CN104769434A - 用于2型糖尿病的生物标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及识别受试者中发展2型糖尿病的倾向的方法，所述方法包括评估从所述受试者获得的样品中的一种或多种代谢物的量的步骤，所述代谢物选自(a)第一组，包括代谢物甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3和同量异序代谢物，该同量异序代谢物具有与甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2或磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3相同的分子量但具有不同的化学式；和/或(b)第二组，包括代谢物乙酰肉毒碱C2和同量异序代谢物，该同量异序代谢物具有与乙酰肉毒碱C2相同的分子量但具有不同的化学式；其中，与对照的一种或多种相应代谢物的量相比，选自所述第一组的代谢物的量的降低或选自所述第二组的代谢物的量的增加表明发展2型糖尿病的倾向。此外，本发明涉及识别能够预防2型糖尿病和与其相关疾病或作为用于开发能够预防2型糖尿病和与其相关疾病化合物的先导化合物的化合物的方法以及选择疗法以预防2型糖尿病的方法。并且，本发明涉及试剂盒。
Description
本发明涉及识别受试者中发展2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus)的倾向(predisposition)的方法，所述方法包括评估从所述受试者获得的样品中的一种或多种代谢物的量的步骤，所述代谢物选自(a)第一组，包括代谢物甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2(lysoPhosphatidylcholineacyl C18:2)、溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3和同量异序(isobaric)代谢物，该同量异序代谢物具有与甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2或磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3相同的分子量但具有不同的化学式；和/或(b)第二组，包括代谢物乙酰肉毒碱(acetylcarnitine)C2和同量异序代谢物，该同量异序代谢物具有与乙酰肉毒碱C2相同的分子量但具有不同的化学式；其中，与对照的一种或多种相应的代谢物的量相比，选自所述第一组的代谢物的量的降低或选自所述第二组的代谢物的量的增加表明发展2型糖尿病的倾向。此外，本发明涉及识别能够预防2型糖尿病和与其相关疾病的化合物或用作用于开发能够预防2型糖尿病和与其相关疾病化合物的先导化合物的方法以及选择疗法以预防2型糖尿病的方法。并且，本发明涉及试剂盒。
在本说明书中，引用包括专利申请和制造商手册在内的许多文献。这些文献的公开内容，不考虑与本发明的可专利性相关，通过引用将其全部内容结合于此。更具体地，所有参考文献通过引用结合到如同每个单独文献具体地且单独地表明通过引用结合的相同程度。
2型糖尿病(T2D)是由β-细胞功能障碍和胰岛素抵抗所导致的升高的血糖水平所限定的代谢性疾病，没有特殊原因如β-细胞的自身免疫性破坏的证据(Stumvoll等人,Lancet 365,1333-1346(2005)；Muoio等人,NatRev Mol Cell Biol 9,193-205(2008))。仅具有略微升高的血糖水平的糖尿病前期(pre-diabetes)的状态可先于该疾病多年(McGarry等人,Diabetes 51,7-18(2002))并且还增加心血管疾病的风险(Schwarz等人,Horm Metab Res41,86-97(2009))。可以通过饮食改变和增加身体活动来预防或延迟糖尿病前期个体中糖尿病的发展(Tuomilehto等人,N Engl J Med 344,1343-1350(2001))。即使通过各种评分(score)引入全局风险评估后，对于T2D的风险预测仍然未达最佳标准。对于T2D的已知风险因素包括年龄、性别、人体测量变量(肥胖、血脂和血压)、代谢变量(血压、肝酶和尿酸)、社会经济变量(白细胞计数、C-反应蛋白和脂连蛋白)和生活方式(缺乏身体活动、饮食组成、吸烟和饮酒)变量(Lloyd等人,Int J Obes(Lond)2012,36(1):1-11；Gerich JE,Clinical cornerstone 2007,8(3):53-68；Grundy SM,JAm Coll Cardiol 2012,59(7):635-643；Aschner P,Expert review ofcardiovascular therapy 2010,8(3):407-412；Lechleitner M,Gerontology 2008,54(5):253-259；Buijsse B等人,Epidemiol Rev 2011；33:46-62)。药物疗法(例如二甲双胍、胰岛素注射)在T2D的治疗中扮演重要角色。生活方式干预(例如饮食调整、运动锻炼和减肥)也可以改善葡萄糖稳态。改善对于T2D的风险预测对于识别可以受益于靶向预防措施的高危个体至关重要。
成为本发明的基础(underlying)的技术问题是识别可替代的和/或改善的方式和方法以识别处于发展2型糖尿病风险中的受试者。
通过提供以权利要求书为特征的实施方式来实现该技术问题的解决方案。
因此，在第一实施方式中本发明涉及识别受试者中发展2型糖尿病的倾向的方法，所述方法包括评估从所述受试者获得的样品中一种或多种代谢物的量的步骤，所述一种或多种代谢物选自(a)第一组，包括代谢物甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3和同量异序代谢物，该同量异序代谢物具有与甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2或磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3相同的分子量但具有不同的化学式；和/或(b)第二组，包括代谢物乙酰肉毒碱C2和同量异序代谢物，该同量异序代谢物具有与乙酰肉毒碱C2相同的分子量但具有不同的化学式；其中，与对照的一种或多种相应代谢物的量相比，选自所述第一组的代谢物的量的降低或选自所述第二组的代谢物的量的增加表明发展2型糖尿病的倾向。
在可替代的实施方式中，本发明的方法涉及用于产生用来识别发展2型糖尿病的倾向的代谢物的量的诊断性信息值(diagnostically informativevalues)的方法，该方法包括上述步骤。
术语“疾病的倾向”在本领域中是确定的并且在本文中类似地使用。因此，术语“发展2型糖尿病的倾向”描述患者处于发展2型糖尿病(T2D)风险中的状态。如在本文中所使用的，发展T2D的倾向基于环境、遗传和/或表观遗传的因素。可以根据本发明的方法在确定所述受试者表现出血糖水平的升高之后在来自受试者的样品中诊断所述发展T2D的倾向，但可以独立地诊断，并且具体地，在后面的确定之前。根据本发明的方法的“受试者”优选是人。
如在本文中所使用的“2型糖尿病”涉及由升高的血糖水平的症状的发展表征的病况(condition)，该升高的血糖水平被认为是β-细胞功能障碍和胰岛素抵抗的结果。用于诊断T2D的标准(如由世界卫生组织建立)包括：(a)空腹血糖>＝126mg/dl，和/或(b)在用75g葡萄糖的口服葡萄糖耐量试验期间两小时后葡萄糖负荷血浆>＝200mg/dl，和(c)HbA1c>＝6.5％。
T2D可以以称为“糖尿病前期”的状态为先导，该状态特征在于如上文所描述的的单独升高的血糖水平和/或不能有效地从血流清除葡萄糖。不能有效地从血流清除葡萄糖被称为“葡萄糖耐量受损”并通过标准化口服葡萄糖耐量试验来确定，其由用75g葡萄糖挑战受试者后两小时测量葡萄糖血浆负荷组成。≥140和<200mg/dl的两小时后葡萄糖血浆负荷证明(qualify)受试者具有葡萄糖耐量受损(impaired glucose tolerance，IGT)。该病况可伴有正常(<110mg/dl)或升高的空腹血糖水平(<126mg/dl)。根据“糖尿病前期”的本领域定义的状态，糖尿病前期受试者可以可替代地仅显示升高的空腹血糖水平随后分类为具有单独的空腹葡萄糖受损(i-IFG)：具有空腹葡萄糖值为110≤和<126mg/dl，但两小时后葡萄糖血浆负荷为<140mg/dl。然而，并且在本发明的基础上，关于从NGT到i-IFG或到IGT的代谢物组(panel)上的不同变化(参见图1)，变得明显的是i-IFG和IGT是两个不同的表型。因此，根据本发明，术语“糖尿病前期的”或“糖尿病前期”仅涉及葡萄糖耐量受损(IGT)状态的存在。下表提供如根据本发明所提及的i-IGF和IGT关系的概述，其是目前由世界卫生组织所批准的(World,H.O.Definition,diagnosis and classification ofdiabetes mellitus and its complications.Part 1:Diagnosis and classification ofdiabetes mellitus.Report of a WHO consultation(1999))。
| 空腹血糖(mg/dl) | 2小时后葡萄糖负荷血浆值(mg/dl) | ||
| NGT | <110 | 和 | <140 |
| i-IFG | 110≤和<126 | 和 | <140 |
| IGT | <126 | 和 | 140≤和<200 |
| T2D | ≥126 | 和/或 | ≥200 |
如在本文中所使用的，在代谢物的上下文中术语“评估量”是指可以被采用以定量一种或多种代谢物的存在的任何方法。本领域技术人员知道适于确定一种或多种代谢物的量的实验方案。例如，可以单独采用如核磁共振(NMR)和/或质谱法的方法或与例如气相色谱法组合。所述一种或多种代谢物“量”的评估是根据本发明的方法诊断发展T2D风险的方法中的决定性因素。在某种程度上，代谢物的量通常地并一般地尤其(interalia)取决于年龄、性别和/或病症而在受试者中各不相同。因此，该量可以被标准化。用于标准化代谢物浓度的若干策略是本领域中已知的，包括但不限于，针对内部参考的浓度标准化，该内部参考是在相同样品中确定的；针对样品尺寸的标准化；针对总代谢物的量的标准化或针对已知量的人工引入分子的标准化。此外，也可以通过调节由患者特异性因素如例如年龄、BMI、激素状态、营养因素(例如空腹)或时间(昼夜节律)获得的值进行标准化。可以例如通过将要研究代谢物的测定值除以参考分子的测量值，或通过从所关注代谢物的测定值减去参考分子的测量值来实现标准化。当与合适的对照群体相比时，被认为是不正常的变化，例如与疾病关联的代谢物的量中的变化必须是显著的，优选是统计学上显著的。在本案的情况下，令人惊讶地发现上述代谢物的量在具有如上文所定义葡萄糖耐量受损(IGT)的糖尿病前期受试者中受影响。
质谱法和其用于确定样品中代谢物浓度的用途是本领域中公知的，并且已描述于例如Griffiths WJ,Koal T,Wang Y,Kohl M,Enot DP,Deigner HP(2010)Targeted metabolomics for biomarker discovery.Angew Chem Int EdEngl 49:5426-5445,Koal T,Deigner HP(2010)Challenges in massspectrometry based targeted metabolomics.Curr Mol Med 10:216-226。
质谱法包括例如串联质谱法、基质辅助激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱法、MALDI-TOF-TOF质谱法、MALDI四极杆-飞行时间(Q-TOF)质谱法、电喷射离子化(ESI)-TOF质谱法、ESI-Q-TOF、ESI-TOF-TOF、ESI-离子阱质谱法、ESI三重四极杆质谱法、ESI傅立叶变换质谱法(FTMS)、MALDI-FTMS、MALDI-离子阱-TOF和ESI-离子阱TOF。以其最基本的水平，质谱法涉及使分子电离和随后测量所得离子的质量。由于分子以公知的方式电离，可以精确地由离子的质量确定分子的分子量。此外，如下文所详述的，通过比较由内部标准物获得的数据，所关注分子的定量是可能的。
液相色谱质谱法结合了液相色谱法(LC)或高效液相色谱法(HPLC)的物理分离能力与质谱法(MS)的质量分析能力(Kushnir MM,RockwoodAL,Roberts WL,Yue B,Bergquist J,Meikle AW(2011)Liquidchromatography tandem mass spectrometry for analysis of steroids in clinicallaboratories.Clin Biochem 44:77-88；Murray KK(2010)Glossary of termsfor separations coupled to mass spectrometry.J Chromatogr A 1217:3922-3928)。HPLC提供超过LC的优点，其具有分析物的较短分析时间和较好分辨率。这因此增加MS的选择性、精度和准确性。
串联质谱法涉及首先获得所关注的离子的质谱，随后破碎该离子并获得片段的质谱。串联质谱法因此提供分子量信息和破碎谱，其可一起结合分子量信息使用以识别肽或蛋白质或小分子(低于1500道尔顿)的确切序列(参见例如Hunt等人.(1986)PNAS USA 83:6233-6237；Shevchenko等人.(1996)PNAS USA 93:14440-14445；Figeys等人.(1996)Anal.Chem.68:1822-1828和Wilm等人.(1996)Nature 379:466-469)；Kushnir MM,Rockwood AL,Roberts WL,Yue B,Bergquist J,Meikle AW:Liquidchromatography tandem mass spectrometry for analysis of steroids in clinicallaboratories.Clin Biochem 2011,44(1):77-88)。
