CN117949648A - 一种用于检测溃疡性结肠炎的标志物及用途 - Google Patents
一种用于检测溃疡性结肠炎的标志物及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供了用于检测炎症性肠病（IBD）的标志物及其用途，所述标志物涉及一种次级胆汁酸甘氨脱氧胆酸及其衍生物。本申请通过对结肠样本进行非靶向代谢组学筛选以及胆汁酸靶向代谢组学检测，发现甘氨脱氧胆酸及其衍生物与溃疡性结肠炎疾病活动度诊断相关，可用于疾病的筛查、诊断、复发预测或治疗效果评估。
Description
技术领域
本发明涉及生物、医药技术领域，具体涉及一种检测、诊断溃疡性结肠炎的标志物及其应用。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease, IBD)是一种累及直肠、回肠、结肠甚至全消化道的无法治愈的慢性炎性病症，其包括溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis, UC)和克罗恩病(Crohn's disease, CD)。近年来，IBD的发病率和患病率在世界范围内均呈逐年上升趋势，已成为全球广泛关注的疾病。UC是IBD的主要发病形式，其具有病情迁延、反复发作的特点，发病机制尚不完全明确。虽然对治疗UC药物的研究已有四十多年，且随着医疗卫生行业的进步，新的治疗方法正在快速发展，但目前仍然缺乏治愈手段。
UC主要原因为炎症所致的肠黏膜上皮的破坏，其多呈缓解与复发交替出现。活动期和缓解期的UC组织表现不同，如何评价UC的活动度和严重程度, 有利于更加准确地评估病情、指导治疗、防治疾病的复发。
代谢物是生物体表型的基础，能帮助更直观有效地了解生物学过程及其机理。代谢组学可以用于代谢途径或代谢网络的解析，不同生物个体的宏观表型现象的代谢基础研究，在临床疾病、生物医药等领域具有广泛应用。溃疡性结肠炎疾病活动期标志物的鉴定有助于指导治疗、防治疾病的复发，并发现潜在的治疗靶点。
发明内容
为实现上述目的，本申请通过对样本进行非靶向代谢组学筛选以及胆汁酸靶向代谢组学检测，发现并鉴定了与溃疡性结肠炎疾病活动度诊断相关的标志物。
具体的，本申请的技术方案涉及一种标志物在制备炎症性肠病的检测产品中的用途，其中，所述标志物为甘氨脱氧胆酸或其衍生物中的至少一种。
进一步的，所述甘氨脱氧胆酸衍生物包括硫酸盐结合形式的甘氨脱氧胆酸。
进一步的，所述标志物为甘氨脱氧胆酸和硫酸盐结合形式的甘氨脱氧胆酸。
进一步的，所述检测产品用于对样品中的所述标志物的含量或丰度进行检测。
进一步的，所述检测产品中包括所述标志物的检测试剂。
进一步优选的，所述检测试剂为检测所述标志物含量或丰度的试剂。
进一步的，所述样品包括受试者的肠粘膜、血液或粪便。
进一步的，所述检测产品用于炎症性肠病的筛查、诊断、复发预测或治疗效果评估。
进一步优选的，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
进一步的，所述检测产品选自试剂、试剂盒或试纸。
本申请的技术方案还涉及一种用于检测炎症性肠病的试剂盒，其中包括检测标志物的试剂，所述标志物为甘氨脱氧胆酸或其衍生物中的至少一种。
进一步的，所述甘氨脱氧胆酸衍生物包括硫酸盐结合形式的甘氨脱氧胆酸。
进一步的，所述标志物为甘氨脱氧胆酸和硫酸盐结合形式的甘氨脱氧胆酸。
进一步的，所述试剂为检测所述标志物含量或丰度的试剂。
进一步的，所述试剂盒用于检测受试者的组织、体液、分泌物。
进一步的，所述试剂盒用于炎症性肠病的筛查、诊断、复发预测或治疗效果评估。
进一步优选的，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
