CN102784160B - 连翘苷作为唯一活性成分在制备改善认知功能及治疗阿尔茨海默症药物中的应用 - Google Patents
连翘苷作为唯一活性成分在制备改善认知功能及治疗阿尔茨海默症药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明在于公开了天然药用植物活性成分连翘苷的新用途,具体地说是涉及连翘苷作为唯一活性成分在制备改善认知功能及治疗阿尔茨海默症药物中的应用。动物和细胞研究结果表明:连翘苷具有确切的认知功能改善作用,可显著改善老龄及阿尔兹海默症模型动物空间学习记忆能力;升高老龄动物中枢单胺类神经递质水平;降低阿尔兹海默症模型大鼠脑内早老素2基因表达;提高β-淀粉样蛋白诱导的人神经母细胞瘤细胞存活率。利用连翘苷配以相关辅料,用常规的制剂方法可制成针对性改善认知功能及治疗阿尔茨海默症的保健品或药物,上述保健品和药物可用于延缓和改善认知功能减退相关疾病如阿尔兹海默症的病程发展,提高老年人的健康素质和生命质量,实现健康老龄化的社会价值。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,具体涉及天然药用植物活性成分连翘苷作为唯一活性成分在制备改善认知功能及治疗阿尔茨海默症药物中的应用。
背景技术
连翘苷(CAS号487-41-2)是一种药用植物活性成分,其来源包括《中华人民共和国药典》收载的常用木犀科植物中药材——连翘Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实。
随着人口老龄化程度不断加深,老龄化认知功能减退及阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,一种神经退行性疾病,俗称老年性痴呆)越来越成为中国社会严重的问题之一。影响老年人认知功能减退的因素既有人口学因素(主要是年龄、受教育程度等),又有健康和疾病因素(如脑血管病史和阿尔茨海默症等)。认知功能正常是老年人健康不可缺少的一个重要方面,老龄化和病理性认知功能减退可诱导发生进行性认知功能障碍,可能导致后期老年人生活障碍、不能自理,严重危害老年人身心健康,相关的社会保障和医疗护理负荷不断加重,成为现代化社会亟待解决的问题之一。
通过对老龄动物、阿尔兹海默症动物和细胞模型的研究,我们发现连翘苷具有确切的认知功能改善作用:明显改善老龄小鼠及海马注射Aβ(β-淀粉样蛋白)的阿尔兹海默症大鼠的认知功能减退(空间学习记忆能力),提高老龄小鼠脑内中枢单胺类神经递质5-HT(5-羟色胺)、5-HIAA(5-羟吲哚乙酸)、NE(去甲肾上腺素)、DA(多巴胺)的水平;明显提高Aβ诱导的SH-SY5Y(人神经母细胞瘤)细胞的存活率。目前国内外均无连翘苷应用于制备改善认知功能及治疗阿尔茨海默症药物的报道,因此研究和开发利用连翘苷保护脑神经细胞,调节脑神经递质分泌,改善认知功能及治疗阿尔茨海默症极具价值。
发明内容
本发明的目的在于提供天然药用植物活性成分连翘苷的新用途,具体是提供了连翘苷作为唯一活性成分在制备改善认知功能及治疗阿尔茨海默症药物中的应用。
为实现上述技术目的,达到上述技术效果,本发明通过以下技术方案实现:
连翘苷作为唯一活性成分在制备改善认知功能及治疗阿尔茨海默症药物中的应用。
一种改善认知功能及治疗阿尔茨海默症的药物组合,包括连翘苷和药学上可接受的辅料。
优选的,每个制剂单位中所述连翘苷的含量为20-100mg。
优选的,所述药物组合为胶囊剂;所述胶囊剂的囊壳的组分包括明胶100mg和山梨醇20mg。
优选的,所述药物组合为口服液;所述口服液的组分包括连翘苷、水和增溶剂。
优选的,所述口服液中所述连翘苷为30-60mg,水和增溶剂5000ml。
优选的,所述增溶剂为聚乙二醇400,所述聚乙二醇400与口服液体积配比为5-20∶100。
优选的,所述药物组合为片剂或颗粒剂;所述片剂或颗粒剂包括连翘苷和环糊精;所述环糊精的重量为80-400mg。
优选的,所述药物组合为散剂、缓释制剂、速释制剂或注射剂。
本发明的有益效果如下:
1、本发明提供一种天然药用植物活性成分的新应用,可针对性改善认知功能减退,提高老年人的健康素质和生命质量,实现健康老龄化的社会价值;
2、本发明利用在体动物和体外细胞模型在行为学、病理生化指标和组织细胞水平上全面科学地评价并证明了连翘苷对认知功能减退及阿尔茨海默症病理指标的确切改善和治疗作用;
3、本发明所涉及的连翘苷对正常动物和细胞相关指标无显著影响,具有很好的安全性。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的实质,下面将用连翘苷的药理实验及结果来说明其在制备改善认知功能及治疗阿尔茨海默症药物中的应用。
实施例1:连翘苷干预老年鼠认知功能减退的实验研究
1.1动物
1月龄ICR鼠20只,8月龄ICR鼠80只,雌雄各半。
1.2药品
连翘苷购自江苏南京泽朗医药科技有限公司,HPLC检测纯度高于98%。
1.3试验设备
Morris水迷宫(Morris water maze)的组成:水迷宫由圆形水池(直径90cm,高50cm)、平台和记录系统三部分组成。随意将水池分为四个象限(东北、东南、西南和西北)。实验开始水池注水30cm深,并加入1斤奶粉,使水成不透明乳白色,水温保持在24℃±1℃左右。水池四周存在丰富的空间参照物(灯、摄像头及操作者等),且位置保持不变,以供小鼠定位平台。圆柱形平台直径9cm,高28cm,置于任一象限中央,平面没于水面下2cm。摄像头置于水池中央的上方约2m处,自动采集动物游泳图像,所收集信号直接输入计算机,由图像自动采集和分析系统统计动物行为学参数。
1.4分组
8月龄老年小鼠随机分为对照组和连翘苷治疗组(10mg/kg、30mg/kg、60mg/kg),每组20只,雌雄各半。每日灌胃给药一次,对照组给与等体积的双蒸水。8周后进行行为学测试。
1.5行为学测试
1.5.1隐蔽平台试验(Hidden Platform Trial)
试验前1d,动物于不含平台的水池中自由游泳90s2次,熟悉迷宫环境。试验时平台位置固定不变,置于东北象限中央,平台中点离池壁22.5cm。在平台对侧选两个与之距离相等的点作为入水点,训练时将动物面朝池壁轻轻放入水中,记录小鼠从入水至找到平台的游泳路线的长度及找到平台的时间(逃避潜伏期,escape latency),然后让小鼠在平台上停留10s。如果90s内找不到平台,潜伏期记为90s,并将小鼠置于平台上休息10s。每天于2个入水点各训练1次,以两次潜伏期的均值进行统计分析。所有实验小鼠均进行隐蔽平台试验5d,反向试验3d及可视平台试验1d,以评价不同治疗组认知功能(学习记忆能力)的变化。
1.5.2反向试验(Reversal Trial)
平台位置移至对面象限的中央,操作同隐蔽平台试验。
1.5.3可见平台试验(Visible Platform Trial)
为排除感觉、视觉或运动功能障碍对空间学习记忆的影响,day10进行可见平台试验。让平台位置露出水面2cm,并粘上黑色胶带,其余操作同隐蔽平台试验。
1.6数据处理
数据用均值±标准误表示,SPSS18.0统计软件单因素方差分析,P<0.05说明显著差异。
1.7结果
由表1可以看出:隐蔽平台实验和反向实验中连翘苷治疗组在训练第3天起成绩稳步提高,与老龄对照组比较有显著性差异。说明连翘苷可显著改善老龄小鼠的认知功能(空间学习记忆能力)。可见平台试验结果则提示动物在感觉、视觉或运动功能方面的差异未对其空间学习记忆产生明显的影响。
表1
*P<0.05,**P<0.01与模型组比较
实施例2:连翘苷对海马注射Aβ致阿尔兹海默症大鼠认知功能减退的改善
2.1动物
SD大鼠50只(8-10月龄,雌雄各半,体重380-400g),购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
2.2药品及试剂
连翘苷同实施例1;
Aβ1-42购自Sigma-Aldrich公司。
2.3分组
动物自由摄食和饮水,室温20℃-22℃,相对湿度为60%-70%,适养一周后随机分为对照组、模型组、连翘苷治疗组(10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg),每组10只,雌雄各半。于造模后3天开始灌胃给药;6周后进行行为学测试。
