CN113966724A - 一种微生态制剂对dss诱导结肠炎小鼠作用的研究方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种微生态制剂对DSS诱导结肠炎小鼠作用的研究方法，将6周龄健康雄性C57BL/6J小鼠随机分成空白对照组、UC模型组和合生元干预组，在葡聚糖硫酸钠造模前两周至造模结束采样前，对小鼠进行灌胃处理，其中对照组及模型组小鼠每天灌胃给予灭菌水，合生元干预组分别每天灌胃给予合生元(罗伊氏乳杆菌、乳双歧杆菌、短双歧杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌6种益生菌+低聚麦芽糖GOS+低聚果糖FOS+蓝莓提取物)。通过让小鼠自由饮用DSS溶液，发现该微生态制剂对DSS诱导的急性UC小鼠的治疗作用具有如下效果：合生元制剂可改善急性UC小鼠的肠道菌群紊乱，并有效缓解急性UC小鼠的结肠炎症及肠粘膜屏障损伤状况。

Description

一种微生态制剂对DSS诱导结肠炎小鼠作用的研究方法
技术领域
本发明涉及微生态制剂技术领域，具体为一种微生态制剂对DSS 诱导急性结肠炎小鼠治疗作用的方法。
背景技术
微生态制剂是利用正常微生物或促进微生物生长的物质制成的活的微生物制剂，一切能促进正常微生物群生长繁殖的及抑制致病菌生长繁殖的制剂都称为微生态制剂，由于其调节肠道之功效，快速构建肠道微生态平衡，无论在婴儿，老人，还是新生畜禽可以防止和治疗腹泻，便秘。
目前，对于溃疡性结肠炎的治疗主要在于诱导并维持临床缓解以及粘膜愈合，防治并发症，改善患者生命质量，加强对患者的长期管理，但大部分患者容易反复发作，无法达到根治效果，现有的药物治疗如氨基水杨酸类可以降低炎症信号因子的表达，但只在轻中度患者中有效，皮质醇类药物作用于免疫细胞和上层细胞，在重度患者中有效，但这类药物有副作用，容易形成药物依赖，生物药物如英夫利昔单抗，可以抑制炎症信号因子的表达，但疗效会随时间减弱，且该类药物对1/3患者没有效果，免疫抑制剂类药物如硫唑嘌呤递送剂，通过限制T细胞数量来缓解炎症，但同时会降低患者的抵抗力，因此，开发具有替代作用的新型疗法成为UC治疗的重要需求。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种微生态制剂对DSS诱导急性结肠炎小鼠具有治疗作用的方法，具备改善急性UC小鼠的肠道菌群紊乱等优点，解决了药物治疗如氨基水杨酸类可以降低炎症信号因子的表达，但只在轻中度患者中有效；皮质醇类药物作用于免疫细胞和上层细胞，在重度患者中有效，但这类药物有副作用，容易形成药物依赖；生物药物如英夫利昔单抗的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种微生态制剂对 DSS诱导急性结肠炎小鼠治疗作用的方法：
探讨合生元对急性溃疡性结肠炎小鼠的干预作用和可能机制，以期为微生态制剂应用于UC防治提供实验依据；
(1)6周龄健康雄性C57BL/6J小鼠随机分成空白对照组、UC 模型组、合生元干预组，在DSS造模前两周至造模结束采样前，对照组及模型组小鼠每天灌胃给予灭菌水，合生元干预组每天灌胃给予合生元；
(2)空白对照组小鼠每天自由饮用灭菌水，其它组小鼠通过饮用DSS溶液建立UC模型，小鼠每天自由饮用3％DSS溶液，持续7 天，第8天处死采样；
(3)造模期间，观察各组小鼠一般情况并记录体重，造模结束后，通过小鼠活体肠镜直视观察结直肠粘膜炎症情况，处死小鼠后，采集小鼠脾脏及结肠，测量脾脏指数，结肠长度，取远端1cm结肠进行组织切片及HE染色，对各组小鼠结肠组织进行病理学损伤评分，通过蛋白免疫印迹及免疫组化检测各组小鼠结肠上皮紧密连接蛋白、粘蛋白以及促炎因子的表达情况；
(4)取各组小鼠的结肠粘膜组织进行16S rDNA测序，比较分析各组小鼠肠道菌群组成情况；
(5)与空白对照组小鼠相比，急性UC模型组小鼠肠壁可见明显病灶溃疡，小鼠体重显著减轻、脾脏指数显著增加和结肠长度显著缩短，模型小鼠结肠组织病理损伤严重，结肠上皮紧密连接蛋白及粘蛋白表达显著下调，而TNF-α表达显著上调；