附图说明
图1A为UC与VEH的非靶向代谢组数据的主成分（PCA）分析示意图。
图1B为UC与VEH的非靶向代谢组数据的正交偏最小二乘法判别（OPLS-DA）分析示意图。
图1C为UC与VEH的前30种差异代谢物热图展示图。
图1D为胆汁酸代谢通路富集流程图。
图1E为差异胆汁酸甘氨脱氧胆酸（GDCA）表达浓度展示图。
图2A为为UC活动期患者组（RLA）、UC缓解期患者组（RLR）、健康对照组（VEH）的靶向胆汁酸代谢组的主成分（PCA）分析示意图。
图2B为UC活动期患者组（RLA）和健康对照（VEH）的差异代谢物分析示意图。
图2C为UC活动期患者组（RLA）和UC缓解期患者（RLR）的差异代谢物分析示意图。
图3A为甘氨脱氧胆酸−3−硫酸盐在溃疡性结肠炎活动期诊断中的ROC曲线图。
图3B为甘氨脱氧胆酸在溃疡性结肠炎活动期诊断中的ROC曲线图。
图3C为甘氨脱氧胆酸−3−硫酸盐和甘氨脱氧胆酸的组合在溃疡性结肠炎活动期诊断中的ROC曲线图。
图4A为DSS诱导小鼠结肠炎模型流程图。
图4B为各组别小鼠体重变化情况示意图。
图4C为小鼠的疾病活动指数评分（DAI score）示意图。
图4D为小鼠结肠长度统计图。
图4E为小鼠结肠图。
图4F为小鼠结肠病理切片图。
图4G为小鼠的病理活动指数评分（HAI score）示意图。
图4H为小鼠肠道TH17（CD4+IL-17+）细胞流式图。
图4I为小鼠肠道TH17（CD4+IL-17+）细胞统计图。
图4J为小鼠肠道病理性TH17（CD4+IFN+IL17A+）细胞流式图。
图4K为小鼠肠道病理性TH17（CD4+IFN+IL17A+）细胞统计图。
图4L为不同化合物干预DSS诱导小鼠结肠炎造模小鼠结肠长度统计图
图5A为GDCA与Vehicle（DMSO）处理健康对照外周血对静息状态下（IL-7刺激）CD4阳性T细胞激活比例流式图。
图5B为GDCA与Vehicle（DMSO）处理健康对照外周血静息状态下（IL-7刺激）CD4阳性T细胞激活比例流式统计图。
图5C为GDCA与Vehicle（DMSO）处理健康对照外周血活化状态下（CD3及CD28刺激）CD4阳性T细胞激活比例流式图。
图5D为GDCA与Vehicle（DMSO）处理健康对照外周血活化状态下（CD3及CD28刺激）CD4阳性T细胞激活比例流式统计图。
图5E为GDCA处理健康对照外周血活化状态下（CD3及CD28刺激）CD4阳性T细胞培养上清IL-17A浓度。
图5F为GDCA处理健康对照外周血活化状态下（CD3及CD28刺激）CD4阳性T细胞培养上清IFN-γ浓度。
图5G为GDCA与Vehicle（DMSO）处理UC患者外周血活化状态下（CD3及CD28刺激）CD4阳性T细胞激活比例流式图。
图5H为GDCA与Vehicle（DMSO）处理UC患者外周血活化状态下（CD3及CD28刺激）CD4阳性T细胞激活比例流式统计图。
图5I为GDCA处理UC患者外周血活化状态下（CD3及CD28刺激）CD4阳性T细胞培养上清IL-17A浓度。
图5J为GDCA处理UC患者外周血活化状态下（CD3及CD28刺激）CD4阳性T细胞培养上清IFN-γ浓度。
图6 A为GDCA作用于非致病性Th17（non-pathogenic Th17，nTh17）的细胞流式图。
图6B为GDCA作用于nTh17统计图。
图6C为GDCA作用于nTh17细胞培养上清IL-17A浓度示意图。
图6D为GDCA作用于致病性Th17（pathogenic Th17, pTh17）细胞流式图。
图6E为GDCA作用于pTh17统计图。
图6F为GDCA作用于pTh17细胞培养上清IL-17A浓度示意图。
