CN116240143B - 一株用于促进骨骼发育的植物乳植杆菌及其微囊化制剂、制剂工艺和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株用于促进骨骼发育的植物乳植杆菌及其微囊化制剂、制剂工艺和应用，属于微生物技术领域，植物乳植杆菌YBT5保藏于中国典型培养物保藏中心，武汉，保藏日期为2022年10月19日，保藏编号为CCTCC NO：M20221594。本发明通过动物实验评估了植物乳植杆菌YBT5对小鼠骨密度及骨微观结构的促进作用；植物乳植杆菌YBT5显著提高了小鼠骨形成标记物，降低骨吸收标记物；植物乳植杆菌YBT5具有较强的改善肠道紊乱及免疫调节能力，植物乳植杆菌激活RANKL‑OPG‑RANK通路，抑制破骨细胞分化成熟的能力，展现了促进骨骼发育的功能。

Description

一株用于促进骨骼发育的植物乳植杆菌及其微囊化制剂、制 剂工艺和应用
技术领域
本发明涉及一株用于促进骨骼发育的植物乳植杆菌及其微囊化制剂、制剂工艺和应用，属于微生物技术领域。
背景技术
人体骨骼为肌肉、肌腱和韧带提供附着点，使其能够运动。骨骼还包含成人造血发生的微环境。骨骼在哺乳动物生理学中的重要作用通过再生修复骨的独特能力所维持。再生修复需要经历骨发生(bone modeling)和骨重建(bone remodeling)两个过程。骨发生是骨组织形态的形成及骨量逐渐增加的过程，能够增加骨的规模、形状和成熟度。而骨重建是通过骨形成(bone formation)和骨吸收(bone resorption)过程来去除和修复受损的骨骼，更新和维护骨，以维持骨骼的完整性和体内的矿物质平衡。骨发生和骨重建都包括骨吸收以及骨形成两个基本过程，在这两个过程中不同类型的骨细胞可以协同工作或单独工作以实现骨的形成或更新。在幼儿时期，骨发生和骨重建两个过程一直都在进行，而在成年期则以骨重建为主。骨重建的过程也是贯穿整个生命过程的持续活动，而这些过程需要多细胞参与、同步调节，以确保骨吸收和骨形成在同一位置顺序进行。在正常的机体中，骨吸收和骨形成过程是处于动态平衡的过程，一旦骨吸收和骨形成之间的平衡发生改变，可能会造成骨的代谢疾病。在健康的个体中，在最初的30年，骨形成一直持续增加，直到骨量达到峰值为止，这个骨量维持大约20年，待骨吸收开始超过骨形成则导致骨质量下降。
骨骼形成会受到遗传、营养、健康和环境等诸多方面因素的影响。骨骼的形成从胚胎发育开始，在儿童及青少年时期，骨量会随着年龄的增长而增加，直至青年时期，骨骼发育成熟，骨量达到峰值。而峰值骨量的增加会降低以后生活中发生骨质疏松症的风险，生长期最大骨量增加10％将降低骨质疏松症性骨折的危险性降低50％。因此，在生命的早期，尤其是在婴儿期，儿童期和青春期，通过饮食和营养改善骨骼的生长可对生命后期骨骼健康起到巨大作用，在生长期提高骨量峰值对维持青少年骨健康具有重要意义。此外一些中老年常伴有骨质疏松等代谢性骨病，其特点有：骨组织微观结构破坏增加，骨量低，导致骨质脆弱，极易发生骨折。然而，我国50岁以上人群骨质疏松症患病率为19.2％，中老年女性骨质疏松问题尤为严重，65岁以上女性骨质疏松患病率高达51.6％，与过去相比日益严重。但在临床中骨质疏松症的治疗率较低，数据显示：只有10％患有脆性骨折的老年女性实际接受了骨质疏松的治疗。骨质疏松已成为我国面临的重要公共健康问题，患病人群庞大，以中老年女性患者为主，却并未受到足够重视。
截至目前，市面常见的促进骨骼发育的药物大多为维生素、矿物质等功能活性物质，通过过量摄入刺激机体吸收，影响骨骼矿化来促进骨形成。然而，机体对这些功能活性物质的过度摄入有一定的副作用，中国营养学会制定的“中国居民膳食营养素参考摄入量”中也规定了如：成人镁适宜摄入量为350mg/d、成人磷适宜摄入量为700mg/d，成人维生素D最高摄入400IU/d等，过量摄入维生素D可能会导致恶心和呕吐腹痛，食欲不振，腹泻，便秘，昏迷，过度口渴，排尿增加，头痛等。
故亟需一种高效、安全的促进骨骼发育的新制剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一株通过抑制破骨细胞分化促进骨骼发育的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)YBT5。
同时，本发明提供一株植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)YBT5的微囊化制剂，该制剂能够保护植物乳植杆菌YBT5免受胃酸环境侵蚀与胆汁盐对菌株细胞膜的影响，提高生物利用度，更大程度发挥菌株的生理功能。
同时，本发明提供一株植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)YBT5的微囊化制剂工艺，该制剂工艺封装效果好，能够更好地耐受胃肠道中的恶劣环境，对封装的益生菌具有显着的保护作用。
同时，本发明提供一种植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂在制备促进骨骼发育药物中的应用。
同时，本发明提供一种植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂在制备调节肠道菌群代谢物中的应用。
同时，本发明提供一种植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂在制备改善肠道紊乱及免疫调节药物中的应用。
同时，本发明提供一种植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂在制备保护肠道屏障药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一株用于促进骨骼发育的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)YBT5，所述植物乳植杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，武汉，保藏日期为2022年10月19日，保藏编号为CCTCC NO：M20221594。
一株用于促进骨骼发育的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)YBT5的微囊化制剂工艺，包括以下步骤：
S01，在1wt％藻酸盐和4wt％大豆蛋白的pH＝7.0的水性混合物中接种1wt％的植物乳植杆菌YBT5悬浮液，搅拌均匀，获得混合物；
