CN111513313A - 一种增强骨密度的组合物及其制剂和制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种增强骨密度的组合物，由下述重量份数比的组分混合得到：30～50份桑叶粉、30～50份魔芋粉。还公开了一种增强骨密度的制剂，由下述重量百分比的组分组成：桑叶粉30％‑50％、魔芋粉30％‑50％、麦芽糊精8％‑25％、赤藓糖醇0.3％‑1.0％、甜菊糖苷0.3％‑1.0％。该制剂的制备方法，包括如下步骤：(1)预处理：取桑叶粉、魔芋粉，过80目筛；(2)混合：a.将步骤(1)所得原料混合；b.称取麦芽糊精、赤藓糖醇、甜菊糖苷，分别过80目筛，再将过筛后的麦芽糊精、赤藓糖醇、甜菊糖苷及步骤a所得的混合物混匀，即得。

Description

一种增强骨密度的组合物及其制剂和制备方法
技术领域
本发明涉及保健品技术领域，具体涉及一种增强骨密度的组合物及其制剂和制备方法。
背景技术
人体缺钙是一个全球性问题。在我国，受饮食习惯影响，膳食结构以植物性食物为主，其中植酸盐、草酸盐等含量较高，不利于钙的吸收。钙是我国居民膳食中缺乏最为明显的营养素，2010-2012年“中国居民营养与健康状况监测数据”报告显示，我国居民膳食中钙的摄入量不足营养学会推荐量的一半。随着人民收入水平及保健意识的提高，越来越多的人开始重视补钙，目前市场上补钙类保健品种类繁多，但存在消化吸收率低、有一定的毒副作用等缺点，因此进一步研究开发安全、高效的补钙产品一直是研究的热点。
桑叶中钙含量丰富，同时富含氨基酸、黄酮类化合物等多种生理活性物质，若作为增强骨密度类保健食品原料，不仅可以达到增强骨密度效果，而且有利于机体健康；桑叶来源广泛，便宜易得，属于药食同源植物，安全性高，是功能性食品原料的理想来源之一。魔芋葡甘聚糖(Konjac glucomannan，KGM)具有促进肠道短链脂肪酸分泌，降低肠道pH值，增加肠道微生物复杂性和多样性等功效，从而改善肠道健康。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种增强骨密度的组合物及其制剂和制备方法。
本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：
一种增强骨密度的组合物，由下述重量份数比的组分混合得到：30～50份桑叶粉、30～50份魔芋粉。
一种增强骨密度的制剂，由下述重量百分比的组分组成：桑叶粉30％-50％、魔芋粉30％-50％、麦芽糊精8％-25％、赤藓糖醇0.3％-1.0％、甜菊糖苷0.3％-1.0％。
上述的增强骨密度的制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)预处理：取桑叶粉、魔芋粉，过80目筛；
(2)混合：
a.将步骤(1)所得原料混合；
b.称取麦芽糊精、赤藓糖醇、甜菊糖苷，分别过80目筛，再将过筛后的麦芽糊精、赤藓糖醇、甜菊糖苷及步骤a所得的混合物混匀，即得。
配方中各组分的功效为：
桑叶粉
桑叶(Morus alba L.)营养丰富，含有多糖、脂类、蛋白质、维生素、矿物质、黄酮类、生物碱、植物甾醇等营养成分。桑叶在小肠内未被消化的纤维素、糖类等进入大肠后被微生物发酵，产生丁酸、乙酸等短链脂肪酸，使肠道pH值降低，酸性环境能有效抑制大肠杆菌等有害细菌的增殖，促进双歧杆菌等有益微生物的生长，起到调节肠道微生物的作用。同时桑叶中粗脂肪、DNJ、矿物质、食物纤维等进入大肠，增加大肠内容物水分含量，软化粪便，促进肠道蠕动，有利于粪便排出。
魔芋粉
魔芋(Amorphophallus rivieri)富含魔芋葡甘聚糖，魔芋葡甘聚糖(Konjacglucomannan，KGM)是从魔芋中提取的一种植物多糖，为优质的可溶性膳食纤维，因良好的束水性、凝胶性、成膜性、增稠性、膨胀性等性质，被广泛应用于食品、医学、环保、生物学等领域。大量研究表明，KGM具有防治糖尿病、抑制人体肥胖、预防和治疗便秘、调节脂质代谢、增强免疫力、抗癌、抑菌抗炎、治疗炎症性肠病、治疗甲状腺功能亢进、抗衰老、提升耐氧能力、解酒等作用。
