CN116158305A - 米蕈松露的固态植菌栽培方法、培植基、米蕈松露营养补充品的制法及颗粒结构 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种米蕈松露的固态植菌栽培方法、培植基、米蕈松露营养补充品的制法及颗粒结构，该栽培方法为先备取胚芽米、黄豆粉、米糠粉及糖蜜、纯水，混合搅拌均匀以作为培植基，再将培植基加热蒸煮，降温后置入菇包袋，再将菇包袋与培植基进行杀菌，灭菌后将松露菌丝发酵液加入菇包袋，继而将菇包袋置于农场中培植数个月，即可收成米蕈松露，其次，将米蕈松露水萃取后干燥并研磨成粉末，再将该米蕈松露粉末制成复数米蕈松露颗粒，使各该米蕈松露颗粒吸附水萃取的萃取液，继而将吸附萃取液的各该米蕈松露颗粒与复数包覆粉末制成复数颗粒状的米蕈松露营养补充品。

Description

米蕈松露的固态植菌栽培方法、培植基、米蕈松露营养补充品 的制法及颗粒结构

技术领域

本发明与米蕈有关，更详而言之是指一种米蕈松露的固态植菌栽培方法、栽培米蕈松露的培植基及米蕈松露营养补充品的制法。

背景技术

食药用蕈菇类(菌丝体与子实体)的营养价值高且脂质含量低，近代科学研究报告指出，食药用蕈菇类含有多种生理活性物质，例如蛋白质、多糖体、超氧歧化酵素(SOD)等，具有提高免疫调节等功效，因此，食药用蕈菇类成为近年来备受注目机能性保健食品，米蕈为食药用蕈菇类之一，意指利用米为主要培植原料栽培的蕈菇类。

已知米蕈的培育方式为利用米糠作为培养基，利用酵母菌发酵而获得米蕈菌丝体。近年来亦有业者利用香菇菌等菌种于米糠上培育成菌丝体(块状)后，再将其置于一液态发酵设备内经过复数日发酵后，即可透过液态发酵的方式培育出米蕈菌丝体。此外，亦有固态发酵培育米蕈的技术，如中国公开CN110074398号专利所示，其主要将干燥的米糠和紫米打碎后加入浓缩香菇菌发酵液以获得基础原料，再将基础原料区分为数份后分别植入出芽酵母菌、牛樟菇菌与北虫草菌，分别经过不同天数的发酵后，即可获得不同成分的原料以组成米蕈。

由上可知，目前所见的米蕈培育方式不论是液态发酵或固态发酵，皆属于发酵的技术范畴，虽然发酵技术培育米蕈的速度较快，不过，培育出的米蕈仅为菌丝体，营养价值不如子实体。其次，前述专利的基础原料中米糠与紫米仅打碎，其营养成分并不会被酵母菌、牛樟菇菌与北虫草菌有效、完全地吸收，会影响所培育米蕈的营养价值。

其次，松露属于蕈类，常见的有黑松露、白松露等，富含多糖、三萜、多酚、类黄酮、γ-胺基丁酸、牛磺酸、神经酰胺、α-雄烷醇、植物固醇、多元不饱和脂肪酸等生理活性代谢物，并且具有抗氧化活性、降血糖、抗发炎、抗菌活性、抗肿瘤活性、免疫调节和舒缓神经等作用，营养价值甚高。松露一般于野外适当的土壤环境下与松树等树木共生，目前人工种植松露的技术，大多是将松露菌种与小树苗的根融合成菌根苗后，再将菌根苗移栽植树，并不易大量生产。

基此，若能研发出可大量生产的松露栽培技术，并将其制作为人体易吸收的米蕈松露营养补充品，将对人们甚有助益。

发明内容

本发明的主要目的即在提供一种米蕈松露的固态植菌栽培方法、栽培米蕈松露的培植基及米蕈松露营养补充品的制法，其利用蕈菇类的固态栽培法栽培出松露子实体，营养成分远高于已知液态发酵及固态发酵培育的米蕈菌丝体，且，栽培过程安全卫生、品质稳定，易于量产，甚具实用价值。

缘是，为达成前述的目的，本发明提供一种米蕈松露的固态植菌栽培方法，其步骤包含备取培植基并搅拌均匀：备取重量比为5：1：1：1的胚芽米、黄豆粉、米糠粉及纯水，以及与纯水体积比为1：100的糖蜜，并混合搅拌均匀以作为培植基；蒸煮：将搅拌均匀的培植基加热蒸煮以熟成胚芽米、黄豆粉及米糠粉；第一次静置：将蒸煮完成的培植基静置降温；装袋：将降温后的培植基置入若干菇包袋；灭菌：将该菇包袋与培植基进行杀菌；第二次静置：静置灭菌后的该菇包袋；添加菌丝发酵液：将培养真菌子实体的松露菌丝发酵液加入该菇包袋内的培植基中；培植：将该菇包袋置于农场中培植4至5个月，使真菌子实体的松露菌丝吸收该培植基的养分而生长；收成：于该菇包袋收成米蕈松露。