优选地，如果使用质谱法，则通过参考内部代谢物标准物(standard)确定代谢物的量。任何分子离子种类(molecular ion species)的丰度通常携带关于浓度的信息，但离子丰度被许多特征混淆，包括仪器响应因子、分子的电离效率、分子离子种类的稳定性和其他可引起所关注分析物的离子抑制分子的存在。因此，已开发可以用于产生适当的校正曲线以将离子丰度转换为代谢物的量的定量测量的内部标准物。内部标准物的非限制性实例包括：标记有待定量代谢物的稳定同位素标记版本的代谢物标准物，其具有类似的提取回收率、电离响应和类似的色谱保留时间；待定量的代谢物的化合物类似物，其类似于待定量化合物、但母体质量略有不同；或待定量的代谢物的氯化版本，其通常具有类似的色谱保留时间。
在样品制备的开始时，通常在血浆制备或固相萃取之前，通常以已知浓度将内部标准物添加到每个样品中，包括标准物。本领域技术人员应当理解，内部标准物的量需要高于定量的极限但足够低以避免抑制分析物的电离。基于存在于样品中的内部标准物的已知浓度，可以通过将代谢物和内部标准物之间的响应比(response ratio)内插到标准曲线来定量所关注代谢物的测量值。这些通过参考内部代谢物标准物用于确定代谢物浓度的方法是本领域中公知的，并且已描述于例如Ciccimaro E,Blair IA(2010)Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis.Bioanalysis2:311-341；Koletzko B,Demmelmair H,Hartl W,Kindermann A,Koletzko S,Sauerwald T,Szitanyi P(1998)The use of stable isotope techniques fornutritional and metabolic research in paediatrics.Early Hum Dev 53 Suppl:S77-97；Postle AD,Hunt AN(2009)Dynamic lipidomics with stable isotopelabelling.Journal of chromatography B,Analytical technologies in thebiomedical and life sciences 877:2716-2721。
优选地，内部代谢物标准物是稳定同位素标记的标准物。如已知的，同位素的背景下的稳定是指，该同位素是非放射性的，即它们不自发衰减。用(a)稳定同位素标记的代谢物标准物是待定量的代谢物的稳定同位素标记的版本，并且是本领域中公知的。通常，所采用的同位素是碳、氮或氢的稳定同位素，如例如12C和13C、14N和15N以及2H(氘)。此类稳定同位素标记的代谢物标准物已描述于例如Lee等人.Clinical Biochemistry43(2010):1269-1277。
如在本文中所使用的术语“样品”是指生物样品，如例如细胞、组织(来自任何器官)或流体(包括血清、血浆、全血)，其已分离自或获自个体或从包括受试者的细胞的细胞培养物的细胞培养组分。可以根据本发明的方法将从包括细胞的患者和/或受试者获得的任何组织或液体样品用于一种或多种代谢物的量的评估。细胞类型的实例是肝细胞、心肌细胞、脂肪细胞、肌细胞、(肾、肺或心血管来源的)上皮细胞和成纤维细胞，以及从这些细胞衍生的细胞(例如，永生化细胞系或诱导多能干细胞系)。本领域中公知，可以容易地从血液样品(从全血、血清或血浆)获得个体的蛋白质(如为代谢物)。因此，根据本发明的方法评估代谢物的量的优选样品是血液、血清和/或血浆。如果需要，用于制备用于蛋白质提取的样品的方法是本领域中公知的，并且可以使用市售试剂盒进行，如例如来自BIOCRATES Life Sciences AG(Innsbruck,Austria)的AbsolutelDQTM p180和p150试剂盒。
对于样品中一种或多种代谢物的量的评估，可能需要根据样品的类型和选择用于评估的方法操作样品。例如，在血液的情况下并且当使用AbsolutelDQTM p150试剂盒(BIOCRATES Life Sciences AG，Innsbruck,Austria)时。例如，可以将血液抽入合适的容器中(例如管，如S-血清管(SARSTEDT AG&Co.，Nümbrecht，Germany))，随后一次或多次平缓颠倒容器，并且让样品在室温下静止数分钟以获得完全凝固。对于血清采集，可以例如以2750g和15℃进行血液的离心10分钟。随后可以分离血清，并且如果需要，填充到容器例如合成吸管中，用于存储，如在液氮(-196℃)中，直到进行代谢分析。
符合本领域中其公知的含义使用术语“代谢物”。简言之，代谢的中间产物和最终产物被称为代谢物(也有时称为具有小于1500道尔顿的分子量的小分子或分析物)。代谢物被分类为直接参与正常生长、发育和繁殖的初级代谢物。次级代谢物不直接参与后面的过程，但可以具有重要的生态学功能(例如，抗生素、色素)。代谢物的示例性生物学功能包括作为生物合成途径中的中间或终点产物或作为细胞信号分子(例如，在能量稳态、脂质和糖转运的调节(例如，CPT、GLUT4)、以及非核受体如GPR-家族、核受体如PPAR、LXR或FXR中(Violante等人,Biochim Biophys Acta2010,1802(9):728-732；Turner等人,Diabetes Metab Res Rev 2005,21(6):505-514；Ulven等人,J Lipid Res 2004,45(11):2052-2062；van Meer等人,Nat Rev Mol Cell Biol 2008,9(2):112-124；Jones等人,Proc Natl AcadSci U S A 2005,102(17):6207-6212；Prossnitz等人,Annu Rev Physiol 2008,70:165-190；Ye J,Endocr Metab Immune Disord Drug Targets 2007,7(1):65-74；Chiang JY,Endocr Rev 2002，23(4):443-463；Makishima M,JPharmacol Sci 2005,97(2):177-183.)。因此，它正成为基因的功能注释中和对生物学病况的细胞响应的全面理解中的关键工具。
本文所指的代谢物的特征包含在下表中。从下表可明显看出，对于如根据本发明的方法所用的代谢物，从人类代谢组数据库HMDB(Wishart等人,2007,Wishart等人,2009)版本2.5提供识别号。
使用本领域中公知的标准缩写来缩写本文所指的代谢物。例如，“PC”是磷脂酰胆碱的缩写，术语“Cx:y”用于描述所有链的碳的总数(x)和双键的数量(y)。关于甘油部分中酯(a)和醚(e)键的存在区分甘油磷脂，其中两个字母(aa＝二酰基，ae＝酰基-烷基)表示两个甘油位置各自结合于脂肪酸残基，同时单个字母(a＝酰基或e＝烷基)表示单个脂肪酸残基的存在。例如“PCae C34:1”表示具有酰基(a)和醚(e)侧链的甘油磷脂酰胆碱，在两个侧链上具有34个碳原子，并且在其中一个链上具有单个双键。
术语“同量异序(isobaric)”是本领域中公知的，并且关于如在本文中所使用的代谢物是指具有与本文所识别的作为发展T2D的风险因素的给定代谢物相同分子量的代谢物。尽管与本文所识别的作为发展T2D的风险因素的代谢物相比具有相同的分子量(如通过本文所述方法确定的)，但同量异序代谢物具有不同的化学式。
根据本发明的方法，可选地制备包括所确定的代谢物的量的值的硬拷贝或软拷贝。硬拷贝的非限制性实例包括打印输出、手写信息、以及如例如从质谱仪最初获得的照片或数据。软拷贝的非限制性实例包括任何形式的计算机文档，如从进行测量的机器(例如质谱仪)或从相应分析程序最初获得的数据输出，或例如包含值的文字或其他文本软件文档，以及例如屏幕截图。
应该理解，包括在所述硬或软拷贝中的值可以是例如计算出的值，例如以从测量结果以及所获得的原始数据衍生的数值的形式。根据本发明，制备包括所确定的代谢物的量的值的硬或软拷贝的选项可以应用于本发明的识别发展2型糖尿病的倾向的方法，或应用于产生本发明的用于识别发展2型糖尿病的倾向的代谢物的量的诊断信息值的方法。
为了识别发展T2D的倾向，将在疑似倾向于发展T2D的受试者的样品中的本文所描述的所述一种或多种代谢物的量与对照的一种或多种相应的代谢物的量相比。对照选自i)对于T2D阴性的受试者的组(本文也称为“对照组”)，没有表现出葡萄糖耐量受损(IGT)，并且可选地没有表现出单独的空腹葡萄糖受损(i-IFG)，即在以75g葡萄糖的口服葡萄糖耐量试验期间，对照组具有空腹血糖<110mg/dl和2小时后葡萄糖血浆负荷<140mg/dl，并且可选地显示HbA1c<5.7％，并且对于研究群体是代表性的(关于例如年龄、种族、性别、健康状态的相同分布)，以及ii)数据库条目。所述受试者组优选由适当大量的受试者组成，以产生代表性的结果。优选地，确定(对于每个值)至少4、6、8、10、20、50、100、200或更优选至少400，甚至更优选(对于每个值)至少500、600、700、800和最优选1000以及更多对照受试者的样品的量。这可以是有利的，因为对照组的一些个体可能潜在地显示所述一种或多种代谢物的升高的量，即，他们处于发展T2D的风险中，但在所述风险因素的基础上在本发明之前不能令人信服地确定处于风险中。这里应当理解，根据本发明的研究结果，根据i)的所述对照组不包含具有指示人处于发展T2D风险中的代谢物的量的个体。然而，根据i)的对照组可以被标准化以排除处于发展T2D风险中的受试者，例如，基于不同于根据本发明的那些的生物标志物，以(进一步)细化(改进，refine)初始对照数据。可以想象地，增加对照组中受试者的数量将产生更准确和代表性的结果以用作对照中给定代谢物的正常量。还优选的是不止一次确定代谢物的量或评估对照组受试者的数个样品。合并所述数个样品、所述数次测试和/或所述对照组的受试者的数以计算平均值或中位值，以及可选地在数个样品或测试的情况下对于每个受试者的方差，和/或对于对照受试者组的方差。这些值可以例如作为对于所述一种或多种代谢物中的每一个的标准化值存储在数据库中，并且如果需要从数据库中取回(retrieve)，因此，使得每次评估患者样品中的量时不必须(dispensable)还需要实验评估对照样品中的代谢物的量。因此，对照也可以是数据库条目，即上述根据项目ii)的对照。此外，通过使用对照样品的代谢物的量的方差，可以确定由待评估样品中对照的平均值的偏差统计显著性。最后，可以使用其中认为适当的、年龄-或性别-特异的或以其他方式偏差的对照。
根据本发明，第一次证明了代谢物(即，以上提及的那些)的量和发展T2D的关联。简言之，在基于群体(population)的KORA基线和后续组群(cohort)S4/F4中进行代谢物的全面筛选和定量(Rathmann等人,Diabet Med 26,1212-1219(2009))。该研究揭示了不同于常见T2D风险指标的IGT个体中的代谢偏差(Rathmann等人,Diabet Med 26,1212-1219(2009)；Lyssenko等人,N Engl J Med 359,2220-2232(2008))，常见T2D风险指标包括例如空腹葡萄糖(FG)、糖化血红蛋白(HbA1c)(ADA.Executive summary:Standards of medical care in diabetes-2010.DiabetesCare 33 Suppl 1,S4-10(2010).)和空腹胰岛素(参见图2和图3)。这些偏差可在EPIC-Potsdam组群中重复(Boeing等人,Ann Nutr Metab 43,195-204(1999))。因此，并且根据本发明的方法，基于代谢物可以确定受试者处于发展T2D的风险中，并且重要地，在葡萄糖耐量受损之前并且独立于上述通常已知的发展T2D的风险因素。可以想象地，并且因为表现出葡萄糖耐量受损的受试者可以延缓或预防T2D的发展，本发明的方法允许早期医学干预，包括例如生活方式的改变和/或用药物治疗。本发明的方法开辟了对于预防T2D的全新的治疗时间框架，其允许严重事件之前的医学干预，严重事件如例如可以影响受试者的健康的葡萄糖耐量受损。相应干预将有助于维持处于发展T2D风险中的受试者的健康。评估上述一种或多种代谢物的量将识别会受益于预防性医学干预的受试者，因此可能通过逆转和/或延迟T2D疾病的发展挽救个体的健康，并且降低对于卫生保健系统的成本。
在进一步的实施方式中，本发明涉及识别能够预防2型糖尿病和与其相关疾病的化合物或作为用于开发能够预防2型糖尿病和与其相关疾病化合物的先导化合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)评估与测试化合物接触的细胞中或在从受试者获得且与所述测试化合物接触的样品中的选自以下的一种或多种代谢物的量：i.第一组，包括代谢物甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2和磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3以及同量异序代谢物，该同量异序代谢物具有与甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2或磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3相同的分子量但具有不同的化学式；和/或ii.第二组，包括代谢物乙酰肉毒碱C2和同量异序代谢物，该同量异序代谢物具有与乙酰肉毒碱C2相同的分子量但具有不同的化学式；和(b)评估从受试者获得的细胞或样品中所述一种或多种代谢物的量，其中所述细胞或样品i.不与所述测试化合物接触；ii.与已知不影响步骤(a)的所述一种或多种代谢物的量的化合物接触，其中，与步骤(b)i.或(b)ii.相比，步骤(a)中选自所述第一组的代谢物的量的增加或选自所述第二组的代谢物的量的降低表明所述测试化合物能够预防2型糖尿病和与其相关的疾病或用作用于开发能够预防2型糖尿病和与其相关疾病的化合物的先导化合物；或iii.与已知增加选自步骤(a)的所述第一组的所述至少一种代谢物的量和/或降低选自步骤(a)的所述第二组的所述至少一种代谢物的量的化合物接触，其中，与步骤(b)iii.相比，步骤(a)的选自所述第一组的所述至少一种代谢物的基本相等量或增加量和/或选自所述第二组的所述至少一种代谢物的降低量表明化合物能够预防2型糖尿病和与其相关疾病或用作用于开发能够预防2型糖尿病和与其相关疾病的化合物的先导化合物。
