CN111920905A - 一种中药组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗肺部疾病的中药组合物及其制药用途，包括龙葵，百合，夏枯草，浙贝母，重楼，制黄精，沙参，半枝莲和白花蛇舌草,采用水提或醇提法制备，该组合物对肺部疾病具有治疗作用，特别是与氧化/抗氧化平衡失调或炎症反应有关的肺部疾病，包括HYP或MDA水平升高,或者TGF‑β的异常表达，或者SOD和GSH水平降低等，试验验证改善大鼠肺部组织，抗纤维化效果优于清肺合剂和吡非尼酮。

Description

一种中药组合物及其用途

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种中药活性组分及其制备治疗肺部疾病药物的用途。

背景技术

呼吸系统疾病主要为鼻、咽急性炎症，多由于病毒引发，或吸烟、采矿、工业废气粉尘过敏等，可导致气管支气管炎症和肺部疾病，严重时导致肺纤维化和肺水肿、肺栓塞等。随着城市化发展，人口密集度日益增高，个人的工作压力持续增高，很多人处于亚健康和免疫力低下的状态，而工业发展导致的空气污染问题，使得呼吸道疾病越来越普遍和严重，特别是伴随着流行性的肺炎细菌病毒，首先侵害的就是肺部免疫系统。

肺纤维化是一种非常严重的肺部疾病具有不可逆性和高致死率，病因尚不明确，病理特征多见肺部反复炎症损伤以及组织结构异常，肺部细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）异常的大量堆积，肺部成纤维细胞出现大量异常增殖。在临床上，肺纤维化患者主要表现为干咳、进行性呼吸困难，严重患者末期以呼吸衰竭致死。目前肺纤维化尚无确切有效的药物治疗，深入研究该疾病的发病机制，寻找有效治疗药物，具有非常重要的意义。目前学界最为认可的IPF（特发性肺纤维化idiopathic pulmonary fibrosis)发病机制是肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cell，AECs)出现异常反应，表现为AEC的反复损伤-异常修复-异常凋亡。AEC异常反应的出现可能是多种原因共同导致的，例如环境因素、基因突变、表观遗传变异等。在IPF的临床诊断方面，中西医有着不同的差异，西医有其明确的诊断标准，中医通常是依靠中医师的临床经验，未能有量化标准且不直观，中医诊断有着不足之处，且未能与西医平行对应上；在IPF的临床治疗方面，西医主要是基于慢性炎症假说用糖皮质激素和免疫抑制剂为主要治疗手段，其疗效欠佳。

中医临床常用的治疗肺病的清肺合剂起源于清肺方，最早可见于《景岳全书》，绵历甲子，1973年总结成中肺协定方，1976年开发为中肺合剂，原方由浙贝母、防己、白花蛇舌草、龙葵、重楼、半枝莲、白茅根、仙鹤草、夏枯草、天龙10味中药组成，主要用于肺癌、肺炎、放射性肺炎引起的咳嗽多痰、胸痛、咳血等。 2002年起对于清肺合剂的质量控制研究、药理药效研究、临床研究持续不断发展，取得了一定进展。

清肺合剂配伍以攻、清、泻为主，缺少养阴、补气药，而现代人亚健康状态免疫力低下通常由于气血问题，过于清攻不适合于免疫力低下患者，特别是后期纤维化患者。同时，清肺合剂由煎煮法制备，患者服用顺应性差。

发明内容

本发明目的是提供一种治疗肺部疾病的中药组合物，特别是口服液，在药理研究中，发现其对肺部损伤肺纤维化特别具有治疗作用。

本发明在清肺合剂古方基础上适当减少攻、清药味，增加补养肺阴、补气药，筛去白茅根、仙鹤草、防己、天龙四味中药，加入沙参(养阴清肺补气化痰)、百合(养阴润肺清心安神)、制黄精(滋阴润肺抑菌防病)三味中药。共九味中药，君药：浙贝母、白花蛇舌草，臣药：龙葵、重楼、半枝莲、南沙参、夏枯草，佐药：百合、制黄精。即所述的中药包括以下原料：龙葵，百合，夏枯草，浙贝母，重楼，制黄精，沙参，半枝莲和白花蛇舌草。