S02，将混合物在低速搅拌的条件下注入喷雾干燥喷嘴中；喷雾干燥过程的条件为：喷嘴直径0.7mm，吸气器压力90％，雾化器压力600nL/h，流速5mL/min，获得益生菌微粒；
S03，将从喷雾干燥机的旋风分离器收集的益生菌微粒引入3wt％的CaCl2水溶液中，CaCl2水溶液的用量至少没过益生菌微粒，然后在室温下连续搅拌1小时，制备获得交联的大豆蛋白藻酸盐微粒，并且交联的大豆蛋白藻酸盐微粒内包封有植物乳植杆菌YBT5，即获得了胶囊化益生菌；
S04，离心，从CaCl2水溶液中获得胶囊化益生菌，用无菌水洗涤，冷冻，冻干，得到植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂。
S01中，植物乳植杆菌YBT5悬浮液的获得方法为：
将冻存于-80℃条件下的植物乳植杆菌YBT5以2％的接种量接种在MRS培养基中，37℃培养24h，连续培养两代，37℃培养18h备用；
取上述活化、备用的植物乳植杆菌YBT5，通过以1500转离心10分钟收获植物乳植杆菌YBT5，并用无菌0.1wt％蛋白胨水洗涤两次，将洗涤后的沉淀用250μL磷酸盐缓冲盐水PBS，pH＝7.4稀释至最终植物乳植杆菌YBT5浓度为107CFU/mL的植物乳植杆菌YBT5悬浮液。
S01中，搅拌均匀的方法为：在室温下、在磁力搅拌器上以600rpm搅拌30分钟；S02中，低速搅拌速率为200rpm；S03中，搅拌速率为800rpm。
S04中，离心工艺为：2300rpm离心5分钟；洗涤，冷冻，冻干工艺为：洗涤三次，在-20℃下冷冻，并在7Pa和-50℃下冻干24小时。
微囊化制剂工艺获得的植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂。
植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂在制备促进骨骼发育药物中的应用。
植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂在制备调节肠道菌群代谢物中的应用。
植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂在制备改善肠道紊乱及免疫调节药物中的应用。
植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂在制备保护肠道屏障药物中的应用。
本发明所使用的乳杆菌作为益生菌的主要来源，是被公认为安全的食品级微生物，因此筛选出一株能够高效缓解炎症的乳杆菌，以开发高效、安全的促进骨骼发育的天然药物。植物乳植杆菌是乳酸菌的一种，乳酸菌作为革兰氏阳性菌，通常从酸奶、泡菜等发酵食品中分离，是益生菌的主要来源。乳杆菌除了在食品中得到广大应用，已被证明可有效预防或治疗各种疾病，例如免疫调节、降胆固醇、抗肿瘤等益生功能。乳杆菌可通过黏附定植到肠道，调整肠道微生物结构，激活机体免疫，从而发挥出相应的益生功能。然而由于胃肠道酸性环境的影响，单独补充益生菌菌株存活率低，难以发挥其生物活性。本发明以植物乳植杆菌YBT5为研究对象，使用大豆蛋白与藻酸盐微囊化工艺制备植物乳植杆菌YBT5菌剂，并研究其对小鼠骨骼发育的影响以及可能的机制，为开发具有促进骨骼发育的功能性乳杆菌提供理论基础和数据支持。
本发明具有以下有益效果：
1.大豆蛋白与藻酸盐微囊化工艺具有保护保护菌株核心免受胃酸环境的影响，并避免胆汁盐对菌株细胞膜的有害影响。
2.植物乳植杆菌YBT5具有调节肠道菌群代谢物的作用，增加了小鼠体内短链脂肪酸丁酸的水平。
3.植物乳植杆菌YBT5具有改善肠道紊乱及免疫调节的作用。改善结肠炎症评分及免疫应答紊乱包括降低促骨炎性细胞因子IL-6、IL-1、TNF-α的含量，并升高抗炎性细胞因子IL-10的含量。
4.植物乳植杆菌YBT5具有保护肠道屏障的作用，抑制异硫氰酸荧光素(FITC)和血清内毒素水平的应用，以及增大紧密连接蛋白Claudin-2、Claudin-3、ZO-1基因的表达水平，促进营养物质高效消化吸收。
5.植物乳植杆菌YBT5具有促进骨细胞骨形成的作用，促进骨形成标记物PINP、OCN和BALP水平的升高。
6.植物乳植杆菌YBT5具有促进骨细胞骨形成的作用，诱导激活RANKL(核因子κB受体激活物配体)/RANK(NF-κB受体激活子)/OPG(骨保护蛋白)信号通路，增大RANKL与OPG结合、降低RANKL与RANK结合后释放的转录活化信号，抑制破骨细胞分化成熟，进而抑制骨吸收，促进骨骼发育。
7.本发明公开了一种新的植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂的应用、植物乳植杆菌在调节肠道菌群中的应用、在改善肠道紊乱及免疫调节中的应用、在保护肠道通透性的应用、在通过“肠骨轴”促进骨平衡中骨形成的应用、在通过“肠骨轴”抑制骨平衡中骨吸收的应用、在促进骨密度及骨微观结构中的应用。本发明通过动物实验评估了植物乳植杆菌YBT5对小鼠骨密度及骨微观结构的促进作用；植物乳植杆菌YBT5显著提高了小鼠骨形成标记物，降低骨吸收标记物；植物乳植杆菌YBT5具有较强的改善肠道紊乱及免疫调节能力，植物乳植杆菌激活RANKL-OPG-RANK通路，抑制破骨细胞分化成熟的能力，展现了促进骨骼发育的功能。
附图说明
图1为小鼠体外消化模拟结果图；SSF表示模拟唾液2分钟，SGF表示模拟胃液2小时，SIF表示模拟肠液3小时；
图2为小鼠骨密度及骨微观结构图定量分析图；注：(A)BMD定量分析，(B)骨体积分数BV/TV，(C)骨小梁厚度Tb.Th，(D)骨小梁数量Tb.N，(E)骨小梁空间度Tb.Sp；不同小写字母表示各组差异性显著(P<0.05)；
图3为小鼠骨形态计量学分析；注：(A)骨形成率(bone formation rate，BFR/BS)、(B)矿化沉积率(mineral apposition rate，MAR)、(C)矿化表面(mineralizing surface，MS/BS)、(D)成骨细胞表面(osteoblast surface，Ob.S/BS)；不同小写字母表示各组差异性显著(P<0.05)；
图4为小鼠肠道菌群代谢物丁酸、丙酸含量图；注(A)为结肠内容物中丁酸的含量、(B)为结肠内容物中丙酸的含量；不同小写字母表示各组差异性显著(P<0.05)；
图5为各组处理对小鼠相关促炎及抗炎因子基因表达水平的影响；注：(A)小肠IL-1表达水平，(B)小肠IL-6表达水平，(C)小肠IL-10表达水平，(D)TNFα表达水平；不同小写字母表示各组差异性显著(P<0.05)；