用于评估代谢物的量的方法是本领域中公知的，并且在本文中示例性描述其中的一些。将要在从与测试化合物接触的受试者获得的细胞或样品中评估一种或多种代谢物的量。所述细胞可以是从已建立的细胞系衍生的细胞培养物菌落的部分。该细胞可以是肝细胞、心肌细胞、脂肪细胞、肌细胞、(肾、肺或心血管来源的)上皮细胞和成纤维细胞，以及从这些细胞衍生的细胞(例如，永生化细胞系或诱导多能干细胞系)。另外，细胞可以是从与测试化合物接触的受试者样品建立的原代细胞培养物的部分。在本文其他地方描述用于评估代谢物的量的从受试者获得的或可获得的合适样品，并且也可以被处理而没有在前的步骤，如建立原代细胞培养物，以评估代谢物的量。
如在本文中所使用的，术语“化合物”涉及可以是固体、半固体、半流体、流体或气体的物质。然而，所述化合物也可以包括在混合物、提取物或组合物中。
根据本发明的方法识别为能够预防T2D和与其相关疾病或能够用作用于开发能够预防T2D和与其相关疾病的化合物的先导化合物的化合物增加选自所述第一组代谢物的所述一种或多种代谢物的量和/或降低选自所述第二组代谢物的所述一种或多种代谢物的量，其可以例如基于在与代谢物本身、与参与给定代谢物的代谢途径的基因或与任何中间物或最终的一种或多种基因产物的直接或间接相互作用中其抑制、促进、竞争或拮抗活性。所述一种或多种化合物可以是化学合成的或经由微生物发酵产生的但也可以包含在例如样品中，例如来自例如植物、动物或微生物的细胞提取物。此外，将要通过本发明的方法识别的所述化合物可以是本领域中已知的但迄今不知道用作能够预防T2D的化合物。与T2D相关的疾病是这样的疾病，其发作和/或持续有原因地涉及T2D的发展和/或存在，或已示出发展并与T2D同时存在(如例如，心血管疾病(例如，中风、心脏病发作)、糖尿病视网膜病变和神经病、或肾衰竭)。另外设想的是与T2D相关的疾病是这样的疾病，其受试者在发展T2D之前受折磨，并且其被调节，如例如在T2D的发展和/或存在之时加重或从急性状况转为慢性状态。
根据本发明的方法，术语“使细胞与化合物接触”涉及使细胞暴露于待测化合物且允许所述化合物与细胞相互作用的过程。取决于待测化合物作用的潜在模式，相互作用可以在细胞外和/或在细胞内发生引起选自所述第一组代谢物的所述一种或多种代谢物的量的增加和/或选自所述第二组代谢物的所述一种或多种代谢物的量的降低——所提供的化合物由此能胜任。例如，化合物可以结合到细胞表面并引起导致所述代谢物的量的增加和/或降低的信号级联。然而，优选地化合物在允许细胞外相互作用和摄取进入细胞、特别是细胞质或细胞核的条件下暴露于细胞，以施加其对给定代谢物的代谢途径中的调节事件的潜在活性。本领域技术人员知道通常适用于摄取化合物如例如蛋白质或核酸分子进入细胞的条件，以及关于速率和量的增强所述摄取的方法，其中所述增强可以包括人工修饰，例如蛋白质(参见，例如，Patsch et Edenhofer,(2007),Handb.Exp.Pharmacol.,178,203-232)或核酸。此外，本领域技术人员也知道相对于其他细胞自然表现出增加的摄取能力的能力的细胞系。此类细胞为例如粘膜细胞或肠细胞的细胞。对于各种化合物穿过质膜的通道存在许多机制，包括被动扩散、易化扩散和主动运输系统。蛋白质通过质膜的双层脂质结构的被动扩散是蛋白质分子的大小、脂溶性和电荷的函数。进一步摄取机制是内吞作用。内吞作用是凭借其细胞用它们的细胞膜通过吞没物质而从外界吸收物质的过程。内吞作用对超过一定大小阈值的大分子或颗粒物质以及也对流体(胞饮)起作用。相应地，测试化合物应以允许测试化合物与细胞相互作用的方式与受试者接触，该细胞为随后从所述受试者获得并根据本发明的方法评估的样品的部分。例如，如果旨在获得血液作为来自受试者的样品，静脉内给予测试化合物(如果必要，作为治疗上可接受的组合物的部分)将适合于允许样品的细胞与测试化合物的相互作用。因此，在评估步骤(a)中的代谢物的量之前，所述测试化合物可以被例如添加到培养基或注射到细胞或给予至个体。此外，待识别的化合物可以包含在小分子的文库中，如可以商购获得的有机或无机小分子。此外，包括抗体或其功能性片段或衍生物(即，维持原始抗体的结合特异性的片段或衍生物)的文库可以被用作识别过程中的起点。合适的文库是可以商购获得的，例如来自ChemBridge Corp.,San Diego,USA。同样，可采用适体如肽适体的文库。本领域技术人员当然自由使用用于在本发明的方法中使用的所需化合物的任何其他起点。
如果在本发明的方法中包含一种或多种化合物的组合物被识别为能够预防T2D和与其相关疾病或作为用于开发能够预防T2D或与其相关疾病的化合物的先导化合物，则也可以或者从识别为包含所讨论化合物的原始组合物分离一种或多种活性化合物或者可以进一步细分原始组合物(例如，如果它由许多不同的测试化合物组成)从而降低每样品的不同物质的数量，并且用原始组合物的细分重复该方法。随后可以例如，通过本文所描述或在文献中(“Cells:A laboratory manual”,v.1-3,edited by Spector等人,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1997)；ISBN 10:0879695218)的方法确定所述细分的组合物或所得到的化合物是否显示所期望的特性。取决于组合物的复杂性，以上所描述的步骤可进行多次，优选直至根据本发明的方法识别的组合物仅包括有限数量的物质或仅一种物质。优选所述组合物包括类似化学和/或物理学特性的物质。由本领域技术人员能够容易地进行本发明的方法和实验设置而无需进一步麻烦设计，例如，根据在现有技术中描述的其他基于细胞的筛选试验。本发明的方法的此类改编很好地在本领域技术人员的技术范围内并且可以进行而无需过度实验。
可以根据本发明测试的化合物包括肽、蛋白质、核酸、抗体、小的有机化合物、配体、肽模拟物、PNA等。取决于是否测试代谢物的第一或第二的量(amount of the first or second of metabolites)，所述化合物可以用作激动剂或拮抗剂。所述化合物也可以是已知药物的功能性衍生物或类似物。用于制备化学衍生物和类似物的方法是本领域技术人员公知的，并且描述于例如Beilstein,Handbook of Organic Chemistry,Springer edition NewYork Inc.,175 Fifth Avenue,New York,N.Y.10010 U.S.A.and OrganicSynthesis,Wiley,New York,USA。同样，可以使用肽模拟物和/或适当药物衍生物和类似物的计算机辅助设计。
适当的计算机程序可以用于确定推定地能够预防T2D和与其相关疾病的化合物的相互作用位点，通过计算机辅助搜索互补结构基序(Fassina,Immunomethods 5(1994),114-120)。用于蛋白质和肽的计算机辅助设计的进一步适当计算机系统在现有技术中描述，例如，在Berry,Biochem.Soc.Trans.22(1994),1033-1036；Wodak,Ann.N.Y.Acad.Sci.501(1987),1-13；Pabo,Biochemistry 25(1986),5987-5991中。可以与本发明的方法结合使用由以上描述的计算机分析获得的结果用于例如优化已知抑制剂、类似物、拮抗剂或激动剂。也可以通过连续化学修饰合成肽模拟物组合文库并测试所得到的化合物，例如，根据本文描述或提及的方法来识别适当的肽模拟物。用于产生和使用肽模拟物组合文库的方法描述于现有技术中，例如在Ostresh,Methods in Enzymology 267(1996),220-234和Dorner,Bioorg.Med.Chem.4(1996),709-715中。此外，所述化合物的三维和/或晶体结构可以用于设计拟肽药物(Rose,Biochemistry 35(1996),12933-12944；Rutenber,Bioorg.Med.Chem.4(1996),1545-1558)。众所周知如何以本发明的方法获得待测化合物，例如，通过化学或生物化学标准技术。因此，也由本发明的方法包括的是制造或生产所述化合物的方式。总之，本发明提供用于识别可以用于预防T2D和与其相关疾病的化合物的方法。
另外，本发明的方法可以在识别先导化合物中有用。根据本发明，术语“先导化合物”是指通过本发明的方法发现的化合物，其将例如被进一步优化，具体地是药学上更加可接受的。可以优化所识别的先导化合物以获得这样的化合物，其可以例如在用于预防T2D的药物组合物中使用。用于优化在筛选中识别的化合物、先导化合物的药理学特性的方法是本领域中已知的，并且包括修饰识别为先导化合物的化合物的方法，以实现：(i)修饰的作用位点、活性谱、器官特异性，和/或(ii)改善的效力，和/或(iii)降低的毒性(改善的治疗指数)，和/或(iv)降低的副作用，和/或(v)修饰的治疗作用的发作、作用持续时间，和/或(vi)修饰的药代动力学参数(吸收、分布、代谢和排泄)，和/或(vii)修饰的物理-化学参数(溶解度、吸湿性、颜色、味道、气味、稳定性、状态)，和/或(viii)改善的全身特异性、器官/组织特异性，和/或(ix)通过以下优化的应用形式和途径：(i)酯化羧基基团，或(ii)用羧酸酯化羟基基团，或(iii)将羟基基团酯化为例如磷酸酯、焦磷酸酯或硫酸酯或半琥珀酸酯，或(iv)形成药学上可接受的盐，或(v)形成药学上可接受的复合物，或(vi)合成药理学活性聚合物，或(vii)引入亲水部分，或(viii)引入/交换芳香基(aromate)或侧链上的取代基，变化取代基模式，或(ix)通过引入电子等排(isosteric)或生物电子等排部分修饰，或(x)合成同源化合物，或(xi)引入分支侧链，或(xii)将烷基取代基转换为环状类似物，或(xiii)将羟基基团衍生为缩酮、缩醛，或(xiv)N-乙酰化为酰胺、苯基氨基甲酸酯，或(xv)合成曼尼希碱(Mannich bases)、亚胺，或(xvi)将酮或醛变换为希夫碱(Schiffs bases)、肟、缩醛、缩酮、烯醇酯、噁唑烷、噻唑烷或它们的组合。
上述各种步骤通常是本领域中已知的。它们包括或依靠定量构效关系(QSAR)分析(Kubinyi(1992)“Hausch-Analysis and Related Approaches”,VCH Verlag,Weinheim)、组合生物化学、经典化学等(参见，例如，Holzgrabeand Bechtold(2000)Deutsche Apotheker Zeitung 140(8),813)。
可以通过本领域中公知的方法配制并给予患者根据本发明的方法识别的治疗上有用的化合物。在他们的体内给予之后，药物或前药被代谢以通过排泄或通过代谢成一种或多种活性或无活性的代谢物来排除(Meyer,J.Pharmacokinet.Biopharm.24(1996),449-459)。更具体地，“前药”是通常为非生物学和/或药理学活性的化合物。在给予之后，前药被激活，通常在体内通过酶促或水解裂解并且转换成具有预期医学作用的生物学和/或药理学化合物。通常通过生物学和/或药理学化合物的化学修饰形成前药。用于选择和制备合适的前药的常规程序描述于例如Design of Prodrugs,ed.H.Bundgaard,Elsevier,1985。因此，不是使用根据本发明的方法识别的实际化合物，可以使用作为前药的相应制剂，其在患者中转化成其活性。在文献中描述可采取用于前药和药物的应用的预防性措施；参见，for review,Ozama,J.Toxicol.Sci.21(1996),323-329。
优选地，以高通量格式实现所述方法。高通量试验，不取决于为生物化学、细胞或其他试验，通常可以在微量滴定板的孔中进行，其中每个板可以包含96、384或1536个孔。优选地由一个或多个计算机控制的机器人系统(包括移液装置)实现板的处理、包括在不同于室温的温度下孵育并开始测试化合物与试验混合物的接触。在待被筛选和/或筛选的测试化合物的大文库要在短时间内完成的情况下，可以将例如10、20、30、40、50或100个测试化合物的混合物添加到每个孔中。在很好显示生物活性的情况下，所述测试化合物的混合物可以被去卷积(de-convolute)以识别产生所述活性的所述混合物中的一种或多种测试化合物。
上述定义已作必要的修正(mutatis mutandis)应用于下述方法。
