DE69509643T2

DE69509643T2 - Sesquiterpenderivate

Info

Publication number: DE69509643T2
Application number: DE69509643T
Authority: DE
Inventors: Maurizio Denaro; Pietro Ferrari; Khalid Islam; Federica Sponga; Stefania Stefanelli
Original assignee: Gruppo Lepetit SpA; Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1994-03-25
Filing date: 1995-03-21
Publication date: 1999-10-14
Anticipated expiration: 2015-03-22
Also published as: US5854036A; ATE179975T1; JP3682977B2; JPH09510619A; DK0751940T3; WO1995026344A1; DE69509643D1; GR3030786T3; EP0751940A1; ES2131326T3; EP0751940B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen, die durch Fermentieren eines Mikroorganismus der Gattung Memnoniella oder Stachybotrys erhalten werden, wobei die Verbindungen Inhibitoren des Enzyms Inositmonophosphatase (EC 3.1.3.25) sind, das nachstehend mit dem Akronym "IMPase" bezeichnet wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser neuen Verbindungen bei der Behandlung von Manie- und Depressionssymptomen und pharmazeutische Zubereitungen, umfassend die Verbindungen als Wirkstoff; die Verbindungen der Erfindung können auch in Analysenverfahren zum Nachweis von IMPase verwendet werden.
Die Erfindung betrifft auch das Fermentations- und Reinigungsverfahren, durch das die neuen Verbindungen erhalten werden.
Lithium, das bevorzugt in Form von Lithiumcarbonat verwendet wird, ist bei der Linderung manischer Symptome hochspezifisch, wobei eher die Stimmung manischer Patienten normalisiert wird, als daß die Exzesse des manischen Zustandes durch Sedierung oder "Beruhigung" kompensiert werden. Ferner scheint es der einzige Arzneistoff in der Psychiatrie zu sein, ihr den eine deutliche Prophylaxe gegen Krankheitsrückfälle und -verschlechterung gezeigt wurde. Lithium zeigt seine deutlichsten Wirkungen bei manisch-depressiven Psychosen, die sowohl Manie als auch Depression oder nur Manie umfassen; diese Erkrankungen werden in die manisch-depressiven Psychosen I und II unterteilt. In den erstgenannten Fällen liegt eine voll ausgebildete ("full-blown") manische Episode vor, während in dem letztgenannten Fall nur eine schwache Hypomanie vorliegt.
Trotz seiner therapeutischen Eigenschaften verringern mehrere Probleme den therapeutischen Nutzen von Lithium. Antipsychotische Arzneistoffe sind die erste pharmakologische Behandlungsart einer akuten manisch-depressiven Psychose, wenn der Patient nicht ausreichend umgänglich ist, um die 7-10 Tage zu warten, die Lithium zur Entfaltung seiner antimanischen Wirkung benötigt. Eine kostspielige, gründliche Untersuchung vor der Lithiumgabe ist wegen der nachteiligen Wirkungen, die bei einer Lithiumtherapie allgemein auftreten, erforderlich. In Wirklichkeit kann Lithium eine transiente Leukozytose hervorrufen, kann bei Patienten mit einer grenzwertigen Reserve in der Schilddrüse eine klinische Hypothyreose verursachen und kann infolge von Verschiebungen von Flüssigkeiten und Elektrolyten den Herzstatus dekompensieren.
Es wurde beobachtet, daß das Polyurie-Polydipsie-Syndrom bei bis zu 60% von behandelten Patienten auftritt. Strukturelle Schädigungen in der Niere, wie interstitielle Fibrose, Tubulusatrophie und glomeruläre Sklerose, werden nach chronischer Lithiumbehandlung besonders von Patienten, die eine Lithiumvergiftung erlitten, berichtet. Weitere nachteilige Wirkungen von Lithium umfassen Tremor, Gewichtszunahme, Diarrhöe und Hautausschlag. Diese Nebenwirkungen sind eine ernsthafte, praktische Abschreckung hinsichtlich der Verwendung von Lithium in der klinischen Praxis.
Nebenwirkungen, insbesondere die ernsteren, können durch Kontrolle der Lithiumkonzentrationen im Plasma von manisch-depressiven Patienten verringert werden. Die Notwendigkeit, die Arzneistoffkonzentrationen im Plasma zu kontrollieren und diese in einem engen therapeutischen Bereich zu halten, vermindert seinen klinischen Nutzen.
Ein ideales, Lithium-mimetisches Mittel weist ein schnelles Einsetzen der Wirkung sowohl bei manisch-depressiven als auch nicht manisch-depressiven Depressionen auf, erfordert nur eine Dosierung einmal am Tag und weist ein Sicherheitsprofil auf, das keine umfassende medizinische Beurteilung vor der Behandlung und keine Kontrolle des Arzneistoffes im Plasma erfordert und mit keinem so ernsten Spektrum von Nebenwirkungen wie bei Lithium an sich verbunden ist.
Es wurde gezeigt, daß Inositmonophosphatase ein Schlüsselenzym in dem Phosphoinositidzyklus ist und für die Bereitstellung von Inosit durch Dephosphorylierung von Inosit-1-phosphat, Inosit-3-phosphat und Inosit-4-phosphat verantwortlich ist; da Lithium die Aktivität des Enzyms hemmt, wurde vorgeschlagen, daß diese Hemmung wahrscheinlich der molekulare Mechanismus ist, durch den Lithium seine antimanische und antidepressive Wirksamkeit ausübt.
In dieser Hinsicht kann die Entwicklung wirksamer und spezifischer Inhibitoren von IMPase zu völlig neuen, zur Behandlung von Manie und Depression wirksamen Arzneistoffen führen.
Eine Verbindung der Formel I,
die die vorstehende IMPase-hemmende Wirksamkeit zeigt, wurde durch Fermentieren eines Pilzes der Spezies Memnoniella oder Stachybotrys, wie in U. S. 4,981,980 beschrieben, erhalten. Diese Verbindung ist auch von Y. K. T. Lam et al. in Jour. of Antib., Bd. 45, 9, 1992, 5. 1397-1403, beschrieben, wo sie als L-671,776 bezeichnet wird. Die vorstehende Struktur scheint jedoch nicht korrekt zu sein, da die Beurteilung der physikalisch-chemischen Daten darauf hinweist, daß sich die Formylgruppe in der 5-Stellung tatsächlich in der 7-Stellung befindet.
H. Kaise et al. beschreiben in J. C. S. Chem. Comm. (1979) S. 726-7, die Verbindung K-76, einen Inhibitor des Komplementsystems, der an rheumatoider Arthritis, Glomerulonephritis und weiteren Immunkomplexkrankheiten beteiligt ist. K-76 wurde aus Stachybotrys complementi nom. nud. sp. K-76 erhalten und weist die Struktur II auf:
Ferner wurde durch Züchten des Pilzes Stachybotrys cylindrospora C. N. Jensen NOF1828 in einer flüssigen Malzextrakt/Hefeextrakt-Kultur eine Verbindung der Formel III
wie von W. A. Ayer et al. in Can. J. Chem., 71, 1993, 487-493, offenbart, erhalten, die als Stachybotrydial bezeichnet und auf eine antimykotische Wirksamkeit gegen Ceratocystiopsis crassivaginata untersucht wurde, bei der jedoch keine Wirksamkeit festgestellt wurde.
Das Dokument DE-A-28 21 403 betrifft eine Klasse von Sesquiterpenderivaten, von denen beschrieben wurde, daß sie eine Tumor-hemmende Wirksamkeit (Wirksamkeit gegen den Komplementkomplex) besitzen.
Journal of Antibiotics, Bd. 47, Nr. 6, 1994, S. 727-730, offenbart Sesquiterpenverbindungen als Inhibitoren der Protease des Myeloblastosevirus von Vögeln.
JP-A6184133, veröffentlicht am 05.07.94, beschreibt Sesquiterpenderivate als Inhibitoren der Esterase zur Behandlung von Hypercholesterinämie.
Es zeigte sich nun, daß die Fermentation eines Pilzes der Gattung Memnoniella oder Stachybotrys unter geeigneten aeroben Bedingungen zu einem Komplex aus wenigstens drei Fermentationsprodukten führt, in denen die bekannte Verbindung der Formel I (L- 671,776) im Gemisch mit zwei neuen Verbindungen, d. h. dem 6'β-Stereoisomer von Verbindung III (Stachybotrydial) und einem Deformylcarboxyderivat des vorstehenden 6'β-Stachybotrydials, nachstehend als MDL63394 bezeichnet, erhalten wird.
Um der Kürze willen wird im folgenden dieser Patentbeschreibung der Komplex aus den drei Verbindungen, der gemäß der vorstehenden Fermentation erhalten wurde, als "IMPase-hemmender Komplex" bezeichnet, während mit dem Begriff "IMPase-hemmende Verbindungen" sowohl 6'β-Stachybotrydial als auch MDL63394 gemeint sind.