较佳地，添加菌丝发酵液的步骤中，该松露菌丝发酵液为白松露菌丝发酵液。

此外，本发明更提供一种栽培米蕈松露的培植基，包含有混合均匀的胚芽米、黄豆粉、米糠粉、糖蜜及纯水，且胚芽米、黄豆粉、米糠粉与纯水的重量比为5：1：1：1，糖蜜及纯水的体积比为1：100。

再者，本发明更提供一种米蕈松露营养补充品的制法，以固态植菌栽培方法所栽培的米蕈松露为原料制备，其制法至少包含有以下步骤：备取米蕈松露：采收利用胚芽米为主要原料所栽培的若干米蕈松露；水萃取：利用水萃法对若干米蕈松露进行萃取以获得萃取液，该萃取液中包含米蕈松露营养成分的水萃物；干燥并研磨：将经过水萃取的米蕈松露予以干燥、去除水分后研磨成粉末；第一次造粒：将该米蕈松露粉末制成复数米蕈松露颗粒；加入萃取液：将该萃取液加入各米蕈松露颗粒，使各该米蕈松露颗粒吸附萃取液；第二次造粒：将吸附萃取液的各该米蕈松露颗粒与复数包覆粉末制成复数颗粒状的米蕈松露营养补充品；过筛：筛选出预定粒径的米蕈松露营养补充品；检测：进行该米蕈松露营养补充品的含水量及微生物检测；包装：将符合含水量及微生物检测的米蕈松露营养补充品进行包装。

较佳地，米蕈松露与水的固液比为1：10。

佳地，干燥并研磨的步骤中，利用热风烘干方式将米蕈松露干燥。

较佳地，第二次造粒的步骤中，各该包覆粉末喷洒结合于各米蕈松露颗粒表面。

较佳地，各该包覆粉末为米蕈松露粉末或/及其他营养成分之一。

较佳地，包含至少13％的蛋白质及至少19％的多糖体等营养成分。

再者，本发明更提供一种依据前述米蕈松露营养补充品的制法所制成的米蕈松露蛋白营养补充品的颗粒结构，包含有一米蕈松露内核，以复数米蕈松露粉末聚集而成，一蛋白外层，以米蕈松露萃取的米蕈真菌蛋白包覆于该米蕈松露内核的外侧而成。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一种米蕈松露的固态植菌栽培方法、栽培米蕈松露的培植基及米蕈松露营养补充品的制法，其利用蕈菇类的固态栽培法栽培出松露子实体，营养成分远高于已知液态发酵及固态发酵培育的米蕈菌丝体，且栽培过程安全卫生、品质稳定，易于量产，甚具实用价值。

附图说明

图1为本发明米蕈松露的固态植菌栽培方法一较佳实施例的流程图。

图2为本发明米蕈松露营养补充品的制法一较佳实施例的流程图。

图3为本发明所制备米蕈松露蛋白营养补充品的颗粒结构剖面示意图。

图4为本发明米蕈松露营养补充品中多糖体的组成定量分析图。

图5为本发明米蕈松露营养补充品中腺苷的HPLC图谱。

图6为本发明米蕈松露营养补充品抑制ACE2和TMPRSS2表现的底片显影图。

图7(A)、图7(B)为本发明米蕈松露营养补充品活化CD4和CD8活性的流式细胞检测结果图。

图8(A)、图8(B)、图8(C)、图8(D)为小鼠肝、肾及肺正常组织与口服本发明米蕈松露营养补充品后的肝、肾及肺组织染色显微放大图，显示大量抑制ACE2和TMPRSS的蛋白质表现。