图6为各组处理对小鼠肠道屏障能力的影响；注：(A)血清FITC-葡聚糖水平，(B)血清内毒素含量，(C)紧密连接蛋白2表达水平，(D)紧密连接蛋白3表达水平；不同小写字母表示各组差异性显著(P<0.05)；
图7为各处理组对骨相关标记物表达水平的影响；注：(A)血清中Ⅰ型前胶原N末端前肽含量，(B)血清骨钙素含量，(C)碱性磷酸酶含量，(D)血清中Ⅰ型胶原交联C-末端肽含量，(E)酸性磷酸酶含量；不同小写字母表示各组差异性显著(P<0.05)；
图8为各处理组小鼠骨形成及骨吸收相关因子表达水平的影响。注：(A)Osterix表达水平，(B)RUNX2表达水平，(C)OPN表达水平，(D)RANKL/OPG表达水平；不同小写字母表示各组差异性显著(P<0.05)；
图9为植物乳植杆菌YBT5对RAW264.7细胞增值分化成破骨细胞的影响。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
本发明中，植物乳植杆菌YBT5的拉丁名为Lactiplantibacillus plantarumYBT5，保藏于中国典型培养物保藏中心，武汉，保藏日期为2022年10月19日，保藏编号为CCTCC NO：M20221594。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1供试菌株
植物乳植杆菌YBT5由分离自传统酸奶。
1.1.2实验动物
健康5周龄的C57BL/6小鼠(n＝40)从北京维生河实验动物技术有限公司购买。在整个实验过程中，所有小鼠均在12小时的光/暗循环(湿度45±5％，温度22±2℃)下饲养，并可自由获取标准实验室食物和水。
1.1.3培养基
1.1.3.1MRS培养基：蛋白胨5.0g，胰蛋白胨10.0g，乙酸钠5.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80 1.0g，硫酸锰0.25g，柠檬酸氢二铵2.0g，硫酸镁0.58g，磷酸氢二钾2.0g，牛肉膏5.0g，用蒸馏水定容至1L，调节pH至5.8，121℃条件下灭菌15min。
1.1.3.2色氨酸培养基：按照上述MRS培养基配方的剂量溶解于800mL蒸馏水，调节pH至5.8，121℃条件下灭菌15min。称取2g色氨酸加入200mL无菌水中，使其充分溶解，用0.22μm水系滤膜过滤除菌之后加入灭完菌的MRS培养基，混匀后即为色氨酸培养基。
1.1.4主要试剂：Ⅰ型前胶原N末端前肽试剂盒、骨碱性磷酸酶试剂盒、骨酸性磷酸酶试剂盒、Ⅰ型胶原交联C-末端肽试剂盒、骨钙素试剂盒、RANKL试剂盒、OPG试剂盒、Osterix试剂盒、RUNX2试剂盒和骨桥蛋白(OPN)试剂盒购自北京诚林生物科技有限公司；白细胞介素1(IL-1)试剂盒；白细胞介素6(IL-6)试剂盒；白细胞介素10(IL-10)试剂盒；肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒。
1.1.5仪器与设备：LDZF-50KB-II立式压力蒸汽灭菌器；VD-1320型洁净工作台；DHP-9272型电热恒温培养箱；HPG-9245烘箱；涡旋振荡器；Lambda Bio35紫外-可见分光光度计；Model 680型酶标仪；PHS-25型pH计；GL-21M高速冷冻离心机；0.22μm滤膜。万分之一电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；电热恒温水浴锅，天津莱斯特仪器有限公司；电冰箱，青岛海尔股份有限公司；涡旋振荡器，惟沃索科技术(北京)有限公司；离心机，上海化工机械公司；超低温冰箱，美国ThermoFisher公司；SEM JSM-5300型电子显微镜和SEMJFC-1100E型溅射涂布机，日本东京JEOL有限公司。MicroμCT ZKKS-MCT-SHARP显微CT仪；全自动生化分析仪，日本日立公司，全系列Eppendorf移液器，购自德国Eppendorf公司；徕卡DM4B显微镜；8890-7000DGC-MS气质联用仪。
1.2实验方法
1.2.1菌株活化与培养
将冻存于-80℃条件下的植物乳植杆菌YBT5以2％的接种量接种在MRS培养基中，37℃培养24h，连续培养两代，37℃培养18h备用。
1.2.2微囊化植物乳植杆菌YBT5制剂的制备
1.2.2.1植物乳植杆菌YBT5菌悬液的准备
取上述活化、备用的植物乳植杆菌YBT5，通过以1500转离心10分钟收获细胞(去除培养基)，并用无菌0.1wt％蛋白胨水洗涤两次。将洗涤后的沉淀用250μL磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)稀释至最终细胞浓度约107CFU/mL的植物乳植杆菌YBT5悬浮液。
1.2.2.2微囊化工艺步骤
采用喷雾干燥法制备包封植物乳植杆菌YBT5的大豆蛋白(SPI)藻酸盐微粒。具体而言，在1wt％藻酸盐和4wt％大豆蛋白(pH＝7.0)的水性混合物中接种1wt％的植物乳植杆菌YBT5悬浮液(植物乳植杆菌YBT5负荷约为7log CFU/mL)，并通过在室温下、在磁力搅拌器(600rpm)上搅拌30分钟而均匀化。将所得混合物在磁力搅拌器(200rpm)上保持低速搅拌，注入喷雾干燥喷嘴中，并使用自动注入/抽出泵(型号6530r 096 3.1a/ph 9407；瑞士Sonceboz-Sombeval Sonceboz SA)连续喷洒。喷雾干燥过程的条件为：喷嘴直径0.7mm，吸气器压力90％，雾化器压力600nL/h，流速5mL/min，获得益生菌微粒。按照实验设计的规定，将从旋风分离器收集的益生菌微粒引入3wt％的CaCl2水溶液中，CaCl2水溶液的用量没过益生菌微粒即可，然后在室温下连续搅拌(800rpm)1小时，制备获得交联的大豆蛋白藻酸盐微粒，并且交联的大豆蛋白藻酸盐微粒内包封有植物乳植杆菌YBT5，即获得了胶囊化益生菌。离心(2300rpm，5分钟)，从CaCl2水溶液中获得大豆蛋白藻酸盐微粒，用无菌水洗涤三次，在-20℃下冷冻，并在7Pa和-50℃下冻干24小时得到植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂，继续冷冻，备后续动物实验使用。
为验证包封效果，另制备单独植物乳植杆菌YBT5粉剂。单独植物乳植杆菌YBT5粉剂的制备方法如下：1wt％的植物乳植杆菌YBT5悬浮液注入喷雾干燥喷嘴中，以喷嘴直径0.7mm，吸气器压力90％，雾化器压力600nL/h，流速5mL/min，获得单独植物乳植杆菌YBT5微粒。