Physikalisch-chemische Eigenschaften von 6'β-Stachybotrydial

A) Ultraviolettabsorptionsspektrum:
Lösungsmittel Lambda max (nm)
MeOH 222, 284
0,1 M KOH 231, 291, 334
B) Positivionen-FAB-Spektrum auf einem Finnigan TSQ 700-Dreistufen-Quadrupol- Massenspektrometer; Sattelfeld-Atomkanone mit Xe-Gas bei einer Spannung von 8 kV und einem Strom von 0,23 mA; Glycerin/ Wasser-Matrix:
FAB/MS-Hauptpeak bei 387 (MH+) bestimmt
C) Rf-Wert von 0,48 in dem folgenden DC-System: Hexan : Aceton, 6 : 4 (V/V) auf Silicagel.
D) NMR-Spektren in CDCl&sub3; mit einem Bruker AM 500-Gerät unter Verwendung von TMS als internen Standard aufgenommen (δ, ppm = 0), (s = Singulett; d = Dublett; br s = breites Singulett; m = Multiplett):
¹H-NMR bei 500 MHz aufgenommen, (δ, ppm): 10,65 s, 10,40 s, 6,94 s, 3,41 br s, 3,194, 2,84d, 2,00-1,72 m, 1,70-1,40 m, 1,02 2m, 0,89 s, 0,77 s;
¹³C-NMR bei 125,76 MHz aufgenommen, (δ, ppm): 193,5, 188,6, 167,6, 157,5, 138,1, 119,5, 111,5, 109,1, 100,7, 75,7, 42,3, 40,1, 37,6, 37,1, 31,2, 30,7, 28,3, 24,7, 24,2, 22,3, 21,0, 16,1, 15,5.