(6)与急性UC模型组小鼠相比，合生元干预组小鼠肠壁溃疡情况显著改善，小鼠体重显著增加、脾脏指数显著减少和结肠长度显著增加，结肠组织病理损伤评分均显著降低，结肠上皮紧密连接蛋白及粘蛋白表达显著上调，TNF-α表达显著下调；
(7)急性UC模型中各组小鼠的肠道菌群组成存在明显分离，模型组小鼠肠道菌群在门水平上，Deferribacteres显著增加，科水平上，Atopobiaceae、Burkholderiaceae、Deferribacteraceae和 Erysipelotrichaceae显著增加，属水平上，Allobaculum和Mucispirillum 显著增加，种水平上Mucispirillum SchaedleriASF457显著增加，而合生元干预组小鼠上述菌群变化情况均被显著逆转。
进一步，所述微生态制剂(合生元)主要包括益生菌、益生元，越来越多的科学研究表明微生态制剂在肿瘤免疫、肥胖、糖尿病、炎症性疾病、情绪方面有调控和治疗作用。
进一步，所述益生菌是活的微生物，当给予足够数量的益生菌时，会给宿主健康带来好处，主要包括乳杆菌属、双歧杆菌属、丙酸菌属和链球菌属等的某些菌株。
进一步，所述益生菌通过促进粘膜层的形成，分泌抗菌因子，促进分泌性免疫球蛋白的分泌，增加紧密连接形成，从而调节肠道功能。
进一步，所述益生元是一种不可消化的食物成分，在通过上消化道时不能被代谢或吸收，在结肠中被细菌发酵，选择性增强消化系统中有益细菌的生长或活性，主要包括菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖等。
进一步，所述益生元对机体的有益作用与其代谢产物短链脂肪酸密切相关，SCFAs主要包括乙酸、丙酸和丁酸，它们是肠道上皮细胞的能量来源，同时也是抗炎因子，尤其是丁酸，可以发挥改善和保护肠道屏障的作用。
进一步，所述合生元由益生菌和益生元组成，既可发挥益生菌的生理活性，又能选择性的增加益生菌的数量，使其作用更加显著和持久，常见乳酸菌加乳糖醇、双歧杆菌加低聚果糖或低聚半乳糖组合。
进一步，所述微生态制剂有助于缓解急性UC炎症并重建正常的肠道功能。
进一步，所述微生态制剂对UC的研究主要集中在混合益生菌与益生元组成的合生元。
进一步，所述低聚果糖FOS能在肠道进行厌氧发酵，主要被双歧杆菌和乳杆菌利用，它们产生的乳酸可促进肠道干细胞增殖以及肠上皮细胞分化，参与ISC介导的肠上皮发育和再生。
与现有技术相比，本申请的技术方案具备以下有益效果：
1、该微生态制剂对DSS诱导结肠炎小鼠作用的研究方法，通过让小鼠自由饮用DSS溶液，成功构建急性UC动物模型。
2、该微生态制剂对DSS诱导结肠炎小鼠作用的研究方法，合生元干预可有效缓解急性UC小鼠的结肠炎症及肠粘膜屏障损伤情况，并可改善急性UC小鼠的肠道菌群紊乱。
附图说明
图1为急性UC小鼠肠镜直视图；
图2为急性UC疾病一般表现图；
图3为急性UC小鼠结肠组织HE染色图；
图4为WB检测急性UC肠道连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1 的表达情况图；
图5为IHC检测急性UC小鼠肠道连接蛋白ZO-1、Occludin、 Claudin-1的表达情况图；
图6为IHC检测急性UC小鼠肠道粘蛋白MUC2的表达情况图；
图7为WB检测急性UC小鼠肠道炎症因子TNF-α的表达情况图；
图8为急性UC小鼠肠道菌群门(A)、纲(B)、科(C)三个水平上的物种相对丰度图；
图9为急性UC小鼠肠道菌群中相对丰度存在显著性差异的属图；
图10为急性UC小鼠肠道菌群中相对丰度存在显著性差异的种图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例中的一种微生态制剂对DSS诱导结肠炎小鼠作用的研究方法，包括以下步骤：
探讨益生元低聚果糖及其合生元制剂，对急慢性溃疡性结肠炎小鼠的干预作用和可能机制，以期为微生态制剂应用于UC防治提供实验依据；
(1)6周龄健康雄性C57BL/6J小鼠随机分成空白对照组、UC 模型组、合生元干预组，在DSS造模前两周至造模结束采样前，对照组及模型组小鼠每天灌胃给予灭菌水，合生元干预组每天灌胃给予合生元；