图7 A为GDCA与溶剂二甲基亚砜（DMSO）处理Th17细胞的转录组水平的差异基因火山图。
图7B为GDCA与DMSO处理Th17细胞差异基因热图。
图7C为GDCA处理Th17细胞差异基因京都基因和基因组百科全书 (KEGG) 通路分析示意图。
图7D为GDCA 处理组下调糖酵解通路及HIF-1通路示意图。
图7E为GDCA与DMSO组对Th17细胞线粒体压力的影响示意图。
图7F为GDCA与DMSO组对Th17细胞线粒体压力统计图。
图7G为GDCA与DMSO组对Th17细胞糖酵解速率的影响示意图。
图7H为GDCA与DMSO组对Th17细胞糖酵解速率统计图。
图8A为不同处理组小鼠肠道菌群β多样性主成分分析（PCA）。
图8B为不同处理组小鼠门水平菌群分布堆叠图。
图8C为不同处理组小鼠门水平菌群统计图。
图8D为不同处理组小鼠种水平不同处理堆叠图。
图8E为DMSO及GDCA处理DSS造模小鼠肠道菌群门水平统计图。
图8F为GDCA与DMSO处理DSS诱导结肠炎小鼠模型肠道菌群差异分类进化树。
图8G为GDCA与DMSO处理DSS诱导结肠炎小鼠模型肠道菌群的线性判别分析（LDAScore阈值为4）。
具体实施方式
以下通过具体实施例来详细阐述和说明本发明的实施方式，但以下内容不应理解为对本发明作任何限制。
本申请主要涉及一种炎症性肠病（IBD）的检测及诊断标志物，所述标志物为一类次级胆汁酸，具体的，所述标志物为甘氨脱氧胆酸。
次级胆汁酸是由初级胆汁酸随胆汁进入肠道，在回肠、结肠上段，由肠道菌酶催化，经过结合反应，脱去羟基转化而成。
甘氨脱氧胆酸，即初级胆汁酸中的脱氧胆酸与甘氨酸结合的产物，其化学式为C26H45NO6·xH2O，化学结构如式1所示。
式1。
本申请中的所述甘氨脱氧胆酸可以采用市售产品，如MedChemExpress公司生产的甘胺脱氧胆酸（货号为HY-125731），也可通过现有技术中的化学及生物方法制备得到。
本申请中所述标志物进一步包括甘氨脱氧胆酸的衍生物，所述衍生物包括甘氨脱氧胆酸的化学修饰物、聚合物、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、前药形式等，比如脱氧甘胆酸钠（Glycodeoxycholicacidsodiumsal），化学式为C26H42NNaO5，可以采用市售产品，如Sigma公司生产的脱氧甘胆酸钠盐（货号为G9910）。
在具体的实施方式中，所述甘氨脱氧胆酸的衍生物包括硫酸盐结合形式的甘氨脱氧胆酸，例如3-硫酸甘氨脱氧胆酸（Glycodeoxycholic Acid−3−Sulfate），化学结构如式2所示。
式2。
本申请进一步提供了本申请所述标志物在制备炎症性肠病的检测产品中的用途。
在具体的实施方式中，所述标志物为甘氨脱氧胆酸和/或硫酸盐结合形式的甘氨脱氧胆酸。
在一个优选的实施方式中，所述标志物为甘氨脱氧胆酸和硫酸盐结合形式的甘氨脱氧胆酸。
本申请提供的所述检测产品用于实现炎症性肠病的检测及诊断功能，具体的，所述检测及诊断功能包括炎症性肠病的筛查、诊断或辅助诊断，预测炎症性肠病的发病及复发风险，对炎症性肠病的给药或治疗效果进行评估等。
在本申请中，复发包括过去的医疗病况（炎症性肠病）的再次发生，病况的体征和症状在缓解后恢复。治疗效果包括但不限于在预防疾病的发生或复发、缓解疾病症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态等方面的效果。
在本申请中，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）。在优选的实施方式中，所述炎症性肠病为UC。
