CN108508055A - 一种基于代谢组学的广西瑶山甜茶抗糖尿病潜在标志物代谢通路及研究方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于代谢组学的广西瑶山甜茶抗糖尿病潜在标志物代谢通路及研究方法，涉及一种天然植物药作用机制的研究方法。本发明要解决现有的单一的药理学方法不能系统、全面地评价天然植物药作用机制的问题。通过以下步骤实现：(1)采用核磁共振技术检测分析链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠及瑶山甜茶干预后的尿液代谢产物；(2)筛选出9个瑶山甜茶抗糖尿病相关尿液潜在标志物并进行鉴定；(3)筛选出瑶山甜茶抗糖尿病的6个代谢通路并进行分析。本发明可更全面、高效、快速的从整体水平无偏向性的综合评价瑶山甜茶抗糖尿病作用机制，为民族药作用机制的阐明及进一步开发提供依据。

Description

一种基于代谢组学的广西瑶山甜茶抗糖尿病潜在标志物代谢 通路及研究方法

技术领域

本发明属医药领域。具体是一种基于代谢组学的广西瑶山甜茶抗糖尿病潜在标志物代谢通路及研究方法。

背景技术

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，已成为严重危害人类健康的第三大慢性病，由此引发的心血管和微血管并发症成为致死、致残的主要原因，而临床上至今未有根治方法。IDF估计2035年我国2型糖尿病的人数将达到1.43亿，50.1％的成年人为糖尿病前期，我国2型糖尿病患病率及其并发症的致残、致死率居世界首位，庞大的患病人群给家庭和社会造成巨大的经济负担。因此，寻找能够预防和干预2型糖尿病发病过程的药物并阐明其作用机制，对于提高我国人民健康水平具有非常重要的意义和紧迫性。

长久以来，医药研究者一直致力于2型糖尿病发病机制及治疗药物的研究。糖尿病发病机制复杂，包括胰岛细胞凋亡、胰岛素抵抗、炎症、肠道菌群及环境等。显然，糖尿病的发生发展是一个涉及多环节、多因素、多网络的动态过程。而当下的口服化学降糖药物多针对糖尿病发病机制中某个单一环节和靶点，在治疗上存在较大的局限性，不仅降糖效果欠佳，而且还存在低血糖、心血管事件、肝损伤、体重增加等副作用。因此，缘于临床对于2型糖尿病安全有效的多途径、多环节降糖的需要，医药研究者一直在寻求治疗效果好、安全性高的抗糖尿病药物。

天然植物药的应用在祖国传统医学包括中医药及民族医药中均有悠久的历史，在中华民族五千年生生不息的历史长河中为本民族的健康繁衍起着保驾护航的作用。天然药物经过几千年的实践，在防治糖尿病方面积累了大量的宝贵经验，而且药物疗效确切，副作用较小。许多发现有改善糖尿病症状的天然植物药其降糖作用是明确的。

广西瑶山甜茶(Rubus suavissimus S.Lee)，为蔷薇科悬钩子属多年生有刺灌木，主要分布在广西壮族自治区金秀、藤县、苍梧等地，瑶山甜茶是广西壮族自治区民间壮、瑶族人民用于治疗糖尿病、肥胖症的民族常用药，疗效确切，在广西民间已有几百年的使用历史，也是通过了美国FDA认证的具有药、糖、茶三重功效的甜味植物。广西瑶山甜茶中不仅含有黄酮类、二萜及其苷类、甜茶素、甜茶多酚、鞣质等化学成分，而且含有多种维生素、氨基酸、微量元素，动物实验也表明对大鼠的生长发育，造血功能、肝肾功能、器官组织，无明显毒性，也无致突变作用。目前对广西瑶山甜茶提取物及其主要成分的作用机制主要集中在药理学研究上，甜茶降糖作用明确，安全性高，通过增加胰岛素分泌、降低甘油三脂和降低胰高血糖素来降低血糖。然而，单一的药理学方法并不能完全阐释甜茶的作用机制，在糖尿病动态进程和降糖起效的过程中，瑶山甜茶对哪些异常的代谢网络进行了调节，其机制目前尚有待深入阐明。