KGM具有促进肠道短链脂肪酸产生，降低肠道pH值，增加肠道微生物复杂性和多样性等功效，从而改善肠道健康。而肠道健康与钙吸收密切相关，桑叶粉和KGM的复配是否通过改善肠道环境达到对钙吸收的效果，是否能产生增强骨密度协同增效的作用，肠道环境的变化影响钙吸收的机理，对开创食源性补钙理论及产品开发都有积极的影响。故本发明以小鼠为试验对象，研究桑叶粉/KGM复配物的增强骨密度功效，为桑叶粉在功能性食品、膳食补充剂领域的应用谋求新的突破，这对于提高桑叶的利用价值，拓宽蚕桑业的经济基础，保持蚕桑业的活力具有重要意义。
在此领域，我们课题组也进行了一些有益的探索，完成了KGM缓解高尿酸血症的作用与机制研究，得出KGM有良好的降尿酸效果，及KGM缓解高尿酸血症的作用机制。同时，完成了KGM毒理学及肠道益生性评价，得出了KGM具有调节肠道健康的功效。并且开发出魔芋桑叶粉调节肠道健康固体饮料，并将其产业化，取得了一定的经济效益。项目组进行了可行性研究，已对项目进行了前期基础研究，对不同品种、不同季节的桑叶进行了总钙含量及钙的存在形态进行了研究，得出桑叶粉中钙含量平均为1614.85mg/100g，相较于常见食品，其钙含量更为丰富，这为后续研究奠定了基础。
魔芋葡甘聚糖是魔芋粉的主要成分，是纯天然的高分子膳食纤维，是一种水溶性高粘度多糖(迄今为止地球上发现的粘度最大的植物多糖)。试验证实KGM遇水会膨胀，可刺激胃肠道消化液的分泌，从而增强胃肠蠕动，减短食物残渣在胃肠道停留的时间，促进排泄。本课题组长期探究KGM及其衍生物以及魔芋桑叶粉的功能特性，课题组前期试验表明魔芋葡甘低聚糖(konjac oligosaccharides，KOS)对雌、雄小鼠急性经口半致死量(LD50)均大于21500mg/kg，属无毒级；采用体外发酵试验表明KGM和KOS具有显著的肠道益生性，而D-KGM没有肠道益生性。桑叶粉/KGM复配物肠道益生性研究结果表明：桑叶粉/KGM复配物可显著增大小鼠盲肠壁表面积、盲肠内容物水分及短链脂肪酸浓度(P＜0.05)，显著降低盲肠内容物pH值、游离氨(P＜0.05)，抑制盲肠内容物中大肠杆菌的生长，显著促进双歧杆菌和乳酸菌的增值(P＜0.05)。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的产品原料为天然的保健食品，根据传统中医理论对补钙的治疗原则，并结合大量的功能文献及临床文献，筛选了具有增强骨密度的食品原料，原料来源广泛、质量可靠、价格实惠。
(2)本发明所用原料均为安全的普通食品原料，生产工艺符合食品卫生相关要求，因此本发明产品食用安全，无任何毒副作用，可长期食用。
(3)用量方面，本产品所用原料均是卫生部、国家食品药品监督管理局批准认可使用的食品原料，用量上主要参考《中华人民共和国药典》和相关政策法规的要求，且各原料无任何配伍禁忌，较为安全。
(4)经过动物试验证明，本发明提供的组合物无毒性、具有显著的增强骨密度的功效。
附图说明
图1是小鼠股骨干骺端松质骨Micro-CT二维图，其中，A为雌性低钙对照组；B为雌性碳酸钙对照组；C为雌性KGM+碳酸钙组；D为KGM+桑叶粉组；E为雄性低钙对照组；F为雄性碳酸钙对照组；G为雄性KGM+碳酸钙组；H为雄性KGM+桑叶粉组。
图2是小鼠股骨干骺端松质骨Micro-CT三维图，其中，A为雌性低钙对照组；B为雌性碳酸钙对照组；C为雌性KGM+碳酸钙组；D为KGM+桑叶粉组；E为雄性低钙对照组；F为雄性碳酸钙对照组；G为雄性KGM+碳酸钙组；H为雄性KGM+桑叶粉组。
图3是各组小鼠股骨HE染色结果，其中，A为雌性低钙对照组；B为雌性碳酸钙对照组；C为雌性KGM+碳酸钙组；D为KGM+桑叶粉组；E为雄性低钙对照组；F为雄性碳酸钙对照组；G为雄性KGM+碳酸钙组；H为雄性KGM+桑叶粉。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1
1.1试验材料：
KM小鼠，雌雄各半，清洁级，体重18～20g，重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司，许可证号SCXK(渝)2012-0011。
魔芋粉(粒度范围160～200目)：由重庆康家客食品有限公司提供，质量满足魔芋粉农业标准NY494-2010。桑叶粉，由四川今日农业开发有限公司(大竹县，四川省，中国)提供，经气流粉碎的桑叶粉100％过200目筛。