其中黄精归脾、肺、肾经，具有润肺益气的作用。黄精提取物具有抗氧化还原作用，可以通过降低过氧化氢和MDA含量实现对线粒体的保护作用，可以降低小鼠脑组织ROS和MDA值，提高SOD，GSH-Px，T-AOC活性。百合归肺经，具有养阴、精血的功效。百合多糖具有抗氧化和增强免疫力的作用。南沙参归肺、胃经，具有养阴润肺的作用。

其中最佳重量份为浙贝12 份，白花蛇舌草15份，龙葵15份，重楼5份，半枝莲15份，沙参12份，夏枯草8份，百合15 份，炙黄精15 份。

组合物中药效成分包括槲皮素，山奈酚，木犀草素，沃戈宁和/或β-谷甾醇。还包括绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素、贝母素甲和/或贝母素乙。

该组合物优选通过水提或醇提方法制备，

水提制备：称取浙贝，白花蛇舌草，龙葵，重楼，半枝莲，沙参，夏枯草，百合，炙黄精，置于蒸馏瓶中，加入8倍量的水，浸泡后恒温回流提取，过滤得滤液，药渣加入8倍量水第二次恒温回流，过滤得滤液，合并两次滤液旋转蒸发，即得；或者，

醇提制备：称取浙贝，白花蛇舌草，龙葵，重楼，半枝莲，沙参，夏枯草，百合，炙黄精，置于蒸馏瓶中，加入8倍量的质量浓度为50% 的酒精，浸泡后恒温回流提取，过滤得滤液，药渣加入8倍量50% 酒精，第二次恒温回流，过滤得滤液，合并两次滤液旋转蒸发，即得。

上述有效成分可以与药学上可接受的辅料制成药学上的剂型，这些剂型包括口服制剂如片剂、胶囊、口服液、冲剂等，静脉注射制剂如注射液、粉针剂、大输液等。优选口服液制剂。

动物实验显示，实验组与模型组相比，大鼠肺组织中TGF-β，HYP，MDA水平显著降低，SOD和GSH水平显著升高(p<0.05)。清肺口服液在对于GSH，SOD的调控上效果比清肺合剂及吡非尼酮明显。

本发明还包括如下技术方案：该药物组合物在制备治疗肺部相关疾病中的用途，所述疾病与氧化/抗氧化平衡失调或炎症反应有关。特别与如下指标失常相关:1）HYP或MDA水平升高,或者2）TGF-β的异常表达，或者3）SOD和GSH水平降低。所述疾病为肺部炎症，或肺纤维化。

本发明的有益效果是：

1）将润肺、养阴、补气摆在首要位置，加入三味新的中药成，特别是抗肺纤维化效果明显优于清肺合剂。从根本上对抗肺纤维化相关症候，以延缓肺纤维化进程，提高患者生存年限

2）方剂组方发挥多途径多靶点的特点，对于GSH，SOD的调控比清肺合剂及吡非尼酮（PFD）更明显。

3）通过对方剂组方靶点的研究，可以进一步选择活性有效成分，控制制剂的质量和提取效率。

附图说明

图1：各组小鼠肺组织HE染色结果（×200）

图2：大鼠肺组织TGF-β 免疫组化结果（×200）

图3：肺组织匀浆TGF-β、HYP、 SOD、 MDA、GSH含量

具体实施方式

通过下述实施例及实验对本发明进行进一步说明

其中主要实验试剂如下：

中药材均购自杭州华东中药饮片有限公司。

吡非尼酮(pirfenidone，PFD)(美国TargetMol公司，批号：T2386) 是《IPF诊治指南》推荐使用药物。具有抑制肺部炎症、胶原沉积的药理作用。

生理盐水(杭州民生药业有限公司，批号：C1805031)

博来霉素(美国MedChem Express公司，批号：27968)