1.2.2.3植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂体外消化模拟
将12.0mg NaCl、15.0mg KCl、100.0mg粘蛋白和7.5mgα-淀粉酶溶解在50.0mL蒸馏水中，制备人工唾液(SSF)。分别在植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂(0.2g，储存在4℃)和0.2mL植物乳植杆菌YBT5悬浮液中加入人工唾液SSF(10mL)，置于摇瓶中，并以50rpm连续搅拌，同时在37℃下孵育2分钟，离心，获得人工唾液消化后的植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂和游离植物乳植杆菌YBT5。将12.0mgNaCl、15.0mg KCl和100.0mg粘蛋白与7.5mg人唾液中的α-淀粉酶混合制备人工胃液(SGF)，将混合物溶解在50.0mL蒸馏水中，加入0.1M HCl调节pH至3.0，获得人工胃液(SGF)。然后将人工唾液消化后的植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂和游离植物乳植杆菌YBT5分别加入到制备的人工胃液SGF(10mL)中，置于摇床上，并在50℃下孵育的同时以2rpm连续搅拌2小时，获得人工胃液消化后的植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂和游离植物乳植杆菌YBT5。人工肠液(SIF)由4.0mg/mL胆汁提取物、2.0mg/mL胰蛋白酶和1.0mg/mL脂肪酶置于调节至pH1的8.0M PBS中，含0.1M HCL制备。将收集的人工胃液消化后的植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂和游离植物乳植杆菌YBT5分别放入制备的人工肠液SIF(10mL)中。在37℃振荡器中孵育3小时后，获得人工肠液消化后的植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂和游离植物乳植杆菌YBT5，活菌计数测定单位为log CFU/mL。
1.2.3小肠、结肠、胫骨及血清中RNA的提取
每只小鼠取20毫米的十二指肠，浸泡在1毫升RNAISO(北京塔卡拉)中。十二指肠样品在液氮中保存5分钟。每只小鼠取右侧完整胫骨，不粘连肌腱或肌腱，立即保存在80℃。粪便样本(>0.8g/只)在腐坏前收集，立即在80℃保存。简而言之，将样品在液氮中研磨成粉末，并悬浮在含有400μL缓冲液R-I.溶液的1.5mL管中，并在管中加入缓冲液R-II.，涡旋15-30秒，并以13000rpm离心5分钟。将上清液放入新的1.5mL管中，然后加入500μL异丙醇。将混合物转移到制备管中，通过溶液W1和溶液W2多次洗涤、纯化提取的RNA。溶液W1为0.9％生理盐水；溶液W2为75％乙醇。
1.2.4细胞培养与诱导
将RAW264.7细胞接种于12孔板(104个细胞/孔)中，加入50ng/mL RANKL诱导分化。分化后的RAW264.7细胞在第3天与不同浓度的植物乳植杆菌YBT5悬浮液共培养。本研究分为以下四组：无RANKL的细胞培养；50ng/mL RANKL细胞培养；50ng/mL RANKL和106CFU/孔YBT5细胞培养；50ng/mL RANKL和107CFU/孔YBT5细胞培养。第4天，用含有相同浓度植物乳植杆菌YBT5悬浮液的新鲜的MRS培养基代替细胞培养基。第5天将细胞固定并染色。
1.2.5细胞染色
抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测破骨细胞分化情况，每个样本在8个视场中计数TRAP阳性多核细胞(>3核)，并将其视为破骨细胞。使用徕卡DM4B显微镜在200倍率下观察细胞，并使用徕卡生物系统公司提供的设备捕捉和分析图像，记录细胞增值分化程度。
1.2.6动物实验
1.2.6.1动物试验设计
每笼饲养3只小鼠。驯化一周后，将小鼠分为三个步骤进行处理。第一步，使用抗生素建立伪无菌小鼠模型。将所有小鼠进行抗生素处理，共40只小鼠。第二步，抗生素处理后，进行婴儿粪便移植阶段。根据世界卫生组织的儿童生长标准的规定，划分为健康发育状况的婴儿和发育不良婴儿，收集相应粪便。将所有小鼠随机分为五组。一组进行健康婴儿粪便移植(粪便悬液的制备方法为：在志愿者家中收集婴儿粪便，新鲜粪便放入无菌收集管中，迅速放入冰箱，24h内利用冰盒转移至实验室内的-80℃冰箱保存，通过在厌氧条件下，在含15％甘油(v/v)的10mL PBS中稀释1g冷冻的婴儿粪便样品用来制备粪便悬液。然后将粪便悬液涡旋悬浮，并分装储存在-80℃冰箱内，每天一次通过灌胃法给小鼠0.2mL粪便悬液)，共8只小鼠；剩余小鼠进行发育不良婴儿粪便移植，共32只小鼠。第三步，健康婴儿粪便移植后，提供PBS缓冲液并命名为正常组；发育不良婴儿粪便移植后，将其随机分为四组(每组8只)，一组提供PBS缓冲溶液为对照组。一组灌胃市售钙片药剂(国药准字H23020997)，灌胃剂量根据《药理实验方法学》把人的临床剂量转换为实验动物的剂量，结果为每次0.03g，钙片药剂研磨溶解于PBS缓冲液为阳性实验组。灌胃106-107CFU植物乳植杆菌YBT5悬浮液为菌液组，灌胃植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂1g为制剂组，植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂溶解于PBS缓冲液中后进行灌胃。具体分组见表1。
表1实验设计方案
1.2.6.2疾病活动指数(DAI)的测定
在小鼠造模及灌胃期间每天观察记录小鼠的生长状态，包括眼神毛发、体重变化、粪便形状及便血状况。参照Joh的评分方法，计算小鼠的疾病活动指数DAI，评分细则如表2所示。
表2DAI评分细则
1.2.6.3样本收集
小鼠最后一次灌胃后，空腹16h后并称重，用乙醚麻醉小鼠并人道处死，眼球取血。分离小鼠器官并称重，以获得器官质量。收集小鼠血样并离心(2300rpm，4℃)以获得血清，用于生化测量和免疫研究。收集肠道内容物于无菌冻存管中，并储存在-80℃中，进行肠道微生物组分析。
1.2.6.4小鼠器官指数的测定
小鼠解剖后，分离心脏、脾脏、肝脏、肾脏，用生理盐水清洗并用滤纸吸干表面水分，然后迅速称量。器官指数(％)＝器官重量(g)/体重(g)×100。
1.2.6.5小鼠结肠组织病理评估