2.4海马CA1区注射Aβ大鼠模型
跳台实验筛选学习记忆功能正常大鼠。Aβ1-42二甲基亚枫溶解后在37℃恒温箱中孵育7天后备用。模型制备:水合氯醛i.p.麻醉,脑立体定位仪固定,平颅头位,按大鼠脑定位图谱,于前囱后3.0mm,中线右侧2.0mm处,用牙科钻钻开颅骨,暴露硬脑膜,微量注射器自脑表面垂直进针2.8mm,选择大鼠右侧海马缓慢注入2μl(10μg/μl)Aβ1-42,每侧注射时间为5min,留针5min,缓慢起针,局部消毒后缝合皮肤,肌注青霉素预防感染。对照组注射等体积的生理盐水(含与模型组等浓度的二甲基亚枫)。
2.5行为学观察
采用Morris水迷宫测试大鼠的学习、记忆能力。方法同实施例1。
2.6结果
由表2可以看出,双侧海马CA1区注射Aβ1-426周后,模型组大鼠在Morris水迷宫评价体系中的游泳持续时间和路径长度,与对照组比较有显著升高,连翘苷治疗组给药6周后,潜伏期显著缩短。
表2
*P<0.05,**P<0.01与模型组比较
实施例3:连翘苷对老龄小鼠脑内中枢单胺类神经递质的影响
3.1.仪器
HPLC检测系统:二元泵、层析柱、自动进样器、电化学检测器。
3.2药品与试剂
NE、DA、5-HT、5-HIAA:购自Sigma-Aldrich公司。
HPLC级高氯酸、乙腈:FisherScientific公司。
3.3检测方法
3.3.1标本制备
将实施例1行为学测试完成后的小鼠断头处死,冰台上迅速取出全脑,称重,液氮快速冷冻,-80℃保存。提取时全脑置冰冷的0.1mol/L高氯酸中匀浆20s(每0.1g脑重加入高氯酸1mL)。高氯酸中含0.04%(w/v)Na2S2O5和0.04%(w/v)EDTA。脑匀浆于4℃,14000×g离心20min。上清液以0.2μm滤膜滤过、分装,-80℃冷藏,用于单胺类神经递质检测。
3.3.2流动相
NaH2PO4:90mmol/L;柠檬酸:50mmol/L;OSA:1.7mmol/L;乙腈:10%;EDTA:100μmol/L。NaH2PO4、柠檬酸及OSA经0.2μm水系膜过滤后,加入经0.45μm有机系膜过滤的乙腈,加入EDTA,重蒸去离子水定容。
3.3.3色谱条件
C18色谱柱;150×4.6mm,5μm;进样量:10μL;流速:0.6mL/min;柱温:室温。
3.3.4检测条件
检测器:5600A型电化学检测器;
电极:M5040型分析电极;电势:-150、+450、+500、+550mV。
3.4结果
从表3可以看出,与老龄小鼠相比,连翘苷小鼠脑中海马5-HT、5-HIAA、NE、DA含量明显升高,均达到统计学意义。
表3
组别 | 5-HT | 5-HIAA | NE | DA |
对照组+双蒸水 | 7.74±1.33* | 5.24±0.81** | 7.74±0.91** | 3.74±0.65** |
老龄鼠+双蒸水 | 4.64±0.64 | 3.24±0.69 | 4.74±1.01 | 1.74±0.21 |
+连翘苷10mg/kg | 6.61±0.71* | 4.54±0.93* | 7.01±1.88* | 2.64±0.31* |
+连翘苷30mg/kg | 6.94±1.03* | 4.69±1.02* | 7.22±2.23* | 3.24±0.71* |
+连翘苷60mg/kg | 7.56±0.99* | 5.17±1.34* | 7.52±1.45* | 3.64±0.41** |
*P<0.05,**P<0.01与模型组比较
实施例4:连翘苷对老龄小鼠及海马注射Aβ大鼠脑内相关基因表达的调节作用
4.1.仪器
高速冷冻离心机,高速匀浆机,MBI-PCR仪等
4.2药品与试剂
Trizol Reagment:Invigen公司
M-ML反转录酶:Promega公司。
4.3PCR检测方法