胃蛋白酶，1:10000，Sigma Chemicals,USA；胰蛋白酶，1:250，Amresco,USA；猪胆盐，BR，成都市科龙化工试剂厂；葡萄糖酸钙、碳酸钙，GR，天津市光复精细化工研究所；硝酸、醋酸、硫酸、苦味酸、二甲苯，AR，成都科龙化学试剂厂；血清钙试剂盒、血清磷试剂盒、血清碱性磷酸酶试剂盒，南京建成生物研究所。
1.2试验方法
1.2.1桑叶粉中总钙含量测定
测定方法参见GB/T 5009.92-2003[15:中华人民共和国卫生部.GB/T 5009.92-2003食品中钙的测定[S].北京:中国标准出版社,2004.],测定过程为：称取1.0g左右桑叶粉(水分含量3.89％)于250mL三角瓶中，加入20mL HNO3-HClO4(4:1)混合酸，三角瓶口放小漏斗一个，在电炉上加热消化，直至无色透明为止，加入2mL纯水用于除去多余的硝酸，待三角瓶中所剩液体接近2～3mL时停止加热，冷却后，将样品转移到50mL容量瓶中，用20g/L的氧化镧多次清洗三角瓶，合并洗液，定容，摇匀，待测。试样做3个重复，同时取与消化样品所用等量的混酸，按照相同的操作方法做空白实验。
1.2.2桑叶粉中不同形态钙含量测定
参照Ohat等的方法适当调整，具体提取顺序、提取剂及对应钙的形态见表1。方法为：称取桑叶粉0.500±0.005g于50mL离心管中，于37℃恒温振荡器用不同溶剂10mL依次提取1h，4000r/min离心10min，将上清液移至25mL容量瓶中，用5％盐酸定容，最后剩余的残渣用蒸馏水冲洗后烘干，混和酸消化，浸提液和消化液采用原子吸收分光光度计(TAS-990，北京普析通用仪器有限公司，北京，中国)测定钙含量。
表1不同形态钙提取顺序及所用试剂
Figure BDA0002448383800000051
1.2.3动物分组及剂量设置
80只小鼠，雌雄各半，经一周适应性喂养后称重，按照体重随机分成4组，分别为低钙对照组、碳酸钙对照组、KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组。以人体钙的推荐摄入量800mg/60kg.d的10倍为饲料中钙的添加量，以人体推荐量3.0g/60kg.d的10倍为饲料中KGM的添加量。
1.2.3.1受试物给予方式
按照动物每100g体重每日摄食10g饲料，根据碳酸钙和桑叶粉中钙含量计算出各组饲料中所需添加量，分别将碳酸钙和桑叶粉加入低钙饲料中，即低钙组饲料中钙含量150.0mg/100g，其余3组饲料中钙含量为283.3mg/100g。各组小鼠以自然投喂的方式给予对应的饲料，自由饮用去离子水。饲养时间13周。
1.2.3.2观察指标
1)体质量和身长
每周测量一次，测体质量之前禁食12h。
2)食物利用率
Figure BDA0002448383800000052
3)代谢试验
正式试验开始后第4周的前3d进行钙代谢试验。记录3d内各组小鼠的摄食量，收集72h粪便，采用原子吸收分光光度法测定饲料、粪便中钙含量。
摄入钙/(mg/d)＝饲料中钙含量/(mg/g)×摄食量/(g/d)
粪钙/(mg/d)＝粪便中钙含量/(mg/g)×粪便量/(g/d)
钙的表观吸收率/％＝(摄入钙-粪钙)/摄入钙×100
1.2.4血清指标测定
血清制备：小鼠饲养13周后，禁食12h，测体质量，摘眼球取血，室温静置1h，4500r/min条件下离心10min，取上层血清分装后保存于-20℃冰箱待检。参照南京建成生物工程研究所试剂盒方法测定血清钙含量、血清磷含量、血清碱性磷酸酶活力。
1.2.5脏器指数
小鼠摘眼球取血后颈椎脱臼处死，立即解剖，取出完整的心、肝、脾、双肾，除去各脏器上粘附的组织，用冰生理盐水洗净血渍，滤纸吸干，称重并记录。
Figure BDA0002448383800000061
1.2.6股骨指标
1.2.6.1骨生物力学测定
样本处理及测定方法：小鼠处死后迅速取出其左侧股骨，用剪刀和纱布剔除附着其上的肌肉及结缔组织，称重并用游标卡尺测定其长度和直径，用生理盐水浸湿的纱布包裹，放入编号的离心管中，于-20℃保存待测。测定前取出样本常温解冻，并用生理盐水复湿，然后将样本置于Instron1101型万能材料机上进行三点弯曲实验，试验参数为加载速度6mm/min，跨距7mm，记录载荷-位移曲线。
所测指标：最大载荷、最大挠度、最大弯曲应力、弹性模量、最大弯曲应变。前4项指标数据由仪器给出，最大弯曲应变根据公式计算得出。
最大弯曲应变＝12dmaxH/2L2
