannten Faktoren ab, jedoch ist es zweckmäßig, die Kultivierung durchzuführen, bis der Titer des gewünschten Antibiotikums maximal wird. Im Falle der Schüttelkultur oder aeroben Submerskultur im flüssigen Medium liegt die erforderliche Zeit normalerweise im Bereich von etwa 3 bis 8 Tagen.

Aus dem in der vorstehend beschriebenen Weise erha-ltenen Kulturmedium kann das Antibiotikum C-14482 A. vorteilhaft durch Verfahren, die normalerweise zur Isolierung von Metaboliten aus Mikrobienkulturen angewendet werden, isoliert werden. Da das Antibiotikum C-14482 A^ schwach basisch ist, kann es beispielsweise mit Hilfe einer geeigneten Kombination von Verfahren, bei denen diese Eigenschaft ausgenutzt wird, isoliert werden. Da dieses Antibiotikum in erster Linie in der Flüssigphase des Kulturmediums vorliegt, wird das Kulturmedium zuerst filtriert, um das Mycel zu entfernen, worauf das Filtrat neutralisiert oder schwach basisch eingestellt wird. Dann können organische Lösungsmittel, die mit Wasser mehr oder weniger unmischbar sind, zur Isolierung des

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Antibiotikums verwendet werden. Als organische Lösungsmittel eignen sich hierzu beispielsweise halogenierte Kohlenwasserstoffe (z.B. Chloroform und Methylenchlorid), Fettsäureester (z.B. Äthylacetat und Butylacetat), Ketone (z.B. Methylisobutylketon) und Alkohole (z.B. Butylalkohol und Isobutylalkohol). Das in dieser Weise mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahierte Antibiotikum C-14482 A₁ kann dann mit Hilfe einer verdünnten wässrigen Lösung einer Mineralsäure, einer organischen Säure oder einer sauren Pufferlösung in eine wässrige Phase überführt und in dieser Weise gereinigt werden.

Das in den Zellen vorhandendene Antibiotikum C-14482 A^ kann aus den abfiltrierten Zellen mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z.B. Aceton oder Methanol, mit einer verdünnten wässrigen Lösung einer Mineralsäure oder mit einem Gemisch dieser Lösungsmittel extrahiert werden.

In gewissen Fällen kann das die Zellen enthaltende Kulturmedium als solches schwach sauer eingestellt und mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, z.B. Aceton oder Methanol, gerührt, das Gemisch filtriert, das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt, das Aceton oder Methanol abdestilliert und die restliche wässrige Lösung in der im Zusammenhang mit dem Filtrat des Kulturmediums beschriebenen Weise behandelt werden.

Nach einem anderen Verfahren kann das Antibiotikum C-14482 A^ durch Adsorption des Antibiotikums an einem Adsorptionsmittel und Elution mit einem geeigneten Lösungsmittel aus dem Filtrat des Kulturmediums isoliert werden. Als Adsorptionsmittel eignen sich hierzu beispielsweise Aktivkohle, nicht-ionische Austauscherharze, z.B. die Produkte der Handelsbezeichnung "Amberlite XAD-2" (Rohm and Haas Co., USA) und "Diaion HP-IO"

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- νί -

(Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan). Als Elutionsmittel werden beispielsweise wässrige Alkohole, z.B. wässriges Methanol und wässriges Butanol, wässriges Aceton und wässrige Medien, die vorher durch Zusatz von verdünnter Mineralsäure ο.dgl. angesäuert worden sind, bevorzugt, jedoch kann das Antibiotikum C-14482 A^ auch mit einem organischen Lösungsmittel, z.B. Äthylacetat oder Chloroform, eluiert werden.

Es ist auch möglich, das Antibiotikum C-14482 A^ unter Ausnutzung seiner basischen Natur durch Adsorption an einem Kationenaustauscherharz und Desorption mit einem Elutionsmittel zu isolieren. Als Kationenaustauscherharze eignen sich beispielsweise die Produkte der Handelsbezeichnung "Amberlite IRC-50", "Amberlite IR-120" (Rohm and Haas Co., USA), "Dowex-50" (Dow Chemical Co., USA) und "CM-Sephadex P-25" (Pharmacia Co., Schweden).