Physikalisch-chemische Eigenschaften von MDL63394

A) Ultraviolettabsorptionsspektrum:
Lösungsmittel Lambda max (nm)
MeOH < 200, 275
0,1 M KOH < 200, 282, 337
B) Positivionen-FAB-Spektrum auf einem Finnigan TSQ 700-Dreistufen-Quadrupol- Massenspektrometer; Sattelfeld-Atomkanone mit Xe-Gas bei einer Spannung von 8 iN und einem Strom von 0,23 mA; Glycerin/Wasser-Matrix:
FABIMS-Hauptpeak bei 403 (MH+) bestimmt
C) Rf-Wert von 0,23 in dem folgenden DC-System: Hexan : Aceton, 6 : 4 (V/V) auf Silicagel.
Auf der Basis der vorstehend berichteten physikalisch-chemischen Daten und durch Vergleich mit der Struktur der bekannten Verbindungen des Fermentationskomplexes kann die folgende Formel IV versuchsweise den neuen Verbindungen 6'β-Stachybotrydial und M0L63394 zugewiesen werden
in der, wenn sowohl R als auch R¹ eine Einheit der Formel -CHO bedeuten, dann 6'β-Stachybotrydial festgelegt ist, während, wenn einer der Reste R oder R¹ eine Einheit der Formel -CHO und der andere eine Einheit der Formel -COOH darstellt, die Verbindung MDL63394 festgelegt ist.
Das Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Erfindung umfaßt:
a) Züchten eines Pilzes der Gattung Memnoniella oder Stachybotrys, der den IMPase-hemmenden Komplex, der die IMPase-hemmenden Verbindungen der Erfindung enthält, erzeugen kann, unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält;
b) Gewinnen der Verbindungen des IMPase-hemmenden Komplexes aus der Fermentationsnährlösung und/oder aus dem Myzel;
c) Reinigen und Isolieren der Verbindungen der Erfindung gemäß an sich bekannten Verfahren.
Bevorzugt wird die Herstellung der IMPase-hemmenden Verbindungen der Erfindung durch Züchtung eines Memnoniella-Stammes, der sie erzeugen kann, erreicht; geeigneterweise wird ein Pilz der Spezies Memnoniella echinata, besonders bevorzugt Memnoniella echinata ATCC 20928, verwendet.
Der Pilz Memnoniella echinata ATCC 20928 wurde ohne Einschränkung bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD., von der er unter der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. 20928 erhältlich ist, hinterlegt und wurde ein Teil davon.
Zur Herstellung der IMPase-hemmenden Verbindungen ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht auf die Verwendung von Memnoniella echinata ATCC 20928 beschränkt. Für das Fermentationsverfahren der Erfindung kann eine beliebige Memnoniella- oder Stachybotrysspezies oder natürliche oder künstliche Mutanten oder Varianten davon verwendet werden, sofern sie die Inhibitoren der Inositmonophosphatase der Erfindung erzeugen können. Die künstliche Erzeugung von Mutanten kann durch herkömmliche Verfahren, wie Röntgen- oder Ultraviolettbestrahlung, Hochfrequenzwellen oder radioaktive Strahlen, oder durch die Verwendung von chemischen Mutagenen, wie Stickstoffsenfgas, salpetrige Säure, Nitrosoguanidin, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin und dergleichen, erreicht werden.
Das Medium, das zur Züchtung des Stammes, der den "IMPase-hemmenden Komplex" erzeugt, verwendet wird, kann ein beliebiges flüssiges oder festes Medium sein, das die Nährstoffe, die die speziellen Mikroorganismen nutzen können, enthält, obwohl ein flüssiges Medium für Verfahren im kommerziellen Maßstab bevorzugt ist.
Wie in dem Fachgebiet bekannt ist, kann die Zusammensetzung des Nährmediums über einen breiten Bereich variiert werden. Wie in dem Fachgebiet bekannt ist, liegen in dem Fermentationsmedium Kohlenstoff und Stickstoffquellen vor. Typische Kohlenstoffquellen umfassen: Glucose, Lactose, Maltose, Galactose, Saccharose, Dextrin, Fette und Öle (z. B. Sojabohnenöl, Specköl, Hühneröl), Stärken, Glycerin, Mannit, Sorbit und dergleichen. Typische Stickstoffquellen umfassen: Ammoniak, Ammoniumsulfat, Aminosäuren, wie Glycin, Arginin, Threonin, Methionin, Trypton, Pepton, komplexe Quellen, wie Hefeautolysate, Malzarten, Sojabohne, Baumwollsamen, Tomatenpaste, Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt und Fermentationsnebenprodukte, wie Vollhefe und lösliche Destillierrückstände. Weitere wesentliche Nährstoffe werden durch Mineralsalze, wie die Chloride, Nitrate, Sulfate, Carbonate und Phosphate von Natrium, Kalium, Ammonium, Magnesium und Calcium, bereitgestellt. Das Nährmedium kann auch Quellen anorganischer Spurenelemente, wie Magnesium, Eisen, Kupfer, Mangan, Zink, Kobalt, Cadmium, Molybdän und dergleichen, enthalten. Es ist natürlich möglich, zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums anorganische oder organische Säuren, Laugen, Puffer etc. oder für Entschäumungszwecke geeignete Mengen an Ölen, grenzflächenaktiven Mitteln etc. zuzugeben.
Gewöhnlich wird der Stamm, der den IMPase-hemmenden Komplex erzeugt, in einem Schüttelkolben vorgezüchtet, und anschließend wird die Kultur zum Animpfen von Gefäßfermentem zur Herstellung von beträchtlichen Mengen der IMPase-hemmenden Verbindungen verwendet. Das für die Vorkultur verwendete Medium kann dasselbe wie das für größere Fermentationen verwendete sein, jedoch können auch andere Medien verwendet werden.
Der Stamm, der den IMPase-hemmenden Komplex erzeugt, wird bei Temperaturen von 20ºC bis 40ºC, bevorzugt 24ºC bis 35ºC gezüchtet, besonders bevorzugt ist eine Tempe ratur von etwa 25ºC.