式中dmax为最大挠度
1.2.6.2骨钙含量测定
三点弯曲试验后的骨样本置于60℃烘箱中烘干至衡重，电子天平称量并记录股骨干重。然后于马弗炉中600℃灼烧8h，干燥器中冷却。灰化完全的试样用1.25mL硝酸(硝酸：水＝1:1)溶液溶解，转移到25mL容量瓶中，用氧化镧溶液反复冲洗坩埚，合并洗液，用氧化镧溶液稀释至刻度，摇匀，原子吸收分光光度计测定吸光度，同时做空白实验，由标准曲线求出试样中钙含量。
1.2.6.3股骨显微结构检查
小鼠处死后迅速取出其右侧股骨，用剪刀和纱布剔除附着的肌肉及结缔组织，称重，固定于4％的多聚甲醛中。然后用micro-CT对股骨远心端进行扫描，扫描条件为：X光图片大小1224×820，分辨率12μm，滤片0.25mm，电压60Kv，电流166μA。曝光时间500ms，旋转角度360°，转角度增0.8°。扫描结束后，选取剧生长板远端1.0mm、层厚2.0mm的骨组织为松质骨感兴趣区域(region ofinterest，ROI)进行三维重建，用仪器自带的软件进行以下物理参数的定量分析：骨密度(bone mineral density，BMD)、连接密度(connection density，Conn.D)、骨体积分数(bone volume/total volume，BV/TV)、结构模型指数(structuremodel index，SMI)、骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁分离度(trabecularseparation，Tb.Sp)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)。
1.2.6.4股骨组织病理检测
取股骨干(股骨下端向上15mm处)横断面及右膝关节(纵矢状断面),10％中性福尔马林液固定,常规脱钙、石蜡切片、H-E染色、普通光镜观察。
1.2.6.5结果判定
根据《保健食品检验与评价规范》(2003版)，试验组小鼠骨钙含量或骨密度显著高于低钙对照组，且不低于相应剂量碳酸钙对照组，钙的吸收率不低于碳酸钙对照组，可判定受试物具有增强骨密度功效。
1.2.7数据处理
采用Excel、SPSS19.0进行数据处理与统计分析，结果均用平均值±标准差
Figure BDA0002448383800000073
表示。
2.结果与分析
2.1桑叶粉中总钙及不同形态钙含量
桑叶粉总钙及不同形态钙含量如表2所示。由表可知，所用桑叶粉含钙量丰富，达到1614.85mg/100g(干基计)，高于牛奶(120mg/100g)、豆制品(367mg/100g)、奶酪(590mg/100g)等食品。对于人体而言，可以吸收的钙为水溶性钙、果胶钙及碳酸钙，桑叶粉中这3种钙的比例接近总钙含量的60％。因此，桑叶粉不仅钙含量高，而且其中钙的存在形态有利于人体的消化吸收。
表2.桑叶粉总钙及不同形态钙含量
Figure BDA0002448383800000071
Figure BDA0002448383800000072
2.2对小鼠体重、身长、总食物利用率的影响
饲喂期间，各组动物均未出现死亡及明显疾病，碳酸钙对照组、KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组小鼠较低钙对照组活跃。
各组小鼠体重、身长变化及总食物利用率如表3所示。由表可知，实验初期各组小鼠体重、身长均无显著性差异(p＞0.05)。第13周末，各组小鼠体重均较实验初期明显增大，雌性小鼠各组之间体重无显著差异(p＞0.05)，雄性小鼠中碳酸钙对照组、KGM+碳酸钙组体重与低钙对照组相比有显著性差异(p＜0.05)。缺钙会影响机体的正常发育，所以低钙对照组小鼠体重增长相对较慢，同时目前的研究表明，KGM与桑叶粉具有减肥的功效，所以KGM+桑叶粉组小鼠体重虽大于低钙对照组但无显著性差异(p＞0.05)。
第13周末，雌性小鼠中KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组身长大于低钙对照组(p＜0.05)，且不低于相应剂量碳酸钙对照组；雄性小鼠中碳酸钙对照组、KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组身长均显著大于低钙对照组(p＜0.05)。