图9(A)为小鼠注射人类肝癌HepG2细胞的控制组与喂食本发明米蕈松露营养补充品的低剂量组、高剂量组的肿瘤大小变化图。

图9(B)为小鼠注射人类肝癌HepG2细胞的控制组与低剂量组、高剂量组的肿瘤重量变化图。

图9(C)为小鼠注射人类肝癌HepG2细胞的控制组与低剂量组的肿瘤相片。

图9(D)为小鼠注射人类肝癌HepG2细胞的控制组与低剂量组、高剂量组的Ki67和C-caspase-3组织染色显微放大图。

图9(E)为小鼠注射人类肝癌HepG2细胞的控制组与低剂量组、高剂量组的肝、肾组织染色显微放大图。

图10(A)为小鼠注射人类结肠直肠癌细胞株HCT-116的控制组与喂食本发明米蕈松露营养补充品的低剂量组、高剂量组的肿瘤大小变化图。

图10(B)为小鼠注射人类结肠直肠癌细胞株HCT-116的控制组与低剂量组、高剂量组的肿瘤重量变化图。

图10(C)为小鼠注射人类结肠直肠癌细胞株HCT-116的控制组与低剂量组的肿瘤相片。

图10(D)为小鼠注射人类结肠直肠癌细胞株HCT-116的控制组与低剂量组、高剂量组的Ki67和C-caspase-3组织染色显微放大图。

图10(E)为小鼠注射人类结肠直肠癌细胞株HCT-116的控制组与低剂量组、高剂量组的肝、肾组织染色显微放大图。

具体实施方式

以下，兹举本发明数个较佳实施例，并配合附图作进一步的详细说明如后：

请参阅图1所示，本发明一较佳实施例的米蕈松露的固态植菌栽培方法100，其第一步骤为备取培植基并搅拌均匀110：备取重量比为5：1：1：1的胚芽米、黄豆粉、米糠粉与纯水，及与纯水体积比为1：100的糖蜜置入一锅具中混合搅拌均匀，以作为培植基，培植基的酸碱值pH约5.8。前述胚芽米、黄豆粉、米糠粉及糖蜜、纯水皆为可食用的原料，各原料的量视米蕈的栽培量而定，例如备取10公斤的胚芽米时，黄豆粉与米糠粉取2公斤，此时糖蜜取20cc，纯水备取2公升。另，调整该培植基酸碱值的方式属已知技术(例如添加医疗级的碳酸钙等配方)，此处不予赘述。

本发明的第二步骤为蒸煮120：将搅拌均匀的培植基加热蒸煮3小时，使胚芽米、黄豆粉、米糠粉熟成并使养分溶出。

本发明的第三步骤为第一次静置130：将蒸煮完成的培植基静置3小时以降温。

本发明的第四步骤为装袋140：将降温后的培植基分别置入数个已知的菇包袋，如同已知栽培菇类的方式。

本发明的第五步骤为灭菌150：将各菇包袋与培植基置于一已知杀菌釜中灭菌1小时以进行杀菌。

本发明的第六步骤为第二次静置160：将灭菌后的菇包袋静置4小时。

本发明的第七步骤为添加菌丝发酵液170：将培养真菌子实体的松露菌丝发酵液加入各菇包袋内的培植基。该松露菌丝发酵液为白松露菌丝发酵液，当然，其亦可为其他种类的松露菌丝发酵液。

本发明的第八步骤为培植180：将各菇包袋置于农场中培植4至5个月，使菌丝可将培植基分解、代谢而吸收培植基的营养成长。该农场概如已知蕈菇类的室内栽培场所，温度、光照强度与湿度等环境条件要求亦概如已知蕈菇类栽培场所，此处不予赘述。

本发明的最后步骤为收成190：当各该菇包袋长满米蕈松露菇体(米蕈培植的白松露)时即可收成(通常是指长出初菇、子实体时，菇包袋内会充满米蕈松露的子实体)，米蕈松露可直接食用，亦可供萃取营养成分再制为其他营养食品或营养补充品，如后所述。

本发明更提供栽培米蕈松露的培植基，该培养基包含有混合均匀的胚芽米、黄豆粉、米糠粉、糖蜜及纯水，且胚芽米、黄豆粉、米糠粉与纯水的重量比为5：1：1：1，且糖蜜及纯水的体积比为1：100。

再者，本发明亦提供一种米蕈松露栽培包，包含有一菇包袋；一培植基，置于该菇包袋内，包含混合均匀并熟成的胚芽米、黄豆粉、米糠粉、糖蜜及纯水，且胚芽米、黄豆粉、米糠粉及纯水的重量比为5：1：1：1，且糖蜜及纯水的体积比为1：100。

前述培植基中采用的胚芽米是指糙米(日本称为玄米)去除表面的米糠后所剩带有胚乳、胚芽的米粒，而胚芽米去除胚芽后即为一般人常食用的精米/精白米(仅剩胚乳部分)，经研究，米的营养成分占比胚芽约占65％、米糠占30％、胚乳占5％，亦即，米的营养成分大多集中在胚芽、其次为米糠，胚芽蕴含丰富的蛋白质、淀粉、膳食纤维、多种维生素及钙、铁、锌、硒等微量元素以及生物活性物质，能发育成胚叶并生长，因此，胚芽米习称为具有生命力的活米，当然，就营养价值而言，糙米高于胚芽米(糙米表面有米糠)、胚芽米高于精米，如前述，米糠的营养成分亦不少，但糙米表面的米糠仅占整体5％、含量不高，是以，本发明的培植基以胚芽米为主要原料并搭配含量更多的米糠粉，营养成分较糙米更高，并搭配富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、膳食纤维、矿物质、维生素与胺基酸等营养成分的黄豆粉，具备松露菌丝生长所需的各种营养成分，供松露菌丝健康地生长，配合该蒸煮120步骤使培植基的营养成分更易释出被松露菌丝吸收。