Zur Elution der aktiven Substanz vom Harz können verdünnte wässrige Mineralsäurelösungen, Lösungen von Salzen wie Natriumchlorid und Ammoniumformat, verdünnte wässrige Alkalilösungen oder Gemische solcher Lösungen mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, z.B. Methanol oder Aceton, verwendet werden. Durch eine geeignete Kombination der vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahren kann das gewünschte antibiotische Produkt in ziemlich hoher Reinheit erhalten werden. Zur Gewinnung eines hochreinen Produkts können Adsorptionsmittel wie Kieselgel (Merck, Deutschland), Aluminiumoxyd (Merck, Deutschland) und "Sephadex LH-20" (Pharmacia, Schweden) verwendet werden. Als Entwicklerlösungsmittel eignen sich beispielsweise die normalerweise für die Abtrennung von organischen Verbindungen verwendeten Lösungsmittel, z.B. halogenierte Kohlenwasserstoffe (z.B. Chloroform und .Methylenchlorid), Alkohole (z.B. Methanol und Äthanol), Gemische dieser Lösungsmittel (z.B. ein Gemisch von Chloroform mit Methanol) und

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Gemische von Estern (z.B. Äthylacetat) beispielsweise mit Alkoholen.

Für die weitere Reinigung eignen sich beispielsweise Methoden, bei denen die Unterschiede im Verteilungskoeffizienten ausgenutzt werden, und Verfahren, bei denen gewisse Adsorptionsmittel verwendet werden.

Zu den Verfahren, bei denen Unterschiede im Verteilungskoeffizienten ausgenutzt werden, gehören beispielsweise das Verteilungsverfahren, das auf dem Unterschied der Koeffizienten zwischen zwei Lösungsmitteln, die nicht mischbare Phasen bilden, beruht, das Gegenstromverteilungsverfahren und die Teilungschromatographie unter Verwendung von Cellulosepulver als Trägermaterial.

Bei der Aufteilung zwischen Chloroform und Wasser bei pH 8,0 wird das Antibiotikum C-14482 A₁ in die Chloroformschicht überführt. Bei dem Adsorptionsverfahren, bei dem beispielsweise Kieselgel als Adsorptionsmittel verwendet wird, wird das Antibiotikum C-14482 A^ zuerst an einer Kieselgelsäule (Merck, Deutschland) adsorbiert und dann mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol eluiert. Durch Dünnschichtchromatographie des erhaltenen rohen Produkts mit einem Lösungsmittelsystem beispielsweise aus Äthylacetat und Methanol wird C-14482 A^ als reine Substanz erhalten.

Das gemäß Beispiel 3 und 4 hergestellte Antibiotikum C-14482 A^ hat die folgenden Kennzahlen:

I) Elementaranalyse (%)

C 58,02 59,18

H 5,84 5,70

N 16,32 17,14

II) Schmelzpunkt: nicht weniger als 300°C

III) Spezifische Drehung:

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{.α J²⁴·-' + 15O^c±3O° (c=0.05, Äthanol) IV) UV-Absorptionsspektrum (siehe Fig.l)

maf <^E1L> ²⁸¹

Dm ±2 (46.0±5)

V) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) (siehe Fig.2) Hauptpeaks (cm ):

3450, 3175, 29AO, 2890, 2850, 1680, I65O, 1625, 1600, 1455, I39O, I345, I25O, 1170, 1140, 1110, 1075, 1025, 995, 935, 910, 825

VI) Löslichkeit: praktisch unlöslich in Hexan und Petroläther;

schwerlöslich in Äthanol, Butanol, Äthylacetat und Wasser;
löslich in Methanol und Chloroform.

VII) Farbreaktionen:

Negativ: Sakaguchi-Reaktion und Barton-Reaktion Kaliumpermanganat wird entfärbt.

VIII) Acidität, Neutralität oder Basizität: schwach basisch

IX) Farbe der Kristalle: dunkelrot bis rötlichbraun.

X) Molekulargewicht: 460

(gemessen durch Dampfdruckosmometrie in Ct-UCOOCpH₁-

XI) Stabilität: zwischen pH 3,0 und pH 8,0: 24 Stunden bei Raumtemperatur stabil; zwischen pH 3,0 und

pH 5,0 selbst bei 8O⁰C 1 Stunde stabil; bei pH 6 leicht instabil, wenn das Antibiotikum 1 Stunde

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bei 80⁰C erhitzt wird; bei pH 7 bis 8 ziemlich instabil.

XII) Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Spot Film f, Tokio Kasei Co., Japan):

Chloroform-Methanol (9:1): Rf 0,52

Äthylacetat-Methanol (10:1): Rf 0,38

XIII) Bildung von Salzen

Da C-14482 A₁ eine basische Substanz ist, bildet es wasserlösliche Salze mit Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Weinsäure, Glucu-

ronsäure usw. und schwerlösliche Salze mit Säuren wie Picrinsäure und Picrolonsäure.