Die Fermentation kann durch ein beliebiges Verfahren, wie eine stationäre, geschüttelte oder aerobe gerührte Kultur, durchgeführt werden; bevorzugt wird eine Schüttel- oder Oberflächenkultur verwendet, wobei die Fermentation auf einem Rotationsschüttelapparat besonders bevorzugt ist.
Die Bewegung und Belüftung des Kulturgemisches können auf mehrere Arten durchgeführt werden. Die Bewegung kann durch einen Propeller oder eine ähnliche mechanische Bewegungsvorrichtung, durch Rotieren oder durch Schütteln des Fermenters, durch verschiedene Pumpvorrichtungen oder durch Leiten von steriler Luft durch das Medium bereitgestellt werden. Die Belüftung kann durch Leiten von steriler Luft durch das Fermentationsgemisch durchgeführt werden.
Während der Fermentation kann die Erzeugung des IMPase-hemmenden Komplexes durch Untersuchung der Nährlösung oder von Myzelextraktproben auf die IMPase-hemmende Wirksamkeit, zum Beispiel durch Biotests oder DC- oder HPLC-Verfahren, kontrolliert werden.
Im allgemeinen ist die Fermentation in etwa 3 bis 5 Tagen beendet.
Die Gewinnung des IMPase-hemmenden Komplexes aus dem Myzel oder den Fermentationsnährlösungen der erzeugenden Mikroorganismen wird gemäß an sich bekannten Verfahren, wie Extraktion mit Lösungsmitteln, Fällung durch Zugabe von Nichtlösungsmitteln oder durch Änderung des pH-Wertes der Lösung, Verteilungschromatographie, Umkehrphasenverteilungschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Molekülausschlußchromatographie und dergleichen, durchgeführt.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung der IMPase-hemmenden Verbindungen der Erfindung umfaßt Extrahieren des filtrierten oder zentrifugierten Myzels mit einem mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel, Einengen der Extrakte und Gewinnen der rohen IMPase-hemmenden Verbindungen durch Fällung, gegebenenfalls unter Zugabe eines Fällungsmittels, durch Extraktion des wäßrigen Rückstands mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel oder durch Adsorptionschromatographie und nachfolgende Elution des erwünschten Produkts aus der Adsorptionsmatrix.
Der in dieser Patentanmeldung verwendete Begriff "mit Wasser mischbares Lösungsmittel" soll die gegenwärtig in dem Fachgebiet für diesen Begriff angegebene Bedeutung haben und betrifft Lösungsmittel, die bei den Bedingungen der Verwendung in einem angemessen breiten Konzentrationsbereich mit Wasser mischbar sind.
Beispiele von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, die bei der Ex traktion der antibiotischen Substanzen der Erfindung aus der Myzelmasse verwendet werden können, sind: Niederalkanole, z. B. (C&sub1;-C&sub3;)-Alkanole, wie Methanol, Ethanol und Propanol; Phenyl-(C&sub1;-C&sub3;)-alkanole, wie Benzylalkohol; niedere Ketone, z. B. (C&sub3;-C&sub4;)-Ketone, wie Aceton und Methylethylketon; cyclische Ether, wie Dioxan und Tetrahydrofuran; Glykole und ihre Produkte partieller Veretherung, wie Ethylenglykol, Propylenglykol und Ethylenglykolmonomethylether; niedere Amide, wie Dimethylformamid und Diethylformamid.
Der in dieser Patentanmeldung verwendete Begriff "mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel" soll die gegenwärtig in dem Fachgebiet für diesen Begriff angegebene Bedeutung haben, und betrifft Lösungsmittel, die bei den Bedingungen der Verwendung in einem angemessen breiten Konzentrationsbereich, der für die beabsichtigte Verwendung geeignet ist, mit Wasser geringfügig mischbar oder mit Wasser praktisch nicht mischbar sind.
Beispiele von mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln, die bei der Extraktion der antibiotischen Substanzen der Erfindung aus einer wäßrigen Phase verwendet werden können, sind: die üblichen Kohlenwasserstofflösungsmittel, die linear, verzweigt oder cyclisch sein können, wie Hexan oder Cyclohexan; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan, Fluorbromethan, Dibromethan, Trichlorpropan, Chlortrifluoroctan und dergleichen; aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol, Xylol und dergleichen; Ester aus wenigstens vier Kohlenstoffatomen, wie Essigsäureethylester, Essigsäurepropylester, Buttersäureethylester und dergleichen; Alkanole aus wenigstens vier Kohlenstoffatomen, die linear, verzweigt oder cyclisch sein können, wie Butanol, 1-Pentanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 1-Hexanol, 2-Hexanol, 3-Hexanol, 3,3-Dimethyl-I-butanol, 4- Methyl-1-pentanol, 3-Methyl-1-pentanol, 2,2-Dimethyl-3-pentanol, 2,4-Dimethyl-3-pentanol, 4,4-Dimethyl-2-pentanol, 5-Methyl-2-hexanol, 1-Heptanol, 2-Heptanol, 5-Methyl-1-hexanol, 2-Ethyl-1-hexanol, 2-Methyl-3-hexanol, 1-Octanol, 2-Octanol, Cyclopentanol, 2-Cyclopentylethanol, 3-Cyclopentyl-1-propanol, Cyclohexanol, Cycloheptanol, Cyclooctanol, 2,3-Dimethylcyclohexanol, 4-Ethylcyclohexanol, Cyclooctylmethanol, 6-Methyl-S-hepten-2-ol, 1-Nonanol, 2-Nonanol, 1-Decanol, 2-Decanol und 3-Decanol; unverzweigte oder verzweigte Alkylether und Gemische davon, wie Petrolether, Ethylether, Propylether, Butylether etc.; und Gemische oder funktionelle Derivate davon.
Beispiele von Fällungsmitteln sind Petrolether, Niederalkylether, wie Ethylether, Propylether und Butylether, und Niederalkylketone, wie Aceton. Bevorzugt wird Ethylether verwendet.