本发明的这种方法基于以下推定：选自所述第一组代谢物的所述一种或多种代谢物的量的增加和/或选自所述第二组代谢物的所述一种或多种代谢物的量的降低适于预防受试者中T2D和与其相关疾病的发展。如上文所描述的，所述一种或多种代谢物与发展T2D的风险相关，并且在处于发展T2D风险的受试者中它们的量分别降低或增加。相对于(vis-a-vis)步骤(b)中对照样品或细胞的相应的一种或多种代谢物的量确定一种或多种代谢物的量的增加和/或降低。对于用作对照的步骤(b)，不言自明的是，步骤(b)i)、ii)或iii)的对照样品不与步骤(a)中提到的测试化合物接触。所述对照样品或细胞可以是尚未与待测化合物接触的样品或细胞。另外地或可替代地，样品或细胞的代谢物的量可以与已经与已知不影响一种或多种代谢物的量的化合物接触的样品或细胞的相应的一种或多种代谢物的量相比。除了针对后来的阴性对照中的一个或两者比较步骤(a)细胞或样品的代谢物的量，还设想的是，完成针对与已知增加所述第一组的所述一种或多种代谢物的量和/或降低所述第二组的所述一种或多种代谢物的量的化合物接触的样品或细胞的比较。相应方法提供待测化合物的定性评估。如果期望筛选对一种或多种代谢物的量具有与后者对照(已经与已知增加选自所述第一组的所述至少一种代谢物的量和/或降低选自所述第二组的所述至少一种代谢物的量的化合物接触的细胞或样品的相应的一种或多种代谢物的量)类似或更优作用的化合物，可替代地可以排他地针对已经与已知增加选自所述第一组的所述至少一种代谢物的量和/或降低选自所述第二组的所述至少一种代谢物的量的化合物接触的细胞或样品的相应的一种或多种代谢物的量比较步骤(a)的细胞或样品的一种或多种代谢物的量。相应的实验设置将因此允许识别类似或更优于现有化合物(其能够增加选自所述第一组的所述至少一种代谢物的量和/或降低选自所述第二组的所述至少一种代谢物的量)的化合物。换言之，与已知增加选自所述第一组的所述至少一种代谢物的量和/或降低选自所述第二组的所述至少一种代谢物的量的所述化合物相比，相应的化合物可以能够基本相等或更高增加所述第一组的一种或多种代谢物的量和/或基本相等或更高降低所述第二组的一种或多种代谢物的量。术语“基本相等”是指代谢物的量，其为已经与已知增加选自所述第一组的所述至少一种代谢物的量和/或降低选自所述第二组的所述至少一种代谢物的量的化合物接触的细胞或样品的相应代谢物的量的约90％至约110％，如约(对于每个值)91％至约(对于每个值)109％、92％至108％、93％至107％、94％至106％、95％至105％、96％至104％、97％至103％、98％至102％、99％至101％、或100％高。同样，当非基本上相等时，一种或多种代谢物的量可以高至为已经与已知增加选自所述第一组的所述至少一种代谢物的量的所述化合物接触的细胞或样品的一种或多种相应代谢物的量的大于110％，如例如至少111％、112％、113％、114％、115％、或优选至少116％或117％，更优选至少120％或130％并且最优选至少200％或更高，或低至已经与已知降低选自所述第二组的所述至少一种代谢物的量的所述化合物接触的细胞或样品的一种或多种相应代谢物的量。取决于已知增加选自所述第一组的所述至少一种代谢物的量和/或降低选自所述第二组的所述至少一种代谢物的量的化合物的效力，可能不能进一步增加选自所述第一组的所述至少一种代谢物的量和/或降低选自所述第二组的所述至少一种代谢物的量。因此，将要通过本发明的方法识别的合适化合物可仅比较之下实现，上述限定的阳性对照的选自所述第一组的所述至少一种代谢物的量增加和/或选自所述第二组的所述至少一种代谢物的量降低的一部分。因此，也可以根据本发明的方法确定这样的化合物，与已经与已知增加选自所述第一组的所述至少一种代谢物的量和/或降低选自所述第二组的所述至少一种代谢物的量的化合物接触的细胞或样品的代谢物的量相比，其仅引起选自所述第一组的所述至少一种代谢物的量的增加和/或选自所述第二组的所述至少一种代谢物的量的降低，其为至少5％，如至少10％、20％、30％、40％、50％，或优选至少60％或70％，并且最优选至少80％，或至少89％。因此，识别能够向着不处于T2D风险中的人的相应的一种或多种代谢物的量调整如本文所描述的一种或多种风险代谢物的量的化合物(优选是选择性地且以剂量依赖性方式)提供用于基于药物的治疗性干预的方式。
上述已作必要的修正应用于本文所述其他实施方式。
在识别能够预防2型糖尿病和与其相关疾病的化合物或用作用于开发能够预防2型糖尿病和与其相关疾病的化合物的先导化合物的方法的优选实施方式中，该方法进一步包括合成能够预防2型糖尿病和与其相关疾病的所述化合物，或用作用于开发能够预防2型糖尿病和与其相关疾病的化合物的先导化合物。
如上所述，如何获得、生产和调制测试化合物，例如通过化学或生物化学标准技术是本领域中公知的。因此，识别能够预防T2D和与其相关疾病的化合物或用作用于开发能够预防T2D和与其相关疾病的化合物的先导化合物，通过采用所述化学或生物化学标准技术，本领域技术人员处于以所需量的合成所述识别的化合物的立场。例如，并且关于小分子、反义核酸分子、siRNA、shRNA、miRNA、核酶、肽适体、基于核酸的适体和抗体作为测试和/或确定化合物，在下文中描述如何获得、生产和调制后者的方法。
在本发明的方法的进一步优选实施方式中，在所述受试者表现出增加的血糖水平之前，选自降低的所述第一组和/或增加的所述第二组的所述一种或多种代谢物的量在受试者中是可检测或检测到的。
此外，令人惊奇的发现，可以示出代谢物为发展T2D的风险标志物，同样重要的发现是，识别为风险因素的所有代谢物共享以下共同特征：为从增加的血糖水平的共同风险因素去结合(decoupled)。换言之，在受试者血糖水平的任何升高之前，可以检测到第一和/或第二组的所述一种或多种代谢物的量的上述扰动。血糖水平的升高定义为HbA1c>5.7％以上的升高，其中HbA1c≥6.5％与T2D相关(ADA(2010)Executive summary:Standards of medical care in diabetes-2010.Diabetes Care 33 Suppl 1:S4-10)。血糖水平的升高可以是由于糖尿病前期(IGT)或由于i-IFG。
在本发明的方法的另一个优选实施方式中，至少每两年进行该方法。
根据本发明理解的是，第一和/或第二组的所述一种或多种代谢物的量的上述扰动可以发生在受试者发展与发展T2D风险相关的葡萄糖耐量受损之前的不同的时间点，可以需要按一定的时间间隔进行因此本发明的方法，如例如至少每年、至少两年一次、至少(对于每个值)3、4、5、6、7年一次或至少8年或更多年一次作为监测代谢物的量的方式。换言之，在来自给定受试者的样品中进行根据本发明识别的方法仅一次不提供发展T2D风险的终点评估，因为由本发明人识别的所述一种或多种代谢物的量的变化可以随着时间发展，并且因此在第一次进行本发明的方法之时可能不存在。因此，如果所述第一测试是阴性的，即，该人被确定为未处于发展T2D的风险中，如上文所描述的，仍应监测所述受试者。根据本发明的方法要进行随后测试的时间间隔可以取决于这些因素：如例如要评估其量的代谢物的选择、受试者的年龄或体格。例如，在仅评估一种代谢物的量的情况下，测试之间的所述时间间隔通常应短于当依赖用于进行风险预测的更多代谢物时，但这也可以取决于所选代谢物。例如，当仅依赖乙酰肉毒碱C2或具有与乙酰肉毒碱C2相同的分子量但具有不同的化学式的同量异序代谢物时，一个人可需要至少每两年重复测试一次，而依赖甘氨酸和/或溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2可保证在7年内仅测试至少一次。为了增加本发明的方法的预测能力，设想根据本发明评估一种以上代谢物的量，尽管评估本文所限定的一种代谢物就足够了。例如，评估所述第一和第二组的至少2种，如至少(对于每个值)3、4种，更优选至少(对于每个值)5、6种，和最优选至少(对于每个值)7、8或9种，即，所有代谢物(不包括同量异序代谢物)的量。当然，还设想评估包括同量异序代谢物或仅所述第一和/或第二组的一种或多种同量异序代谢物的混合物。
在本发明的方法的不同优选实施方式中，所述一种或多种代谢物选自：所述第一组代谢物的溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、甘氨酸和同量异序代谢物，该同量异序代谢物具有与溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2或甘氨酸相同的分子量但具有不同的化学式，和所述第二组代谢物的乙酰肉毒碱C2和同量异序代谢物，该同量异序代谢物具有与乙酰肉毒碱C2相同的分子量但具有不同的化学式。
每个上述代谢物已示出特别地预测T2D以及IGT的发展。下文陈列代谢物的特定组合，其相比于本领域T2D风险指标状态，所述组合一起提供特别改善的IGT和T2D的预测。如可从图3和图4看出，与本领域预测T2D标志物的状态相比，某些组合提供显著改善的预测值。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述一种或多种代谢物选自所述第一组代谢物的溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、甘氨酸和同量异序代谢物，该同量异序代谢物具有与溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2或甘氨酸相同的分子量但具有不同的化学式，和所述第二组代谢物的乙酰肉毒碱C2和同量异序代谢物，该同量异序代谢物具有与乙酰肉毒碱C2相同的分子量但具有不同的化学式。
在本发明的方法的进一步优选实施方式中，其中评估代谢物甘氨酸和溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2或同量异序代谢物的量，该同量异序代谢物具有与甘氨酸和溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2相同的分子量但具有不同的化学式；其中评估选自包括甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2和乙酰肉毒碱C2或同量异序代谢物的组的三种代谢物的量，该同量异序代谢物具有与甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2和乙酰肉毒碱C2相同的分子量但具有不同的化学式；其中评估选自包括甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、乙酰肉毒碱C2和磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2或同量异序代谢物的组的四种代谢物的量，该同量异序代谢物具有与甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、乙酰肉毒碱C2和磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2相同的分子量但具有不同的化学式；或其中评估选自包括甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、乙酰肉毒碱C2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2和溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0或同量异序代谢物的组的五种代谢物的量，该同量异序代谢物具有与甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、乙酰肉毒碱C2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2和溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0相同的分子量但具有不同的化学式。
在本发明的方法的另一个优选实施方式中，样品选自血液、血清或血浆。
由于血液采集的容易可及性和临床常规以及从血液成分提取和可选地纯化代谢物的标准化方案，将要在本发明的方法中使用的一个优选样品是血液(也参见上文)。根据本发明的方法优选的是外周血单核细胞作为血液成分，其要被进一步处理以提取代谢物。血清作为样品是优选的。用于从血液、血清或血浆提取和可选地纯化代谢物的合适方法是本领域技术人员公知的，并且示例性方法在本文中描述。
根据本发明的方法，也设想作为样品是唾液和口腔涂片样品，其对于采集同样方便可达到，相比于血液、血清或血浆采集，然而不必损害受试者以获得样品。优选的是口腔粘膜上皮细胞，其可从口腔拭子分离用于进一步处理以提取和可选地纯化代谢物以评估与发展T2D风险相关的代谢物的量。
在本发明的方法的进一步优选实施方式中，所述一种或多种代谢物的量的评估由靶向或非靶向的NMR、FIA-MS、GC-MS或LC-MS完成。
对于代谢物浓度的定量，核磁共振(NMR)谱和质谱(MS)是最广泛使用的技术(Suhre等人,PloS one,e13953(2010))。NMR是唯一不依赖分析物分离的检测技术，并且因此可以回收样品用于进一步分析。可以同时测量各种小分子代谢物—在这个意义上，NMR接近为通用检测器。NMR的主要优点是高分析的再现性和样品制备的简易性。然而，实际上，相比于基于质谱的技术它是相对不灵敏的，并且需要更大的(10-100×)样品体积。
质谱用于由气体(GC)和液相(LC)色谱分离后识别并定量代谢物。MS是灵敏的并且可非常具体。基于MS的技术被进一步分类为非定向方法(例如，GC-MS和LC-MS)和定向代谢组学，其基于预选的MRM对与同位素标记的内部标准物，用基于快速直流注射(FIA)的许多它们的方法，然而具有进行多重GC-MS和LC-MS方案的能力。当研究具有许多数据点的大群体和时间系列时，FIA-MS特别适于高通量试验。
例如，如在实例部分中另外描述的，使用AbsolutelDQTM试剂盒途径的(approached)定向FIA-和LC-MS可以用于评估代谢物的量。如由制造商所描述的进行样品制备。立即(也参见Romisch-Margl等人,Metabolomics 2012,8(1):133-142)，可以在Hamilton ML Star机器人系统(瑞士，Bonaduz，Hamilton Bonaduz AG)上进行以下样品制备步骤：(a)移取10μl血清到96孔试剂盒板的过滤插入件(包含稳定同位素标记的内部标准物)，(b)在氮气流下干燥样品，(c)用5％异硫氰酸苯酯试剂(PITC)衍生化氨基酸，(d)干燥样品，(e)用在甲醇中的5mM醋酸铵提取代谢物和内部标准物，(f)通过过滤膜离心，(g)用MS运行溶剂稀释。可以使用配备有Agilent 1200系列HPLC和由软件Analyst 1.5控制的来自CTC的HTC PAL自动采样器的API 4000三重四极质谱仪(ABSciex)分析最终提取物。包括两个20μL注射器(一个用于正电喷雾离子化模式，而另一个用于负电喷雾离子化模式)的标准流注射方法可应用于所有测量。可以通过多反应监测(MRM)检测结合使用稳定同位素标记及其他的内部标准物来实现定量。随后可以用MetlQTM软件包(AbsolutelDQTM试剂盒的组成部分)进行用于定量代谢物浓度的数据评价。所有代谢物的浓度可初步以μM计算。证明示例性方法符合FDA Guidelines(U.S.Department of Health and Human Services 2001)，其意味着在给出误差范围内再现性的证明。