(2)空白对照组小鼠每天自由饮用灭菌水，其它组小鼠通过饮用葡聚糖硫酸钠溶液建立UC模型，急性UC模型小鼠每天自由饮用 3％DSS溶液，持续7天，第8天处死采样；
(3)造模期间，观察各组小鼠一般情况并记录体重，造模结束后，通过小鼠活体肠镜直视观察结直肠粘膜炎症情况，处死小鼠后，采集小鼠脾脏及结肠，测量脾脏指数，结肠长度，取远端1cm结肠进行组织切片及HE染色，对各组小鼠结肠组织进行病理学损伤评分，通过蛋白免疫印迹及免疫组化检测各组小鼠结肠上皮紧密连接蛋白、粘蛋白以及促炎因子的表达情况；
(4)取急性UC模型中3组小鼠的结肠粘膜组织进行16SrDNA 测序，比较分析各组小鼠肠道菌群组成情况。
一种微生态制剂对DSS诱导结肠炎小鼠作用的研究结果：
(1)与空白对照组小鼠相比，急性UC模型组小鼠肠壁均可见明显病灶溃疡，小鼠体重显著减轻、脾脏指数显著增加和结肠长度显著缩短，模型小鼠结肠组织病理损伤严重，结肠上皮紧密连接蛋白及粘蛋白表达显著下调，而TNF-α表达显著上调；
(2)与急性UC模型组小鼠相比，合生元干预组小鼠肠壁溃疡情况均显著改善，小鼠体重显著增加、脾脏指数显著减少和结肠长度显著增加，结肠组织病理损伤评分均显著降低，结肠上皮紧密连接蛋白及粘蛋白表达显著上调，TNF-α表达显著下调；
(3)急性UC模型中各组小鼠的肠道菌群组成存在明显分离，模型组小鼠肠道菌群在门水平上，Deferribacteres显著增加，科水平上，Atopobiaceae、Burkholderiaceae、Deferribacteraceae和 Erysipelotrichaceae显著增加，属水平上，Allobaculum和Mucispirillum 显著增加，种水平上Mucispirillum SchaedleriASF457显著增加，而合生元干预组小鼠上述菌群变化情况均被显著逆转。
第8天造模结束时，在肠镜直视下观察各组小鼠的肠道炎症状况。镜下见空白对照组小鼠肠道粘膜光滑完整，血管纹路清晰，无任何溃疡灶；UC模型组小鼠肠道溃疡灶明显，可见多处糜烂充血，肠壁脆弱，触及易出血，亦可见肠腔狭窄；合生元干预组小鼠肠壁少见溃疡灶，炎症程度较轻(图1)。以上结果表明，DSS诱导小鼠急性UC
图2(A：小鼠体重变化百分比统计图，B：脾脏指数统计图，C：小鼠结肠直观图， D：小鼠结肠长度统计图；**P<0.01，****P<0.0001)
DSS造模期间，每天监测体重变化，统计各只小鼠与第0天相比的体重 变化百分比，第8天造模结束时，DSS诱导小鼠急性UC会导致小鼠体重明 显减轻，合生元干预可以有效缓解体重减轻的趋势(图2A)。第8天造模结 束后采样，剥离出小鼠的脾脏，肉眼可见DSS组小鼠脾脏明显应激性增大， 称取各组小鼠脾脏重量并统计分析脾脏指数，小鼠急性UC状态下，机体免疫 系统被激活，脾脏应激性变大，脾脏指数升高，合生元干预可降低急性UC小鼠脾脏指数(图2B)。第8天造模结束后采样，分离小鼠结肠，见空白对 照组小鼠结肠外观正常，肠内大便成形，而UC模型组小鼠结肠结肠内残留稀 便或血便，结肠明显水肿缩短，合生元干预组小鼠统计分析各组小鼠结肠亦 可见稀便，结肠有一定程度水肿并缩短，但无模型组明显(图2C)。记录并 统计各组小鼠结肠长度，发现DSS诱导小鼠急性UC可造成小鼠结肠长度明 显缩短，FOS、合生元干预可有效缓解结肠缩短的趋势(图2D)。
图3(A：小鼠结肠组织HE染色图(200X)，B：HE染色组织学损伤评分统计图) (**P<0.01，****P<0.0001)
第8天造模结束后采样，取远端结肠制备石蜡切片，HE染色后镜下观察， 空白对照组小鼠结肠粘膜结构完整，含大量杯状细胞，隐窝及腺体排列整齐； UC模型组小鼠结肠粘膜结构完整性被严重破坏，肠壁明显增厚，肠上皮细胞 及杯状细胞大量丢失，隐窝消失，粘膜层被大量中性粒细胞浸润，肌层明显 增厚；合生元干预组小鼠结肠粘膜完整性被轻度破坏，隐窝部分受损、杯状 细胞部分丢失，粘膜层被少量炎性细胞浸润(图3A)。HE染色组织学评分结 果显示，UC模型组与空白对照组评分具有显著差异，合生元干预组与UC模 型组也具有显著差异(图3B)。在急性UC状态下，结肠组织显微结构被严 重破坏，可见明显炎性浸润，合生元干预可增加结肠粘膜的完整性，减少炎 性浸润。