各组小鼠总的食物利用率无显著差异(p＞0.05)，由于KGM吸水后易膨胀，增加饱腹感，在一定程度上减少摄食量，同时KGM和桑叶粉有控制体重增长的作用，所以KGM+桑叶粉组食物利用率较低。
表3各组小鼠体重、身长变化及总食物利用率
Figure BDA0002448383800000081
Figure BDA0002448383800000082
注：*.与同性别低钙对照组相比，有显著性差异(p＜0.05)
2.3对小鼠脏器系数的影响
解剖时对各组小鼠心、肝、脾、双肾等器官进行肉眼观察，未见异常，各脏器质量及脏/体比如表4-1、4-2所示。由表4-1、4-2可知，各组小鼠各脏器质量及脏/体比均无显著性差异(p＜0.05)。
表4-1各组小鼠各脏器质量及脏/体比(1)
Figure BDA0002448383800000083
Figure BDA0002448383800000091
表4-2各组小鼠各脏器质量及脏/体比(2)
Figure BDA0002448383800000092
Figure BDA0002448383800000093
2.4对小鼠钙表观吸收率的影响
各组小鼠钙的表观吸收率如表5所示。由表可知，与低钙对照组相比，碳酸钙对照组、KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组钙的表观吸收率较低，且呈极显著性差异(p＜0.01)；KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组钙的表观吸收率不低于相应剂量的碳酸钙对照组。
表5各组小鼠钙的表观吸收率
Figure BDA0002448383800000094
Figure BDA0002448383800000095
Figure BDA0002448383800000101
注：**.与同性别低钙对照组相比，有极显著性差异(p＜0.01)
机体对钙的吸收过程可分为主动吸收和被动吸收两种形式，当机体钙摄入量较低时，机体以主动吸收为主，钙的消化吸收率较高，当钙的摄入量超过100mg，机体对钙的主动转运过程将会达到饱和，机体由主动吸收为主转为被动吸收为主，钙的消化吸收速率减慢。低钙对照组由于饲料中钙含量低，机体长期处于钙摄入不足状态，机体对钙的主要吸收方式为主动转运，导致钙的表观吸收率相较于其他3组显著增高。
关于膳食纤维对肠道钙吸收的影响学术界存在不同看法，部分学者认为膳食纤维含有多种酸性基团如糖醛酸，在胃肠道内电离成负电性，与金属钙离子以静电离子键或配位键结合成络合物，从而有利于钙的吸收；部分学者认为膳食纤维不利于钙的吸收。本次试验结果表明，KGM对钙的表观吸收率无不利影响。
2.5对小鼠左侧股骨长度、直径的影响
各组小鼠左侧股骨长度、直径测定结果如表6所示。由表可知，相较于低钙照组相，碳酸钙对照组、KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组小鼠股骨长度略大，但并无显著性差异(p＞0.05)，股骨直径显著性增大(p＜0.05)；相较于碳酸钙对照组，KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组股骨长度、直径无显著差异。
表6各组小鼠左侧股骨长度、直径测定结果
Figure BDA0002448383800000102
Figure BDA0002448383800000103
注：*.与同性别低钙对照组相比，有显著性差异(p＜0.05)
2.6对小鼠股骨重量、骨钙含量的影响
各组小鼠股骨重量及骨钙含量测定结果如表7所示。由表可知，碳酸钙对照组、KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组小鼠双侧股骨重量、股骨指数、股骨干重均大于低钙对照组，且有显著性差异(p＜0.05)。KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组小鼠双侧股骨重量、股骨指数、股骨干重与碳酸钙组相比无显著性差异(p＞0.05)。碳酸钙对照组、KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组骨钙含量无显著性差异(p＞0.05)，但都显著高于低钙对照组(p＜0.05)。