Als Breitspektrum-Antibiotika, deren Kristalle eine rote bis rötlich-purpurne Farbe aufweisen, sind Mi tomycin (T.Hata und Mitarbeiter, The Journal of Antibiotics, Serie A, 9 (1956) 141) und Naphthyridinomycin (D.Kluepfel und Mitarbeiter, The Journal of Antibiotics 28 (1975) 497) zu nennen. Diese beiden Antibiotika unterscheiden sich jedoch vom erfindungsgemäßen Antibiotikum C-14482 A. deutlich in den Absorptionen im Ultraviolettbereich und sichtbaren Bereich und in der Elementaranalyse (insbesondere im Stickstoffgehalt).

Da kein bekanntes Antibiotikum die vorstehend genannten chemischen Eigenschaften (insbesondere die Absorptionen im Ultraviolettbereich und sichtbaren Bereich des Spektrums) und die später beschriebenen biologischen Eigenschaften mit diesem Antibiotikum teilt, ist das Antibiotikum C-14482 A^ als neue Substanz anzusehen.

Biologische Aktivität
A) Antimikrobielle Aktivität

Trypticase-Sojaagar-Medium (nachstehend als TSA bezeichnet, Hersteller Baltimore Biological Ltd., USA),

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mit 3% Glycerin ergänztes TSA und mit 1% Glucose ergänztes TSA wurden verwendet. Die Mindesthemmkonzentrationen von C-14482 A. gegen Bakterien, säurefeste Bakterien, Pilze und Hefen wurden nach der Agarverdünnungsmethode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 genannt.

Tabelle 4
Antimikrobielles Spektrum von Antibiotikum C-14482 A.

Testmikroorganismus Medium MHK,ug/ml

Escherichia coli Kl2 IFO 33OI Escherichia coli NIHJ Proteus vulgaris IFO 304-5 Proteus morpranii IFO 3168 Proteus mirabilis IFO 384-9 Pseudomonas aeruginosa IFO 3O8O Salmonella typhimurium IFO 12529 Salmonella enteritidis IFO 33I3 Alcaligenes faecalis IFO I3III Enterobacter cloacae IFO 12009 Serratia marcescens IFO 304-6 Bacillus pumilus IFO 38I3 Bacillus subtilis 6633 IFO 3134-Bacillus subtilis PCI 219 IFO 3513 Bacillus cereus IFO 351^ Bacillus mep;aterium IFO 12108 Bacillus brevis IFO 3331

Staphylococcus aureus FDA 2O9P IFO 12732 TSA Staphylococcus aureus OE-R
Staphylococcus aureus 4-R

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TSA	2
TSA	5
TSA	10
TSA	50
TSA	10
TSA	2
TSA	2
TSA	10
TEA	1
TSA	20
TSA	50
TSA	2
TSA	1
TSA	1
TSA	2
TSA	1
TSA	0.2
2732 TSA	1
TSA TSA	1 1

- VT-Tabelle 4 (Forts.)

Medium MHK, ng/ml

Testmikroorganismus Sarcina lutea IFO 3232 Mycobacterium avium IFO 3143 Mycobacterium avium SM-R Mycobacterium avium NM-R Mycobacterium smegmatis Mycobacterium phlei Mycobacterium sp. 607 Aspergillus niger IFO 4066 Penicillium chrysogenum IFO 4626 Trichophyton rubrum IFO 5467 Saccharomyces cerevisiae IFO 0209 Candida albicans IFO 0583 MHK = Mindesthemmkonzentration TSA: Trypticase-Sojaagar

TSA.GlyrTrypticase-Sojaagar mit 3% Glycerin ergänzt· TSA,Glu:Trypticase-Sojaagar mit 1% Glucose ergänzt.

OE-R: Gegen Oleandomycin-Erythromycin in vitro

resistenter Mutant.

20 4R: Gegen Tetracyclin-Streptomycin-Chloramphenicol-Erythromycin in vitro resistenter Mutant.