由上可知，本发明运用固态植菌寄宿栽培法栽培出米蕈松露(本实施例为白松露)的子实体，不仅有别于已知利用发酵(液态与固态发酵)培育米蕈的菌丝体的技术，由于培植基采用胚芽米、营养成分高，栽培出的米蕈松露营养成分远高于已知米蕈的菌丝体，且，本发明栽培松露的方式较已知结合松露菌种与小树苗为菌根苗后移栽植树的方式简便，便于量产而具经济效益。其次，经分析，本发明栽培的米蕈松露包含约13.1％的蛋白质及约19.4％的多糖体等营养成分，多糖体的比例甚高，可具有很高的免疫调节效果，食用本发明米蕈松露可使免疫异常及免疫低下状态恢复到正常，并产生其他保健效果，且本发明栽培过程安全卫生、品质甚为稳定，甚具实用价值。

此外，如前所述，本发明所栽培的米蕈松露除了可直接食用，更可作为原料供萃取营养成分再制为营养食品或营养补充品，如图2所示，本发明更提供一种米蕈松露营养补充品的制法200，其第一步骤为备取米蕈松露210：采收前述利用胚芽米为主要原料所栽培的新鲜米蕈松露(子实体)。

该制法200的第二步骤为水萃取220：先将米蕈松露切削为片状或块状后置于一容器中(图中未示)，再以米蕈松露与水的固液比为1：10的比例加入纯水，加热适当时间(沸腾后约30分钟至1小时之间)后可获得萃取液，再加以过滤、收集滤液，借以可利用水萃法萃取米蕈松露的营养成分，该萃取液中包含米蕈松露营养成分的水萃物，包含蛋白、多糖体及腺苷等。

该制法200的第三步骤为干燥并研磨230：将经过水萃取的米蕈松露予以干燥、去除水分后研磨成粉末。干燥的方式可为日晒、热风烘干或冷冻干燥等技术均可，本实施例采用热风烘干。

该制法200的第四步骤为第一次造粒240：运用喷雾造粒技术将部分米蕈松露粉末制成复数米蕈松露颗粒，详言之，将70％至80％的米蕈松露粉末混合纯水呈浆状后，于一已知流动床喷雾造粒干燥设备内以微滴状喷洒而出(利用流动床喷雾造粒干燥设备的喷枪喷洒)，使各该米蕈松露粉末可受热空气干燥成颗粒状，以获致复数米蕈松露颗粒。前述流动床喷雾造粒干燥设备乃属已知技术，此处不予赘述其详细构成。其次，将各该米蕈松露粉末制成颗粒状的技术并不限于前述的喷雾造粒技术，亦可为其他造粒技术。

该制法200的第五步骤加入萃取液250：将该萃取液加入各米蕈松露菇体颗粒，使各该米蕈松露颗粒吸附萃取液，加入萃取液的动作可在一容器(图中未示)内进行。

该制法200的第六步骤为第二次造粒260：运用喷雾造粒技术将吸附萃取液的各该米蕈松露颗粒制成复数颗粒状的米蕈松露营养补充品，详言之，将吸附萃取液的各该米蕈松露颗粒置于已知流动床喷雾造粒干燥设备中，使各该米蕈松露颗粒可受热风吹动而浮动，再将复数包覆粉末(例如第一次造粒240使用剩下的20％至30％米蕈松露粉末)喷洒于均匀浮动状态的米蕈松露颗粒上(利用流动床喷雾造粒干燥设备的喷枪喷洒)，使各该包覆粉末可结合于复数米蕈松露颗粒表面，然后干燥至所需的含水量，以获致复数颗粒状的米蕈松露营养补充品。当然，将各该涂布材料粉末设置于米蕈松露颗粒表面的技术并不限于前述的喷雾造粒技术，亦可为其他技术。其次，该包覆粉末不限为米蕈松露粉末，亦可包含其他营养成分或为其他营养成分。