代谢组学(metabonomics)是关于生物体系受刺激或扰动后其代谢产物(内源代谢物质)种类、数量及其变化规律的科学。代谢组学的全局、动态观念与植物药多成分作用于多靶点的整体观研究思路不谋而合，它基于系统和整体对植物药的作用机制来进行研究将有助于客观科学的反映在药物作用过程中对系统的动态调控及影响。代谢组学研究流程通常包括生物样本采集、预处理、样品分析、数据处理、标志物的鉴定及生物学意义阐释等过程。其技术主要包括核磁共振(NMR)、气相色谱-质谱(GS/MS)联用技术、液相色谱-质谱(LC/MS)联用技术等。通过多变量统计手段进行数据处理和模式识别，以此获得生物样品中全部小分子化合物的定量化学信息，然后采用化学计量学/生物信息学方法从海量的数据中总结规律，识别起效生物标志物，阐明起效所调控的代谢网络与靶点群。

在代谢组学的各种分析手段中，核磁共振技术作为一种先进的分离分析技术，基于其灵敏性、无损性以及能够根据特征峰定性的探测代谢物成分等优点，已被广泛应用于代谢组学领域的研究当中。核磁共振测定的样品为尿液、血液等容易获得的样品，且检测需要样本量较少，就可以获得提取物的结构信息，具有较好的重现性。目前运用代谢组学手段研究天然药物作用机制是基于其“多成分－多靶点”作用模式下较为科学的方法之一，有利于用现代语言表述这种整体调节的系统起效模式。目前已有报道利用代谢组学技术研究天然植物药的作用机制。Zhao X等运用超高液相色谱-质谱联用技术研究了苗药灯盏细辛治疗血瘀证的作用机制，发现胆酸、苯基丙氨酸、犬尿喹啉酸在治疗后的代谢网络调控中起了重大的作用。哈木拉提·吾甫尔应用代谢组学技术发现异常黑胆质成熟剂通过调节异常黑胆质型肝癌模型的氨基酸代谢、糖代谢等能量代谢紊乱和异常黑胆质型支气管哮喘大鼠体内氨基酸代谢与能量代谢途径发挥预防和治疗的作用。天然植物药广西瑶山甜茶抗糖尿病作用机制的代谢组学研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有药理学方法不能完整全面的阐释广西瑶山甜茶发挥抗糖尿病作用机制的难点，提供一种基于代谢组学的瑶山甜茶抗糖尿病潜在标志物代谢通路及研究方法，为瑶山甜茶进一步开发利用提供依据。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种基于代谢组学的广西瑶山甜茶抗糖尿病潜在标志物代谢通路及研究方法，采用核磁共振技术检测分析链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠及瑶山甜茶干预后的尿液代谢产物，获得代谢指纹图谱。利用多元变量统计分析筛选出九个瑶山甜茶潜在抗糖尿病相关尿液标志物并进行鉴定，；利用metaboanalyst在线分析软件筛选出瑶山甜茶抗糖尿病的六个代谢通路网络并进行分析。

获得广西瑶山甜茶降糖的潜在标志物代谢通路的具体实现步骤如下：

1.广西瑶山甜茶提取液的制备：

称取100g的广西甜茶叶，去除多余的枝干，晒干粉碎。添加10倍量微沸的蒸馏水提取两次，每次2h,过滤，合并滤液，即得广西甜茶总水提取物浓缩液，其浓度为1g生药/ml，放入-20℃冰箱冻存。