SM-R: Resistenz gegen Streptomycin

NM-R: Resistenz gegen Neomycin

IFO-Zahl: Zugangsnummern des Institute for Fermenta.-25 tion, Osaka, Japan

Plasmid R 100, R 100-1 oder. F wurde auf Escherichia coli CRT 46, einen Mutanten mit einem wärmeempfindlichen Chromosomen-Gen dna A, zur Auslösung der DNA-

TSA	•Gly	1
TSA	•Gly	10
TSA	•Gly	20
TSA	•Gly	20
TSA	■Gly	5
TSA	•Gly	5
TSA'	■Glu	10
TSA-	GIu	>100
TSA-	GIu	>100
TSA·	GIu	>100
TSA-	GIu	>100
TSA·	XLOO

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Replikation (Hirota und Mitarbeiter, Journal of Molecular Biology 35 (1968) 175) und seine in vitro gegen Nalidixinsäure resistenten Mutanten übertragen, und die hitzebeständigen Revertanten (Hfr-Stämme) TE 33, TE und TE 120 wurden nach der Methode von Nishimura und Mitarbeitern (Journal of Molecular Biology 55 (1971) 441) gewonnen. Die wachstumshemmende Wirkung von Antibiotikum C-14482 A₁ wurde gegen diese Stämme von Escherichia coli nach der Kulturmedium-Verdünnungsmethode von Yoshikawa und Mitarbeitern (Antimicrobial Agents and Chemotherapy 5 (1974) 362) bestimmt. Die spontanen hitzebeständigen Revertanten TE 144 und Te 146 wurden als Kontrollen verwendet. Das Wachstum wurde nach der Extinktion bei 6OO nm bewertet. Das Wachstumsverhältnis wurde aus dem Verhältnis der Extinktion für die behandelte Gruppe zur Extinktion der unbehandelten Gruppe berechnet.

Tabelle 5

Teststamm	Temperatur	Wachstumverhältnis	0.125 με/ΐα^
TE 55	52°C	0.0625 \ψ/η£	0.974
	4-20C	0.974	<0.052
TE 82	32°C	0.548	1.000
	42°C	1.019	0.029
TElPO	52°C	0.553	1.000
	42°C	1.000	<Ο.Ο29
TE144	52°C	0.029	1.000
	42°C	0.985	0.846
TE146 -	52°c	0.897	0.981
	42°C	0.981	0.294
0.912

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TE	33	CRT	46	nalr R 100	Hfr
TE	82	CRT	46	R 100-	1 Hfr
TE	120	CRT	46	FHfr
TE	144	CRT	46	spontaner hi	tzebes
TE	146	CRT	46	nal	d
B)	Toxizität

Bei einem. Test an Mäusen (CF Nr.1, männlich, 4 Wochen alt) zur Bestimmung der akuten Toxizität wurde eine Lösung von C-14482 A^ in physiologischer Kochsalzlösuna intravenös verabreicht. Die geschätzte LD₅₀ dieses Antibiotikums betrug etwa 5 mg/kg.

Wie Tabelle 4 zeigt, hat das Antibiotikum C-14482 A₁ eine starke hemmende Wirkung gegen gramnegative, grampositive und säurefeste Bakterien. Das Antibiotikum C-14482 A. ist daher wertvoll als keimtötendes Mittel und Desinfektionsmittel.

Ferner zeigen die Ergebnisse in Tabelle 5, daß dieses Antibiotikum wertvoll als Mittel zur Eliminierung von R-Plasmiden wie ein anscheinend starker Inhibitor der Nucleinsauresynthese ist. Dies läßt darauf schließen, daß das Produkt gemäß der Erfindung als tumorhemmendes Mittel wertvoll ist.

Das Antibiotikum C-14482 A₁ kann als keimtötendes Mittel, Desinfektionsmittel oder Arzneimittel zur äußeren Anwendung, beispielsweise zur Desinfektion von Geschirr, chirurgischen Instrumenten, Vogelkäfigen, Händen usw. verwendet werden. Bei Verwendung des Antibiotikums als keimtötendes Mittel, Bakterizid oder Desinfektionsmittel gegen Bakterien, beispielsweise die in Tabelle genannten Bakterien, kann es als flüssige Zubereitung, die beispielsweise durch Auflösen von 10 mg Antibiotikum in 1000 bis 2000 ml Wasser hergestellt wird, angewendet werden. ^Für die Verwendung dieses Antibiotikums als

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Arzneimittel zur äußeren Anwendung kann es zu einer Salbe beispielsweise durch gleichmäßiges Vermischen von 0,5 mg C-14482 A. mit 10 g weißem Petrolatum formuliert werden ο

Beispielsweise kann das Antibiotikum in Form einer Salbe, die 0,5 mg C-14482 A₁ pro 10 g weißes Petrolatum enthält, zur Verhinderung oder Behandlung der Eiterung von Wunden durch Staphylococcus aureus oder durch Mischinfektion mit den in Tabelle 4 genannten Mikroorganis— men an der Hand örtlich angewendet werden, indem 0,02 bis 0,2 g Salbe viermal täglich auf die Wunde aufgetragen wird ο