小鼠抗人转化生长因子β1单克隆抗体（南京建成海浩生物科技有限公司，批号：AB92486）

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒-WST-1法(南京建成海浩生物科技有限公司，货号A001-3)

丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(南京建成海浩生物科技有限公司，货号A003-1)

还原型谷胱苷肽(glutathione，GSH)测定试剂盒(南京建成海浩生物科技有限公司，货号A006-2)

羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)测定试剂盒(南京建成海浩生物科技有限公司，货号A015-3)

转化生长因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)测试盒(南京建成海浩生物科技有限公司，货号H034)

实施例1：清肺口服液制备（水提）

称取浙贝12 g，白花蛇舌草15 g，龙葵15 g，重楼5 g，半枝莲15 g，沙参12 g，夏枯草8g，百合15 g，炙黄精15 g，置于蒸馏瓶中，加入8倍量(896 ml)的水，浸泡1小时，180℃恒温回流提取1.5小时，过滤得滤液，药渣加入8倍量水第二次180℃恒温回流1.5小时，过滤得滤液，合并两次滤液旋转蒸发到体积为896 ml，即得。

实施例2：清肺口服液（醇提）

称取浙贝12 g，白花蛇舌草15 g，龙葵15 g，重楼5 g，半枝莲15 g，沙参12 g，夏枯草8g，百合15 g，炙黄精15 g，置于蒸馏瓶中，加入8倍量(896 ml)的50% 酒精，浸泡1小时，180℃恒温回流提取1.5小时，过滤得滤液，药渣加入8倍量50% 酒精，第二次180℃恒温回流1.5小时，过滤得滤液，合并两次滤液旋转蒸发到体积为896 ml，即得。

实施例3：药理试验

1）实验动物

A.大鼠: 无特定病原体(Specific pathogen Free，SPF)级雄性CD(SD)大鼠108只(北京维通利华有限公司，动物合格证号：11400700359419)，在SPF级动物屏障系统内，将实验大鼠饲养于不锈钢铁丝笼中(500×350×200 mm)，每笼6只，检疫时间为5-7天，选取健康大鼠用于试验。

B.建立模型: 除去正常对照组外。以戊巴比妥静脉麻醉大鼠后，仰卧固定于鼠板，剪去颈毛，75%酒精+碘伏消毒皮肤。颈部切口逐层分离至暴露出气管，在目光直视下用1 ml注射器穿刺两软骨环间，保持针头与气道方向一致，一次性快速注射博来霉素3 mg/kg(体积不超过0.2 ml)，博来霉素注射后反复回抽两次，并快速竖立鼠板，保持大鼠身体直立，左右来回旋转1 min左右，使得药液尽可能均匀到达两侧肺部，最后缝合皮肤，碘伏消毒，并于创口处涂抹青霉素防止感染。

C.动物分组及给药方案

将上述大鼠于术后第二天，按体重随机分为6组：正常对照组(健康大鼠)、模型对照组、清肺合剂36 ml/kg组、清肺口服液水提组36 ml/kg、清肺口服液醇提组36 ml/kg、PFD组50mg/kg组，每组6只，以上各组受试动物按给药容量10 ml/kg灌胃给予相应受试物，除PFD每天2次外，其余各组每天1次。给药周期为21天，模型对照组受试物为不含活性药物的安慰剂。

D.样本采集

实验第7天、14天、21天各组随机抽取6只大鼠摘眼球取血(保留血清)。动物麻醉放血处死后，解剖，取出肺脏。从中间位置切断气管，夹住气管，一边提起气管，一边切断纵隔胸膜，摘取肺脏，适当灌注。将肺脏在缓冲中性福尔马林溶液中固定，于-80℃保存备用。