2.动物模型的制备：

选取200±20g重量的雄性SD大鼠30只，动物在室温为20～24℃、相对湿度为50～70％、人工模拟自然环境条件下昼夜饲养，动物自由摄食饮水，经适应l周后开始实验。随机选取六只健康大鼠作为正常组，其余大鼠造模。在大鼠禁食不禁水12h后，将链脲佐菌素溶于pH 4.2～4.5的0.1mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液中，在避光条件下配制成质量浓度为1％的溶液，按链脲佐菌素55mg/kg作单次腹腔注射，正常对照组注射相同体积的pH 4.2～4.5的0.1mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液。72h后连续三天尾静脉采血检测血糖，以连续三次测得血糖≥16.7mmol/L为糖尿病大鼠。造模成功的糖尿病大鼠按随机原则分为模型组和广西瑶山甜茶治疗组，每组六只老鼠。广西瑶山甜茶治疗组按3g生药/kg/d灌胃给药，空白对照组和模型组灌胃给予相同体积的0.9％氯化钠溶液，连续六周。

3.大鼠尿液的保存和前处理：

第六周时利用代谢笼收集各组大鼠的24小时尿液，用浓度为10mg/mL的0.01ml叠氮化钠保存于2mL的离心管中，每管1.5ml，于－80℃温度下保存。测定前取在室温溶解的尿样，加入pH＝7.4的0.2ml磷酸缓冲液，用混匀器混匀混合液。于室温静置10min，在转速为14000rpm条件下离心10min。取上清液0.45ml于5mm核磁管，加入含四甲基硅烷0.1mg/mL的0.05ml重水中，混匀，得到尿液标本。

4.核磁共振检测：

在室温30℃下，用Varian INOVA 600MHz NMR核磁共振仪检测步骤3的尿液标本，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill脉冲序列进行检测，脉冲序列可以压制水峰和大分子物质的信号，从而检测尿液中的小分子代谢物。具体参数设置如下：谱宽8000Hz，采样点64k，采样时间4s，弛豫延迟2s，自旋回波时间320ms。核磁共振具体参数如下：谱宽8000Hz，采样点64k，采样时间4s，弛豫延迟0s，均在弛豫延迟期间采用预饱和照射水峰。

5.核磁共振¹H-NMR图谱数据预处理：

采用MestReNova核磁图谱专业处理软件对所有核磁共振¹H-NMR图谱进行相位、基线调整。在核磁共振NMR图谱中,以四甲基硅烷的化学位移δ0ppm为标准进行化学位移校正；以每段0.04ppm为单位，对δ0.01～6.00区域的谱图进行等宽度分割，去除δ4.60～5.60区域水峰，对图谱进行分段积分，将积分数据归一化处理，以txt文本格式保存。

6.利用多元变量统计分析并筛选潜在生物标志物：

在获得核磁共振数据后，采用SIMCA-P12.0软件对导入的对照组、糖尿病大鼠模型组、瑶山甜茶治疗组三组尿液样本数据进行主成分分析和偏最小方差判别分析；主成分分析作为无监督式学习方法，可以真实反映样本的聚类情况，所建模型变量的拟合能力指数R²Y表示模型的解释率，模型的预测指数Q2_cum表示模型的预测率，见表1；在三组尿液样本的主成分分析PCA图中，糖尿病大鼠模型组与空白对照组分离良好，无交叉和重叠，说明两组代谢模式存在明显的差异；瑶山甜茶治疗组介于空白组和糖尿病大鼠模型组之间，与空白组有部分重叠，提示瑶山甜茶治疗后糖尿病大鼠尿液代谢模式出现改变，表明瑶山甜茶对链脲佐菌素诱导的糖尿病模型大鼠的代谢紊乱有一定的干预作用；进一步采用有监督式方法进行建模分析，模型参数见表1。空白对照组、糖尿病大鼠模型组和瑶山甜茶治疗组的偏最小方差分析PLS-DA图中，瑶山甜茶治疗组与空白对照组分离良好，无交叉和重叠；瑶山甜茶治疗组介于与空白组和糖尿病模型组之间，与空白组部分重叠，提示瑶山甜茶治疗后糖尿病大鼠尿液代谢模式出现改变，更趋向正常，表明瑶山甜茶有一定的抗糖尿病作用；对三组尿液样本核磁共振数据进行偏最小方差分析PLS-DA，得到空白对照组和糖尿病大鼠模型组的偏最小方差分析PLS-DA载荷图，图中“S”曲线中每一个点代表1个变量，变量对分类的重要程度由相关系数的大小来衡量，变量越远离原点，相关系数值越大，对代谢物发生变化的贡献也越大。为了找到使其存在差异的潜在的生物标记物，选取S-plot上“-0.1-0.1”以外的变量作为有差异的潜在生物标记物。能够突显出空白组和糖尿病模型组差异的最大化合物，可被认为是与糖尿病代谢相关的潜在标志物，潜在生物标记物的化学位移为：3.24、3.28、3.4、3.44、3.48、3.52、3.56、3.72、3.76、3.8、3.88、3.92、4.68、5.24。