在具体的实施方式中，甘氨脱氧胆酸和/或硫酸盐结合形式的甘氨脱氧胆酸，优选的，甘氨脱氧胆酸和3-硫酸甘氨脱氧胆酸，可用于溃疡性结肠炎的筛查、诊断、发病及复发风险预测及治疗效果评估。
在一些具体的实施方式中，甘氨脱氧胆酸和/或硫酸盐结合形式的甘氨脱氧胆酸可用于溃疡性结肠炎疾病活动度的诊断及评估。本申请中疾病活动度以Mayo 内镜评分为标准，具体为:Mayo 内镜评分≤1分定义为缓解，Mayo内镜评分>1分定义为活动。
在另一些具体的实施方式中，甘氨脱氧胆酸和/或硫酸盐结合形式的甘氨脱氧胆酸可用于用药效果、病情缓解及改善的效果评估。
在具体的实施方式中，所述检测产品用于对样品中的所述标志物进行检测。
在具体的实施方式中，所述检测产品通过检测样品中所述标志物的含量或丰度，以实现所述炎症性肠病的检测及诊断功能。
在具体的实施方式中，所述检测产品中包括所述标志物的检测试剂，优选的，所述检测试剂为检测所述标志物含量或丰度的试剂。
在一些具体的实施方式中，所述检测试剂可选自用于以下检测方法的试剂：液相色谱、液相质谱、ELISA、层析分析等。
在具体的实施方式中，所述样品包括受试者的组织、体液或分泌物。
在具体的实施方式中，所述受试者选自哺乳动物。在优选的实施方式中，所述受试者为人类。
在具体的实施方式中，所述样品选自组织、体液、分泌物中的至少一种。
在具体的实施方式中，所述组织为结直肠组织，如肠粘膜。
在具体的实施方式中，所述体液为血液，如血清、血浆、全血。
在具体的实施方式中，所述分泌物为粪便、尿液或外泌物。
在具体的实施方式中，所述检测产品选自试剂、试剂盒、试纸或诊断芯片。
本申请进一步提供了一种检测炎症性肠病的试剂盒，其中包括检测标志物的试剂，所述标志物为甘氨脱氧胆酸或其衍生物中的至少一种。
在具体的实施方式中，所述甘氨脱氧胆酸衍生物包括硫酸盐结合形式的甘氨脱氧胆酸。
在具体的实施方式中，所述标志物为甘氨脱氧胆酸和/或硫酸盐结合形式的甘氨脱氧胆酸。
在一些优选的实施方式中，所述标志物为甘氨脱氧胆酸和硫酸盐结合形式的甘氨脱氧胆酸。
在具体的实施方式中，所述试剂为检测所述标志物含量或丰度的试剂。
在具体的实施方式中，所述试剂盒用于检测样本中所述标志物含量或丰度。
在具体的实施方式中，所述样本包括受试者的组织、体液或分泌物。
在具体的实施方式中，所述样品为受试者的肠粘膜、血液或粪便。
本申请提供的所述试剂盒可用于实现炎症性肠病的检测及诊断功能，具体的，所述检测及诊断功能包括炎症性肠病的筛查、诊断或辅助诊断，预测炎症性肠病的发病及复发风险，对炎症性肠病的给药或治疗效果进行评估等。
本申请还提供了用于检测及诊断炎症性肠病的方法，包括检测样本中标志物的含量或丰度，并将所述含量或丰度值与参考值进行比较，所述标志物为甘氨脱氧胆酸或其衍生物中的至少一种。
实施例
如无特别说明，本申请以下实施例中使用的。其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一：对溃疡性结肠炎代谢物的分析及标志物的筛选和验证
1. 对代谢物的分析及标志物筛选
实验设置：本实验共纳入6例例行息肉复检的健康对照（VEH）和9例UC活动期患者（UC）。为了研究溃疡性结肠炎患者结肠组织的代谢谱，对45块人群粘膜组织样本进行了非靶向代谢组学质谱分析。质谱下机原始数据经过ProteoWizard转换为mzML格式，采用XCMS程序进行峰提取，对齐，保留时间校正。采用“SVR”方法对峰面积进行校正，并对各组样本中缺失率>50%的峰进行过滤。校正筛选后的峰，通过检索实验室自建数据库、整合公共库以及metDNA方法得到代谢物鉴定信息。最后通过R程序进行统计学分析。统计学分析分为单变量统计学分析和多变量统计学分析，单变量统计分析包括 Student's t-test 和差异倍数分析，多变量统计分析包括主成分（PCA）分析（如图1A所示）和正交偏最小二乘法判别（OPLS-DA）分析（如图1B所示）。通过以上分析检测出UC组和对照组298种差异代谢物，前30种差异代谢物用热图展示（如图1C所示）。随后通过对胆汁酸代谢通路富集到1种差异胆汁酸——甘氨脱氧胆酸（GDCA）（图1C、1D、1E），说明胆汁酸与UC疾病活动度有关。