该制法200的第七步骤为过筛270：以80目筛网过筛各该颗粒状的米蕈松露营养补充品，以获得低于80目粒径的米蕈松露营养补充品。

该制法200的第八步骤为检测280：将各该米蕈松露营养补充品进行含水量及微生物检测，含水量需低于1至5％(视后续步骤的包装材料类型而调整)，微生物则须为无检出。

该制法200的最后步骤为包装290：将符合含水量及微生物检测的米蕈松露营养补充品进行包装，例如装袋或填装为胶囊。

借此，该制法200所制备的米蕈松露营养补充品是利用整颗米蕈松露菇体(子实体)制成，不仅含有米蕈松露的完整营养成分(包含约13.1％的蛋白质及约19.4％的多糖体等营养成分)，且，透过前述萃取水萃物、使各米蕈松露颗粒吸附水萃物后再喷粉造粒的方式，可使营养成分更快速地被人体分解与吸收，获致提高免疫功能等保健效果。

其次，如前述第二次造粒260步骤所述，该包覆粉末不限为米蕈松露粉末，亦可包含其他营养成分或为其他营养成分，例如，该包覆粉末可为米蕈松露萃取的米蕈真菌蛋白，如图3所示，该包覆粉末包覆于米蕈松露颗粒表面后可形成米蕈松露蛋白营养补充品的颗粒结构10，该颗粒结构10即包含一米蕈松露内核12(即米蕈松露颗粒)与一蛋白外层14(即米蕈松露萃取的米蕈真菌蛋白)。

借此，该米蕈松露蛋白营养补充品的颗粒结构10可供适量汇集后容纳于胶囊或包装袋中贩售。

其次，该米蕈松露蛋白营养补充品进入消化道后，胃酸先接触外层的该蛋白外层14，利用该蛋白外层14先被胃消化酵素分解，可避免该米蕈松露内核12过早接触胃酸、被胃酸破坏，可提高营养成分被人体完整吸收的效果。

以下，兹就本发明所制备的米蕈松露营养补充品的营养成分分析及保健功效进行相关实验与说明：

首先，分析米蕈松露营养补充品中多糖体的组成，使用一已知高效阴离子交换层析仪搭配脉冲式电流侦测法(pulsed amperometric detection,PAD)，可在短时间内完成糖类分子的分析。可先进行标准溶液的配制，取预先经烘箱70℃干燥4小时以上的半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖及麦芽糖对照用标准品各约2.5g，分别以50％乙醇溶液溶解并定容至50mL，作为标准原液，再取适量的各标准原液混合，以去离子水稀释至0.5～30μg/mL，作为标准溶液。接着，再进行检液的配制，将该米蕈松露营养补充品混匀后，取约1g置于一离心管中，加入50％乙醇溶液10mL，以超音波振荡20分钟，再经一振荡器振荡10分钟，再以50％乙醇溶液定容至20mL，于9000×g离心30分钟，取适量的上清液，以去离子水稀释50倍，经一滤膜过滤供作检液。

接着，精确量取检液及标准溶液各10μL，分别注入高效阴离子交换层析仪中进行分析，就检液与标准溶液所得波峰的滞留时间比较鉴别之，并依下列计算式求出检体中各糖类的含量(g/100g)：

检体中各糖类的含量(g/100g)＝C*V*F/M*10000

C：由标准曲线求得检液中各糖类的浓度(μg/mL)、V：检体最后定容的体积(20mL)、M：取样分析检体的重量(g)、F：稀释倍数(50)。

检验结果，该米蕈松露营养补充品的多糖体组成分析定量如表一及图4所示:

表一：

由上可知，该米蕈松露营养补充品的多糖体的组成为果糖、葡萄糖与麦芽糖。另，前揭该高效阴离子交换层析仪的操作方式、测定条件与脉冲式电流侦测法的分析方法乃已知技术，此处不予赘述。

此外，该米蕈松露营养补充品中亦包含有腺苷，可使用一已知高效液相层析仪(HPLC)进行腺苷含量的分析，先进行标准溶液的配制，取腺核苷对照用标准品约10mg，以去离子水溶解并定容至10mL，再以去离子水稀释至1～200μg/mL，供作标准溶液。接着，再进行检液的调制，将米蕈松露营养补充品混匀后，取约0.5g，加入去离子水20mL混合，于60℃超音波振荡30分钟后静置冷却，再以去离子水定容至25mL，于5500×g离心3分钟，取上清液，经一滤膜过滤后作为检液。再精确量取检液及标准溶液各10μL，分别注入该高效液相层析仪中分析腺苷含量，先制作腺苷标准曲线，再以相同条件下进行腺苷含量的分析：就检液与标准溶液所得波峰的滞留时间及吸收图谱比较鉴别之，并依下列计算式求出检体中腺核苷的含量(mg/g)：