图4(A：WB法检测ZO-1、Occludin、Claudin-1的蛋白条带；B、C、D分别为 ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白相对表达量统计图) (*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)
第8天造模结束后采样，收集结肠组织，通过WB与IHC检测结肠上皮 紧密连接蛋白的表达情况。WB结果显示，与空白对照组相比，UC模型组小 鼠肠道连接蛋白(ZO-1，Occludin，Claudin-1)表达均显著下调；与UC模型 组相比，合生元干预组小鼠结肠连接蛋白表达均显著上调(图5)。在急性UC 状态下，小鼠结肠上皮紧密连接蛋白表达显著下调，合生元干预可缓解其下 调趋势，减少炎症状态下肠道连接蛋白的丢失，维持肠道屏障的完整性。
图6(A：IHC法检测MUC2的染色图片(200X)；B：MUC2蛋白平均光密度值统 计图)(**P<0.01，***P<0.001)
第8天造模结束后采样，收集结肠组织，通过IHC检测结肠粘蛋白MUC2 的表达情况。与空白对照组相比，UC模型组小鼠结肠粘蛋白MUC2表达显 著下调，合生元干预组小鼠结肠MUC2表达量显著上调(图6)。在急性UC 状态下，小鼠结肠粘蛋白MUC2大量丢失，合生元干预可减少炎症状态下粘 蛋白MUC2的丢失，维持肠道屏障的完整性。
图7(A：WB法检测TNF-α的蛋白条带；B：TNF-α蛋白相对表达量统计图) (***P<0.001)
第8天造模结束后采样，取结肠组织制备蛋白样，WB检测TNF- α的表达情况。结果显示，与空白对照组相比，UC模型组小鼠结肠 TNF-α表达量显著增加；与UC模型组相比，合生元干预组小鼠结肠 TNF-α表达量显著减少(图7)。在急性UC状态下，小鼠结肠促炎因子TNF-α表达显著增加，合生元干预均可显著下调TNF-α的表达。
第8天造模结束后，收集急性UC小鼠结肠粘膜组织进行16S rDNA微生物多样性分析。在分类学水平上，小鼠结肠微生物在门水平上(图8A)主要含有Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)，相对于空白对照组，UC模型组小鼠的Deferribacteres(脱铁杆菌门)相对丰度增加；与UC模型组相比，Deferribacteres在合生元干预组小鼠中相对丰度减少。在纲水平(图8B)主要含有Clostridia (梭菌纲)、Bacteroidia(拟杆菌纲)，相对于空白对照组，UC模型组小鼠的Coriobacteriia(红蝽菌纲)、Deferribacteres(脱铁杆菌纲)、 Erysipelotrichia(丹毒丝菌纲)、Gammaproteobacteria(伽马变形菌纲) 呈现增多趋势；与UC模型组相比，这四类纲微生物在合生元干预组小鼠中相对丰度减少。在科水平上(图8C)主要为Lachnospiraceae (毛螺菌科)，相对于空白对照组，UC模型组小鼠的Atopobiaceae(阿托波菌科)、Burkholderiaceae(伯克氏菌科)、Deferribacteraceae(脱铁杆菌科)、Erysipelotrichaceae(韦荣球菌科)呈现增多趋势；与UC 模型组相比，这四类科微生物在合生元干预组小鼠中相对丰度减少。在属水平上，Allobaculum、Mucispirillum在三组小鼠中，相对丰度具有明显差异(图9)。相对于空白对照组，UC模型组小鼠的Allobaculum、Mucispirillum相对丰度明显增加，合生元干预组小鼠的Allobaculum、Mucispirillum相对丰度减少。在种水平上， Mucispirillum_schaedleri_ASF457(沙氏粘液性细菌_ASF457)在三组小鼠中，相对丰度具有明显差异(图10)，与空白对照组相比，Mucispirillum_schaedleri_ASF457在UC模型组小鼠中相对丰度明显增加，合生元干预组小鼠的相对丰度与空白对照组相近。以上结果表明，合生元干预可调节急性UC状态下的肠道菌群紊乱。