Wie in dem Fachgebiet bekannt ist, kann die Produktextraktion durch Aussalzen oder durch Zugabe eines geeigneten organischen Salzes, das mit dem Antibiotikum ein Ionenpaar bildet, das in dem Extraktionslösungsmittel löslich ist, verbessert werden.
Wie in dem Fachgebiet bekannt ist, kann die Phasentrennung durch Aussalzen verbessert werden.
Beispiele stationärer Phasen, die nutzbringend in dem vorstehenden chromatographischen Adsorptionsschritt zur Gewinnung des rohen IMPase-hemmenden Komplexes nach dem Einengen der Myzelextrakte verwendet werden, sind Silicagel (z. B. ICN Biomedicals Silica 32-62, 60 Å), silanisiertes Silicagel (z. B. Hibar Lichrosorb RP 18; Beckman Ultrasphere ODS), Aluminiumoxid, Kieselgur, Kohlenstoff, Polystyrolharze (z. B. Amberlite XAD2 oder XAD4, Rohm und Haas; Dowex M112 oder 5112, Dow Chemical Co.; Diaion HP 20, Mitsubishi), Acrylharze (z. B. XAD7 oder XAD8, Rohm und Haas), Polyamidharze, wie Polycaprolactame, Nylonarten und vernetzte Polyvinylpyrrolidone (z. B. Polyamid-CC 6, Polyamid-SC 6, Polyamid-CC 6, 6, Polyamid-CC 6AC und Polyamid-SC 6AC, Macherey-Nagel & Co., Westdeutschland; PA 400, M. Woelm AG, Westdeutschland; und das Polyvinylpyrrolidonhar2 PVP-CL, Aldrich Chemie GmbH & Co., KG, Westdeutschland) und vernetzte Dextrane mit regulierten Poren (z. B. Sephadex LH-20, Pharmacia Fine Chemicals, Ab). Bevorzugt werden Polystyrolharze verwendet, wobei das Harz S 112 besonders bevorzugt ist.
Das bevorzugte Lösungsmittel zum Eluieren des IMPase-hemmenden Komplexes aus der Adsorptionsmatrix hängt von der speziellen stationären Phase ab.
Wenn Silicagel oder Aluminiumoxid verwendet wird, sind zum Beispiel bevorzugte Lösungsmittel halogenierte Kohlenwasserstoffe, Niederalkanole, Ether, höhere Ketone und Gemische davon; ein niederes Keton, wie Aceton, oder ein niederer Alkohol, wie Methanol, kann mit Kohlenstoff als stationäre Phase verwendet werden; mit Wasser mischbare Lösungsmittel oder Gemische davon, wie Ethanol, sind bevorzugte Elutionsmittel für Polystyrol- oder Acrylharze, während wäßrige Gemische aus mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln für Polyamidharze bevorzugt sind.
Eine Reinigung der rohen, IMPase-hemmenden Verbindungen wird gemäß an sich bekannten Verfahren, zum Beispiel durch Suspendieren des Rohprodukts in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Aceton, und Entfernen des Niederschlags, erhalten. Die einzelnen Komponenten des Komplexes werden anschließend durch bekannte chromatographische Verfahren getrennt; zum Beispiel können MPLC-Trennsysteme verwendet werden, wobei Silicagel als stationäre Phase und Hexan/Aceton als mobile Phase verwendet werden.
Wie vorstehend angegeben, hat es sich gezeigt, daß sowohl 6'β-Stachybotrydial als auch MDL63394 eine hemmende Wirksamkeit gegen das Enzym Inositmonophosphatase (EC 3.1.3.:25) zeigen.
Zur Bestimmung der Wirksamkeit wird IMPase mit einer höheren Reinheit als 90 %, wie durch SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) beurteilt, wie in P. D. Pelton und A. J. Ganzhorn, Journal Biolog. Chem., 267, 1992, S. 5916-5920, beschrieben, gereinigt. Das Enzym kann aus tierischem Gehirn oder aus rekombinanten E. coli Stämmen, die tierische IMPase exprimieren, gereinigt werden. Obwohl rohe Enzymzubereitungen ebenfalls verwendet werden können, ist die Verwendung von gereinigtem Enzym bevorzugt. Das gereinigte Enzym weist routinemäßig eine spezifische Aktivität von 25 umol Pi/min/mg Protein auf, wie mit 4 mM 2-Glycerinphosphat als Substrat in einer Standardanalyse (P. V. Attwood et al., Biochem. Jour., 1988, 253, S. 387-394) bestimmt wurde.
Die Enzymaktivität kann gemäß A. J. Ganzhorn und M. C. Chanal, Biochem., 1990, 29, bestimmt werden; das Reaktionsgemisch enthält 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM Magnesiumchlorid und 0,1 mM EGTA. Anschließend werden 5 ug/ml IMPase und 4 mM 2- Glycerinphosphatsubstrat zu dem Reaktionsgemisch gegeben; in einer anderen Ausführungsform ist es auch möglich, das Substrat direkt in das Reaktionsgemisch zu geben, bevor das Enzym zugegeben wird.
Die Reaktion wird 30 Minuten nach der Zugabe des Substrats oder des Enzyms (in Abhängigkeit davon, welches später zugegeben wird) als beendet angesehen; das freigesetzte Phosphat wird durch Molybdatfärbung (P. V. Attwood et al., Biochem. Jour., 1988, 253, S. 387-394) bei 350 nm mit einem Spektrophotometer UV 2100 von Shimadzu bestimmt.
Die Enzymreaktion wird entweder in Abwesenheit oder in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an 6'β-Stachybotrydial oder MDL63394 durchgeführt, um die Menge an Inhibitor zu bestimmen, die zur Hemmung der Enzymaktivität um 50% (IC50) erforderlich ist; die Ergebnisse sind, verglichen mit der Wirksamkeit von L-671,776, in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Verbindung IC50 ug/ml
6'β-Stachybotrydial 25
MDL63394 80
L-671,776 180
Dieselben Ergebnisse werden erhalten, wenn die vorstehende Analyse bei 37ºC durchgeführt wird.
Auf der Basis der vorstehenden Ergebnisse können die Verbindungen 6'β-Stachybotrydial und MDL63394 als antimanische und antidepressive Mittel im therapeutischen Bereich Anwendung finden.
Ferner können die Verbindungen der Erfindung in einem Analysenverfahren zum Nachweis von IMPase verwendet werden.