检体中腺核苷的含量(mg/g)＝C*V/M*1000

C：由标准曲线求得检液中腺核苷的浓度(μg/mL)、V：检体最后定容的体积、M：取样分析检体的重量(g)。

分析后发现，如图5所示，该米蕈松露营养补充品的腺苷(Adenosine)含量为0.39(mg/1g)，腺苷常作为增能剂，在传统医学中更被认为有利于疾病的治疗。

其次，胜肽蛋白除了具有生理调控功能外，近年来其抗菌、抗病毒的活性也逐渐被发现与重视，例如，可抵抗流感病毒A型与B型、反转录病毒HIV，B型肝炎与C型肝炎，泡疹病毒以及肠病毒等，相关研究指出，胜肽抗病毒的活性主要有抑制病毒进入细胞、抑制病毒复制、抑制病毒DNA或RNA的合成。其次，自2019年起，冠状病毒(COVID-19)已在世界各国造成严重感染甚至死亡，此种病毒是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARSCoV-2)带有一种刺突蛋白的冠状病毒。SARS-CoV-2病毒包膜上的刺突蛋白结构域可以直接与血管紧张素转换酶2(ACE2)结合，这是一种膜相关的酶，SARS-CoV-2刺突蛋白可以被切割并被跨膜蛋白酶活化，包括丝氨酸2(TMPRSS2)，从而促进SARS-CoV-2进入宿主细胞。SARS-CoV-2对ACE2的高亲和力可能促进人与人之间的传播传送。因此，减少ACE2的蛋白质表达和TMPRSS2在宿主细胞中，可能是一种有效的策略预防和治疗SARS-CoV-2感染方法。

基此，本发明更进行该米蕈松露营养补充品的抗病毒活性及免疫调节的实验与分析：

首先，配制好该米蕈松露营养补充品的10mg/mL浓度原液(Stock)后，再进行细胞培养(利用HepG2细胞，即人肝细胞癌细胞系)及细胞存活率试验，然后，使用已知西方墨点法(Western blot)侦测相关蛋白质变化，其内容包含细胞蛋白质抽取、蛋白质定量、蛋白质电泳等步骤后进行暗房底片显影。经分析，该米蕈松露营养补充品的蛋白质分子量约为25kDa，水解该米蕈松露营养补充品的分子量约为13kDa。

接着，进行COVID-19棘蛋白受体结合抑制剂潜力机制和免疫学研究，以小黑鼠(C57BL/6mice；18–20g；5–7weeks)为实验动物，将其分为控制组以及每日口服该米蕈松露营养补充品的口服组，每周三次记录每只小鼠的体重，并在第7天牺牲。实验结束时收集小黑鼠的血液、组织样品和淋巴结，将血清保持在-80℃，组织固定在10％福尔马林中，淋巴结放入磷酸盐缓冲生理盐水(PBS溶液)中，收集上清液，以750×g离心10分钟后，弃去上清液，将细胞置于0.5mL PBS中。然后进行已知流式细胞仪(BD biosciences)检测。

利用西方点墨法分析该米蕈松露营养补充品对ACE2和TMPRSS2所产生的蛋白质变化，经分析发现，该米蕈松露营养补充品在没有细胞毒性之下在反应24小时候会大量抑制ACE2和TMPRSS蛋白质表现，如图6所示。

其次，细胞的表面带有CD4+的标志，会协助活化B细胞产生抗体，也可协助细胞毒性T细胞及巨噬细胞发挥免疫功能，且，细胞的表面亦带有CD8+的标志，它的功能就像杀手或细胞毒素，会辨识和消灭肿瘤细胞。小黑鼠的淋巴细胞透过流式细胞仪检测分析口服该米蕈松露营养补充品对CD4和CD8所产生的活性变化，在没有细胞毒性之下CD4和CD8均会活化，CD4约活化3倍到12倍，CD8会活化3倍到6倍，如图7(A)、图7(B)所示。

再者，取小鼠组织肝、肾和肺脏进行H&E染色分析和免疫组织化学分析。用以判断ACE2和TMPRSS2在小鼠组织肝、肾和肺脏中的表现。利用西方点墨法分析该米蕈松露营养补充品对ACE2和TMPRSS2所产生的蛋白质变化，发现该米蕈松露营养补充品的口服组在H&E染色下不具有毒性，且在肝、肾和肺脏会大量抑制ACE2和TMPRSS的蛋白质表现，如图8(A)至图8(D)所示。

据此，由于临床试验中证实TMPRSS2抑制剂能阻止SARS-CoV-2进入肺细胞，而口服该米蕈松露营养补充品的小鼠在肝、肾和肺脏可大量抑制ACE2和TMPRSS的蛋白质表现，因此，该米蕈松露营养补充品显然可以抑制病毒进入细胞，进而提高免疫力、保护人体不受病毒的侵害。