小鼠远端结肠(距肛门1cm处)1cm浸泡于甲醛中固定组织，然后石蜡包埋切片，经二甲苯脱蜡后染色，用于结肠组织病理评估，组织学评分按照以下标准，轻度损伤(1分)：由黏膜表层至隐窝基部局部正常结构消失，尚存少数杯状细胞，损伤占肠道横断面1/4左右范围；中度损伤(2分)：黏膜全层固有的正常结构消失，结缔组织增生及炎性细胞浸润，黏膜下层水肿及炎性浸润，损伤连续性或续断性占肠道横断面1/3左右范围；重度损伤(3分)：损伤特征同中度损伤，损伤连续性或续断性占肠道横断面1/2左右范围。
1.2.6.6生化分析
称取适量的血清，根据制造商的说明，使用酶联免疫分析试剂盒测定小鼠血清样品中的白细胞介素IL-1、IL-6、IL-10和TNFα等骨相关炎症因子。
1.2.6.7上皮屏障完整性分析
基于异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖吸收的体内检查肠上皮细胞旁通透性。最后一次灌胃的同时，小鼠用口服强饲法、用500μL 22mg/mL 4kDa FITC-葡聚糖(上海元业生物科技)处理。使用多检测酶标仪(SpecpraMax X3)在485nm和535nm的波长下测定血清FITC-葡聚糖浓度。
1.2.6.8菌群代谢物丁酸、丙酸含量的分析
通过8890-7000D GC-MS，气质联用测定肠道内容物中的短酸水平。准确称取0.8000g(精确到0.01g)肠道内容物放入粪便样本盒中，通过粪便处理仪配制10％悬浊液。取500μL悬浊液与100μL巴豆酸偏磷酸溶液混合，-30℃冻结24h，解冻后8000rpm、4℃离心3min去除蛋白质等杂质，取上清用0.22μm水系过滤器过滤后上机测定。仪器程序设定如下：使用HP-5ms色谱柱，进样量1μL，分流模式选择脉冲分流(10psi，10：1)，隔垫吹扫流速3mL/min，载气为氦气，色谱柱流速1mL/min，柱箱升温程序为在40℃保持2分钟；15℃/min升温至150℃，保持1分钟；30℃/min升温至300℃，保持5分钟。前进样口温度260℃，传输线温度280℃，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电离电压70eV，采集模式选择SIM模式，溶剂延迟3.8min。SIM模式下丁酸保留时间为7.32min，定量离子145(m/z)，定性离子75，117，145。丙酸保留时间6.2min，定量离子131(m/z)，定性离子75，131。用标品溶液获得标准曲线，用MultiQuant 3.0.2软件进行峰值测定、峰面积积分和标准品的校准曲线分析，定量丁酸与丙酸含量。
1.2.6.9骨转换标记物及相关因子的测定
称取适量血清，根据制造商的说明，严格按照试剂盒说明书要求检测小鼠的骨形成标记物PINP、OCN和BALP，骨吸收标记物CTX-I，TRACP及骨相关因子Osterix、RUNX2、OPN、RANKL与OPG。
1.2.6.10微型计算机体层摄影术、生物力学检测与骨形态计量学分析
显微CT球管参数按照以下参数设置：微焦斑X光源，焦斑5μm、工作电压60KVP、工作功率40W、光束锥角45°；空间分辨率：15μm、图像矩阵4096′4096；视野：单次扫描10mm′10mm(min)，以360°角度获取连续的断面μCT(微焦点CT)图像(沿着大鼠股骨干方向扫描远端股骨)，电脑软件自动重建骨组织三维图像。扫描结束后，利用软件截取股骨远端距离生长板下1mm处截取厚层为5mm的范围和距离股骨远端生长板6mm处截取厚层为1mm的范围作为数据分析的感兴趣区(range of interests ROI)，图像系统采集数据后利用机载软件自动分析骨参数，主要检测参数如下：骨密度(Bone mineral density，BMD，mg/cm3)、骨体积分数(percentage of bone volume，BV/TV，％)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th，mm)、骨小梁数量(trabecular number，Tb.N，mm-1)、骨小梁空间度(trabecular spacing，Tb.Sp，mm)、骨皮质厚度(cortical thickness，Ct.Th，mm)。用纹理分析仪测量股骨骨干的生物力学性能(弯曲应力、弯曲载荷和杨氏弯曲模量)。
骨形态计量学分析方法如下：在处死前的第7天和第2天，给小鼠皮下注射钙黄素。使用Leica RM2155切片机沿正面从甲基丙烯酸甲酯塑料嵌入块上切下非连续纵向切片(5mm厚)，并用Goldner三色染色进行静态测量。另外10mm厚的切片未染色，用于动态(荧光)测量。测量的松质骨面积约为2.5mm2，仅包含次级海绵，位于股骨骨骺生长软骨附近0.5–2.5mm。使用Osteomeasure软件分析染色切片图得到骨骼重建参数，矿化表面(mineralizing surface，MS/BS)、矿化沉积率(mineral apposition rate，MAR)、骨形成率(bone formation rate，BFR/BS)和成骨细胞表面(osteoblast surface，Ob.S/BS)。
1.2.7数据处理
实验数据均以平均数±标准差来表示，至少重复3次，采用SPSS18.0软件对不同组之间的数据进行单因素方差，Spearman相关系数用于评价两个统计变量的相关性，并用GraphPad Prism 5.0和Origin 9.0软件进行作图，P<0.05为统计学上有显著差异。
2结果与分析
2.1YBT5微囊化制剂体外模拟消化实验分析
为了优化其在宿主中的有益作用，益生菌必须在人类胃肠道的恶劣条件下存活足够长的时间才能到达肠道。因此，使用模拟的人工唾液(SSF)、人工胃液(SGF)和人工肠液(SIF)进行消化。结果如图1所示，在人工唾液(SSF)中2分钟后，与初始活力计数相比，游离细胞(即植物乳植杆菌YBT5悬浮液)和微胶囊(即YBT5微囊化制剂)的活性没有显著降低；将被唾液消化的游离和微囊化植物乳植杆菌YBT5置于人工胃液(SGF)中2小时。微胶囊和游离植物乳植杆菌YBT5的活性均显著降低，但微胶囊的活性损失显著小于游离细胞；分别收集人工胃液中未完全消化的微胶囊和游离细胞，放入模拟人工肠液(SIF)中进一步消化3h，评估细胞活性。与人工胃液(SGF)消化类似，游离细胞和微胶囊的活性显着降低，细胞间无明显差异；由以上结果可知，微胶囊更好地耐受胃肠道中的恶劣环境，对封装的益生菌具有显着的保护作用。
2.2小鼠器官指数分析
小鼠经过抗生素，粪菌移植，灌胃钙制剂、YBT5悬浮液、YBT5制剂后，器官脏体比见表3，如表所示，本研究所采用的实验方法没有对各组脏体比产生影响，可见本研究的实验方法是安全可行的。