2. 对所筛选标志物的诊断灵敏性和特异性验证
为评估所筛选的代谢标志物在溃疡性结肠炎疾病活动诊断中的灵敏度与特异性，在新的23例活动期UC患者（RLA）、18例内镜下缓解的UC患者（RLR）、25例例行息肉复检的健康对照者（VEH）进行外部的靶向胆汁酸代谢组的质谱分析，通过收集198块人群粘膜组织样本，检测69种与胆汁酸代谢相关的代谢物，包括32种初级胆汁酸和37种次级胆汁酸(SBAs)。通过靶向代谢质谱验证，主成分分析（PCA）显示，在活动期UC患者（RLA）和健康对照组（VEH）之间的胆汁酸代谢物的聚类分析中存在差异，且缓解期UC患者（RLR）胆汁酸代谢物的聚类位于活动期UC患者（RLA）和健康对照组（VEH）之间（如图2A所示），说明溃疡性结肠炎患者不同疾病活动度的代谢具有差异。
为了进一步筛选与溃疡性结肠炎疾病活动度诊断相关的差异代谢物，对所测的胆汁酸进行差异分析，包括计算代谢物在两组间表达量的差异倍数（Fold Change），以及进行T检验分析。活动期UC患者（RLA）和健康对照组（VEH）相比，差异代谢物有石胆酸（Lithocholic acid）、鹅去氧胆酸（Chenodeoxycholic acid）、ω-鼠胆酸（ω-MuricholicAcid）、甘氨脱氧胆酸（Glycodeoxycholic acid，GDCA）、3-硫酸石胆酸（Lithocholic Acid-3-Sulfate）、3-硫酸甘氨脱氧胆酸（Glycodeoxycholic Acid−3−Sulfate）（如图2B所示）。同时为了探讨溃疡性结肠炎患者不同疾病活动度的代谢情况，比较活动期UC患者（RLA）和缓解期UC患者（RLR）的差异代谢物，发现甘氨脱氧胆酸（Glycodeoxycholic acid，GDCA）和其硫酸盐结合形式的3-硫酸甘氨脱氧胆酸（Glycodeoxycholic Acid−3−Sulfate）差异仍然显著，p<0.05（如图2C所示）。
为了评估甘氨脱氧胆酸（Glycodeoxycholic acid，GDCA）和3-硫酸甘氨脱氧胆酸（Glycodeoxycholic Acid−3−Sulfate）的潜在转化价值，绘制了所述两种标志物在区分UC活动期和健康对照的ROC曲线。结果显示，硫酸盐结合形式（Glycodeoxycholic Acid−3−Sulfate）的AUC值为0.8139（如图3A所示），甘氨脱氧胆酸的 AUC值为0.7513（如图3B所示），两个代谢物组合使用时对UC活动期的诊断具有良好的诊断效果，ROC曲线下面积AUC值为0.8835（如图3C所示）。
实施例二：甘氨脱氧胆酸（GDCA）可以减轻DSS诱导小鼠结肠炎模型炎症
1. 实验组设置：
在DSS造模前首先对实验小鼠设置饮水组（H2O+Vehicle组，14只）和空白给药组（H2O+30mg/kg GDCA组，14只），饮水组小鼠正常饮水，空白给药组小鼠在第一天给予30mg/kg甘氨脱氧胆酸GDCA。三天后分别对饮水组和空白给药组中的部分小鼠（每组随机选7只）进行DSS造模（在饮用水中添加2.5%的DSS），形成造模组（2.5%DSS+ Vehicle组）和造模给药组（2.5%DSS+30mg/kg GDCA组）。造模持续7天后结束。造模流程图如图4A所示。结束后对各组别小鼠进行相关检测和实验。