Zur Behandlung von manischen oder depressiven Symptomen können die Verbindungen der Erfindung als solche verabreicht werden oder mit pharmazeutisch verträglichen Trägern formuliert werden; die Verabreichung kann oral, parenteral oder rektal erfolgen.
Zur oralen Verabreichung können die Verbindungen der Erfindung in festen oder flüssigen Zubereitungen, wie Kapseln, Pillen, Tabletten, Pastillen, Pulver, Sirupen, Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen, formuliert werden.
Zur Herstellung fester Zusammensetzungen, wie Tabletten, wird der Hauptwirkstoff mit einem pharmazeutischen Träger, d. h. herkömmlichen Tablettierbestandteilen, wie Lactose, Saccharose und Maisstärke, in Kombination mit Bindemitteln, wie Gummi arabicum, Maisstärke oder Gelatine, Sprengmitteln, wie Kartoffelstärke oder Alginsäure, Gleitmitteln, wie Stearinsäure oder Magnesiumstearat, und weiteren pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, wie Wasser, gemischt, wobei eine feste Vorformulierungszusammensetzung, die ein homogenes Gemisch enthält, gebildet wird. Wenn diese Vorformulierungszusammensetzungen als homogen bezeichnet werden, bedeutet das, daß der Wirkstoff gleichmäßig in der ganzen Zusammensetzung dispergiert ist, so daß die Zusammensetzung leicht in gleich wirksame Einheitsdosierungsformen, wie Tabletten, Pillen, Kapseln und dergleichen, aufgeteilt werden kann. Diese feste Vorformulierungszusammensetzung wird anschließend in Einheitsdosierungsformen des vorstehend beschriebenen Typs aufgeteilt, die 50 bis etwa 350 mg des Wirkstoffes der vorliegenden Erfindung enthalten. Die Tabletten oder Pillen der neuen Zusammensetzungen können überzogen oder anderweitig kombiniert werden, um eine Dosierungsform, die den Vorteil einer verlängerten Wirkung bietet, bereitzustellen. Die Tablette oder Pille kann zum Beispiel eine innere und eine äußere Dosierungskomponente umfassen, wobei die letztere in Form einer Hülle über der ersteren vorliegt. Die zwei Komponenten können durch eine darmlösliche Schicht getrennt sein, die dazu dient, der Auflösung im Magen zu widerstehen, und es der inneren Komponente erlaubt, intakt in den Zwölffingerdarm zu gelangen oder eine verzögerte Freisetzung aufzuweisen.
Die flüssigen Formen, in die die neue Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zur oralen Verabreichung eingeschlossen sein kann, umfassen wäßrige Lösungen, geeignet aromatisierte Sirupe, wäßrige oder ölige Suspensionen, aromatisierte Emulsionen mit Speiseölen, wie Baumwollsamenöl, Sesamöl, Kokosnußöl, Erdnußöl und dergleichen, sowie Elixiere und ähnliche pharmazeutische Träger. Geeignete Dispergier- oder Suspendiermittel für wäßrige Suspensionen umfassen synthetische und natürliche Gummiarten, wie Tragant, Gummi arabicum, Alginat, Dextran, Natriumcarboxymethylcellulose, Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine und dergleichen.
Zur parenteralen Verabreichung können die Verbindungen der Erfindung in geeigneten injizierbaren Zubereitungen, die einen flüssigen Träger enthalten, formuliert werden. Dieser Träger weist normalerweise keine therapeutische Wirkung auf und sollte nicht toxisch sein. Beispiele von zur Herstellung injizierbarer Dosierungsformen der Verbindungen der Erfindung geeigneten Trägern sind Wasser, wäßrige Träger (z. B. Natriumchloridinjektionen, Dextroseinjektionen etc.), mit Wasser mischbare Lösungsmittel (z. B. Ethylalkohol, Polyethylenglykol, Propylenglykol etc.) und nicht-wäßrige Träger (z. B. "fette Öle", wie Maiskeimöl, Baumwollsamenöl, Erdnußöl und Sesamöl). Gegebenenfalls kann die injizierbare Zubereitung ferner Puffer zur Stabilisierung der Lösung (z. B. Citrate, Acetate und Phosphate) und/oder Antioxidationsmittel (z. B. Ascorbinsäure oder Natriumhydrogensulfit) enthalten. Der erwünschte Weg der parenteralen Verabreichung stellt Anforderungen an die spezielle Formulierung. Suspensionen werden zum Beispiel wegen der Gefahr unlöslicher Teilchen, die Kapillaren verstopfen, nicht direkt in den Blutstrom verabreicht, während subkutan zu verabreichende Lösungen eine genaue Berücksichtigung der Tonizitätseinstellung erfordern, sonst verursacht eine Reizung der Nervenenden in dem anatomischen Bereich ausgeprägte Schmerzen.
Nützliche Angaben für die Zubereitungen geeigneter oraler, parenteraler oder rektaler Dosierungsformen können in: Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage, 1985, 1985 (Merck Publishing Company, Easton, Pennsylvania), gefunden werden.
Die Dosierung des Wirkstoffes hängt von vielen Faktoren ab, die den Typ, das Alter und den Zustand des Patienten, den speziellen Wirkstoff und die spezielle Formulierung, die für die Verabreichung ausgewählt wurden, den Verabreichungsplan etc. umfassen. Im allgemeinen ist eine Dosierungshöhe von etwa 10-20 mg/kg/Tag bei einem Behandlungsschema von 1-4 mal am Tag bevorzugt.
Es ist selbstverständlich, daß das genaue Behandlungsausmaß von der Krankengeschichte des zu behandelnden Patienten abhängt, und letzten Endes bleibt das genaue Behandlungsausmaß, das unter die vorstehenden Richtlinien fällt, dem Ermessen des Therapeuten überlassen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele ausführlicher veranschaulicht.