2）实验方法：

A.肺组织苏木素-伊红（H＆E）染色，横切取材，用乙醇进行梯度脱水，：60%乙醇0.5～2h、70%乙醇0.5～2 h、80%乙醇0.5～2 h、90%乙醇0.5～2 h、95%乙醇0.5～2 h、95%乙醇0.5～3 h、无水乙醇Ⅰ0.25～3 h、无水乙醇Ⅱ0.25～3 h。透明：环保透明剂Ⅰ0.15 ～1.35 h、环保透明剂Ⅱ0.15～0.7 h。浸蜡：蜡缸Ⅰ0.15～0.5 h、蜡缸Ⅱ0.15～2 h、蜡缸Ⅲ0.15～1 h。石蜡包埋和切片。烤片5 min。经环保透明剂Ⅰ和环保透明剂Ⅱ脱蜡各8 min。放入无水乙醇Ⅰ中5 min和无水乙醇Ⅱ中4 min，以及90%、80%、70%乙醇溶液中各约3 min，取出，至于自来水流水中冲洗3 min。切片置苏木素染色液中4 min，取出，再至于流水中冲洗3 min。将切片放入0.5%盐酸乙醇分化液中，见切片变红，颜色较浅即可，约8 s。水洗3 min，稀氨水返蓝1min。自来水水洗2 min。梯度乙醇脱水：70%乙醇80 s、80%乙醇80 s、95%乙醇2 min。用0.25%伊红染色液对比染色3 s。依次放入95%乙醇Ⅰ80 s、95%乙醇Ⅱ80 s以及无水乙醇Ⅰ5 min、无水乙醇Ⅱ5 min。环保透明剂透明10 min～20 min完成后，及时用中性树胶封片。

B. Masson染色：常规取材、脱水、包埋，与HE染色相同。切片，防脱玻片，常规脱蜡至水。天狼星红染色液滴染。 流水稍微冲洗，去除切片表面染液。 Mayer苏木素染色液染细胞核。流水冲洗10 min。常规脱水透明，中性树胶封固。

C.肺组织TGF-β免疫组化测定：常规取材，脱蜡、水化参照HE染色，根据抗体说明书推荐采用煮沸热修复法进行抗原修复，室温自然冷却，自来水冲洗，ddH2O洗2×5 min，PBS洗3×5 min。滴加正常山羊血清封闭液，室温封闭20 min。加一抗，4℃过夜。PBS洗3×5min，加二抗，室温静置1小时。PBS洗3×5 min。DAB溶液显色。自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，静置干燥后封片。显微镜下观察成像。

D.肺组织匀浆TGF-β，Hyp以及SOD，MDA，GSH含量测定：取各组大鼠剩余右肺，称重后剪碎，组织匀浆后，通过试剂盒检测TGF-β，Hyp以及SOD，MDA，GSH的含量。

上述指标中，肺部损伤的异常修复与TGF-β 异常的过量表达有着密切的关系，TGF-β 蛋白的含量也是评价肺纤维化的主要指标之一；检测大鼠肺组织匀浆中Hyp的含量可以换算出胶原蛋白的含量，进而反映大鼠肺纤维化程度。Hyp是指示肺纤维的重要指标之一。检测患者血清中MDA，GSH，SOD 反应机体的氧化应激反应程度，可以反应体内炎性反应和自由基程度。

3） 结果

实验结果以均数±标准差(mean±SD)表示，使用SPSS19.0软件分析数据。数据的组间差异使用One-way ANOVA进行分析，p<0.05有统计学差异。

A.动物一般行为观察：

实验中，空白组大鼠饮水、进食一直正常，精神状态一直正常。第二周开始，模型组大鼠出现进食减少、不太活跃、精神状态低下等情况。第三周、第四周期间，多只大鼠出现呼吸急促的情况。与模型组相比，各实验组大鼠在实验期间表现出更好的精神状态，饮水、进食也较多。实验于持续给药21天后结束，实验过程中无大鼠意外死亡。

B.病理检测结果：

肺组织病理组织学检测结果如图1所示，其中

空白组：所有动物肺脏组织结构正常，纤毛结构正常，肺内细支气管上皮完整，排列整齐，气管和血管周围无明显炎症反应。未见纤维化。

模型组：除第一周一只动物外，小鼠肺内细支气管上皮增生，管壁增厚，管腔狭窄，出现炎性细胞浸润，肺泡间隔有明显增宽，所有动物肺脏均见不同程度的纤维化，随着时间的延长发生率升高和程度加重。