Ferner kann das Antibiotikum beispielsweise in Form einer Flüssigkeit, die 10 mg C-14482 A₁ in 1000 bis 2C00 ml Wasser enthält, zur Desinfektion verwendet werden, indem Geschirr, chirurgische Instrumente, Vogelkäfige oder die Hände etwa 10 Minuten in die Flüssigkeit getaucht werden»

Bei Verabreichung an Mäuse, die mit Leukämie P388 infiziert worden sind, verhindert C-14482 A₁ die Vermehrung der Tumorzellen, wobei es eine starke lebensver— längernde Wirkung zeigt. C-14482 A₁ ist daher außerdem wertvoll als Antxtumormittel für die Behandlung von Tumorzellen bei Warmblütern (z.B. Maus, Ratte, Mensch)»

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert» In diesen Beispielen verstehen sich die Teile als Gewichtsteile, falls nicht anders angegeben. "Teile" verhalten sich zu "Raumteilen" wie Gramm zu Kubikzentimeter. Den Prozentsätzen liegt "Gew./Volo" zu Grunde₉ falls nicht anders angegeben» Den in den Beispielen genannten Prozentsätzen von ii/ässrigem Aceton und wässrigem Methanol liegt "Volumen/Volumen" zu Grunde»

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Beispiel 1

Eine Kultur des das Antibiotikum C-14482 A. bildenden Stammes Nocardia sp. C-14482 (IFO 13725, Ferm-P 4130, ATCC 31309) im Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar-Schrägröhrchen wurde zum Beimpfen eines Erlenmeyerkolbens verwendet, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hatte und 40 Raumteile eines Impfkulturmediums (pH 7,0) enthielt, das aus 2% Glucose, 3% löslicher Stärke, 1% Sojabohnenmehl, 1% Maisquellwasser, 0,5% Pepton, 0,3% NaCl und 0,5% CaCO₃ bestand, worauf 48 Stunden bei 28°C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bebrütet wurde. Hierbei wurde eine Impfkultür erhalten.

Ein Teil von 0,5 Raumteilen dieser Impfkultur wurde in einen Erlenmeyerkolben überführt, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hatte und 40 Raumteile eines Nährmediums (pH 7,0) aus 5% Dextrin, 3% Sojabohnenmehl, 0,1% Pepton und 0,5% CaCO₃ enthielt, worauf 90 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 28°C bebrütet wurde. Dieses Kulturmedium wurde nach der Agarverdünnungsmethode gegen Staphylococcus aureus FDA 209 P und Proteus mirabilis IFO 3849 als Testmxkroorganxsmen unter Verwendung von C-14482 A₁ als Standard getestet. Hierbei wurde ein Titer von 50 iig/ml gefunden.

Beispiel 2

10 Raumteile der gemäß Beispiel 1 hergestellten Impfkultur wurden in einen Sakaguchi-Kolben überführt, der ein Fassungsvermögen von 2000 Raumteilen hatte und 500 Raumteile eines Impfkulturmediums ähnlich dem gemäß Beispiel 1 hergestellten Medium enthielt. Das ge— impfte Medium wurde 48 Stunden bei 28°C kultiviert. 1000 Raumteile der Kultur wurden in 100000 Raumteile des vorstehend genannten Kulturmediums in einem Fermentationstank geimpft, der ein Fassungsvermögen von 200 000 Raumteilen hatte. Das Medium wurde 48 Stunden

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bei 28°C bebrütet, wobei mit einer Rate von 100 000 Raumteilen/Minute belüftet und mit 200 UpM gerührt wurde. Hierbei wurde eine Impfkultur erhalten. Diese Impfkultur wurde in einen 2000 000 Raumteile fassenden Tank aus nichtrostendem Stahl überführt, der 1000 000 Raumteile des in Beispiel 1 beschriebenen Fermentationsmediums enthielt. Die verwendete Größe des Inoculums betrug 10%. Die Kultivierung wurde 90 Stunden bei 28°C bei einer Belüftungsrate von 1 000 000 Raumteilen/Minute, einer Rührergeschwindigkeit von 150 UpM (1/3 DT) und einem Innendruck von 0,981 bar durchgeführt. Das erhaltene Kulturmedium hatte einen Titer von 20 ug/ml, bestimmt in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise.

Das vorstehend beschriebene Kulturmedium wurde auf pH 5,0 eingestellt und mit der Filterpresse unter Verwendung von 30 000 Teilen des Filterhilfsmittels "Hyflo-Supercel" (Johns Manville Co., USA) filtriert. Das Filtrat (880 000 Raumteile) wurde auf pH 8,0 eingestellt und durch eine Säule geleitet, die 100 000 Raumteile des Ionenaustauscherharzes "Amberlite XAD-2" enthielt. Die Säule wurde mit 300 000 Raumteilen Wasser gewaschen, worauf mit 250 000 Raumteilen 50%igem wässrigem Aceton eluiert wurde.