一种微生态制剂对DSS诱导结肠炎小鼠作用的研究结论：
(1)通过让小鼠自由饮用DSS溶液，成功构建急性UC动物模型；
(2)合生元干预可有效缓解急性UC小鼠的结肠炎症及肠粘膜屏障损伤情况；
(3)合生元制剂均可改善急性UC小鼠的肠道菌群紊乱。
主要试剂配制：
(1)用分析天平称取2g和3g DSS粉末溶于100mL灭菌水，充分溶解至透明备用；
(2)用分析天平称取8.0g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4， 0.24g KH2PO4，溶于900mL一级水中，磁力搅拌至完全溶解，再用一级水定容至1L备用；
(3)用量筒量取90mL 1XPBS，10mL甲醛，二者充分混匀后避光保存备用；
(4)用分析天平称取0.30285g Tris碱、0.4383g NaCl和0.05g SDS，溶于30mL一级水中，在磁力搅拌状态下，加入0.5mL 1％ NP-40，充分混匀后定容至50mL，4℃保存备用；
(5)用分析天平称取5.0g SDS、15.1g Tris碱和94.0g甘氨酸，溶于900mL一级水中，磁力搅拌至完全溶解，再用一级水定容至1L 备用；
(6)用量筒量取200mL 5X电泳缓冲液，加一级水定容至1L，磁力搅拌充分混匀备用；
(7)用分析天平称取3.7g SDS、58.0g Tris碱和29.0g甘氨酸，溶于900mL一级水中，磁力搅拌至完全溶解，再用一级水定容至1L 备用；
(8)用量筒量取100mL 10X电转缓冲液，200mL甲醇，700mL 一级水于烧杯中，磁力搅拌充分混匀备用；
(9)用分析天平称取80g NaCl，24.2g Tris，溶于900mL一级水中，浓盐酸调节pH至7.2-7.6后，加水定容至1L备用；
(10)用量筒量取100mL 10xTBS溶液，加一级水定容至1L，在磁力搅拌状态下，缓慢加入1mL的Tween-20，充分混匀备用；
(11)用分析天平称取5g脱脂奶粉，溶于100mL 1xTBST溶液，充分溶解后备用。
实验方法，6周龄健康雄性C57BL/6J小鼠适应性喂养一周后，随机分成3组，包括空白对照组、UC模型组、合生元干预组，在DSS 造模前两周至造模结束采样前，空白对照及模型组小鼠每天灌胃给予灭菌水，合生元干预组每天灌胃给予合生元。
空白对照组小鼠每天自由饮用灭菌水，其它组小鼠通过饮用DSS 溶液诱导UC模型。急性UC模型：UC模型组、合生元干预组小鼠每天自由饮用3％DSS溶液，持续7天，第8天处死采样，。
在造模结束之后，利用肠镜观察小鼠肠道溃疡性结肠炎的状况：
(1)将麻醉成功的小鼠仰卧位固定，使用注射器和橡胶管组合经肛门注入灭菌PBS冲洗肠道，清除残留大便；
(2)用75％酒精纱布对肠镜镜头消毒，并用石蜡棉球润滑肠镜；
(3)肠镜经小鼠肛门导入，在小动物呼吸机的作用下间断充气，使肠管充盈，便于观察；
(4)在肠镜显示器的实时录像指引下，寻腔进镜，轻柔到达结肠末端脾区，退镜时开始录像，直至肠镜离开小鼠体内；
(5)小鼠肠镜过程中边观察边记录小鼠的肠道炎症状况，并根据视频资料留取典型图片。
造模结束后，留取小鼠结肠及脾脏标本备用：
(1)结肠：将小鼠断颈处死后，仰卧位固定，用灭菌的镊子和剪刀从腹正中剪开，分离出整个结肠，并测量肛门至盲囊的距离作为结肠长度，沿纵轴将结肠剪开，再将其置于无菌的10cm培养皿中， 1xPBS充分漂洗去粪便，灭菌纸吸干水分后，分段收集结肠，盲囊下2cm留作菌群和转录组测序标本，远端1cm结肠留作石蜡切片标本，剩余肠段留作WesternBlotting标本。
(2)脾脏：用灭菌的镊子和剪刀小心剥离出小鼠脾脏，分析天平称取脾脏重量，计算脾脏指数。
蛋白质免疫印迹：
(1)小鼠结肠蛋白提取：向小鼠结肠中按比例加入组织裂解液，在冰上用组织匀浆仪充分研磨后，静置30min，充分裂解组织，再4℃ 5000g离心5min，收集上清，然后用使用BCA试剂盒测定样品蛋白浓度以调节合适上样量，再按比例加蛋白上样缓冲液后煮沸10min，分装置于-80℃保存备用；
(2)电泳：上层浓缩胶电泳条件80V 0.5h，下层分离胶电泳条件120V 1h，以充分电泳分离蛋白样品；