Beispiel 1

Fermentationsverfahren zum Erhalt des IMPase-hemmenden Komplexes

Ein Anteil von 2 ml einer in Glycerin gefrorenen Kultur ATCC20928 wird aufgetaut und aseptisch auf drei Schrägkulturen, die festes PCA-Medium (20 g/l Kartoffelbrei, 20 g/l Karottenbrei, 20 g/l Agar) enthalten, übertragen. Etwa 10 Tage später wird eine Schrägkultur zum Animpfen eines 500 ml Erlenmeyerkolbens mit Kerben, der 100 ml steriles Medium (pH 6,8) mit 40 g/l Tomatenpaste, 5 g/l zerstäubtes Maisquellwasser, 10 g/l Kartoffelstärke, 10 g/l Glucose und 10 ml eines Spurenelementgemisches enthält, verwendet. Das Spurenelementgemisch enthält 1 g/l FeSO&sub4;·7H&sub2;O, 1 g/l MnSO&sub4;·4H&sub2;O, 25 mg/l CuCl&sub2;·2H&sub2;O, 100 mg/l CaCl&sub2;·2H&sub2;O, 56 mg/l H&sub3;BO&sub3;, 19 mg/l (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4;·4H&sub2;O und 200 mg/l ZnSO&sub4;·7H&sub2;O.
Das Gemisch wird mit 150 UpM 3 Tage bei 25ºC inkubiert.
Fünf Prozent Inokulum werden zum Animpfen eines 15 Liter-Fermenters mit 12 Litern des Impfmediums, das wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, verwendet. Die Fermentation wird etwa 4 Tage bei 25ºC unter einem Luftstrom im Bereich von 6 Litern/Minute und einer Schüttelgeschwindigkeit von 200-500 UpM durchgeführt.

Beispiel 2

Gewinnung des IMPase-hemmenden Komplexes aus dem Fermentationsgemisch

8 l des gemäß Beispiel 1 fermentierten Gemisches werden geerntet, und das Myzel wird durch Filtration mit einer Hyflo-Filtermatrix entfernt. Der IMPase-hemmende Komplex wird aus dem Filtrat (3 Stunden Rühren, diskontinuiertlich) auf 250 ml Polystyrolharz S 112 (Dow Chemical Company) adsorbiert. Das Harz wird anschließend gewonnen, mit Wasser gewaschen und mit 1 l EtOH eluiert. Die Eluate werden unter reduziertem Druck eingeengt, und der wäßrige Rückstand wird lyophilisiert, wobei roher IMPase-hemmender Komplex entsteht.

Beispiel 3

Reinigung des IMPase-hemmenden Komplexes und Isolierung der einzelnen Faktoren L-671,776, 6'β-Stachybotrydial und MDL63394.

Die rohe Zubereitung (gemäß Beispiel 2 erhalten) wird in Aceton suspendiert, der Niederschlag wird mit einer Zentrifuge abgetrennt und verworfen. Der Überstand wird unter reduziertem Druck eingeengt, und 3 g der erhaltenen Probe werden anschließend auf den Kopf einer vorher mit Hexan äquilibrierten Silicagelsäule (470 · 30 mm, Teilchengröße 230-400 Mesh ASTM, Merck 9385) aufgetragen.
Eine Stufenfraktionierung des rohen Gemisches wird mit einem Mitteldruckgerät (präparatives LC-System B680 A von BUCHI) durch Eluieren bei einer Fließgeschwindigkeit von 35 ml/min mit zunehmenden Mengen Aceton (Lösungsmittel B) in Hexan (Lösungsmittel A) gemäß dem folgenden Gradienten durchgeführt:
von 0% B bis 40% B in 120 Minuten,
isokratisch bei 40% B für 10 Minuten und
von 40% B bis 100% B in 20 Minuten.
Fraktionen von 35 ml werden aufgenommen, und jede Fraktion wird durch DC (auf Silicagel unter Verwendung von Hexan : Aceton, 6 : 4, als mobile Phase) analysiert und auf IMPasehemmende Wirksamkeit (gemäß dem vorstehend zitierten A. J. Ganzhorn und M. C. Chanal, Biochem., 1990, 29) untersucht.
Die Fraktionen, die denselben Einzelfaktor enthalten, werden vereinigt, getrocknet, erneut in t-Butanol gelöst und lyophilisiert, wobei die reinen Verbindungen L-671,776, 6'β- Stachybotrydial und MDL63394 erhalten werden.
Eine DC-Analyse der drei Faktoren auf Silicagel unter Verwendung von Hexan : Aceton (6 : 4) als mobile Phase zeigt die folgenden Rf-Werte:
Verbindung L-671,776 = 0,26;
6'β-Stachybotrydial = 0,48;
MDL63394 = 0,23.