Das Eluat wurde unter vermindertem Druck destilliert, um das Aceton zu entfernen. Die restliche wässrige Lösung wurde auf pH 6 eingestellt und an einer 60 000 Raumteile des Ionenaustauscherharzes "Amberlite IRC-50" (Η-Form) enthaltenden Säule adsorbiert. Die Säule wurde mit 180 000 Raumteilen Wasser gewaschen und dann mit 180.000 Raumteilen 0,2n-Salzsäure eluiert. Das Eluat wurde auf pH 6,0 eingestellt und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat (30 000 Raumteile) wurde auf pH 6,0 eingestellt und an einer 15 000 Raumteile des Ionenaustauscherharzes "Amberlite XAD-2" enthaltenden Säule adsorbiert. Die Säule wurde mit 45 000 Raum-

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teilen Wasser gewaschen, worauf mit 60 000 Raumteilen 50%igem wässrigem Aceton eluiert wurde. Das Eluat wurde auf pH 5,6 eingestellt und unter vermindertem Druck auf etwa 1000 Raumteile eingeengt.

Dem Konzentrat wurden 9000 Raumteile Aceton zugesetzt, wobei 124 Teile rohes Produkt I erhalten wurden.

Die Mutterflüssigkeit wurde weiter destilliert, um das Aceton zu entfernen. Der Rückstand wurde gefriergetrocknet, wobei 36 Teile rohes Produkt II erhalten wurden.

In 450 Raumteilen Wasser wurden 4,5 Teile des rohen Produkts II gelöst. Die Lösung wurde mit verdünntem wässrigem NH.OH auf pH 8 eingestellt und mehrmals (vier- bis fünfmal) mit 225 Raumteilen CHCl- extrahiert. Die CHCl^-Extrakte wurden vereinigt und die aktive Substanz unter Verwendung von 300 Raumteilen 1/200 η-Salzsäure in eine wässrige Schicht überführt. Die weinfarbige wässrige Schicht wurde auf pH 5,5 bis 6,0 eingestellt, unter vermindertem Druck eingeengt, auf pH 6,0 eingestellt und auf eine Säule von 170 Raumteilen des Nicht-Ionenaustauscherharzes "Diaion HP-IO" (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan) aufgegeben. Die Säule wurde mit 500 Raumteilen Wasser und 700 Raumteilen 30%igem wässrigem Methanol in dieser Reihenfolge gewaschen und dann mit 700 Raumteilen 80%igem wässrigem Methanol eluiert, wobei eine weinfarbige antibiotische Substanz erhalten wurde.

Das Eluat wurde auf pH 6 eingestellt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Hierbei wurden 0,185 Teile eines dunkelroten Pulvers erhalten. 0,155 Teile dieses Produkts wurden der Dünnschichtchromatographie an K-ieselgel (Merck, Deutschland, H^) unterworfen (Lösungsmittel CHCl₃-MeOH = 10:1). Fraktionen mit einem Rf-Wert von 0,45 wurden aufgefangen und mit Methanol extrahiert, wobei 0,024 Teile einer

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- vr --3*0

Fraktion Α.. erhalten wurden.

0,02 Teile dieser Fraktion A.. wurden durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Merck, Deutschland, HF_?c-₄) mit einem Lösungsmittelsystem aus Äthylacetat und Methanol (10:1) gereinigt, wobei eine gereinigte Fraktion A₁ (0,009 Teile) durch Extraktion mit Methanol aus der A. entsprechenden Bande (Rf 0,33) erhalten

wurde. Der E. ° -Wert dieses Antibiotikums C-14482 A. 1 cm 1

in Methanol betrug 41,3 bei 498 nm.