PFD组：动物纤维化，第二周动物肺纤最明显。与同期的模型组动物比较，病变程度较轻，第二周病变发生率相近，其它两周发生率低于模型组动物。

清肺合剂组：第一周和第二周病变程度较模型组动物严重，第三周两组动物程度相近。动物肺纤发生率和程度明显高于同期的PFD组动物。

清肺口服液水提组：第一周和第三周病变程度较模型组动物轻，第二周两组动物程度相近。第三周动物肺纤发生率和程度明显与同期的PFD组动物相近。

清肺口服液醇提组：第一周和第三周病变程度和发生率较模型组动物轻；第三周动物肺纤发生率和程度明显与同期的PFD组动物相近，

C.肺纤维化TGF-β免疫组化结果：

如图2所示，相较于对照组，模型组、给药组中TGF-β 表达明显增加。相较于模型组，各给药组中TGF-β 表达略有减少，其中清肺口服液水提组明显减少。

D. 肺组织匀浆匀浆TGF-β，HYP以及SOD，MDA，GSH含量测定

与对照组相比，模型组大鼠肺组织中TGF-β，HYP，MDA水平显著升高，SOD和GSH水平显著降低(p<0.05); 与模型组相比，实验组大鼠肺组织中TGF-β，HYP，MDA水平显著降低，SOD和GSH水平显著升高(p<0.05)。清肺口服液在对于GSH，SOD的调控上效果比清肺合剂及PFD明显，其中清肺口服液水提组优于清肺口服液醇提组。如图3所示。

由上述结果可见，本发明清肺口服液在对于GSH，SOD的调控比清肺合剂及PFD更明显。其中清肺口服液水提组TGF-β表达明显减少清肺口服液抗肺纤维化的效果也明显优于清肺合剂。

上述具体实施例并不构成对本发明的保护范围的限定，本领域技术人员可以根据上述说明对本发明进行各种变化和应用。

Claims (10)

1.一种用于肺部疾病的药物组合物，其特征在于含有如下药物：龙葵，百合，夏枯草，浙贝母，重楼，制黄精，沙参，半枝莲和白花蛇舌草。

2.权利要求1所述的组合物，其特征在于由下述重量份的药物组分组成：浙贝12 份，白花蛇舌草15份，龙葵15份，重楼5份，半枝莲15 份，沙参12份，夏枯草8份，百合15 份，炙黄精15 份。

3.权利要求1所述的组合物，其特征在于药效成分包括槲皮素，山奈酚，木犀草素，沃戈宁和/或β-谷甾醇。

4.权利要求1所述的组合物，其特征在于药效成分包括绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素、贝母素甲和/或贝母素乙。

5.权利要求2所述的组合物，其特征在于通过如下方法制备：称取浙贝，白花蛇舌草，龙葵，重楼，半枝莲，沙参，夏枯草，百合，炙黄精，置于蒸馏瓶中，加入8倍量的水，浸泡后恒温回流提取，过滤得滤液，药渣加入8倍量水第二次恒温回流，过滤得滤液，合并两次滤液旋转蒸发，即得；或者，

称取浙贝，白花蛇舌草，龙葵，重楼，半枝莲，沙参，夏枯草，百合，炙黄精，置于蒸馏瓶中，加入8倍量的质量浓度为50% 的酒精，浸泡后恒温回流提取，过滤得滤液，药渣加入8倍量50% 酒精，第二次恒温回流，过滤得滤液，合并两次滤液旋转蒸发，即得。

6.权利要求1所述的药物组合物在制备治疗肺部相关疾病中的用途。

7.权利要求6所述的用途，其特征在于，该疾病与氧化/抗氧化平衡失调或炎症反应有关。

8.权利要求7所述的用途，其特征在于，该疾病与如下指标失常相关:

1）HYP或MDA水平升高,或者

2）TGF-β的异常表达，或者

3）SOD和GSH水平降低。

9.权利要求7所述的用途，其特征在于疾病为肺部炎症。

10.权利要求7所述的用途，其特征在于疾病为肺纤维化。

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