表1评价模型质量参数

7.潜在生物标记物的鉴定及其含量变化：

查阅已有的归属文献，同时搜索http://hmdb.ca/数据库，对找到的潜在生物标记物的化学位移进行鉴定，用SPSS软件对这些代谢物的峰面积进行独立样本t检验，得到与对照组比较具有显著差异(P<0.05)的九个潜在生物标志物：牛磺酸、脯氨酸、胆碱、甘氨酸、亮氨酸、甘油、甜菜碱、肌酸和葡萄糖，这九个标志物含量在糖尿病大鼠模型组中均增高，经瑶山甜茶治疗后含量中降低，如表2所示。在MetaboAnalyst上对鉴定的潜在生物标记物进行代谢通路在线查询，有六个相关代谢通路参与了瑶山甜茶抗高血糖的代谢过程，如表2所示。

表2潜在生物标志物的鉴定和在空白对照组、糖尿病大鼠模型组和甜茶治疗组中的含量变化

*P<0.05**P<0.01***P<0.001

8.潜在生物标记物的分析：

进一步利用MetaboAnalyst对鉴定的潜在生物标记物进行代谢通路重要性分析，通过代谢通路分析后所得影响值大小，依据代谢通路的p值和通路重要值，牛磺酸代谢通路、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢通路、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路，甘油代谢通路四个代谢通路为瑶山甜茶抗糖尿病的重要代谢通路，参与了瑶山甜茶抗糖尿病的主要代谢过程，形成相互交错的代谢网络，完整的阐释了瑶山甜茶抗糖尿病的作用机制。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

(1)本发明利用核磁共振技术结合多元统计分析对糖尿病大鼠尿液代谢产物进行分析，发现民族药瑶山甜茶抗糖尿病的相关潜在标志物。

(2)进一步通过该技术分析瑶山甜茶抗糖尿病的相关潜在标志物的含量变化，对潜在标志物进行代谢通路分析，得到瑶山甜茶抗糖尿病的代谢通路。

(3)从整体水平全面、快速、高效综合评价瑶山甜茶抗糖尿病的作用机制，为天然植物的民族药代谢组学及作用机制的阐明提供示范性研究。

附图说明

图1是本发明的对照组、糖尿病大鼠模型组和瑶山甜茶治疗组大鼠尿液样本的核磁共振图谱。

图中，control为对照组，model为糖尿病大鼠模型组，L-RS为瑶山甜茶治疗组。

图2是本发明的基于核磁共振技术的对照组、糖尿病大鼠模型组和瑶山甜茶治疗组大鼠尿液样本无监督的主成分分析得分图。

图中，正方形代表对照组，圆形代表糖尿病大鼠模型组，三角形代表瑶山甜茶治疗组。

图3是本发明的基于核磁共振技术的对照组、糖尿病大鼠模型组和瑶山甜茶治疗组大鼠尿液有监督的偏最小二乘法-判别分析得分图。图中，正方形代表对照组，圆形代表糖尿病大鼠模型组，三角形代表瑶山甜茶治疗组。