在识别能够预防2型糖尿病和与其相关疾病的化合物或用作用于开发能够预防2型糖尿病和与其相关疾病的化合物的先导化合物的方法的不同的优选实施方式中，所述测试化合物选自小分子、反义核酸分子、siRNA、shRNA、miRNA、核酶、肽适体、基于核酸的适体、抗体或它们的组合。
如在本文中所使用的，术语“小分子”可以描述例如小的有机分子。有机分子涉及或属于具有碳基(carbon basis)的化学化合物的类别，碳原子由碳-碳键连接在一起。术语有机的原始定义涉及化学化合物的来源，其中有机化合物是从植物或动物或微生物来源获得的那些含碳化合物，然而无机化合物从矿物来源获得。有机化合物可以是天然的或合成的。可替代地，化合物可以是无机化合物。无机化合物从矿物来源得到，并且包括无碳原子(除了二氧化碳、一氧化碳和碳酸酯外)的所有化合物。优选地，小分子具有小于约2000amu(原子质量单位)、或小于约1000amu如500amu、以及甚至小于约250amu的分子量。可以通过本领域中公知的方法例如质谱法来确定小分子的尺寸。可以基于潜在药物靶标的晶体结构例如在计算机芯片上(in silico)设计小分子，其中可以在体内试验中、如在体内HTS(高通量筛选)试验中确定并验证推测负责生物活性且参与本文所确定代谢物的量调整的位点。
术语“反义核酸分子”是本领域中已知的，并且是指互补于靶核酸的核酸。根据本发明的反义分子能够与靶核酸相互作用于、更具体地杂交。通过形成杂交体，一个或多个靶基因的转录和/或靶mRNA的翻译被降低或阻止。优选地，核酸分子是反义RNA分子。已描述涉及反义技术的标准方法(参见，例如，Melani等人,Cancer Res.(1991)51:2897-2901)。
对于治疗性用途，通过反义分子或通过核酶(参见下文)的RNA失活似乎是可以实现的。这两类化合物可以是化学合成的或在体外或甚至在体内结合启动子通过生物表达产生的。
小干扰RNA(siRNA)，有时称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类为18至30、优选20至25、最优选21至23或21个核苷酸长度的双链RNA分子，其发挥多种生物学作用。最值得注意的是，siRNA参与RNA干扰(RNAi)途径，其中siRNA干扰特定基因的表达。除了它们在RNAi途径中的作用，siRNA还用在RNAi相关的途径例如抗病毒机制中或在塑造基因组的染色质结构中行使功能。
所述siRNA分子或其代谢加工产物能够介导靶特异性核酸修饰，特别是RNA干扰和/或DNA甲基化。优选地至少一个RNA链具有5'-和/或3'-突出。优选地，双链的一个末端具有1-5个核苷酸、更优选1-3个核苷酸和最优选2个核苷酸的3'-突出。另一个末端可以是平端或具有最高达6个核苷酸的3'-突出。通常，在本发明中设想适于用作siRNA的任何RNA分子。
优选的siRNA具有意义明确的结构：在任一末端上具有2-nt的3'突出的短双链RNA(dsRNA)。每条链具有5'磷酸基团和3'羟基(-OH)基团。至于天然存在的siRNA，这种结构是通过dicer处理的结果，dicer是将长dsRNA或小发夹RNA转变为siRNA的酶。也可以外源地(人工地)将siRNA引入到细胞以实现所关注基因的特异性敲低。基本上，因此可以基于与适当定制的siRNA的序列互补性靶向其序列已知的任何基因。
到目前为止，用由21-nt正义和21-nt反义链组成的siRNA双链体(以具有2-nt的3'-突出的方式配对)获得最有效的沉默。2-nt 3'突出的序列对靶识别的特异性作出小贡献，该靶识别限于邻近第一碱基对的未配对核苷酸(Elbashir等人,EMBO J 2001,20(23):6877-6888)。在3'突出中的2'-脱氧核苷酸与核糖核苷酸一样有效，但合成较便宜且可能更具核酸酶抗性。
短发夹RNA(shRNA)是产生紧密发夹弯的RNA序列，其可以用于经由RNA干扰沉默基因表达。shRNA使用引入到细胞的载体且利用U6启动子以确保始终表达shRNA。该载体通常被传递给子代细胞，允许基因沉默被遗传。由细胞机制将shRNA发夹结构切割为siRNA，其随后结合到RNA诱导的沉默复合体(RISC)。这种复合体结合于并切割mRNA，其匹配结合到它的siRNA。
使用适当的保护的核糖核苷亚磷酰胺和传统的DNA/RNA合成仪，优选地化学合成在本发明的方法中将要使用的si/shRNA。RNA合成试剂的供应商是Proligo(Hamburg,Germany)、Dharmacon Research(Lafayette,CO,USA)、Pierce Chemical(Perbio Science的一部分，Rockford,IL,USA)、Glen Research(Sterling,VA,USA)、ChemGenes(Ashland,MA,USA)和Cruachem(Glasgow,UK)。最方便地，siRNA从商业的RNA寡聚合成供应商获得，其销售不同质量和价格的RNA合成产物。通常，在本发明中可应用的RNA被传统地合成，并且容易地以适于RNAi的质量提供。
影响RNAi的另外的分子包括例如微RNA(miRNA)。所述RNA种类是单链RNA分子，其作为调控基因表达的内源性RNA分子。一旦结合到互补的mRNA转录本就通过类似于RNA干扰的过程引发所述mRNA转录本的降解。因此，miRNA可以用于直接或间接调控与如本文所定义发展T2D的风险相关的代谢物的量。
“核酶”(来自核糖核酸酶，也称为RNA酶或催化性RNA)是催化多种反应的RNA分子。许多天然核酶催化自身切割或其他RNA的切割，但也发现它们催化核糖体的氨基转移酶活性。
良好表征的小的自身切割性RNA的实例是锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎病毒和在体外选择的前导依赖性(lead-dependent)核酶。这些小催化剂的结构(organization)与较大核酶如I型内含子(group I intron)形成对比。催化自身切割的原理已在过去10年中成为公认的。在具有核酶活性的RNA分子中，锤头状核酶的表征最好。由于示出了锤头状结构可以整合至异源RNA序列中并且核酶活性可因此转移到这些分子，似乎可产生对于几乎任何靶序列的催化性反义序列，提供的靶序列包含潜在匹配切割位点。构建锤头状核酶的基本原理如下：选择包含GUC(或CUC)三联体的所关注的RNA区域。采用各自具有6至8个核苷酸的两种寡核苷酸链并且将催化性锤头序列插在它们之间。针对许多靶序列合成这种类型的分子。它们示出在体外和某些情况下也在体内的催化活性。通常用短核酶和靶序列获得最好的结果。
适体是结合特异性靶分子的寡聚核酸或肽分子。通常通过从大的随机序列池选择它们而产生适体，但天然适体也存在于核糖开关中。适体可以作为大分子药物用于基础研究和临床目的二者。此外，它们可与核酶组合以在它们的靶分子的存在下自身切割。
更具体地，适体可分类为DNA或RNA适体或肽适体。而前者由寡核苷酸的(通常是短的)链组成，后者由短的可变肽结构域组成，在两个末端处连接到蛋白质支架。核酸适体为这样的核酸种类，其可以通过反复多轮的体外选择或等同地通过SELEX(通过指数富集的配体的系统进化)工程化以结合到各种分子靶，如小分子、蛋白质、核酸，以及甚至细胞、组织和生物体。
肽适体是设计以干扰细胞内其他蛋白质相互作用的蛋白质。它们由以两个末端连接至蛋白质支架的可变肽环组成。这种双重结构约束将肽适体的亲和力极大提高至与抗体的亲和力可比的水平(纳摩尔范围)。可变环长度通常包括10至20个氨基酸，并且该支架可以是具有良好溶解度特性的任何蛋白质。目前，细菌蛋白质硫氧还蛋白-A是最常用的支架蛋白质，被插在还原活性位点内的可变环，在野生蛋白质中其是-Cys-Gly-Pro-Cys-环，两个半胱氨酸侧链能够形成二硫桥。可以使用不同的系统进行肽适体选择，但目前最常用的是酵母双杂交系统。
由于适体提供比得上那些常用的生物分子、特别是抗体的分子识别特性的分子识别特性，适体提供用于生物技术和治疗性应用的效用。除了它们的区别识别外，由于适体可以在试管中完全工程化、通过化学合成容易地生产、具有理想的存储特性以及在治疗性应用中引起很少或无免疫原性，适体提供优于抗体的优点。
非修饰的适体以几分钟到几小时的半衰期从血流快速清除，主要是由于核酸酶降解和通过肾脏从身体清除，这是适体的固有的低分子量的结果。未修饰适体应用目前集中于治疗瞬态病况如血液凝固，或治疗其中局部递送是可能的器官如眼睛。这种快速清除可以是应用(如体内诊断成像)中的优点。若干修饰，如2'-氟取代的嘧啶、聚乙二醇(PEG)键等是科学家可利用的，使用它们，适体的半衰期可容易地增加到天或甚至周时间尺度。
最近的开发是识别小化合物的适体与锤头核酶的组合。设想当结合靶分子之后再适体中诱导的构象变化调节核酶的催化功能。
如在本文中所使用的术语“抗体”可以例如涉及多克隆或单克隆抗体。术语“抗体”也包括其中保留结合特异性的其衍生物或片段。用于生产抗体的技术是本领域中公知的，并且描述于例如Harlow and Lane“Antibodies,A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988和Harlowand Lane“Using Antibodies:A Laboratory Manual”Cold Spring HarborLaboratory Press,1999中。可以根据本发明的方法将抗体用于调节本文所描述的与发展T2D风险相关的任何代谢物的量。另外，抗体可以用于与发展T2D风险相关的基因的基因产物(即蛋白质)的免疫沉淀、亲和纯化和免疫定位，以及用于监测此类蛋白质的存在和量，例如，在真核细胞或生物体的培养物中。
根据本发明将要使用的抗体也包括这样的实施方式，如嵌合(人类恒定结构域、非人类可变结构域)、单链和人源化(除了非人类CDR外的人类抗体)抗体，以及抗体片段等，尤其是，Fab或Fab'片段。抗体片段或衍生物进一步包括Fd、F(ab')2、Fv或scFv片段；参见，例如，Harlow andLane(1988)和(1999),loc.cit。各种程序是本领域中已知的，并且可以用于生产此类抗体和/或片段。例如，可以通过肽模拟物产生(抗体)衍生物。此外，描述的用于生产单链抗体的技术(参见，尤其，美国专利US4,946,778)可适于产生对于任何靶表位特异的单链抗体。另外，转基因动物或植物(参见，例如，美国专利US 6,080,560)可以用于表达对于任何靶表位特异的(人源化)抗体。对于单克隆抗体的制备，可以使用提供通过连续细胞系培养产生的抗体的任何技术。此类技术的实例包括杂交瘤技术(and Milstein,Nature 256(1975),495-497)、三体瘤技术、人类B-细胞杂交瘤技术(Kozbor,Immunology Today 4(1983),72)和EBV-杂交瘤技术以产生人类单克隆抗体(Cole等人,Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985),77-96)。如在BIAcore系统中所采用的表面等离子体共振可以用于增加噬菌体抗体的效能，其结合到本发明多肽的表位(Schier,Human Antibodies Hybridomas 7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods 183(1995),7-13)。在本发明的上下文中，还设想术语“抗体”包括可在细胞中表达的抗体构建体，例如可以经由除其他外的病毒或质粒载体转染和/或转导的抗体构建体。
在本发明的方法中将要使用的抗体能够与靶表位特异性结合/相互作用。如根据本发明所用的术语“特异性结合/相互作用”是指，抗体不或基本上不与类似结构的表位交叉反应。可以测试处于研究下的一组抗体(apanel of antibodies)的交叉反应性，例如，通过在常规条件下评估所述一组抗体与所关注表位以及与若干(在结构上和/或功能上)或多或少密切相关的表位的结合。只有在它的相关环境中结合到所关注表位(例如，在蛋白质结构中的特定基序)但不或基本上不结合到任何其他表位的那些抗体才被认为是对于所关注表位特异的并且因此才是根据本发明的抗体。相应方法描述于例如Harlow and Lane,1988and 1999,loc cit。
如上文所描述的，代谢物的量可以受在本文识别的作为发展T2D的风险因素的给定代谢物的代谢途径中靶向(例如调节性)或酶活性蛋白质的显著影响。因此，通过使用例如靶向所述调节性或酶活性蛋白质的上文所描述的反义核酸分子、RNA分子或抗体，或编码它们的基因，将可以降低或增加所述给定代谢物的量。可以通过本领域中公知的方法设计所述化合物来靶特异性地与所述调节性或酶活性蛋白质的mRNA或蛋白质分子相互作用，并且因此间接降低本文识别为风险因素的一种或多种代谢物的代谢物的量。例如，可以设计适于RNA干扰的RNA分子，其引起mRNA分子的减少和因此编码所述调节性或酶活性蛋白质的一个或多个靶基因的表达水平的降低。然而，还可以通过使用任何上述化合物、通过降低和/或抑制例如参与所述一个或多个靶基因的表达调控的蛋白质或mRNA分子来降低或增加所述一个或多个靶基因的表达水平。当使用例如抗体时，也可直接靶向代谢物以降低上文所定义的第二组的代谢物的量。
根据本发明应当进一步理解，当使几个(不同的)上述化合物组合时可以(仅)实现给定代谢物的量的增加或降低。因此，在本发明的方法中使用设想所述测试化合物的组合并同时与从受试者获得的细胞或测试样品接触。
在进一步实施方式中，本发明涉及选择疗法以预防2型糖尿病的方法，包括以下步骤：(a)根据权利要求1、4至10中任一项识别发展2型糖尿病的倾向；和(b)基于在前述步骤中获得的结果选择疗法。
对本领域技术人员显然的是，从本发明推断的知识现在可以用于精确和可靠地表征受试者的代谢物谱，只要它在发展T2D倾向的识别中是相关的。有利地，可以预测T2D并且可相应地应用预防措施。此外根据上述情况，在其中已给出的疗法(如，二甲双胍方案，增加身体活动和/或减肥)被证明为无效的情况下，可以基于关于与发展T2D风险相关的代谢物的受试者的个人的代谢物谱的知识设计合适的个人疗法，并且可以例如通过本发明的和/或如上文所讨论开发的方法识别新的和/或改善的治疗剂。