表3小鼠脏体比
2.3植物乳植杆菌YBT5对骨密度及骨微观结构的影响
密度测定对于各种原因所致骨质疏松症，灵敏度高，诊断率高。骨密度测定有助于协助诊断骨质疏松症。骨密度(BMD)是最有效的骨折风险预测指标，骨折风险与骨密度呈几何级数关系。骨密度(BMD)的变化可以用骨密度仪来监测。骨体及分数(BV/TV)是皮质骨和松质骨骨量评价常用指标，对于髓腔内松质骨而言，该比值能够反应不同样本骨小梁骨量的多少，该值增高说明骨合成代谢大于分解代谢，骨量增加，反之亦然，从而能够间接反应骨代谢状况。骨小梁是皮质骨在松质骨内的延伸部分，即骨小梁与皮质骨相连接，在骨髓腔中呈不规则立体网状结构，如丝瓜络样或海绵状，起支持造血组织的作用。骨小梁连接而成的多孔网架结构，按应力曲线规律性排列，具有非均匀的各向异性，这种排列能增加骨强度，可以说，骨小梁的骨质量与其微结构密切相关从骨小梁的微结构可计算得到骨小梁数(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁分离度(Tb.Sp)，这些是评价骨小梁空间形态结构的主要指标。在骨分解代谢大于骨合成代谢时情况下，比如发生骨质疏松时，Tb.N和Tb.Th数值减少；Tb.Sp数值增加。
为了评价植物乳植杆菌YBT5对小鼠骨骼发育的影响，采用Micro-CT扫描股骨，分析骨密度和骨微结构数据按Shapiro-Wilk正态性检验正态分布。结果如图2所示，相比于正常组小鼠，灌胃发育不良婴儿粪便的对照组小鼠，其骨密度及骨微观结构显著恶化，这说明我们成功构造了骨骼发育受损的小鼠模型。在实验组的处理中，相比于对照组小鼠，菌液组逆转了灌胃发育不良婴儿粪便所导致的BMD、BV/TV、TB.TH、TB.N降低与TB.SP的升高，与阳性实验组的治疗效果相当(P>0.05)。然而制剂组小鼠的治疗效果超过了阳性实验组，差异具有显著性(P<0.05)，这可能是因为制剂组中微胶囊能够保护植物乳植杆菌YBT5免受胃酸环境侵蚀与胆汁盐对菌株细胞膜的影响，提高生物利用度，更大程度发挥了该菌株的生理功能。
为了评估各处理组在增加骨密度防止骨折方面的作用，我们对小鼠股骨标本进行生物力学测试。结果见表4，对照组的杨氏弯曲模量较正常组显著降低(P<0.05)，而菌液组可以显著提高小鼠的抗弯强度与杨氏弯曲模量(P<0.05)。与菌液组相比，制剂组能够显著提高小鼠的抗弯强度与杨氏弯曲模量(P<0.05)，且显著高于阳性实验组(P<0.05)。
由以上结果可知，植物乳植杆菌YBT5能够显著提高小鼠的骨密度及骨微观结构，增加骨抗骨折的能力，且经制剂工艺处理后，这种治疗效果更为显著并超过了补充钙元素的效果。
表4骨生物力学分析
注：数据表示用平均值±标准差；同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
根据μCT扫描和骨微观结构测定，我们得到了基于骨骼空间物理结构的骨骼发育情况，根据骨生物力学测试得到了骨宏观力学效应情况。为了进一步观察植物乳植杆菌YBT5对骨骼发育的影响，我们又对骨骼进行了骨形态计量学分析，可以提供骨骼重建中细胞层面的解答。结果如图3所示，骨形成率代表骨表明形成的活跃程度，在植物乳植杆菌YBT5干预后，菌液组和制剂组小鼠的骨形成率较对照组小鼠显著提高(P<0.05)，制剂组的骨形成率水平较阳性对照组显著提高(P<0.05)。矿化沉积率代表小鼠骨骼每天矿化的宽度，反映骨矿化的快慢，成骨细胞的活性，在植物乳植杆菌YBT5干预后，菌液组和制剂组相较于对照组小鼠的矿化沉积率显著提高(P<0.05)，且制剂组的矿化沉积率显著高于阳性对照组(P<0.05)。矿化表面反映骨小梁矿化表明占总骨小梁表面得到百分比，在植物乳植杆菌YBT5干预后，菌液组和制剂组的矿化表面相较于对照组显著提高(P<0.05)。成骨细胞表面代表成骨细胞占骨表面的百分比，在植物乳植杆菌干预后，菌液组和制剂组小鼠的成骨细胞表面较对照组小鼠显著提高(P<0.05)，制剂组和空白对照组的结果无显著性差异(P>0.05)。以上结果表明，植物乳植杆菌YBT5制剂可以通过提高骨形成率、矿化沉积率、矿化表面、和成骨细胞表面来促进骨骼发育。
2.4植物乳植杆菌在调节肠道菌群代谢物中的作用
人体摄入的食物可被肠道菌群分解代谢，参与调节机体生理功能。短链脂肪酸主要由由羧酸和小烃链组成，通过肠道菌群发酵食物中的难消化碳的水化合物(主要是膳食纤维)而产生，是肠道代谢物中最重要的成分之一。短酸可以通过多种机制影响骨代谢，包括直接抑制OC分化、通过调节性T细胞(Tregs)促进OB分化以及通过多种途径促进Ca吸收。丁酸与丙酸作为短酸的主要成分，可能是上述机制的介导物质。我们通过研究结肠内容物中丁酸与丙酸的水平，观察植物乳植杆菌在干预小鼠肠道菌群后所产生的代谢物水平上的影响。结果如图4所示，丁酸水平在植物乳植杆菌YBT5干预后显著提高(P>0.05)，阳性对照组丁酸水平偏低，可能是由于摄入单纯的钙元素在胃肠道过量积累，阻碍肠道菌群对于食物的代谢效率，使其低于正常组小鼠的丁酸水平，菌液组和制剂组在统计学上为表现出显著差异，但在平均值水平上，制剂组存在微弱的领先效果。丙酸水平在植物乳植杆菌YBT5干预后，与正常组未表现出显著差异(P>0.05)。以上结果表明，植物乳植杆菌YBT5干预后，对小鼠肠道菌群存在调节作用，使分解代谢丁酸的菌属富集，增大丁酸物质的水平，丁酸又进一步通过某种机制影响骨代谢。
2.5植物乳植杆菌YBT5调节肠道紊乱及免疫调节
2.5.1DAI评分
DAI可以反映出小鼠体重变化、大便状态以及便血情况三个方面的总体特征，DAI评分越高，说明肠炎症状越明显。正常组小鼠的粪便正常，DAI评分几乎为0，生长状态良好；对照组小鼠从第20天开始大便出现血迹，体重开始下降，部分血迹黏附肛门，DAI分值达到最大值；阳性实验组小鼠从第16天开始便血，粪便状态较差，DAI评分较高；菌液组与制剂组小鼠的粪便正常，生长状态良好，DAO评分几乎为0。以上结果说明，植物乳植杆菌YBT5能够改善发育不良婴儿粪菌带来的低水平健康特征。
2.5.2骨相关炎症因子水平