图4是本发明的基于核磁共振技术的对照组、糖尿病大鼠模型组有监督的偏最小二乘法-判别分析载荷图。

图5是本发明使用metaboanalyst平台进行分析的代谢通路总结图。

具体实施方式：

下面结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明方法的具体实现过程如下：

一种基于代谢组学的广西瑶山甜茶抗糖尿病潜在标志物代谢通路及研究方法，采用核磁共振技术检测分析链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠及瑶山甜茶干预后的尿液代谢产物，获得代谢指纹图谱。利用多元变量统计分析筛选出九个瑶山甜茶潜在抗糖尿病相关尿液标志物并进行鉴定，筛选出瑶山甜茶抗糖尿病的代谢通路；利用metaboanalyst在线分析软件筛选出瑶山甜茶抗糖尿病的六个代谢通路网络并进行分析。

获得广西瑶山甜茶降糖的潜在标志物代谢通路的具体实现步骤如下：

1.广西瑶山甜茶提取液的制备：

称取100g的广西甜茶叶，去除多余的枝干，晒干粉碎。添加10倍量微沸的蒸馏水提取两次，每次2h,过滤，合并滤液，即得广西甜茶总水提取物浓缩液，其浓度为1g生药/ml，放入-20℃冰箱冻存。

2.动物模型的制备：

选取200±20g重量的雄性SD大鼠30只，动物在室温为20～24℃、相对湿度为50～70％、人工模拟自然环境条件下昼夜饲养，动物自由摄食饮水，经适应l周后开始实验。随机选取六只健康大鼠作为正常组，其余大鼠造模。在大鼠禁食不禁水12h后，将链脲佐菌素溶于pH 4.2～4.5的0.1mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液中，在避光条件下配制成质量浓度为1％的溶液，按链脲佐菌素55mg/kg作单次腹腔注射，正常对照组注射相同体积的pH 4.2～4.5的0.1mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液。72h后连续三天尾静脉采血检测血糖，以连续三次测得血糖≥16.7mmol/L为糖尿病大鼠。造模成功的糖尿病大鼠按随机原则分为模型组和广西瑶山甜茶治疗组，每组六只老鼠。广西瑶山甜茶治疗组按3g生药/kg/d灌胃给药，空白对照组和模型组灌胃给予相同体积的0.9％氯化钠溶液，连续六周。

3.大鼠尿液的保存和前处理：

第六周时利用代谢笼收集各组大鼠的24小时尿液，用浓度为10mg/mL的0.01ml叠氮化钠保存于2mL的离心管中，每管1.5ml，于－80℃温度下保存。测定前取在室温溶解的尿样，加入pH＝7.4的0.2ml磷酸缓冲液，用混匀器混匀混合液。于室温静置10min，在转速为14000rpm条件下离心10min。取上清液0.45ml于5mm核磁管，加入含四甲基硅烷0.1mg/mL的0.05ml重水中，混匀，得到尿液标本。

4.核磁共振检测：

在室温30℃下，用Varian INOVA 600MHz NMR核磁共振仪检测步骤3的尿液标本，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill脉冲序列进行检测，脉冲序列可以压制水峰和大分子物质的信号，从而检测尿液中的小分子代谢物。具体参数设置如下：谱宽8000Hz，采样点64k，采样时间4s，弛豫延迟2s，自旋回波时间320ms。核磁共振具体参数如下：谱宽8000Hz，采样点64k，采样时间4s，弛豫延迟0s，均在弛豫延迟期间采用预饱和照射水峰。

5.核磁共振¹H-NMR图谱数据预处理：

采用MestReNova核磁图谱专业处理软件对所有核磁共振¹H-NMR图谱进行相位、基线调整，所得结果见图1。在核磁共振NMR图谱中,以四甲基硅烷的化学位移δ0ppm为标准进行化学位移校正；以每段0.04ppm为单位，对δ0.01～6.00区域的谱图进行等宽度分割，去除δ4.60～5.60区域水峰，对图谱进行分段积分，将积分数据归一化处理，以txt文本格式保存。