如上所述，识别独立于增加葡萄糖水平的出现的发展T2D倾向(如，可以为葡萄糖耐量受损的情况)的可靠方法在本发明之前是不可利用的。因此，倾向的早期诊断潜在地需要与治疗患病受试者中葡萄糖耐量受损相关的症状不同的治疗。
最后，由于本发明可以选择合适的医学干预，如例如药物治疗和/或生活方式的改变(如例如，饮食改变)，整体上具有比医学方法更有利的效果，而无需考虑(without having regard to)与发展T2D风险相关的代谢物的个体代谢谱。可以通过本领域中公知的方法并包括例如体外方法或采集涉及患者或患者组中的疾病症状的数据确定治疗的效果，例如，药物的药理学效果。
在用于选择疗法的方法的优选实施方式中，所述方法包括i)在步骤(b)之前，应用和监测疗法的另外的步骤(a’)；和/或ii)在步骤(b)之后，监测在步骤(b)中所选择的疗法的另外的步骤(b’)。
选择疗法的方法可以包括应用和监测疗法的另外的步骤(a’)并且基于它的结果选择疗法。例如，可以监测、记录被诊断为处于发展T2D风险中且增加预防性疗法的受试者，并且如果必要(选择(b)还包括不改变疗法)，随后调整或改变他们的疗法，相应于选择步骤(b)，这取决于是否存在T2D的另外的风险因素和达到何种程度。记录的数据提供用于评估应用的疗法是否有利于患者的基础。基于本领域技术人员(在这种情况下有可能是临床医生)的所述评估将能够调整目前应用的疗法，例如，通过增加/降低治疗的剂量方案或剂量，和/或建议进一步改变患者的生活方式，或决定完全切换到另一种疗法，例如基于不同的治疗上活性的化合物。上述应用已作必要的修正，如果作为对步骤(a’)的替代，或除了步骤(a’)，进行监测步骤(b)中所选疗法的另外的步骤(b’)。
在进一步实施方式中，本发明涉及包含以下或由以下组成的试剂盒：稳定同位素标记的甘氨酸、稳定同位素标记的溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、稳定同位素标记的溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、稳定同位素标记的溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、稳定同位素标记的溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、稳定同位素标记的磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、稳定同位素标记的磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2、稳定同位素标记的磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3和/或稳定同位素标记的乙酰肉毒碱C2；
稳定同位素标记的同量异序代谢物，该同量异序代谢物具有与甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3和/或乙酰肉毒碱C2相同的分子量但具有不同的化学式；和/或
化合物，其不天然存在于人类样品中且化学上类似于甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3和/或乙酰肉毒碱C2。
优选地，试剂盒由以下组成或包含以下：稳定同位素标记的甘氨酸、稳定同位素标记的溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、稳定同位素标记的溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、稳定同位素标记的溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、稳定同位素标记的溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、稳定同位素标记的磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、稳定同位素标记的磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2、稳定同位素标记的磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3和/或稳定同位素标记的乙酰肉毒碱C2。
例如，试剂盒可以包含以下组合：
稳定同位素标记的甘氨酸和稳定同位素标记的溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2；
稳定同位素标记的同量异序代谢物，其具有与甘氨酸和溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2相同的分子量但具有不同的化学式；
化合物，其不天然存在于人类样品中且化学上类似于甘氨酸和溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2；
稳定同位素标记的甘氨酸、稳定同位素标记的溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2和稳定同位素标记的乙酰肉毒碱C2；
稳定同位素标记的同量异序代谢物，其具有与甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2和乙酰肉毒碱C2相同的分子量但具有不同的化学式；
化合物，其不天然存在于人类样品中且化学上类似于甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2和乙酰肉毒碱C2；
稳定同位素标记的甘氨酸、稳定同位素标记的溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、稳定同位素标记的乙酰肉毒碱C2和稳定同位素标记的磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2；
稳定同位素标记的同量异序代谢物，其具有与甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、乙酰肉毒碱C2和磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2相同的分子量但具有不同的化学式；
化合物，其不天然存在于人类样品中且化学上类似于甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、乙酰肉毒碱C2和磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2；
稳定同位素标记的甘氨酸、稳定同位素标记的溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、稳定同位素标记的乙酰肉毒碱C2、稳定同位素标记的磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2和稳定同位素标记的溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0；
稳定同位素标记的同量异序代谢物，其具有与甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、乙酰肉毒碱C2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2和溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0相同的分子量但具有不同的化学式；
化合物，其不天然存在于人类样品中且化学上类似于甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、乙酰肉毒碱C2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2和溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0；
不天然存在于给定人类样品中的化学上类似的化合物包括这样的化合物，其具有例如类似的化学式、类似的极性或疏水性、完全相同的电离要求、类似(但不完全相同)的前体离子的质量、和与在本发明的方法中使用的上文提及的给定代谢物一样的独特的质量破碎谱。不天然存在于所述给定人类样品中的化学上类似化合物的非限制性实例包括例如氨基甲酰氧基磷脂酰胆碱、丁二炔修饰的磷脂、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、或具有非天然链长的脂质，所有这些是本领域中公知的，并且已描述于例如Curatolo W,Bali A,Gupta CM(1985)Phase behavior ofcarbamyloxyphosphatidylcholine,a sphingolipid analogue.J Pharm Sci 74:1255-1258、Dagan A,Wang C,Fibach E,Gatt S(2003)Synthetic,non-naturalsphingolipid analogs inhibit the biosynthesis of cellular sphingolipids,elevateceramide and induce apoptotic cell death.Biochim Biophys Acta 1633:161-169、Navab M,Hama S,Hough G,Fogelman AM(2003)Oral syntheticphospholipid(DMPC)raises high-density lipoprotein cholesterol levels,improves high-density lipoprotein function,and markedly reducesatherosclerosis in apolipoprotein E-null mice.Circulation 108:1735-1739、QinJD,Weiss L,Slavin S,Gatt S,Dagan A(2010)Synthetic,non-natural analogsof ceramide elevate cellular ceramide,inducing apoptotic death to prostatecancer cells and eradicating tumors in mice.Cancer Invest 28:535-543、Zumbuehl A(2009)Nonnatural Phospholipids:Probing Nature's ModularPlatform.Chimia 63:63-65。
已在上文中描述稳定同位素标记的代谢物标准物。本发明的试剂盒包括三种此类稳定同位素标记的代谢物标准物，适用于定量样品中SMOHC16:1、PCaa C36:2和PCae C34:2的代谢物浓度，如例如从怀疑有子宫内膜异位症的妇女获得的样品。
稳定同位素标记的脂质的制备、一般用途和数据解读是本领域中公知的，并且可以通过它们在质量和独特同位素分布上的增加确定稳定同位素(Postle AD(2012)Lipidomics.Current opinion in clinical nutrition andmetabolic care 15:127-133；Postle AD,Hunt AN(2009)Dynamic lipidomicswith stable isotope labelling.Journal of chromatography B,Analyticaltechnologies in the biomedical and life sciences 877:2716-2721)。
试剂盒的组分可以被包装在一个或多个容器如一个或多个小瓶中。除了代谢物标准物，试剂盒优选进一步包括用于存储的防腐剂或缓冲剂。此外，试剂盒可以包含使用说明书。
在本发明的试剂盒的优选实施方式中，同位素选自由12C、13C、14N、15N和2H组成的组。
本发明进一步涉及本发明的试剂盒在根据本发明识别受试者中发展2型糖尿病的倾向的方法中的应用。
关于在本说明书中、特别是在权利要求书中表征的实施方式，意在在从属权利要求中所述的每个实施方式与所述从属权利要求从属于其的每个权利要求(独立或从属)的每个实施方式组合。例如，在记载3个替代A、B和C的独立权利要求1、记载3个替代品D、E和F的从属权利要求2、和从属于权利要求1和2且记载3个替代品G、H和I的权利要求3的情况下，应当理解，除非具体地另外提及，否则说明书明确地公开对应于以下组合的实施方式：A、D、G；A、D、H；A、D、I；A、E、G；A、E、H；A、E、I；A、F、G；A、F、H；A、F、I；B、D、G；B、D、H；B、D、I；B、E、G；B、E、H；B、E、I；B、F、G；B、F、H；B、F、I；C、D、G；C、D、H；C、D、I；C、E、G；C、E、H；C、E、I；C、F、G；C、F、H；C、F、I。
类似地，也在其中独立和/或从属权利要求未记载替代的这些情况下，应当理解的是，如果从属权利要求引用多个前述权利要求，所涵盖的主题的任何组合因此被认为是明确公开的。例如，在独立权利要求1、引用权利要求1的从属权利要求2和引用权利要求2和1的从属权利要求3的情况下，由此得出结论(it follows that)，权利要求3和1的主题的组合清楚且明确地公开为权利要求3、2和1的主题的组合。如果存在进一步的从属权利要求4，其引用权利要求1至3中任一项，由此得出结论，清楚且明确地公开权利要求4和1、权利要求4、2和1、权利要求4、3和1、以及权利要求4、3、2和1的主题的组合。
上述考虑已作必要的修正应用于所有随附权利要求。
附图示出：
图1：群体描述。