炎症性肠病(IBD)的特点是严重的胃肠道炎症，部分是由异常的先天性和获得性免疫反应介导的。此外，克罗恩病和溃疡性结肠炎患者所经历的炎症经常影响肠外部位。多达40％的IBD患者出现肠外症状，几乎每种组织类型都可能在结肠炎发作之前、并发或之后出现这种症状。骨质流失是常见的肠外症状之一，几乎在所有肠道炎症模型中都可以观察到显著的骨质流失。骨质流失与破骨细胞密切相关，而破骨细胞及其前体对炎症细胞因子，如白细胞介素(IL-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-a)、趋化因子等非常敏感，可以进一步调节破骨细胞分化和功能。为了评估肠道炎症水平，我们检测了肠道促炎和抗炎细胞因子的表达谱。结果如图5所示，对照组与阳性实验组小鼠的促炎性细胞因子IL-1、IL-6和TNFα与正常组相比显著升高(P<0.05)，而经过植物乳植杆菌YBT5治疗的菌液组与制剂组小鼠较对照组小鼠的IL-1、IL-6和TNFα有显著的逆转作用。对照组与阳性实验组(即阳性对照组)小鼠的抗炎性细胞因子IL-10与正常组相比显著降低(P<0.05)，而灌胃植物乳植杆菌YBT5可以恢复这种低抗炎因子IL-10的状态。总的来说植物乳植杆菌YBT5突破了传统钙制剂补充骨密度时所不具备的改善肠道紊乱的效果，显著抑制了小鼠的高水平促骨炎症因子水平，提高抗炎因子水平。
2.5.3HE组织染色
HE组织染色可以反映出肠道的病变状态，肠道上皮作为肠道粘膜的重要组成部分，以自身的更新能力来保肠道结构。正常组、菌液组和制剂组小鼠结肠黏膜层见有丰富的杯状细胞，黏膜表层黏膜上皮细胞呈高柱状，排列整齐；隐窝呈瓶状结构，中央见有小腔或无明显腔状结构；对照组与阳性实验组黏膜全层固有结构消失，结缔组织增生及炎性细胞浸润，且组织损伤评分相对于植物乳植杆菌YBT5治疗的小鼠显著升高(P<0.05)；与对照组相比，植物乳植杆菌YBT5在一定程度上缓解了结肠组织的损伤，结肠粘膜层保留了大部分的杯状细胞，肠上层结构完整，炎症细胞浸润显著减轻，组织损伤评分显著低于模型组(P<0.05)，说明植物乳植杆菌YBT5对结肠组织损伤具有一定的缓解能力。
2.5.4结肠长度变化
结肠长度可直接反映结肠炎症的严重程度，饮用DSS可使小鼠结肠缩短。小鼠处死后，取出完整结肠，测量其长度，正常组的结肠长度为(7.03±0.25)cm，对照组小鼠结肠明显缩短，为(3.8±0.1)cm，阳性实验组小鼠结肠也出现一定程度的缩短，为(4.5±0.13)cm，通过补充植物乳植杆菌YBT5的菌液组和制剂组显著增加小鼠结肠长度至5.77±0.06cm和6.46±0.06，差异具有显著性(P<0.05)。
2.6植物乳植杆菌YBT5对肠道屏障能力的影响
肠上皮是宿主和肠腔微生物群之间的界面。肠道通过细胞间隙的大小控制肠腔和粘膜下层之间的分子转运。这种选择性生理屏障可以阻止直径较大的分子通过。在这个过程中，肠壁与肠腔内的微生物密切接触，不断识别肠腔内的外源抗原，并及时做出反应。在病理条件下，通透性增加使较大的分子和潜在的抗原进入上皮粘膜下层，这可能引发异常的肠道和机体炎症反应。此外，破骨细胞性细胞因子，如白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)由驻留在肠上皮下组织中的免疫细胞产生，肠道通透性的任何变化也可能提高破骨细胞性细胞因子的水平，然后影响骨质量。
通过检测异硫氰酸荧光素(FITC)、右旋糖酐和血清内毒素，观察植物乳植杆菌YBT5对小鼠肠上皮通透性的影响。如图6所示，对照组和阳性实验组小鼠血清FITC-葡聚糖水平(P<0.05)和内毒素水平(P<0.05)均显著高于正常组小鼠。而灌胃植物乳植杆菌YBT5小鼠的FITC-葡聚糖水平和内毒素水平均有明显的抑制作用(P<0.01)，与未加植物乳植杆菌YBT5的对照组小鼠相比，差异有显著性意义。
紧密连接蛋白是构成肠道屏障的重要组成部分，在维持肠道上皮结构稳定发挥着重要作用，结果如图6所示，与正常组相比，对照组和阳性实验组小鼠的紧密连接蛋白，包括Claudin-2和Claudin-3的表达水平显著下调(P<0.05)。而补充植物乳植杆菌YBT5组小鼠两个因子的表达谱明显高于未加植物乳植杆菌YBT5的小鼠(P<0.05)。这说明植物乳植杆菌YBT5具有补充钙制剂所不具备的保护肠道屏障能力的功能，且经制剂工艺处理后，其效果较菌液组相比显著升高(P<0.05)。
2.7植物乳植杆菌YBT5对骨形成标记物的影响
骨形成过程包括成骨细胞发生的骨形成和破骨细胞发生的骨吸收过程，两者动态平衡维持能够保持正常的骨量和体内的矿物质代谢稳态。骨形成的标志物是在不同阶段表达的活性成骨细胞直接或间接的产物，反映成骨细胞的不同方面功能。I型胶原蛋白是骨基质的重要组成部分，成骨细胞在骨形成过程中分泌其前体前胶原。骨钙素是骨基质最丰富的非胶原蛋白之一，也可由成骨细胞在骨形成过程中产生，并按照一定比例释放到细胞外进入血液循环中。Ⅰ型前胶原N末端前肽(PINP)是成骨细胞分泌的I型胶原(typeIcollagen，COLI)的降解产物，血清骨钙素(osteocalcin，OCN)是成骨细胞在骨形成过程中分泌并释放成骨细胞分泌的。
为了确定经过植物乳植杆菌YBT5治疗后所带来的肠道微生物结构变化是否影响成骨细胞的骨参数，本研究测量了PINP、OCN、BALP的参数来反映骨形成能力。结果如图7A-C所示，与正常组相比，对照组的PINP、OCN和ALP水平显著降低(P<0.05)，而补充植物乳植杆菌YBT5的菌液组和制剂组小鼠逆转了这种低水平的表现，差异均具有显著性(P<0.05)，且制剂组小鼠的治疗效果明显优于阳性对照组，差异均具有显著性(P<0.05)。
2.8植物乳植杆菌YBT5对骨吸收标记物的影响
Ⅰ型胶原交联C-末端肽(CTX-I)是骨吸收的关键标志，由破骨细胞分泌组织蛋白酶K酶解形成。非胶原蛋白，如抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)也是骨吸收标志物。我们检测了小鼠血清中CTX-I和TRACP的水平，如图7D、E所示，与正常组相比，对照组的CTX-I与TRACP水平显著增高(P<0.01)，而补充植物乳植杆菌YBT5的菌液组和制剂组小鼠逆转了这种高水平CTX-I与TRACP，差异具有显著性(P<0.05)，且制剂组小鼠的抑制效果优于阳性实验组，差异均具有显著性(P<0.05)。
2.9骨相关因子
为了进一步探讨植物乳植杆菌YBT5促进骨骼发育的机制，我们评估了骨形成过程中相关趋化因子，包括Osterix、RUNX2、骨桥蛋白(OPN)、RANKL/OPG(骨保护素)和IGF-1在不同组间的表达(图8)。Osterix是骨形成所必需的成骨细胞特异性转录因子，Osterix最早是在间质干细胞被骨形成蛋白2诱导向成骨细胞分化过程中发现的基因，在这五组中并没有发现统计学上的差异(P>0.05)；RUNX2主要分布在新生骨小梁周围及边缘，早期促进分化，晚期抑制分化，RUNX2表达有骨髓间充质干细胞分化而来的成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞及成纤维细胞，是决定骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的重要转录因子，除此之外还具有调节成骨细胞的功能。在本实验中，五组小鼠并没有发现在RUNX2水平上的差异(P>0.05)；OPN是成骨细胞的表型之一，在骨基质的矿化和吸收过程中起重要作用，五组小鼠并没有发现在OPN水平上的差异(P>0.05)。