6.利用多元变量统计分析并筛选潜在生物标志物：

在获得核磁共振数据后，采用SIMCA-P12.0软件对导入的对照组、糖尿病大鼠模型组、瑶山甜茶治疗组三组尿液样本数据进行主成分分析和偏最小方差判别分析；主成分分析作为无监督式学习方法，可以真实反映样本的聚类情况，所建模型变量的拟合能力指数R²Y表示模型的解释率，模型的预测指数Q2_cum表示模型的预测率，见表1；在三组尿液样本的主成分分析PCA图中，糖尿病大鼠模型组与空白对照组分离良好，无交叉和重叠，说明两组代谢模式存在明显的差异；瑶山甜茶治疗组介于空白组和糖尿病大鼠模型组之间，与空白组有部分重叠，提示瑶山甜茶治疗后糖尿病大鼠尿液代谢模式出现改变，表明瑶山甜茶对链脲佐菌素诱导的糖尿病模型大鼠的代谢紊乱有一定的干预作用，如图2所示；进一步采用有监督式方法进行建模分析，模型参数见表1。空白对照组、糖尿病大鼠模型组和瑶山甜茶治疗组的偏最小方差分析PLS-DA图中，瑶山甜茶治疗组与空白对照组分离良好，无交叉和重叠；瑶山甜茶治疗组介于与空白组和糖尿病模型组之间，与空白组部分重叠，提示瑶山甜茶治疗后糖尿病大鼠尿液代谢模式出现改变，更趋向正常，表明瑶山甜茶有一定的抗糖尿病作用，如图3所示；对三组尿液样本核磁共振数据进行偏最小方差分析PLS-DA，得到空白对照组和糖尿病大鼠模型组的偏最小方差分析PLS-DA载荷图，如图4,图中“S”曲线中每一个点代表1个变量，变量对分类的重要程度由相关系数的大小来衡量，变量越远离原点，相关系数值越大，对代谢物发生变化的贡献也越大。为了找到使其存在差异的潜在的生物标记物，选取S-plot上“-0.1-0.1”以外的变量作为有差异的潜在生物标记物。能够突显出空白组和糖尿病模型组差异的最大化合物，可被认为是与糖尿病代谢相关的潜在标志物，潜在生物标记物的化学位移为：3.24、3.28、3.4、3.44、3.48、3.52、3.56、3.72、3.76、3.8、3.88、3.92、4.68、5.24，如图4所示。

表1评价模型质量参数

7.潜在生物标记物的鉴定及其含量变化：

查阅已有的归属文献，同时搜索http://hmdb.ca/数据库，对找到的潜在生物标记物的化学位移进行鉴定，用SPSS软件对这些代谢物的峰面积进行独立样本t检验，得到与对照组比较具有显著差异(P<0.05)的九个潜在生物标志物：牛磺酸、脯氨酸、胆碱、甘氨酸、亮氨酸、甘油、甜菜碱、肌酸和葡萄糖，这九个标志物含量在糖尿病大鼠模型组中均增高，经瑶山甜茶治疗后含量中降低。在MetaboAnalyst上对鉴定的潜在生物标记物进行代谢通路在线查询，有六个相关代谢通路参与了瑶山甜茶抗高血糖的代谢过程，如表2所示。

表2潜在生物标志物的鉴定和在空白对照组、糖尿病大鼠模型组和甜茶治疗组中的含量变化

*P<0.05**P<0.01***P<0.001

8.潜在生物标记物的分析：

进一步利用MetaboAnalyst对鉴定的潜在生物标记物进行代谢通路重要性分析，通过代谢通路分析后所得影响值大小，构建代谢通路总结图，如图5所示，依据代谢通路的p值和通路重要值，牛磺酸代谢通路、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢通路、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路，甘油代谢通路四个代谢通路为瑶山甜茶抗糖尿病的重要代谢通路，参与了瑶山甜茶抗糖尿病的主要代谢过程，形成相互交错的代谢网络，完整的阐释了瑶山甜茶抗糖尿病的作用机制。