股骨指数可以在一定程度上反应小鼠骨骼生长状况。本次实验中，低钙对照组小鼠长期处于钙摄入量不足状态，导致机体严重缺钙，股骨生长状况较差，所以其股骨指数显著低于其余3组。机体摄入的钙经肠道吸收后首先进入血液循环，然后沉积在骨骼中，机体会自动调节使血钙和骨钙处于动态平衡。当膳食钙摄入量不足时，血液中钙浓度下降，甲状旁腺素将会促使骨骼释放钙，用以维持钙平衡，从而导致骨丢失。骨钙含量测定结果表明，低钙对照组由于长期钙摄入量不足导致骨钙流失严重，碳酸钙、桑叶粉的摄入提高小鼠体内Ca2+浓度，骨骼则不必释放出自身的钙。Grano等认为Ca2+-H+交换能够改变细胞微环境的pH值，改变破骨细胞内骨架的结构，从而降低其骨吸收活性。Zaidi等研究认为破骨细胞的细胞膜存在Ca2+受体，Ca2+与受体结合后能够直接抑制破骨细胞的骨吸收活性。因此，Ca2+浓度的增加使破骨细胞的骨吸收活性减弱，成骨细胞活性增强，机体中骨生成处于优势，从而骨钙含量增加。试验结果表明，低钙饲料中添加碳酸钙、桑叶粉/KGM复配物能够增加骨骼中钙的储存量，提高骨的质量。
表7各组小鼠股骨重量及骨钙含量测定结果
Figure BDA0002448383800000111
Figure BDA0002448383800000112
注：*.与同性别低钙对照组相比，有显著性差异(p＜0.05)，**.与同性别低钙对照组相比，有极显著差异(p＜0.01)
2.7对小鼠血清指标的影响
血清钙和磷是与骨矿化有关的生化指标。各组小鼠血清钙、磷含量、碱性磷酸酶活性测定结果如表8所示。由表可知，与低钙对照组相比，碳酸钙对照组血清钙含量显著增大(p＜0.05)，KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组血清钙含量极显著增大(p＜0.05)，雌性KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组血清钙含量显著高于碳酸钙对照组(p＜0.05)，雄性碳酸钙对照组、KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组血清钙含量无显著性差异(p＞0.05)。各组小鼠血清磷含量无显著性差异(p＞0.05)。
雌性碳酸钙对照组、KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组小鼠血清碱性磷酸酶极显著低于低钙对照组(p＜0.01)，雄性碳酸钙对照组、KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组小鼠血清碱性磷酸酶含量显著低于低钙对照组(p＞0.05)。
本次试验中，低钙对照组一直饲喂低钙饲料，导致膳食钙摄入不足，因此血清钙含量显著低于其他3组，也说明通过饲喂低钙饲料成功构造缺钙模型。
血清中碱性磷酸酶(AKP)主要由骨骼中成骨细胞分泌，在肝功能正常的情况下，能较好的反映成骨细胞的功能和活性，当机体处于一些疾病状态时，AKP会大量释放进入血清，使血清中AKP含量增高。Elwakf等研究表明，AKP活性异常增强，将会导致骨转换率升高，骨吸收与骨形成之间脱节，破骨细胞吸收的骨量大于成骨细胞形成的骨量，导致净骨量丢失。本次实验中，低钙对照组由于长期食用低钙饲料，机体缺钙严重，导致成骨细胞活动异常，大量释放AKP进入血清，其余3组饲料中钙含量丰富，成骨细胞活动正常，血清中AKP活性较低。
表8各组小鼠血清钙、磷含量、碱性磷酸酶活性测定结果
Figure BDA0002448383800000121
Figure BDA0002448383800000122
注：*、**分别表示与同性别低钙对照组相比，p＜0.05和p＜0.01；Δ表示与同性别碳酸钙组相比，p＜0.05
2.8小鼠股骨干骺端松质骨Micro-CT定量参数