在KORA组群中代谢组学筛选，在基线S4(A)处，在S4和F4(B)以及预期(C和D)之间重叠。示出了参与者人数。正常葡萄糖耐量(NGT)、单独空腹葡萄糖受损(i-IFG)、葡萄糖耐量受损(IGT)、2型糖尿病(T2D)和初诊T2D(dT2D)。非T2D个体包括NGT、i-IFG和IGT参与者。
图2：来自横截面分析的代谢物浓度的差异。
图A和图B示出在多变量逻辑回归分析(在对于以P<3.6×10-4的多重检验的Bonferroni校正之后)中在模型1和模型2的五个成对比较中具有显著不同浓度的代谢物的名称。图C示出对于NGT、IGT和dT2D组的三个代谢物(甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2(LPC(18:2))和乙酰肉毒碱C2)具有标准误差浓度的平均残差(average residue)。图A示出具有对模型1调整的结果(年龄、性别、BMI、身体活动、饮酒、吸烟、收缩BP和HDL胆固醇)，而图B和C具有对于HbA1c、空腹葡萄糖和空腹胰岛素(模型2)的另外调整。从线性回归模型计算残差(公式：T2D状态～代谢物浓度+模型2)。
图3：前瞻性分析：使用两个调整模型预测IGT和T2D。
图A-图D示出使用仅已知的T2D风险因素(模型1或模型2)以及与三种代谢物(甘氨酸、LPC(18:2)和C2)组合预测IGT或T2D的AUC值和来自比较两个值的似然比检验的P值。
模型1包括年龄、性别、BMI、身体活动、饮酒、吸烟、收缩BP和HDL。模型2包括来自模型1的风险因素加HbA1c、空腹葡萄糖和空腹胰岛素。
图4：前瞻性分析：使用与9种代谢物组合的两个调整模型预测IGT和T2D。
图A-图D示出使用仅已知T2D风险因素(模型1或模型2)以及与九种代谢物(甘氨酸、LPC(18:2)、C2、LPC(17:0)、LPC(18:0)、LPC(18:1)、PC ae C34:2、PC ae C36:2和PC ae C36:3)组合预测IGT或T2D的AUC值和来自比较两个值的似然比检验的P值。
模型1包括年龄、性别、BMI、身体活动、饮酒、吸烟、收缩BP和HDL。模型2包括来自模型1的风险因素加HbA1c、空腹葡萄糖和空腹胰岛素。
实施例举例说明本发明：
实施例1：方法
样品来源和分类
奥格斯堡地区的合作健康研究(Cooperative Health Research in theRegion of Augsburg)(KORA)调查是在奥格斯堡的城市及周边村镇中进行的基于群体的研究(Holle等人,2005；Wichmann等人,2005)。KORA是流行病学、卫生经济学和卫生保健研究领域中的研究平台。以从1984年至2001年招募的18079名参与者进行四次调查。调查4(S4)由从1999年至2001年检查的4261名个体(年龄25-74岁)组成。从2006年至2008年，3080名参与者(具有32-81的年龄范围)参加了后续(F4)调查。已在别处描述来自KORA S4/F4的人体测量和个人访谈以及个人实验室测量的确认(Jourdan等人,PloS one 7:e40009(2012)；Meisinger等人,DiabetMed 27:360-362(2010)；Rathmann等人,Diabet Med 26:1212-1219(2009))。
采样
在KORA组群中，在空腹至少8h后，在上午8:00至10:30am之间将血液抽取到S-血清管(SARSTEDT AG&Co.,Numbrecht,Germany)中。轻轻倒置试管两次，随后在室温下静置30min，以获得完全凝固。对于血清采集，在10℃下以2750g离心血液10min。将血清填充到合成吸管中，其储存在液氮中直至进行代谢分析。
代谢物测量和排除代谢物
对于KORA S4调查，定向代谢组学方法基于用Absolute/DQTM p180试剂盒(BIOCRATES Life Sciences AG,Innsbruck,Austria)的测量。该方法允许使用液相色谱和流注射分析质谱同时定量188种代谢物。已先前详细地描述试验程序(lllig等人,Nat Genet 42:137-141(2010)；Romisch-MarglW等人,Metabolomics 2012,8(1):133-142)。对于每个试剂盒板，除了KORA样品外，测量五个参考物(人类血浆合并(pooled)材料，Seralab)和三个零样品(PBS)。为了确保数据质量，每种代谢物必须满足两个标准：(1)对于总共110种参考样品中的代谢物的方差(CV)的系数都必须小于25％。总体而言，去除七个离群值，因为它们的浓度均大于平均值加5×SD；(2)对于代谢物的50％所有测量样品浓度应高于检测限(LOD)，其被定义为3×三个零样品的中值。总体而言，140种代谢物通过了质量控制：1种己糖(H1)、21种酰基肉毒碱、21种氨基酸、8种生物胺、13种鞘磷脂(SM)、33种二酰基(aa)磷脂酰胆碱(PC)、35种酰基-烷基(ae)PC和8种溶血PC(lysoPC)。以μM报告所有分析的代谢物的浓度。已详细地描述3080 KORA F4样品的测量和涉及的清洗程序(Mittelstrass等人,2011；Yu等人,2012)。
统计分析
在R统计环境(http://www.r-project.org/)下进行计算。
多变量逻辑回归和线性回归
在多变量逻辑回归分析中，在两组之间计算对于单一代谢物的OR。调整(依比例增减，scale)每种代谢物的浓度以具有为零的平均值和为一的SD；因此，所有报告的OR值对应于代谢物浓度的每SD的变化。将各种T2D风险因素添加到逻辑回归分析作为协变量。为了从多重比较处理假发现率，根据Bonferroni校正、以3.6×10-4的水平(针对总共使用的140种代谢物以5％水平)计算对于显著性的截点。因为代谢物在良好限定的生物组(例如8种溶血PC、33种二酰基PC、35种酰基-烷基PC和13种SM)内相关联，该校正是保守的。
此外，分析分类的代谢物浓度和组合评分(参见下文)，并且跨越四分位数(quartile)计算OR。为了测试跨越四分位数的趋势，我们指定所有个体浓度或组合评分的中值，并使用相同的回归模型获得P值。
对于线性回归分析，从每种代谢物的浓度和2-h葡萄糖值计算β估计。将每种代谢物的浓度对数转换且标准化以具有为零的平均值和为一的SD。在逻辑回归中添加各种风险因素作为协变量，并且采用相同的显著水平(3.6×10-4)。
代谢物的组合
为了获得代谢物的组合评分，首先用包含所有混杂变量的多变量逻辑回归来模拟(model)调整(依比例增减，scale)的代谢物浓度(平均值＝0、SD＝1)。来自模型的这些代谢物的系数随后用于计算对于每个个体的加权和。根据甘氨酸和LPC(18:2)的下降趋势，我们将这些值转化为组合评分。
代谢物浓度的残差
当绘制代谢物的浓度时，为了避免其他致混淆因素的影响，使用来自线性回归模型的残差。对数转换且调整(依比例增减，scale)代谢物浓度(平均值＝0、SD＝1)，并且随后从线性回归推导残差，其包括相应的致混淆因素。
随机森林、逐步选择方法和候选生物标志物选择
为了选择候选生物标志物，应用两种另外的方法：随机森林选择(Briman,2001,Random Forests,Vol.Machine Learning::Kluwer AcademicPublishers.)和逐步选择，其评估作为组的代谢物。
在两组之间，首先使用随机森林的监督分类方法以在重要性评分的30种最高排名变量中选择代谢物，允许从不同组最佳分离个体。T2D风险指标也包括在具有所有代谢物的该方法中。
在逻辑回归模型上使用逐步选择进一步选择代谢物。在该模型中连同所有风险指标一起使用在逻辑回归中具有比较组之间显著不同浓度的代谢物(并且也使用随机森林选择其)。赤池信息量准则(Akaike's InformationCriterion，AIC)用于评价在这些模型中所用的代谢物的这些子集的特性。选择具有最小AIC的模型。将接收者操作特征曲线(receiver-operating-characteristic curves)下面积(AUC)用于评价模型。
实施例2：识别风险代谢物
研究参与者
通过内科医生验证的自我报告确定(Rathmann等人,2010)并且从我们的分析排除具有已知T2D的个体，以避免来自具有非空腹参与者的抗糖尿病药物和具有缺失值的个体的潜在影响(图1A)。基于空腹和2-h葡萄糖值(即口服75g葡萄糖2h后负荷)，根据WHO诊断标准定义个体以具有正常葡萄糖耐量(NGT)、单独的IFG(i-IFG)、IGT或初诊T2D(dT2D)(Meisinger等人,2010；Rathmann等人,2009；WHO,1999)(参见上文)。样品组包括91名初诊T2D患者和1206名具有非T2D的个体，其包括866名具有NGT的参与者、102名具有i-IFG的参与者和238名具有IGT的参与者，在横截面KORA S4调查中(图1A；研究特性示于表1)。1010名参与基线和后续调查的空腹状态下的个体中(图1B)，其中876人在基线时为非糖尿病。这些之外，约10％发展T2D(即91个事件T2D)(图1C)。从在基线时的具有NGT的641名个体，七年后18％发展IGT(即118个事件IGT)(图1D)。前瞻性KORA S4→F4的研究特性示于表2。
表1 KORA S4横截面研究样品的特征
*：对于女性≥20g/天；对于男性≥40g/天。
缩写：NGT，正常葡萄糖耐量；i-IFG，单独空腹葡萄糖受损；IGT，葡萄糖耐量受损；dT2D，初诊2型糖尿病；BP，血压；HDL，高密度脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白。对于每个变量和每个组(NGT、NFG、IGT和dT2D)给出个体的百分比或平均值±SD。
表2 KORA S4→F4前瞻性研究样品的特征
*：对于女性≥20g/天；对于男性≥40g/天。
缩写：BP，血压；HDL，高密度脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白。对于每个变量和每个组给出个体的百分比或平均值±SD。
分析策略
对于具有KORA S4中的横截面研究的140种代谢物，并且对于KORAF4中的131种代谢物，首先筛选四组(dT2D、IGT、i-IFG和NGT)中的显著不同的代谢物浓度。识别三种IGT特异性代谢物，并且在前瞻性KORA S4→F4组群中进一步研究，以检查基线代谢物浓度是否可以预测事件IGT和T2D，以及七年后它们是否与葡萄糖耐量相关。我们的结果基于前瞻性的基于群体的组群，其不同于以前的巢式病例对照研究(Wang等人,Nat Med 17:448-453(2011))。另外，使用我们的数据进行具有相同研究设计的分析。所得结果提供线索以解释两组生物标志物之间的差异。
识别不同于已知T2D风险指标的新的糖尿病前期代谢物
为了确定在具有NGT、i-IFG、IGT和dT2D的个体之间具有改变浓度的代谢物，在横截面KORA S4调查中首先检查五个成对比较(i-IFG、IGT和dT2D对NGT，以及dT2D对i-IFG或IGT)。基于多变量逻辑回归分析，在五个比较的至少一个中在两组之间有26种代谢物浓度显著不同(P值<3.6×10-4)(图2A；优势比(odds ratio，OR)和P值示于表3)。这些关联独立于年龄、性别、身体质量指数(BMI)、身体活动、饮酒、吸烟、收缩血压(BP)和HDL胆固醇(模型1)。正如预期，总己糖H1的水平，其主要由葡萄糖表示(H1和空腹葡萄糖之间的皮尔森(Pearson)相关系数值r达到0.85)，在所有五个比较中显著不同。显著变化代谢物组从NGT对i-IFG或对IGT不同。相比于NGT，在具有dT2D和IGT的个体之间发现大多数显著改变的代谢物浓度。
为了研究HbA1c、空腹葡萄糖和空腹胰岛素水平是否介导所示出的关联，将这些作为协变量添加到回归分析(模型2)，除了模型1外(图2B)。我们观察到，在这些条件下，当将具有dT2D的个体与具有NGT的那些个体比较时，没有代谢物显著不同，这表明这些代谢物与HbA1c、空腹葡萄糖和空腹胰岛素水平相关。只有九种代谢物浓度在IGT和NGT个体之间显著不同(表3)。因此，这些代谢物表示新的生物标志物候选，并且独立于已知的T2D风险指标。逻辑回归分析基于每个单一代谢物，并且预期这些代谢物中的一些相互关联。为了进一步评估作为组的代谢物，采用两个另外的统计方法(非参数随机森林和参数逐步选择)以识别独特且独立的生物标志物候选。九种代谢物之外，在随机森林后选择五种分子(即甘氨酸、LPC(18:2)、LPC(17:0)、LPC(18:1)和C2)，并且随后在逐步选择后去除LPC(17:0)和LPC(18:1)。因此，发现三种分子含有独立信息；甘氨酸(调整OR＝0.67(0.54-0.81)，P＝8.6×10-5)、LPC(18:2)(OR＝0.58(0.46-0.72)，P＝2.1×10-6)和乙酰肉毒碱C2(OR＝1.38(1.16-1.64)，P＝2.4×10-4)(图2C)。在后续KORA F4研究中观察到类似的结果。例如，当380名IGT个体与2134名NGT参与者相比时，也发现这三种代谢物是高度显著不同的(甘氨酸，OR＝0.64(0.55-0.75)，P＝9.3×10-8；LPC(18:2)，OR＝0.47(0.38-0.57)，P＝2.1×10-13；和C2，OR＝1.33(1.17-1.49)，P＝4.9×10-6。
表3 在KORA S4中用两个调整模型的五个成对比较中的优势比(OR)和P值
*将空腹葡萄糖值作为协变量添加到模型2，引起i-IFG和NGT之间的完美分离。
用多变量逻辑回归分析计算OR，其具有对于模型1中年龄、性别、BMI、身体活动、饮酒、吸烟、收缩BP和HDL胆固醇的调整；模型2包括模型1中的那些变量加HbA1c、空腹葡萄糖和空腹胰岛素。Cl表示置信区间。
预测IGT和T2D的风险