本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种基于代谢组学的广西瑶山甜茶抗糖尿病潜在标志物代谢通路及研究方法，其特征在于：采用核磁共振技术检测分析链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠及瑶山甜茶干预后的尿液代谢产物，获得代谢指纹图谱，利用多元变量统计分析筛选出九个瑶山甜茶潜在抗糖尿病相关尿液标志物并进行鉴定；利用metaboanalyst在线分析软件筛选出瑶山甜茶抗糖尿病的六个代谢通路网络并进行分析；

获得广西瑶山甜茶降糖的潜在标志物代谢通路的具体实现步骤如下：

(1)广西瑶山甜茶提取液的制备：

称取100g的广西甜茶叶，去除多余的枝干，晒干粉碎，添加10倍量微沸的蒸馏水提取两次，每次2h,过滤，合并滤液，即得广西甜茶总水提取物浓缩液，其浓度为1g生药/ml，放入-20℃冰箱冻存；

(2)动物模型的制备：

选取200±20g重量的雄性SD大鼠30只，动物在室温为20～24℃、相对湿度为50～70％、人工模拟自然环境条件下昼夜饲养，动物自由摄食饮水，经适应l周后开始实验；随机选取六只健康大鼠作为正常组，其余大鼠造模，在大鼠禁食不禁水12h后，将链脲佐菌素溶于pH4.2～4.5的0.1mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液中，在避光条件下配制成质量浓度为1％的溶液，按链脲佐菌素55mg/kg作单次腹腔注射，正常对照组注射相同体积pH 4.2～4.5的0.1mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液，72h后连续三天尾静脉采血检测血糖，以连续三次测得血糖≥16.7mmol/L为糖尿病大鼠，造模成功的糖尿病大鼠按随机原则分为模型组和广西瑶山甜茶治疗组，每组六只老鼠，广西瑶山甜茶治疗组按3g生药/kg/d灌胃给药，空白对照组和模型组灌胃给予相同体积的0.9％氯化钠溶液，连续六周；

(3)大鼠尿液的保存和前处理：

第六周时利用代谢笼收集各组大鼠的24小时尿液，用浓度为10mg/mL的叠氮化钠0.01ml保存于2mL的离心管中，每管1.5ml，于－80℃温度下保存，测定前取在室温溶解的尿样，加入pH＝7.4的0.2ml磷酸缓冲液，用混匀器混匀混合液，于室温静置10min，在转速为14000rpm条件下离心10min，取上清液0.45ml于5mm核磁管，加入含四甲基硅烷0.1mg/mL的0.05ml重水中，混匀，得到尿液标本；

(4)核磁共振检测：

在室温30℃下，用Varian INOVA 600MHz NMR核磁共振仪检测步骤(3)的尿液标本，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill脉冲序列进行检测，脉冲序列可以压制水峰和大分子物质的信号，从而检测尿液中的小分子代谢物，具体参数设置如下：谱宽8000Hz，采样点64k，采样时间4s，弛豫延迟2s，自旋回波时间320ms，核磁共振具体参数如下：谱宽8000Hz，采样点64k，采样时间4s，弛豫延迟0s，均在弛豫延迟期间采用预饱和照射水峰；

(5)核磁共振¹H-NMR图谱数据预处理：

采用MestReNova核磁图谱专业处理软件对所有核磁共振¹H-NMR图谱进行相位、基线调整；在核磁共振NMR图谱中,以四甲基硅烷的化学位移δ0ppm为标准进行化学位移校正；以每段0.04ppm为单位，对δ0.01～6.00区域的谱图进行等宽度分割，去除δ4.60～5.60区域水峰，对图谱进行分段积分，将积分数据归一化处理，以txt文本格式保存；