各组小鼠股骨干骺端松质骨Micro-CT定量参数如表9、10所示。由表可知，雌性小鼠中，与低钙对照组相比，KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组SMI显著降低(p＜0.05)，碳酸钙对照组有所降低，但无显著性(p＞0.05)；KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组BMD、BV/TV、Tb.N显著升高(p＜0.05)，碳酸钙对照组有所升高，但无显著性(p＞0.05)；碳酸钙对照组、KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组CONN.D均升高，但仅有KGM+碳酸钙组有显著性差异；碳酸钙对照组、KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组Tb.Th极显著升高(p＜0.01)；Tb.Sp减小，但无显著性差异(p＞0.05)。雄性小鼠中，与低钙对照组相比，其余3个实验组SMI均降低，KGM+碳酸钙组有显著性差异(p＜0.05)；BMD、BV/TV、CONN.D、Tb.N均升高，KGM+碳酸钙组有显著性差异(P＜0.05)；Tb.Th增大、Tb.Sp减小，但均无显著性差异(p＞0.05)。与碳酸钙对照组相比，KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组所有指标均无显著性差异(p＞0.05)。
SMI表示骨小梁板状和杆状的程度，理想板状骨小梁和杆状骨小梁的SMI值分别为0和3，发生骨质疏松时，骨小梁由板状像杆状转变，相应的SMI值会增大。发生骨质疏松时Tb.N、Tb.Th值减小，Tb.Sp增大提示骨吸收增加，可能发生骨质疏松。本次试验中，相对于低钙对照组，其余3组SMI值均呈现不同程度的降低，BMD、CoNN.D增大，Tb.N、Tb.Th增大，Tb.Sp减小，表明在低钙饲料中添加碳酸钙、桑叶粉/KGM复配物能够使小鼠股骨骨小梁结构有所改善，增大其骨密度，并使其结构更加紧密，对改善骨小梁结构退化具有积极作用。
表9各组小鼠股骨干骺端松质骨Micro-CT定量参数
Figure BDA0002448383800000131
Figure BDA0002448383800000132
注：*.与低钙对照组相比，有显著性差异(p＜0.05)，**.与低钙对照组相比，有极显著差异(p＜0.01)
表10各组小鼠股骨干骺端松质骨Micro-CT定量参数
Figure BDA0002448383800000133
Figure BDA0002448383800000134
注：*.与低钙对照组相比，有显著性差异(p＜0.05)
2.9小鼠股骨干骺端松质骨Micro-CT二维和三维图
各组小鼠股骨二维微观截面图及SEG三维重建图更加形象地展示了各组小鼠股骨远端松质骨形态情况。由图1、2可知，低钙对照组小鼠骨小梁数量明显减小，间隙较大，连接出现断裂，网状结构退化，有大量的无骨小梁骨髓空腔。碳酸钙对照组、KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组骨小梁数量较多，走向一致，连接紧密，保持更为完整的微观结构。
2.10各组小鼠股骨病理切片
各组小鼠股骨HE染色结果如图3所示。由图可知，低钙对照组骨小梁数量较少，间隙大，连接断裂，网状结构遭到破坏，出现明显较大的骨髓空腔，部分区域出现骨小梁断裂游离的残端，表明长期食用低钙饲料的小鼠出现典型的骨质疏松症状。其余3组由于额外钙的添加，骨小梁变粗，数量增多，有序排列并形成网状结构，骨小梁的断裂点较少，说明碳酸钙、桑叶粉在提高松质骨的骨量、恢复骨小梁结构方面具有积极作用，这与骨钙含量测定及显微结构观察结果一致。
2.11各组小鼠股骨生物力学参数的变化
WHO(WorldHealth Orginization)1994年定义，骨密度测量T值低于-2.5时在临床上确诊为骨质疏松，一直以来骨量被认为是骨质疏松诊断和治疗评估的重要指标，目前临床上骨质疏松诊断及骨质疏松病情评估主要是通过骨密度的检测来实现。但是近年来大量的动物实验和临床研究结果表明单纯骨矿盐含量的增加，骨质量并不一定相应增加，有时反而下降，为了更准确的评价骨脆性和预测骨折危险性，有必要对骨的生物力学进行研究，了解骨组织在外力作用下的力学特性和骨在受到力的作用后的生物学效应，不但有助于对骨质量进行直接评价，也是对各种对抗骨质丢失措施进行评价的最佳方法之一。