(3)转膜：用湿转的方式将分离的蛋白样品转移至PVDF膜；
(4)封闭：用5％脱脂奶粉在室温摇床上封闭2h，再用1xTBST 洗膜3遍，5min/遍；
(5)一抗孵育：将PVDF膜浸入用抗体稀释液稀释后的相应蛋白抗体中，4℃孵育过夜，再用1xTBST洗膜3遍，10min/遍；
(6)二抗孵育：将PVDF膜浸入用1xTBST稀释好的二抗中，室温摇床上孵育1h，再用1xTBST洗膜3遍，10min/遍；
(7)显影：将ECL化学发光液均匀滴加至PVDF膜上，用Tannon 全自动化学发光成像分析系统扫描PVDF膜，显现出特异性蛋白条带；
(8)使用软件ImageJ分析蛋白条带灰度值。
小鼠结肠石蜡切片制备：
(1)取材：将新鲜小鼠远端1cm结肠组织放入10％中性福尔马林液中固定24h，再将组织和对应的标签放入于脱水框中；
(2)脱水浸蜡：将脱水框依次放入75％酒精3h、85％酒精2h、
90％酒精1.5h、95％酒精1.5h、无水乙醇I 0.5h、无水乙醇Ⅰ0.5 h、醇苯7min、二甲苯I 7min、二甲苯II 7min、融化石蜡I1h、融化石蜡II 1h、融化石蜡III 1h；
(3)包埋：将融化的蜡倒入包埋框，在蜡凝固之前迅速将组织从脱水框内取出放入包埋框并贴上标签，-20℃冷却，待蜡块凝固后将其从包埋框中取出并修整；
(4)切片：将修整好的蜡块置于半自动石蜡切片机进行切片，厚度为3μm，将切片漂浮于40℃温水，利用水的张力将组织展平，然后用载玻片捞起切片，60℃烘箱内烤片2h，取出后常温保存备用。
HE染色：
(1)石蜡切片脱蜡至水：将切片依次将放入二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min、无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、95％酒精5 min、85％酒精5min，自来水洗；
(2)苏木素染色：将切片放入苏木素染液浸染4min，自来水洗至淡蓝色；
(3)伊红染色：将切片放入85％酒精脱水1min，入伊红染液中浸染1min；
(4)脱水封片：将切片依次放入85％酒精30s、95％酒精30s、无水乙醇I1min、无水乙醇II 1min，冷风吹15min风干，二甲苯透明，中性树胶封片；
(5)显微镜镜检，图像采集，每组5只小鼠，每只小鼠随机选取20倍物镜下3个视野分析。
免疫组化(IHC)：
(1)石蜡切片脱蜡至水：同HE染色；
(2)抗原修复：将组织切片置于煮沸后的盛有适量0.01M柠檬酸抗原修复液的微波炉中，160V 4min，进行抗原修复，自然冷却后用蒸馏水浸洗6遍；
(3)阻断内源性过氧化物酶：将切片浸入3％H2O2溶液，避光孵育12min，再用蒸馏水浸洗6遍；
(4)血清封闭：用免疫组化笔将组织圈起来，在圈内滴加封闭山羊血清，使其均匀覆盖组织，室温封闭30min；
(5)一抗孵育：直接甩掉组织上的封闭液，在圈内滴加按比例稀释好的一抗，使其均匀覆盖组织，于湿盒内4℃孵育过夜；
(6)二抗孵育：取出湿盒室温下复温45min，用1×PBST浸洗玻片4遍，5min/遍，甩去擦干多余PBST，在圈内滴加适宜的二抗，使其均匀覆盖组织，于湿盒内37℃孵育30min；
(7)DAB显色：用1×PBST浸洗玻片4遍，5min/遍，甩去多余PBST，在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显色1min，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色；
(8)复染细胞核：将显色完成的组织切片于苏木素中复染1min 30s，自来水洗至阴性区域呈淡蓝色；
(9)脱水封片：85％酒精2min、95％酒精2min、无水乙醇I 2min、无水乙醇II 4min，冷风吹15min风干，二甲苯透明，中性树胶封片；
(10)显微镜镜检，图像采集，每组5只小鼠，每只小鼠随机选取20倍物镜下5个视野分析。
DSS诱导的急性UC模型组小鼠肠壁可见自发性出血点及明显溃疡糜烂，与人类重度UC镜下表现一致。在DSS诱导急性UC的过程中，随着造模时间的延长，模型组小鼠表现出加重性腹泻，粘液脓血便，体重减轻等症状，结肠病理性缩短，脾脏指数增加，结肠组织 HE染色表现为上皮细胞的广泛损害，被大量中性粒细胞浸润。