其次，本发明更利用小鼠进行该米蕈松露营养补充品的抗癌(抗人类肝癌HepG2及抗人类结肠直肠癌细胞株HCT-116)动物实验分析：

小鼠分为对照组、低剂量(150mg/Kg)组与高剂量(300mg/Kg)组，饲养第2周时于所有小鼠左右侧臀部分别各一次皮下注射人类肝癌HepG2细胞(细胞数2×10⁶)和人类结肠直肠癌细胞株HCT-116(细胞数2×10⁶)，肿瘤体积成长至50–100mm³时，开始给予低剂量喂食组与高剂量喂食组小鼠每天口服该米蕈松露营养补充品一次，实验期间纪录小鼠的体重变化及每周纪录肿瘤的体积改变，实验八周后，存活的小鼠以CO₂牺牲，取出肝脏、肾脏等器官与血液、肿瘤并记录以进行后续的实验与分析。

一、抗人类肝癌HepG2动物实验部分：

如图9(A)显示，在36天的观察期间，与对照组相比，喂食米蕈真菌胜肽的小鼠表现出对人类肝癌HepG2肿瘤体积减小的显着效果，并呈现浓度依赖性。详言之，高剂量组的给药从第15天起显着减弱了对人类肝癌HepG2肿瘤体积，而低剂量组从第21天起显示出对肿瘤体积的显着抑制，且肿瘤重量显着的抑制，如图9(B)、(C)所示。另，为了确定该米蕈松露营养补充品抑制人类肝癌HepG2负瘤小鼠的机制，对肝癌HepG2肿瘤中C-caspase-3(肿瘤细胞凋亡的标志物)和Ki67(肿瘤细胞增殖的标志物)的免疫(IHC)染色从经该米蕈松露营养补充品喂食的小鼠和赋形剂对照小鼠中采取检体。与对照组相比，在该米蕈松露营养补充品喂食组的肿瘤中检测到C-caspase-3表达显着增加和Ki67表达降低，如图9(D)所示。切片结果显示，食用该米蕈松露营养补充品可降低癌细胞增殖并诱导肝癌HepG2肿瘤中caspase依赖性凋亡。

除此的外，检查了小鼠肾脏和肝脏标本的组织病理学特征，以评估该米蕈松露营养补充品喂食对负瘤小鼠的一般毒性。在显微镜下，与经媒介物处理的小鼠相比，从低剂量组和高剂量组的小鼠采样的肾脏和肝脏组织中均未观察到明显变化，如图9(E)所示。组织病理学特征的结果表明，该米蕈松露营养补充品对带有肝癌HepG2肿瘤的小鼠没有明显的细胞毒性。体内数据共同证明，该米蕈松露营养补充品抑制了皮下肝癌HepG2肿瘤的生长并诱导了细胞凋亡，而在小鼠中未显示明显的细胞毒性，这表明该米蕈松露营养补充品可能为安全且有吸引力的抗肝癌药物候选。

二、抗人类结肠直肠癌细胞株HCT-116动物实验部分：

如图10(A)显示，在41天的观察期间，与对照组相比，喂食该米蕈松露营养补充品的小鼠表现出对人类结肠直肠癌细胞株HCT-116肿瘤体积减小的显着效果，并呈现浓度依赖性。详言之，高剂量组的给药从第25天起显着减弱了对结肠直肠癌细胞株HCT-116肿瘤体积，而低剂量组从第30天起显示出对肿瘤体积的显着抑制，且肿瘤重量显着的抑制，如图10(B)、(C)所示。另，为了确定该米蕈松露营养补充品抑制人类结肠直肠癌细胞株HCT-116负瘤小鼠的机制，对结肠直肠癌细胞株HCT-116肿瘤中c-caspase-3(肿瘤细胞凋亡的标志物)和Ki67(肿瘤细胞增殖的标志物)的免疫(IHC)染色从经该米蕈松露营养补充品喂食的小鼠和赋形剂对照小鼠中采取检体。与对照组相比，在低剂量组与高剂量组的肿瘤中检测到c-caspase-3表达显着增加和Ki67表达降低，如图10(D)所示。切片结果显示，该米蕈松露营养补充品在体内可降低癌细胞增殖并诱导人类结肠直肠癌细胞株HCT-116肿瘤中caspase依赖性凋亡。

除此之外，检查小鼠的肾脏和肝脏标本的组织病理学特征，以评估该米蕈松露营养补充品喂食对负瘤小鼠的一般毒性。在显微镜下，与经媒介物处理的小鼠相比，从喂食低剂量和高剂量的小鼠采样的肾脏和肝脏组织中均未观察到明显变化，如图10(E)所示。组织病理学特征的结果表明，该米蕈松露营养补充品对带有结肠直肠癌细胞株HCT-116肿瘤的小鼠没有明显的细胞毒性。体内数据共同证明，该米蕈松露营养补充品抑制了皮下结肠直肠癌细胞株HCT-116肿瘤的生长并诱导了细胞凋亡，而在小鼠中未显示明显的细胞毒性。这表明该米蕈松露营养补充品可能为安全且有吸引力的抗前列腺癌药物候选。