此外，本研究进一步比较了GDCA与5-氨基水杨酸(5-ASA)对DSS诱导小鼠结肠炎的效果，所有小鼠随机分成4组，自第一天起分别给予DMSO溶剂或25mg/kg 5-ASA或25mg/kgGDCA，三天后替换饮用水为2.5%DSS溶液，DSS饮用7天后造模结束。
2. 主要实验方法：
小鼠疾病活动指数评分（DAI score），评分标准如表1所示：
表1
。
小鼠病理活动指数评分（HAI score），评分标准如表2所示：
表2
。
以上三项评分相加乘以结肠受累范围：＜25% ×1，25%-50% ×2，51%-75% ×3，＞75%×4
结肠组织切片染色：苏木素-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining），简称HE染色法，简要染色步骤为：石蜡切片入苏木素染0.5-1分钟，自来水漂洗，1%盐酸酒精分化数秒，自来水漂洗，然后1%氨水水溶液返蓝1分钟，流水冲洗数秒后放入伊红染液中染色数秒，流水漂洗。
细胞流式实验：以消化液消化小鼠结肠组织制成混悬液，混悬液以Percoll分离液进行梯度分离得到肠道单个核细胞，PBS清洗1次后转移至流式管中，加入流式染料染色，过滤后流式仪上机。
H2O+Vehicle组,n=5;H2O+30mg/kg GDCA组,n=6;2.5%DSS+ Vehicle组,n=9;2.5%DSS+30mg/kg GDCA组,n=8。各组间统计采用单因素方差分析。* P＜0.05，** P＜0.01，***P＜0.001，**** P＜0.0001。
3. 实验结果分析：
图4B的小鼠体重变化情况示意图显示：DSS造模组较饮水组相比体重明显下降，虽然GDCA干预在饮水组中有明显降低体重的效果，但与DSS对照组相比，GDCA干预下体重下降并不明显。图4C的小鼠疾病活动指数评分（DAI score）结果显示：DSS组与饮水组相比整体DAI评分较高，但GDCA干预可以明显降低DAI评分。图4D和4E的小鼠结肠长度统计图和结肠图片显示：DSS组较饮水组小鼠相比结肠长度明显缩短，GDCA干预降低DSS小鼠结肠短缩趋势。上述实验结果均表明，给予GDCA可显著改善DSS小鼠的炎症表型。
图4F的小鼠结肠病理切片染色图显示：DSS组较饮水组相比，存在明显上皮损伤、隐窝破坏及结肠水肿等急性结肠炎表现，而GDCA干预下炎症损伤标志如上皮破坏程度等明显减轻。图4G的小鼠病理活动指数评分（HAI score）结果显示：GDCA干预下病理活动指数评分明显缓解，且存在统计学差异。上述实验结果表明，给予GDCA还可显著减少结肠组织病理损伤和组织学炎症。
为了解GDCA如何影响肠道炎症，对接受GDCA或溶剂PBS治疗的结肠炎小鼠的全结肠组织进行了免疫细胞分析。鉴于在炎症性肠病的发生发展过程中, TH17细胞及其相关细胞因子发挥着重要作用，如在病理条件下Th17会分泌促炎介质以加重疾病进展和预后，我们重点关注了甘氨脱氧胆酸是否能调节这类细胞的变化。图4H-K的结果显示，GDCA治疗显著降低了与炎症相关的TH17细胞（CD4+IL-17A+）比例以及病理性TH17（pathogenic TH17，pTh17）（CD4+IFN+IL17A+）比例等。
为探究GDCA与不同药物之间疗效对比，我们将GDCA与5-ASA进行比较，结果提示相同处理浓度下，GDCA缓解DSS结肠炎效果优于5-ASA，具体表现为小鼠结肠短缩程度明显降低（如图4L所示）。
实施例三：GDCA对CD4阳性T细胞活化状态影响
CD154（CD40LG）与抗原呈递细胞表面CD40结合在Th17极化中起到重要作用，因此为补充探究GDCA对Th17细胞极化的影响，我们分离纯化了健康人外周血naïve CD4阳性T细胞，在体外构建静息状态（IL-7刺激）及活化状态（CD3及CD28刺激）下CD4阳性T细胞模型，分别以GDCA及DMSO干预两种状态细胞，两组细胞分别于37℃，5%CO2孵箱中培养3天，3天后收集细胞进行流式染色，同时收集细胞培养上清进行ELISA检测。