各组小鼠股骨生物力学指标变化如表11、12所示。由表可知，与低钙对照组相比，碳酸钙对照组、KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组最大载荷都显著增大(p＜0.05)，雄性小鼠变化更为明显；最大挠度有所上升，但变化无显著性差异(p＞0.05)；最大弯曲应力显著增大(p＜0.05)；最大应变无显著性差异(p＞0.05)；弹性模量除雄性KGM+碳酸钙组有显著性差异以外，其余各组无显著性差异。与碳酸钙对照组相比，KGM+碳酸钙组、KGM+桑叶粉组所有生物力学指标均无显著性差异(p＜0.05)。
最大载荷表示的是骨骼所能承受的极限载荷，当骨骼受到大于最大载荷的外力时则发生骨折，一般而言，最大载荷越大越好。挠度是抗扭曲程度，挠度越大其骨骼抗断裂的程度越强，它与骨骼的韧性或弹性有关。弹性模量反应骨的内在硬度，表示骨抵抗弹性变形能力的大小，不受骨外在尺寸大小和几何形状的影响。结果提示，本试验所用剂量的碳酸钙、KGM+碳酸钙、KGM+桑叶粉能够使小鼠股骨的韧性在一定程度上得到改善，脆性减弱，抗变形能力有所提高，相较于低钙对照组，骨的综合力学性能有所提高。结合Micro-CT实验结果分析发现，骨小梁体积分数、骨小梁数量与其生物力学性能呈正相关，SMI和骨小梁间分离度与其生物力学性能呈负相关，这与Teo等的研究结论一致。
表11雌性小鼠股骨生物力学指标
Figure BDA0002448383800000151
Figure BDA0002448383800000152
注：*.与低钙对照组相比，有显著性差异(p＜0.05)，**.与低钙对照组相比，有极显著差异(p＜0.01)
表12雄性小鼠股骨生物力学指标
Figure BDA0002448383800000153
Figure BDA0002448383800000154
注：*.与低钙对照组相比，有显著性差异(p＜0.05)，**.与低钙对照组相比，有极显著差异(p＜0.01)
3.结论
以小鼠为试验对象，碳酸钙为对照，研究了桑叶粉/KGM复配物的增强骨密度功效，结果表明：通过自制低钙饲料成功建立缺钙小鼠模型。KGM+桑叶粉组小鼠钙的表观吸收率不低于相应剂量的碳酸钙对照组(p＞0.05)；同时KGM+碳酸钙组小鼠钙的表观吸收率不低于相应剂量的碳酸钙组(p＞0.05)，表明KGM对钙的吸收无阻碍作用。KGM与桑叶粉复配可以增长小鼠股骨长度、增大骨密度，提高股骨直径、干重、指数、骨钙含量等指标(p＜0.05)，与相应剂量的碳酸钙之间无显著性差异(p＞0.05)。与低钙对照组相比，其余3组血清钙含量显著降低(p＜0.05)，血清磷含量无显著性差异(p＞0.05)，血清碱性磷酸酶活力显著降低，表明低钙饲料中碳酸钙、桑叶粉/KGM复配物的添加可以在一定程度上缓解缺钙所导致的高骨转换率。Micro-CT及病理切片结果表明，碳酸钙、桑叶粉/KGM复配物在提高松质骨的骨量、恢复骨小梁结构方面具有积极作用。生物力学试验结果表明，低钙饲料中碳酸钙、桑叶粉/KGM复配物的添加有助于股骨生物力学性能的提高。
实施例2
一种增强骨密度的组合物，按如下步骤制得：
(1)预处理：取桑叶粉、魔芋粉，过80目筛。
(2)混合：
a.将步骤(1)所得原料直接加入到混合机内混合15min；
b.称取麦芽糊精、赤藓糖醇、甜菊糖苷，分别过80目筛，再将过筛后的麦芽糊精、赤藓糖醇、甜菊糖苷及步骤a所得的混合物直接加入到混合机内混合15min。
(3)内包装，检验，外包装即得产品。
按照此步骤制备4份增强骨密度的组合物样品，每份样品的各组分配比如表13所示：
表13
Figure BDA0002448383800000161

Claims (3)

1.一种增强骨密度的组合物，其特征在于，由下述重量份数比的组分混合得到：30～50份桑叶粉、30～50份魔芋粉。
2.一种增强骨密度的制剂，其特征在于，由下述重量百分比的组分组成：桑叶粉30％-50％、魔芋粉30％-50％、麦芽糊精8％-25％、赤藓糖醇0.3％-1.0％、甜菊糖苷0.3％-1.0％。
3.如权利要求2所述的增强骨密度的制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)预处理：取桑叶粉、魔芋粉，过80目筛；
(2)混合：
a.将步骤(1)所得原料混合；
b.称取麦芽糊精、赤藓糖醇、甜菊糖苷，分别过80目筛，再将过筛后的麦芽糊精、赤藓糖醇、甜菊糖苷及步骤a所得的混合物混匀，即得。
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