据此，该米蕈松露营养补充品在动物实验中可以抑制人类肝癌HepG2和结肠直肠癌细胞株HCT-116的生长，通过肿瘤中组织切片染色后，更发现该米蕈松露营养补充品会促进癌细胞中C-caspase-3的活化，最终导致细胞凋亡而抑制肿瘤生长，对于人体食用应具有正向的效益。

综上所述，本发明利用蕈菇类的固态栽培法栽培出松露(米蕈松露)的子实体，营养成分远高于已知液态发酵及固态发酵培育的米蕈菌丝体，且，栽培过程安全卫生、品质稳定，易于量产，甚具实用价值。

以上所述仅为本发明的数个较佳实施例而已，并非用以限制本发明，任何所属技术领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的修改、更动与润饰，因此本发明的保护范围当视所附的权利要求书所界定为准。

Claims (10)

1.一种米蕈松露的固态植菌栽培方法，其特征在于，至少包含有以下步骤：

备取培植基并搅拌均匀：备取重量比为5：1：1：1的胚芽米、黄豆粉、米糠粉及纯水，以及与纯水体积比为1：100的糖蜜，并混合搅拌均匀以作为培植基；

蒸煮：将搅拌均匀的培植基加热蒸煮以熟成胚芽米、黄豆粉及米糠粉；

第一次静置：将蒸煮完成的培植基静置降温至冷却；

装袋：将冷却后的培植基置入若干菇包袋；

灭菌：将该菇包袋与培植基进行杀菌；

第二次静置：静置灭菌后的该菇包袋；

添加菌丝发酵液：将培养真菌子实体的松露菌丝发酵液加入该菇包袋内的培植基中；

培植：将该菇包袋置于农场中培植4至5个月，使真菌子实体的松露菌丝吸收该培植基的养分而生长；及

收成：于该菇包袋收成米蕈松露。

2.如权利要求1所述米蕈松露的固态植菌栽培方法，其特征在于，添加菌丝发酵液的步骤中，该松露菌丝发酵液为白松露菌丝发酵液。

3.一种栽培米蕈松露的培植基，其特征在于，包含有混合均匀的胚芽米、黄豆粉、米糠粉、糖蜜及纯水，且胚芽米、黄豆粉、米糠粉与纯水的重量比为5：1：1：1，糖蜜及纯水的体积比为1：100。

4.一种米蕈松露营养补充品的制法，其特征在于，以如权利要求1或2所述固态植菌栽培方法所栽培的米蕈松露为原料制备，其制法至少包含有以下步骤：

备取米蕈松露：采收利用胚芽米为主要原料所栽培的若干米蕈松露；

水萃取：利用水萃法对若干米蕈松露进行萃取以获得萃取液，该萃取液中包含米蕈松露营养成分的水萃物；

干燥并研磨：将经过水萃取的米蕈松露予以干燥、去除水分后研磨成粉末；

第一次造粒：将该米蕈松露粉末制成复数米蕈松露颗粒；

加入萃取液：将该萃取液加入各米蕈松露颗粒，使各该米蕈松露颗粒吸附萃取液；

第二次造粒：将吸附萃取液的各该米蕈松露颗粒与复数包覆粉末制成复数颗粒状的米蕈松露营养补充品；

过筛：筛选出预定粒径的米蕈松露营养补充品；

检测：进行该米蕈松露营养补充品的含水量及微生物检测；及

包装：将符合含水量及微生物检测的米蕈松露营养补充品进行包装。

5.如权利要求4所述的米蕈松露营养补充品的制法，其特征在于，米蕈松露与水的固液比为1：10。

6.如权利要求4所述的米蕈松露营养补充品的制法，其特征在于，干燥并研磨的步骤中，利用热风烘干方式将米蕈松露干燥。

7.如权利要求4所述的米蕈松露营养补充品的制法，其特征在于，第二次造粒的步骤中，各该包覆粉末喷洒结合于各米蕈松露颗粒表面。

8.如权利要求7所述的米蕈松露营养补充品的制法，其特征在于，各该包覆粉末为米蕈松露粉末或/及其他营养成分之一。

9.如权利要求4所述的米蕈松露营养补充品的制法，其特征在于，包含至少13％的蛋白质及至少19％的多糖体等营养成分。

10.一种米蕈松露蛋白营养补充品的颗粒结构，其特征在于，依据权利要求4所述的米蕈松露营养补充品的制法所制成，包含有一米蕈松露内核，以复数米蕈松露粉末聚集而成，一蛋白外层，以米蕈松露萃取的米蕈真菌蛋白包覆于该米蕈松露内核的外侧而成。

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