将实施例1和实施例2行为学测试完成后的动物断头处死,冰台上迅速取出全脑,称重,液氮快速冷冻,-80℃保存。提取全脑总RNA,逆转录得到cDNA模板,根据NCBI数据库的淀粉样蛋白前体(amyloidprotein precursor,APP)、早老素1(presenilin1,PSEN1)和早老素2(presenilin2,PSEN2)基因设计引物,q-PCR进行目的基因扩增。内参基因为GAPDH,结果以对照组做归一处理。
4.4结果
从表4可以看出,与对照小鼠比较,老龄小鼠APP、PSEN1和PSEN2mRNA表达均无显著变化,连翘苷给药也无显著影响;与对照大鼠比较,海马注射Aβ大鼠脑中的APP、PSEN1mRNA表达无显著变化,而PSEN2mRNA表达显著升高,连翘苷中、高剂量给药均可显著降低上述模型大鼠脑中PSEN2mRNA表达。
表4
*P<0.05,**P<0.01与模型组比较
实施例5:连翘苷对SH-SY5Y细胞损伤模型保护作用
5.1细胞来源
人神经母细胞瘤株系SH-SY5Y细胞购自中国协和医科大学基础医学研究所。
5.2主要试剂
低限基本培养基(MEM)和营养混合物培养基(F12)培养基、胎牛血清、青/链霉素购于Gibco公司,非必需氨基酸购自于Hyclone公司,胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐(MTT)购于Amresco公司,Aβ25-35购于Sigma-Aldrich公司,乳酸脱氢酶(LDH)活性试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
5.3试验仪器
酶标仪,倒置相差显微镜,紫外分光光度计
5.4方法
5.4.1SH-SY5Y细胞的培养
SH-SY5Y细胞按照ATCC方法进行培养,即细胞以完全培养基置于37℃,5%CO2培养箱中孵育,2天换液,3-4天传代。
5.4.2分组
对照组、模型组、连翘苷低、中、高浓度治疗组(以PBS倍比稀释配制成不同浓度,连翘苷浓度分别为5mg/L、50mg/L、500mg/L)。
5.4.3检测
取对数生长期的SH-SY5Y细胞,0.25%胰酶消化液消化细胞后,用完全培养基将细胞悬液浓度调整至2.5×104个/ml,接种于96孔板内,每孔200ul。置于CO2培养箱内孵育36h后,更换含一定浓度Aβ25-35的培养基,继续培养24h,然后吸取并保存细胞培养液以备LDH测定,细胞迅速加入含MTT(终浓度为50μg/ml)培养基100μl,CO2培养箱内孵育。酶标仪检测读取OD值。所收集的数据以细胞的存活率(公式:细胞存活率=所测细胞的OD/空白组细胞的OD值×100%)表示。
取细胞培养液,按照LDH试剂盒的说明进行操作,检测LDH活性。
5.5结果
光镜下可见随Aβ25-35浓度的增加SH-SY5Y细胞活力降低,胞浆混浊,细胞突起明显减少。高浓度Aβ25-35诱导部分细胞萎缩坏死,细胞贴壁不充分,有脱落。SH-SY5Y细胞的存活率随着Aβ25-35的浓度增高而呈下降趋势。同时,测定经处理后的细胞外液的LDH含量,发现LDH的漏出量也随着Aβ25-35的浓度增高而上升,说明了细胞的受损程度在加重。
3个浓度的连翘苷与受损的SH-SY5Y细胞共孵育后,SH-SY5Y细胞的存活率增加,细胞外液LDH的含量减少,证明连翘苷具有保护受损的SH-SY5Y神经细胞的作用。
实施例6:
将连翘苷按照常规制剂方法,加入水及适量增溶剂(聚乙二醇400)溶解,分装,灭菌,制备成连翘苷含量为100mg/ml的改善认知功能及治疗阿尔茨海默症用口服液;所述连翘苷口服液的重量体积配比为连翘苷60mg、水和增溶剂5000ml;所述增溶剂聚乙二醇400与口服液体积配比为20∶100。
将连翘苷按照常规制剂方法,软胶囊材质选用明胶100mg和山梨醇20mg,制备成连翘苷含量为100mg/粒的改善认知功能及治疗阿尔茨海默症用胶囊;
将连翘苷按照常规制剂方法,加入赋形剂环糊精400mg,混合均匀,制粒,压片,制备成连翘苷含量为100mg/片的改善认知功能及治疗阿尔茨海默症用片剂;
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
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