Beispiel 3

850 000 Raumteile eines Filtrats eines Kulturmediums, das nach einem Verfahren ähnlich dem in Beispiel 2 beschriebenen hergestellt worden war, wurden durch eine Säule von 85 000 Raumteilen des Ionenaustauscherharzes "Amberlite XAD-2" geleitet. Die Säule wurde mit Wasser (255 000 Raumteile) gewaschen und mit 210 000 Raumteilen 50%igem wässrigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde zur Entfernung des Acetons destilliert. Die restliche wässrige Lösung wurde auf pH 6,0 eingestellt und an einer Säule von 51 000 Raumteilen des Ionenaustauscherharzes "Amberlite IRC-50" (Η-Form) adsorbiert. Die Säule wurde mit 150 000 Raumteilen Wasser gewaschen und dann mit 150 000 Raumteilen 0,2n-HCl eluiert. Das Eluat wurde auf pH 5,5 bis 6,0 eingestellt, unter vermindertem Druck auf etwa 50 000 Raumteile eingeengt und an einer Säule von 12 000 Raumteilen des Ionenaustauscherharzes "Amberlite XAD-2" adsorbiert. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit 18 000 Raumteilen 50%igem wässrigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde auf pH 5,5 bis 6,0 eingestellt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Hierbei wurden 118,3 Teile rohes C-14482 A₁ in Pulverform erhalten.

In 9000 Raumteilen Wasser wurden 90 Teile des erhaltenen rohen pulverförmigen Produkts gelöst. Die Lösung wurde

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mit verdünntem wässrigem ΝΗ,ΟΗ auf pH 8,0 eingestellt und dreimal mit 3000 Raumteilen n-Butanol extrahiert.

Die Extrakte wurden vereinigt und mit 3000 Raumteilen 1/20On-HCl zweimal in wässrige Schichten überführt. Die wässrigen Schichten wurden zusammengegossen und auf pH 6 eingestellt. Das n-Butanol wurde entfernt und die restliche wässrige Lösung (pH 6) auf eine Säule von 4500 Raumteilen des Harzes "Diaion HP-IO" (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) aufgegeben. Die Säule wurde mit 13500 Raumteilen Wasser und 9000 Raumteilen 30%igem wässrigem Methanol in dieser Reihenfolge gewaschen und mit 13500 Raumteilen 80%igem wässrigem Methanol eluiert, wobei 3,45 Teile einer A.-reiihen Fraktion (F-I) erhalten wurden.

3,0 Teile der A^-reichen Fraktion (F-I) wurden an einer Säule von 150 Teilen Kieselgel (Merck, Deutschland) adsorbiert. Die Elution wurde mit Lösungsmittelgemischen aus Chloroform und Methanol im Verhältnis von 50:1 (1300 Raumteile), 25:1 (1000 Raumteile) und 10:1 (1000 Raumteile) in dieser Reihenfolge vorgenommen. Abschließend wurde mit 1000 Raumteilen Methanol eluiert.

Die Elution mit dem Cnloröforii-Methanol-Gemisch (25:1) ergab 0,368 Teile einer A^-reichen Fraktion. 0,340 Teile der A^-reichen Fraktion wurden durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Merck, HFp₁-*) mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol (9:1) gereinigt, wobei 0,109 Teile C-14482 A^ als gereinigtes dunkelrotes kristallines Pulver erhalten wurden.

Elementaranalyse (nach Trocknung für 30 Stunden bei 60°C im Vakuum): C 59,18 H 5,70 N 17,14

498 nm(E^_m 48.3)

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Beispiel 4

900 000 Raumteile eines auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise hergestellten Kulturmediums wurden mit 4n-H₂S0₄ auf pH 4,0 eingestellt und dann mit 800 Raumteilen Aceton versetzt. Das Gemisch wurde 3 Stunden gerührt. Nach Zusatz von 30 000 Teilen des Filterhilfsmittels "Hyflo-Supercel" (Johns Manville Co., USA) wurde das Gemisch mit der Filterpresse filtriert. Das Filtrat wurde auf pH 5,5 eingestellt und unter vermindertem Druck auf 800 000 Raumteile eingeengt. Das Aceton wurde entfernt und die restliche wässrige Lösung auf pH 6,0 eingestellt und durch eine Säule von 90 000 Raum_ teilen des Harzes "Diaion HP-IO" geleitet. Die Säule wurde mit 270 000 Raumteilen Wasser gewaschen und mit 250 000 Raumteilen 50%igem wässrigem Aceton eluiert.

Das Aceton wurde entfernt und die restliche wässrige Lösung (100000 Raumteile) auf pH 8,0 eingestellt und dreimal mit 30 000 Raumteilen Isobutanol extrahiert. Die Extrakte wurden zusammengegossen und die aktive Substanz zweimal mit 60 000 Raumteilen 1/20On-HCl in eine wässrige Schicht überführt. Das in der wässrigen Schicht enthaltene Isobutanol wurde bei pH 5 bis 6 unter vermindertem Druck abdestilliert. Die restliche wässrige Lösung wurde auf pH 6,0 eingestellt und auf eine Säule des Harzes "Diaion HP-IO" (45000 Raumteile) aufgegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit 135 000 Raumteilen 50%igem wässrigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde auf pH 6 eingestellt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Hierbei wurden 82 Teile eines an C-14482 A. reichen Pulvers (f-1) erhalten.