为了研究三种识别的代谢物对于IGT和T2D的预测值，使用前瞻性KORA S4→F4组群检查基线代谢物浓度和事件IGT和T2D之间的关联(表2)。以118名事件IGT个体与471名NGT对照个体比较基线代谢物浓度。发现甘氨酸和LPC(18:2)，但不是C2，在调整模型1和模型2中以5％水平显著不同(表4)。对于甘氨酸和LPC(18:2)，但不对于C2，在91名事件T2D个体和785名保持非糖尿病(非T2D)的参与者之间以基线浓度另外观察到显著差异。三种代谢物的组合的每个标准偏差(SD)增量与33％降低的未来患糖尿病的风险相关(OR＝0.39(0.21-0.71)，P＝0.0002)。在组合的代谢物浓度的第四四分位数中的个体，与血清水平在第一四分位数(即甘氨酸、LPC(18:2)和C2的组合)中的那些个体相比，具有三倍较低的发展糖尿病的机会(OR＝0.33(0.21-0.52)，P＝1.8E-05)，这表示来自与C2较低浓度组合的甘氨酸和LPC(18:2)的较高浓度的保护作用。用完全调整的模型2，获得对于LPC(18:2)但不对于甘氨酸的一致结果。当三种代谢物添加到完全调整的模型2时，对于IGT和T2D，接收者操作特性曲线下面积(AUC)分别增加2.6％(P＝0.015)和1％(P＝0.058)(图3)。因此，这提供了与T2D风险指标相比的IGT和T2D的改善预测。
表4 在KORA组群中预测IGT和T2D
*β估算表示对应于在标准化的基线代谢物浓度方面的1SD差异的在葡萄糖耐量方面的未来差异。
多变量逻辑回归结果的优势比(OR，95％置信区间)和P值分别示出于：对于IGT示出于(A)和(B)，以及对于T2D示出于(C)和(D)，而来自基线KORA S4中代谢物浓度和后续KORA F4中2-h葡萄糖值之间的线性回归分析的β估算和P值示出于(E)。对于年龄、性别、BMI、身体活动、饮酒、吸烟、收缩BP和HDL胆固醇调整所有模型。
与未来葡萄糖耐量相关的基线代谢物浓度
在口服葡萄糖耐量测试后，下一步研究的是基线代谢物浓度和后续2-h葡萄糖值之间的关联。对于三种代谢物观察到一致结果：发现甘氨酸和LPC(18:2)，但不是乙酰肉毒碱C2水平显著相关，这表明甘氨酸和LPC(18:2)预测葡萄糖耐量。此外，即使在横截面KORA S4群中的全调整模型2中，三种代谢物(甘氨酸、LPC(18:2)和C2)表现高显著性。正如预期，对于模型1中的己糖H1观察到非常显著的关联(P＝1.5×10-22)，同时对于完全调整的模型2中的它观察到无显著性(P＝0.12)。
基于前瞻性群体的设计与巢式病例对照设计
为了在我们的研究中研究5个支链和芳香族氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)(Wang等人,Nat Med 17:448-453(2011))的预测值，我们将基线代谢物浓度与后续2-h葡萄糖值关联。我们发现这些中没有一个是显著相关的，这表明这五种氨基酸不能预测IGT的风险。此外，这五种氨基酸中没有示出与横截面KORA S4研究中的2-h葡萄糖值相关。
为了复制所识别的五个支链和芳香族氨基酸(Wang等人，2011)，使用相同的前述方法将基线样品匹配到91事件T2D(Wang等人,Nat Med 17:448-453(2011))。我们重复出5个支链和芳香族氨基酸中的4个(four outof the five)。正如预期，三种所识别的IGT-特异性代谢物在匹配的病例对照样品之间没有显著不同，因为所选对照是用附有高风险特性(如肥胖和升高的空腹葡萄糖)的个体富集的，如由Wang等人所述(Wang等人,NatMed 17:448-453(2011))。事实上，91个匹配的对照包括约50％糖尿病前期个体，其比一般群体显著更高(约15％)。
Claims (14)
1.一种识别受试者中发展2型糖尿病的倾向或用于产生用来识别发展2型糖尿病的倾向的代谢物的量的诊断信息值的方法，所述方法包括评估从所述受试者获得的样品中的一种或多种代谢物的量的步骤，所述代谢物选自：
(a)第一组，包括代谢物甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3和同量异序代谢物，所述同量异序代谢物具有与甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2或磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3相同的分子量但具有不同的化学式；和/或
(b)第二组，包括代谢物乙酰肉毒碱C2和同量异序代谢物，所述同量异序代谢物具有与乙酰肉毒碱C2相同的分子量但具有不同的化学式；和
可选地，制备包括所确定的代谢物的量的值的硬拷贝或软拷贝；并且
其中，与对照的一种或多种相应代谢物的量相比，选自所述第一组的代谢物的量的降低或选自所述第二组的代谢物的量的增加表明发展2型糖尿病的倾向。
2.一种识别化合物的方法，所述化合物能够预防2型糖尿病和与其相关疾病的化合物或作为用于开发能够预防2型糖尿病和与其相关疾病的化合物的先导化合物，所述方法包括以下步骤：
(a)评估与测试化合物接触的细胞中或从受试者获得且与所述测试化合物接触的样品中的选自以下的一种或多种代谢物的量：
i.第一组，包括代谢物甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3和同量异序代谢物，所述同量异序代谢物具有与甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2或磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3相同的分子量但具有不同的化学式；和/或
ii.第二组，包括代谢物乙酰肉毒碱C2和同量异序代谢物，所述同量异序代谢物具有与乙酰肉毒碱C2相同的分子
量但具有不同的化学式；
和
(b)评估从受试者获得的细胞或样品中的所述一种或多种代谢物的量，其中所述细胞或样品：
i.不与所述测试化合物接触；
ii.与已知不影响步骤(a)的所述一种或多种代谢物的量的化合物接触，
其中，与步骤(b)i.或(b)ii.相比，步骤(a)中选自所述第一组的代谢物的量的增加或选自所述第二组的代谢物的量的降低表明所述测试化合物能够预防2型糖尿病和与其相关疾病或用作用于开发能够预防2型糖尿病和与其相关疾病的化合物的先导化合物；或
iii.与已知增加选自步骤(a)的所述第一组的所述至少一种代谢物的量和/或降低选自步骤(a)的所述第二组的所述至少一种代谢物的量的化合物接触，
其中，与步骤(b)iii.相比，步骤(a)的选自所述第一组的所述至少一种代谢物的基本相等量或增加量和/或选自所述第二组的所述至少一种代谢物的降低量表明所述化合物能够预防2型糖尿病和与其相关疾病或者用作用于开发能够预防2型糖尿病和与其相关疾病的化合物的先导化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，进一步包括合成所述化合物，所述化合物能够能够预防2型糖尿病和与其相关疾病或用作用于开发能够预防2型糖尿病和与其相关疾病的化合物的先导化合物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在受试者表现出血糖水平的增加之前，选自所述第一组的所述一种或多种代谢物的量降低和/或选自所述第二组的所述一种或多种代谢物的量增加在所述受试者中是可检测的或检测到的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中至少每两年进行所述方法。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述一种或多种代谢物选自所述第一组代谢物的溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、甘氨酸和同量异序代谢物，所述同量异序代谢物具有与溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2或甘氨酸相同的分子量但具有不同的化学式，和所述第二组代谢物的乙酰肉毒碱C2和同量异序代谢物，所述同量异序代谢物具有与乙酰肉毒碱C2相同的分子量但具有不同的化学式。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述一种或多种代谢物选自所述第一组代谢物的溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、甘氨酸和同量异序代谢物，所述同量异序代谢物具有与溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2或甘氨酸相同的分子量但具有不同的化学式，和所述第二组代谢物的乙酰肉毒碱C2和同量异序代谢物，所述同量异序代谢物具有与乙酰肉毒碱C2相同的分子量但具有不同的化学式。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中评估代谢物甘氨酸和溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2或同量异序代谢物的量，所述同量异序代谢物具有与甘氨酸和溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2相同的分子量但具有不同的化学式；
其中评估选自包括甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2和乙酰肉毒碱C2或同量异序代谢物的组的三种代谢物的量，所述同量异序代谢物具有与甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2和乙酰肉毒碱C2相同的分子量但具有不同的化学式；
其中评估选自包括甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、乙酰肉毒碱C2和磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2或同量异序代谢物的组的四种代谢物的量，所述同量异序代谢物具有与甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、乙酰肉毒碱C2和磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2相同的分子量但具有不同的化学式；或
其中评估选自包括甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、乙酰肉毒碱C2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2和溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0或同量异序代谢物的组的五种代谢物的量，所述同量异序代谢物具有与甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、乙酰肉毒碱C2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2和溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0相同的分子量但具有不同的化学式。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述样品选自血液、血清或血浆。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述一种或多种代谢物的量的所述评估通过靶向或非靶向的NMR、FIA-MS、GC-MS或LC-MS完成。
11.根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中所述测试化合物选自小分子、反义核酸分子、siRNA、shRNA、miRNA、核酶、肽适体、基于核酸的适体、抗体或它们的组合。
12.一种选择疗法以预防2型糖尿病的方法，包括以下步骤：
(a)根据权利要求1、4至11中任一项识别发展2型糖尿病的倾向；和
(b)基于前述步骤中获得的结果选择疗法。
13.根据权利要求12所述的方法，包括：
i)在步骤(b)之前应用和监测疗法的另外的步骤(a’)；和/或
ii)在步骤(b)之后监测在步骤(b)中所选择的所述疗法的另外的步骤(b’)。
14.一种试剂盒，包含以下或由以下组成：
稳定同位素标记的甘氨酸、稳定同位素标记的溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、稳定同位素标记的溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、稳定同位素标记的溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、稳定同位素标记的溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、稳定同位素标记的磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、稳定同位素标记的磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2、稳定同位素标记的磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3和/或稳定同位素标记的乙酰肉毒碱C2；
稳定同位素标记的同量异序代谢物，所述同量异序代谢物具有与甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3和/或乙酰肉毒碱C2相同的分子量但具有不同的化学式；和/或
化合物，所述化合物不天然存在于人类样品中且化学上类似于甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:2、溶血磷脂酰胆碱酰基C17:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C18:1、磷脂酰胆碱酰基-烷基C34:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:2、磷脂酰胆碱酰基-烷基C36:3和/或乙酰肉毒碱C2。
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