实验结果显示，在静息状态时，两组间激活比例无统计学差异（如图5A、5B所示），而GDCA可降低活化状态下CD4+T细胞激活比例（如图5C、5D所示），且能降低活化状态下细胞培养上清IL-17A及IFN-γ浓度（如图5E、5F所示）。
此外，我们进一步分离纯化了UC患者外周血naïve CD4阳性T细胞，在体外构建活化状态（CD3及CD28刺激）下CD4阳性T细胞模型，结果发现GDCA同样能够降低UC患者活化状态下CD4+T细胞激活比例（如图5G、5H所示），且同样能降低活化状态下细胞培养上清IL-17A及IFN-γ浓度（如图5I、5J所示）。
实施例四：GDCA对Th17细胞及IL-17水平的影响
为进一步探究GDCA对Th17的影响，通过分离小鼠脾脏单个核细胞，体外进行不同细胞因子组合刺激，以IL-6+TGF-β诱导非致病性Th17（Non-pathogenic Th17，nTh17）细胞极化，以IL-6+TGF-β+IL-1β+IL-23诱导致病性Th17（Pathogenic Th17，nTh17）细胞极化，两组细胞分别于37℃，5%CO2孵箱中培养3天，3天后收集细胞进行流式染色，同时收集细胞培养上清进行ELISA检测。组间比较采用t检验。* P＜0.05，*** P＜0.001，**** P＜0.0001。
实验结果显示，GDCA干预可以降低nTh17细胞及pTh17细胞比例及其培养上清IL-17A水平（如图6A-6F所示）。
实施例五：GDCA在 Th17极化条件下可抑制糖酵解调控Th17细胞代谢重编程
为了进一步探究GDCA依赖性调节 T 细胞分化的机制，我们使用GDCA 处理以及DMSO溶剂处理的 Th17极化 T 细胞进行RNA 测序 (RNA-seq)。两组细胞分别于37℃，5%CO2孵箱中培养3天，3天后收集细胞，离心后收集细胞培养上清进行ELISA检测，细胞液氮速冻后进行RNA测序。各组间统计采用单因素方差分析。** P＜0.01， **** P＜0.0001。
实验结果显示，GDCA处理的Th17极化T细胞和对照Th17极化T细胞之间总共鉴定出458个差异表达基因（DEG）（如图7A所示）。在 Th17 特征基因中，与对照相比，GDCA处理组下调了包括葡萄糖转运蛋白Slc2a6（编码Glut-6）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、己糖激酶2（HK2）在内的几个糖酵解相关基因，以及TH17相关基因CCR5、il1r以及信号转导子和转录激活子4 (Stat4) 的基因的相对表达（如图7B所示）。京都基因和基因组百科全书 (KEGG) 通路分析发现，GDCA 处理组下调了糖酵解通、HIF-1通路、细胞增殖通路等（如图7C、7D所示）。编码Th17极化重要转录因子的基因的相对表达，包括RORγt（Rorc），并没有被GDCA下调。
T 细胞激活的早期阶段会诱导代谢转向并依赖有氧糖酵解。Th17是一种CD4+辅助性T细胞，在炎症反应中发挥调控作用时依赖糖酵解代谢。我们通过细胞能量代谢（Seahorse）检测技术评估存在或不存在GDCA 的情况下 T 细胞极化过程中代谢功能是否改变。在naive T细胞诱导Th17极化3天后，将细胞收集接种于细胞能量代谢培养板，通过seahorse细胞能量代谢分析仪检测线粒体压力和细胞糖酵解速率。我们观察到naive T细胞分化为TH17过程时耗氧率（OCR）有降低趋势，细胞外酸化率 （ECAR） 显著降低，GDCA处理极化的 Th17细胞基础糖酵解和补偿性糖酵解进一步受到抑制（如图7E-7H所示）。这些结果表明GDCA通过抑制极化的Th17细胞的糖酵解介导TH17细胞代谢重编程，进而抑制TH17的功能。