本研究中，急性UC状态下，与空白对照组相比，UC模型小鼠结肠上皮紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1及粘蛋白MUC2 表达显著下调，这与MergaY等研究结果一致，DSS通过直接作用于肠上皮细胞，造成细胞损伤，上皮紧密连接蛋白丢失，MUC2分泌减少，肠道屏障破坏严重，TNF-α主要由活化的巨噬细胞、NK细胞和 T淋巴细胞产生，是参与肠道炎症起始与持续的重要炎症递质，在 UC患者中表达明显升高，本研究中，DSS诱导的急性UC小鼠结肠组织TNF-α的表达相较于Control组均显著增加，处于较高炎症水平，综上所述，基于模型动物的一般情况、结肠组织病理学损伤、肠黏膜屏障变化以及炎症因子水平这几方面的结果，证明本研究通过饮用 DSS溶液成功建立了急性UC小鼠模型。
本研究中所选用的合生元包括FOS和数种来自双歧杆菌属和乳杆菌属的益生菌，研究结果发现，与急性UC模型组小鼠相比，合生元干预组小鼠肠壁溃疡情况显著改善，小鼠体重显著增加、脾脏指数显著减少和结肠长度显著增加，结肠组织病理损伤评分均显著降低，结肠上皮紧密连接蛋白及粘蛋白表达显著上调，TNF-α表达显著下调。急性UC模型中各组小鼠的肠道菌群组成存在明显分离，模型组小鼠肠道菌群在门水平上，Deferribacteres显著增加，科水平上， Atopobiaceae、Burkholderiaceae、Deferribacteraceae和Erysipelotrichaceae显著增加，属水平上，Allobaculum和Mucispirillum 显著增加，种水平上Mucispirillum SchaedleriASF457显著增加，而合生元干预组小鼠上述菌群变化情况均被显著逆转
本发明中，微生态制剂主要包括益生菌、益生元，越来越多的科学研究表明微生态制剂在肿瘤免疫、肥胖、糖尿病、炎症性疾病、情绪方面有调控和治疗作用。
本发明中，益生菌是活的微生物，当给予足够数量的益生菌时，会给宿主健康带来好处，主要包括乳杆菌属、双歧杆菌属、丙酸菌属和链球菌属等的某些菌株。
本发明中，益生菌通过促进粘膜层的形成，分泌抗菌因子，促进分泌性免疫球蛋白的分泌，增加紧密连接形成，从而调节肠道功能。
本发明中，益生元是一种不可消化的食物成分，在通过上消化道时不能被代谢或吸收，在结肠中被细菌发酵，选择性增强消化系统中有益细菌的生长或活性，主要包括菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖等。
本发明中，益生元对机体的有益作用与其代谢产物短链脂肪酸密切相关，SCFAs主要包括乙酸、丙酸和丁酸，它们是肠道上皮细胞的能量来源，同时也是抗炎因子，尤其是丁酸，可以发挥改善和保护肠道屏障的作用。
本发明中，合生元由益生菌和益生元组成，既可发挥益生菌的生理活性，又能选择性的增加益生菌的数量，使其作用更加显著和持久，常见乳酸菌加乳糖醇、双歧杆菌加低聚果糖或低聚半乳糖组合。
本发明中，微生态制剂有助于缓解UC炎症并重建正常的肠道功能。
本发明中，微生态制剂对UC的研究主要集中在混合益生菌与益生元组成的合生元。
本发明中，低聚果糖FOS能在肠道进行厌氧发酵，主要被双歧杆菌和乳杆菌利用，它们产生的乳酸可促进肠道干细胞增殖以及肠上皮细胞分化，参与ISC介导的肠上皮发育和再生。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种微生态制剂对DSS诱导的急性结肠炎小鼠治疗作用的方法，其特征在于：包括以下步骤：
探讨合生元制剂对急性UC小鼠的干预作用和可能机制，以期为微生态制剂应用于UC防治提供实验依据；
(1)6周龄健康雄性C57BL/6J小鼠随机分成空白对照组、UC模型组、合生元干预组，在DSS造模前两周至造模结束采样前，对照组及模型组小鼠每天灌胃给予灭菌水，合生元干预组每天灌胃给予合生元；
(2)空白对照组小鼠每天自由饮用灭菌水，其它组小鼠通过饮用DSS溶液建立UC模型，小鼠每天自由饮用3％DSS溶液，持续7天，第8天处死采样；