(6)利用多元变量统计分析并筛选潜在生物标志物：

在获得核磁共振数据后，采用SIMCA-P12.0软件对导入的对照组、糖尿病大鼠模型组、瑶山甜茶治疗组三组尿液样本数据进行主成分分析和偏最小方差判别分析；主成分分析作为无监督式学习方法，可以真实反映样本的聚类情况，所建模型变量的拟合能力指数R²Y表示模型的解释率，模型的预测指数Q2_cum表示模型的预测率，见表1；在三组尿液样本的主成分分析PCA图中，糖尿病大鼠模型组与空白对照组分离良好，无交叉和重叠，说明两组代谢模式存在明显的差异；瑶山甜茶治疗组介于空白组和糖尿病大鼠模型组之间，与空白组有部分重叠，提示瑶山甜茶治疗后糖尿病大鼠尿液代谢模式出现改变，表明瑶山甜茶对链脲佐菌素诱导的糖尿病模型大鼠的代谢紊乱有一定的干预作用；进一步采用有监督式方法进行建模分析，模型参数见表1，空白对照组、糖尿病大鼠模型组和瑶山甜茶治疗组的偏最小方差分析PLS-DA图中，瑶山甜茶治疗组与空白对照组分离良好，无交叉和重叠；瑶山甜茶治疗组介于与空白组和糖尿病模型组之间，与空白组部分重叠，提示瑶山甜茶治疗后糖尿病大鼠尿液代谢模式出现改变，更趋向正常，表明瑶山甜茶有一定的抗糖尿病作用；对三组尿液样本核磁共振数据进行偏最小方差分析PLS-DA，得到空白对照组和糖尿病大鼠模型组的偏最小方差分析PLS-DA载荷图，图中“S”曲线中每一个点代表1个变量，变量对分类的重要程度由相关系数的大小来衡量，变量越远离原点，相关系数值越大，对代谢物发生变化的贡献也越大，为了找到使其存在差异的潜在的生物标记物，选取S-plot上“-0.1-0.1”以外的变量作为有差异的潜在生物标记物，能够突显出空白组和糖尿病模型组差异的最大化合物，可被认为是与糖尿病代谢相关的潜在标志物，潜在生物标记物的化学位移为：3.24、3.28、3.4、3.44、3.48、3.52、3.56、3.72、3.76、3.8、3.88、3.92、4.68、5.24；

表1评价模型质量参数

(7)潜在生物标记物的鉴定及其含量变化：

查阅已有的归属文献，同时搜索http://hmdb.ca/数据库，对找到的潜在生物标记物的化学位移进行鉴定，用SPSS软件对这些代谢物的峰面积进行独立样本t检验，得到与对照组比较具有显著差异(P<0.05)的九个潜在生物标志物：牛磺酸、脯氨酸、胆碱、甘氨酸、亮氨酸、甘油、甜菜碱、肌酸和葡萄糖，这九个标志物含量在糖尿病大鼠模型组中均增高，经瑶山甜茶治疗后含量降低，在MetaboAnalyst上对鉴定的潜在生物标记物进行代谢通路在线查询，有六个相关代谢通路参与了瑶山甜茶抗高血糖的代谢过程，如表2所示；

表2潜在生物标志物的鉴定和在空白对照组、糖尿病大鼠模型组和甜茶治疗组中的含量变化

*P<0.05**P<0.01***P<0.001

(8)潜在生物标记物的分析：

进一步利用MetaboAnalyst对鉴定的潜在生物标记物进行代谢通路重要性分析，通过代谢通路分析后所得影响值大小，依据代谢通路的p值和通路重要值，牛磺酸代谢通路、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢通路、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路，甘油代谢通路四个代谢通路为瑶山甜茶抗糖尿病的重要代谢通路，参与了瑶山甜茶抗糖尿病的主要代谢过程，形成相互交错的代谢网络，完整的阐释了瑶山甜茶抗糖尿病的作用机制。