Claims

1. Sesquiterpenverbindung mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

A) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

Lösungsmittel Lambda max (nm)

MeOH 222, 284

0,1 M KOH 231, 291, 334

B) Positivionen-FAB-Spektrum auf einem Finnigan TSQ 700-Dreistufen-Quadrupol- Massenspektrometer; Sattelfeld-Atomkanone mit Xe-Gas bei einer Spannung von 8 kV und einem Strom von 0,23 mA; Glycerin/Wasser-Matrix:

FABIMS-Hauptpeak bei 387 (MH+) bestimmt

C) Re-Wert von 0,48 in dem folgenden DC-System: Hexan : Aceton, 6 : 4 (VW) auf Silicagel.

D) NMR-Spektren in CDCl&sub3; mit einem Bruker AM 500-Gerät unter Verwendung von TMS als internen Standard aufgenommen (δ, ppm = 0), (s = Singulett; d = Dublett; br s = breites Singulett; m = Multiplett):

¹H-NMR bei 500 MHz aufgenommen, (δ, ppm): 10,65 s, 10,40 s, 6,94 s, 3, 41 br s, 3, 19d, 2, 84d, 2,00-1,72 m, 1,70-1,40 m, 1,022m, 0,89 s, 0,77 s;

¹³C-NMR bei 125,76 MHz aufgenommen, (δ, ppm): 193, 5, 188, 6, 167, 6, 157, 5, 138, 1, 119, 5, 111, 5, 109, 1, 100,7, 75, 7, 42, 3, 40,1, 37, 6, 37, 1, 31, 2, 30,7, 28, 3, 24, 7, 24, 2, 22, 3, 21,0, 16, 1, 15, 5.

2. Sesquiterpenverbindung mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

A) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

Lösungsmittel Lambda max (nm)

MeOH < 200, 275

0,1 M KOH < 200, 282, 337

B) Positivionen-FAB-Spektrum auf einem Finnigan TSQ 700-Dreistufen-Quadrupol- Massenspektrometer; Sattelfeld-Atomkanone mit Xe-Gas bei einer Spannung von 8 kV und einem Strom von 0,23 mA; Glycerin/ Wasser-Matrix:

FAB/MS-Hauptpeak bei 403 (MH+) bestimmt

C) Rf-Wert von 0,23 in dem folgenden DC-System: Hexan : Aceton, 6 : 4 (V/V) auf Silicagel.

3. Verbindung der Formel IV

in der R und R¹ beide eine Einheit der Formel -CHO bedeuten oder einer der Reste R oder R¹ eine Einheit der Formel -CHO und der andere eine Einheit der Formel -COOH darstellt.

4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß den Ansprüchen 1. 2 oder 3, das umfaßt:

a) Züchten eines Pilzes der Gattung Memnoniella oder Stachybotrys, der einen IMPasehemmenden Komplex, der die IMPase-hemmenden Verbindungen 6'β-Stachybotrydial und/- oder MDL63394 enthält, erzeugen kann, unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält;

b) Gewinnen des IMPase-hemmenden Komplexes aus der Fermentationsnährlösung und/- oder aus dem Myzel;

c) Reinigen des erhaltenen rohen Komplexes und Isolieren der Verbindungen 6'β-Stachybotrydial und/oder MDL63394.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der Pilz der Gattung Memnoniella Memnoniella echinata ATCC 20928 oder eine einen IMPase-hemmenden Komplex erzeugende Variante oder Mutante davon ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der IMPase-hemmende Komplex aus dem Myzel durch Extrahieren des filtrierten oder zentrifugierten Myzels mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, Einengen der Extrakte und Gewinnen des rohen IMPase-hemmenden Komplexes durch Fällung, durch Extraktion des eingeengten wäßrigen Rückstandes mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel oder durch Adsorptionschromatographie und nachfolgende Elution des erwünschten Produkts von der Adsorptionsmatrix gewonnen wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die einzelnen Faktoren des IMPase-hemmenden Komplexes durch chromatographische Verfahren getrennt werden.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die einzelnen Faktoren des IMPase-hemmenden Komplexes durch MPLC unter Verwendung von Silicagel als stationäre Phase und Hexan/Aceton als mobile Phase getrennt werden.

9. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, 2 oder 3 in einem Analyseverfahren zum Nachweis von Inositmonophosphatase.

10. Verbindung gemäß Anspruch 1. 2 oder 3 zur Verwendung als Medikament.

11. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, 2 oder 3 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung manischer und depressiver Symptome.

12. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1, 2 oder 3 als den Wirkstoff im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

13. Arzneimittel gemäß Anspruch 12 zur Behandlung von Manie- und Depressionssymptomen.