实施例六：GDCA对肠道菌群组成的影响
胆汁酸代谢物为宿主及肠道菌群之间重要的沟通桥梁，因此本研究进一步探索了GDCA对DSS诱导小鼠结肠炎模型肠道菌群的影响。按照实施例二的方式设置各实验组，进行肠道菌群成分分析，通过对各组小鼠粪便16S rRNA基因全长进行扩增以鉴定不同菌落组成。
实验结果显示，通过主成分分析（PCA），DMSO干预的DSS造模组相较于其他三组菌群组成具有显著分离性（P=0.001），而GDCA干预的DSS造模组群落组成与饮水组相比无统计学差异（如图8A所示）。菌群门水平分析发现DSS组小鼠肠道菌群较对照组（VE) 以及GDCA干预DSS组（DSSG）变形菌门丰度明显增加，而GDCA干预DSS组（DSSG）较DSS组和VE组显著增加疣微菌门（Verrucomicrobiota）丰度（如图8B-C所示）。具体到种水平分析发现阿克曼氏菌属（Akkermansia）是GDCA干预DSS组（DSSG）较VE以及DSS组显著增加的菌种（如图8D-E）。LEfSe分析及LDA分析也提示GDCA干预下DSS造模小鼠阿克曼氏菌丰度增加（如图8F-G所示，其中图8F中， DMSO处理组中e、f、g、h组分类群显著升高，GDCA处理组中a、b、c、d、i、j、k、l分类群显著升高）。因此，推测GDCA可能影响肠道菌群组成，并由此减轻DSS诱导小鼠结肠炎。
前面仅仅示出了本申请的原理，应理解，本申请的范围不预期限制在本文所述的示例性方面，而应包括所有当前已知的和未来开发的等同物。另外，应当指出，在不脱离本申请技术原理的前提下，还可以作出若干改进和修改，这些改进和修改也应被视为本申请的范围。
Claims (10)
1.一种标志物在制备炎症性肠病的检测产品中的用途，其中，所述标志物为甘氨脱氧胆酸和硫酸盐结合形式的甘氨脱氧胆酸。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述检测产品用于对样品中的所述标志物的含量或丰度进行检测。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述检测产品中包括所述标志物的检测试剂，优选的，所述检测试剂为检测所述标志物含量或丰度的试剂。
4.根据权利要求2所述的用途，其中，所述样品包括受试者的组织、体液或分泌物。
5.根据权利要求1所述的用途，其中，所述检测产品用于炎症性肠病的筛查、诊断、复发预测或治疗效果评估，优选的，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
6.根据权利要求1所述的用途，其中，所述检测产品选自试剂、试剂盒、试纸或诊断芯片。
7.一种用于检测炎症性肠病的试剂盒，其中包括检测标志物的试剂，所述标志物为甘氨脱氧胆酸和硫酸盐结合形式的甘氨脱氧胆酸。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂为检测所述标志物含量或丰度的试剂。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其用于检测受试者的组织、体液或分泌物。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其用于炎症性肠病的筛查、诊断、复发预测或治疗效果评估，优选的，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
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