In 1,5 χ 10³ R_aumteilen Wasser wurden 15 Teile dieses Pulvers (f-1) gelöst. Die aktive Sußstanz wurde viermal mit 750 Raumteilen CHCl₃ bei pH 8,0 (mit verdünntem NH.OH eingestellt) extrahiert und zweimal in 750 Raum-

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teile 1/20On-HCl überführt. Die wässrigen Schichten wurden vereinigt und bei pH 6 unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde auf eine Säule von 400 Raumteilen des Harzes "Diaion HP-IO" aufgegeben. Die Säule wurde mit 1200 Raumteilen Wasser und 1200 Raumteilen 30%igem wässrigem Methanol in dieser Reihenfolge' gewaschen. Die Elution wurde mit 1200 Raumteilen 80%igem wässrigem Methanol durchgeführt. Das Eluat wurde auf pH 6 eingestellt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Hierbei wurden 0,393 Teile eines dunklen■rötlichbraunen Pulvers, das reich an A₁ war, erhalten. 0,375 Teile dieses pulverfÖrmigen Produkts wurden durch Säulenchromatographie an Kieselgel und Dünnschichtchromatographie auf die in Beispiel 2 und 3 beschriebene Weise gereinigt. Hierbei wurden 0,02 Teile C-14482 A. in Form von gereinigten dunkelroten Kristallen erhalten.

Elementaranalyse (nach Trocknung für 30 Stunden bei 60⁰C im Vakuum):

C 58.02; H 5.84; N 16.32

j ileUii λ no _rm)(y/-'^r Mh. o\ max - ™^ν£Ί™ ^. ^J

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Claims (4)

1. Patentansprüche 1) Antibiotikum C-14482 A₁ mit folgenden Merkmalen:

   I) Elementaranalyse (%) C 58,02 59,18

   H 5,84 5,70

   N 16,32 17,14

   II) Schmelzpunkt: nicht weniger als 300°C

   III) Spezifische Drehung:

   foO²⁴·⁵ + 150°± 30° (c=0.05, Äthanol)

   IV) UV-Absorptionsspektrum:

   λ ^He0H (e\^% ) 214 run ± 2 (503 ± 50) max ^v lcm'

   ·, MeOH _(El°/ ₎ 281 nm ± 2 (209 ± 10)

   max

   , MeOH _(]Ll°/c _} 498 nm ± 2 (46.0 ± 5)

   ^Λ max lcm^/

   V) Infrarotabsorptionssjlektrym (KBr): Hauptpeaks (QJ¹" )* ,'%..

   3^30, 3175, 29JP, 2890^2850^ 1680, .1650, 1625, 1600, 1455, 1390, I345, 1^50, II70, 1140, 1110, 1075, 1025, 995, 935,^10, 825

   VI) Löslichkeit:

   Praktisch unlöslich: Hexan, Petroläther Schwerlöslich: Äthanol, Butanol, Äthylacetat,

   Wasser.
   Löslich: Methanol, Chloroform.

   VII) Farbreaktionen:

   Negativ: Sakaguchi-Reaktion, Barton-Reaktion. Kaliumpermanganat entfärbt.

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   ORIGINAL INSPECTED

   VIII) Acidität, Neutralität oder BasizitMt: schwachbasisch .

   IX) Farbe der Kristalle: dunkelrot bis rötlichbraun

   X) Molekulargewicht; 460

   (gemessen durch Dampfdruckosmometrie in CH.,COOC„H_ )
2. 2) Verfahren zur Herstellung von Antibiotikum C-14482 A₁, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Gattung Nocardia gehörenden Mikroorganismus, der das Antibiotikum C-14482 A. zu bilden vermag, in einem Nährmedium kultiviert und hierdurch das Antibiotikum C-14482 A. im Kulturmedium bildet und anreichert und das Antibiotikum isoliert.
3. 3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Nocardia sp„ C-14482 (ATCC-31309, FERM-P 4130, IFO-13725) verwendete
4. 4) Eine im wesentlichen reine Kultur des zur Gattung Nocardia gehörenden Mikroorganismus mit den Charakteristiken, die mit denen des Mikroorganismus ATCC-31309 identifizierbar sind, wobei diese Kultur in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen und digerierbare Stickstoffquellen enthält, eine gewinnbare Menge des Antibiotikums C-14482 A₁ zu bilden vermag.

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