RANKL是核因子κB受体活化因子配体，又名骨保护素配体是破骨细胞关键的分化因子，骨保护素(osteoprotegerin，OPG)是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)受体家族的新成员，具有抑制破骨细胞的功能。OPG-RANKL-RANK信号系统是指成骨细胞分泌的骨保护素(OPG)和破骨细胞前体上的核因子κB受体活化因子配体(RANK ligand，RANKL)竞争性结合破骨细胞前体上的核因子κB受体活化因子(RANK)，RANKL-RANK信号通路激活核因子κB(NF-κB)，促进破骨细胞分化和功能。而OPG与RANKL竞争性结合RANK，抑制破骨细胞分化和细胞功能，因此，RANKL/OPG的比值可提示骨吸收过程的状态，比值增大提示骨吸收强度增大，比值减小提示骨吸收被抑制。在本实验中，对照组和阳性实验组小鼠的骨髓中，RANKL与OPG的比值(RANKL/OPG)均显著高于正常组的小鼠，而补充植物乳植杆菌YBT5对小鼠骨髓的(RANKL/OPG)有显著抑制作用，且制剂组显著低于菌液组(P<0.05)，也就是说植物乳植杆菌YBT5促进骨吸收的原因可能是通过RANKL-OPG-RANK信号通路，抑制破骨细胞分化，使骨转换过程偏向骨形成，进而达到促进骨骼发育的目的。
2.10植物乳植杆菌YBT5对RANKL诱导RAW264.7细胞破骨形成的影响
为进一步探讨AR281抑制破骨细胞发生的机制，我们用RANKL刺激RAW264.7细胞向破骨细胞分化。我们观察了它对RAW264.7细胞破骨细胞样多核细胞(>3核)形成的影响。结果如图9所示，RANKL刺激RAW264.7细胞时，破骨细胞分化活跃，与未使用RANKL刺激的组相比，其增值率显著增加(P<0.05)。然而在植物乳植杆菌YBT5干预下，其增值率受到影响发生下降，在106CFU/mL浓度下，其增值率在下降到89％-92％，在107CFU/mL浓度下，其增值率在下降到75％-79％。这一结果说明，与我们测定的RANKL与OPG的比值降低相一致，细胞实验也验证了植物乳植杆菌YBT5通过RANKL-OPG-RANK信号通路降低破骨细胞分化，使骨转换过程偏向骨形成，进而达到促进骨骼发育的目的。
以上，我们确定了植物乳植杆菌YBT5制剂具有促进骨骼发育的功能。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株用于促进骨骼发育的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）YBT5，其特征在于，所述植物乳植杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，武汉，保藏日期为2022年10月19日，保藏编号为CCTCC NO：M20221594。
2.根据权利要求1所述的一株用于促进骨骼发育的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）YBT5的微囊化制剂工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S01，在1wt%藻酸盐和4wt%大豆蛋白的pH＝7.0的水性混合物中接种1wt%的植物乳植杆菌YBT5悬浮液，搅拌均匀，获得混合物；
S02，将混合物在低速搅拌的条件下注入喷雾干燥喷嘴中；喷雾干燥过程的条件为：喷嘴直径0.7mm，吸气器压力90%，雾化器压力600nL/h，流速5mL/min，获得益生菌微粒；
S03，将从喷雾干燥机的旋风分离器收集的益生菌微粒引入3wt%的CaCl2水溶液中，CaCl2水溶液的用量至少没过益生菌微粒，然后在室温下连续搅拌1小时，制备获得交联的大豆蛋白藻酸盐微粒，并且交联的大豆蛋白藻酸盐微粒内包封有植物乳植杆菌YBT5，即获得了胶囊化益生菌；
S04，离心，从CaCl2水溶液中获得胶囊化益生菌，用无菌水洗涤，冷冻，冻干，得到植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂。
3.根据权利要求2所述的微囊化制剂工艺，其特征在于，S01中，植物乳植杆菌YBT5悬浮液的获得方法为：
将冻存于-80℃条件下的植物乳植杆菌YBT5以2%的接种量接种在MRS培养基中，37℃培养24h，连续培养两代，37℃培养18h备用；
取上述活化、备用的植物乳植杆菌YBT5，通过以1500转离心10分钟收获植物乳植杆菌YBT5，并用无菌0.1wt%蛋白胨水洗涤两次，将洗涤后的沉淀用250μL磷酸盐缓冲盐水PBS，pH＝7.4稀释至最终植物乳植杆菌YBT5浓度为107CFU/mL的植物乳植杆菌YBT5悬浮液。
4.根据权利要求2所述的微囊化制剂工艺，其特征在于，S01中，搅拌均匀的方法为：在室温下、在磁力搅拌器上以600rpm搅拌30分钟；S02中，低速搅拌速率为200rpm；S03中，搅拌速率为800rpm。
5.根据权利要求2所述的微囊化制剂工艺，其特征在于，S04中，离心工艺为：2300rpm离心5分钟；洗涤，冷冻，冻干工艺为：洗涤三次，在-20℃下冷冻，并在7Pa和-50℃下冻干24小时。
6.根据权利要求2~5任意一项所述的微囊化制剂工艺获得的植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂。
7.根据权利要求6所述的植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂在制备促进骨骼发育药物中的应用。
8.根据权利要求6所述的植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂在制备调节肠道菌群代谢物中的应用。
9.根据权利要求6所述的植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂在制备改善肠道紊乱及免疫调节药物中的应用。
10.根据权利要求6所述的植物乳植杆菌YBT5微囊化制剂在制备保护肠道屏障药物中的应用。
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