(3)造模期间，观察各组小鼠一般情况并记录体重，造模结束后，通过小鼠活体肠镜直视观察结直肠粘膜炎症情况，处死小鼠后，采集小鼠脾脏及结肠，测量脾脏指数，结肠长度，取远端1cm结肠进行组织切片及HE染色，对各组小鼠结肠组织进行病理学损伤评分，通过蛋白免疫印迹及免疫组化检测各组小鼠结肠上皮紧密连接蛋白、粘蛋白以及促炎因子的表达情况；
(4)取各组小鼠的结肠粘膜组织进行16S rDNA测序，比较分析各组小鼠肠道菌群组成情况；
(5)与空白对照组小鼠相比，急性UC模型组小鼠肠壁可见明显病灶溃疡，小鼠体重显著减轻、脾脏指数显著增加和结肠长度显著缩短，模型小鼠结肠组织病理损伤严重，结肠上皮紧密连接蛋白及粘蛋白表达显著下调，而TNF-α表达显著上调；
(6)与急性UC模型组小鼠相比，合生元干预组小鼠肠壁溃疡情况显著改善，小鼠体重显著增加、脾脏指数显著减少和结肠长度显著增加，结肠组织病理损伤评分均显著降低，结肠上皮紧密连接蛋白及粘蛋白表达显著上调，TNF-α表达显著下调；
(7)急性UC模型中各组小鼠的肠道菌群组成存在明显分离，模型组小鼠肠道菌群在门水平上，Deferribacteres显著增加，科水平上，Atopobiaceae、Burkholderiaceae、Deferribacteraceae和Erysipelotrichaceae显著增加，属水平上，Allobaculum和Mucispirillum显著增加，种水平上Mucispirillum SchaedleriASF457显著增加，而合生元干预组小鼠上述菌群变化情况均被显著逆转。
2.根据权利要求1所述的一种微生态制剂对DSS诱导结肠炎小鼠作用的研究方法，其特征在于：所述微生态制剂(合生元)主要包括益生菌、益生元，越来越多的科学研究表明微生态制剂在肿瘤免疫、肥胖、糖尿病、炎症性疾病、情绪方面有调控和治疗作用。
3.根据权利要求2所述的一种微生态制剂对DSS诱导结肠炎小鼠作用的研究方法，其特征在于：所述益生菌是活的微生物，当给予足够数量的益生菌时，会给宿主健康带来好处，主要包括乳杆菌属、双歧杆菌属、丙酸菌属和链球菌属等的某些菌株。
4.根据权利要求2所述的一种微生态制剂对DSS诱导结肠炎小鼠作用的研究方法，其特征在于：所述益生菌通过促进粘膜层的形成，分泌抗菌因子，促进分泌性免疫球蛋白的分泌，增加紧密连接形成，从而调节肠道功能。
5.根据权利要求2所述的一种微生态制剂对DSS诱导结肠炎小鼠作用的研究方法，其特征在于：所述益生元是一种不可消化的食物成分，在通过上消化道时不能被代谢或吸收，在结肠中被细菌发酵，选择性增强消化系统中有益细菌的生长或活性，主要包括菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖等。
6.根据权利要求2所述的一种微生态制剂对DSS诱导结肠炎小鼠作用的研究方法，其特征在于：所述益生元对机体的有益作用与其代谢产物短链脂肪酸(SCFAs)密切相关，SCFAs主要包括乙酸、丙酸和丁酸，它们是肠道上皮细胞的能量来源，同时也是抗炎因子，尤其是丁酸，可以发挥改善和保护肠道屏障的作用。
7.根据权利要求1所述的一种微生态制剂对DSS诱导结肠炎小鼠作用的研究方法，其特征在于：所述合生元由益生菌和益生元组成，既可发挥益生菌的生理活性，又能选择性的增加益生菌的数量，使其作用更加显著和持久，常见乳酸菌加乳糖醇、双歧杆菌加低聚果糖与低聚半乳糖组合。
8.根据权利要求1所述的一种微生态制剂对DSS诱导结肠炎小鼠作用的研究方法，其特征在于：所述微生态制剂有助于缓解UC炎症并重建正常的肠道功能。
9.根据权利要求1所述的一种微生态制剂对DSS诱导结肠炎小鼠作用的研究方法，其特征在于：所述微生态制剂对UC的研究主要集中混合益生菌与益生元组成的合生元。
10.根据权利要求1所述的一种微生态制剂对DSS诱导结肠炎小鼠作用的研究方法，其特征在于：所述低聚果糖FOS能在肠道进行厌氧发酵，主要被双歧杆菌和乳杆菌利用，它们产生的乳酸可促进肠道干细胞增殖以及肠上皮细胞分化，参与ISC介导的肠上皮发育和再生。
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