CN1063926C - 促钙吸收作用的林蛙卵组合物及其制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的是林蛙卵组合物及其制剂，该组合物由林蛙卵、碳酸钙、维生素D、柠檬酸和基质组成，具有促钙吸收作用，可用来作为哺乳动物的钙增补剂。
Description
本发明涉及的是一种由林蛙卵和食品添加剂组成的保健食品，用来作哺乳动物钙增补剂。林蛙也称哈士蟆是我国特有的补品和滋补性中药材(中药大辞典1977；1650)，主要分布在我国的吉林、辽宁、黑龙江和甘肃等地区(中药通报1955；2：205；中草药1996；27：82)，多野生于长白山密林溪水中。传统的食用方法是将活林蛙全体炖煮后服用，补而不燥；或将雌林蛙放血处死，晾干，剖取输卵管(哈士蟆油)食用或与其它中药配方，蛙体的其余部分弃去。近年来，人们开始注意林蛙的精加工和综合利用，中国专利CN 1076857A，CN 1130087A公开了一种林蛙油口服液的制作方法；CN 1107674A公开了将林蛙油制成饮料及羹的方法；CN 1110559A公开了除去哈士蟆油和内脏后将剩余部分加工成胶囊的方法。对林蛙卵的研究揭示，其中含有丰富的氨基酸，三十多种微量元素，多种不饱和脂肪酸，维生素D、E，雌激素和孕激素等多种生物活性物质(中药及天然药物1994；29：712)。中国专利CN 1066590A公开了活取哈士蟆油及卵的方法；CN 1117352A公开了中华雪蛤精(活取的哈士蟆油及卵)及其组合物制成保健食品的方法。这些方法开辟了林蛙综合利用的途径，但没有充分发掘林蛙卵应有的生物调节作用。
我们的前期工作表明林蛙卵具有显著的促钙吸收作用，钙对机体生命活动十分重要，正正常人每日需要补充1000mg的钙，钙在胃中以离子形式存在，但胃不能吸收钙离子，小肠是钙吸收的主要部位，但肠内的碱性环境使钙产生Ca(OH)2沉淀，而不能被吸收。所以，钙只能在小肠上段很小的区域，在胃酸没有被肠内的碱性环境完全中和的情况下被吸收。因此，无论机体摄入多少钙，其吸收均受到很大的限制。维生素D可以促进钙的吸收，是目前促钙吸收的最佳物质，但仍然达不到机体对钙的需求。美国专利US 95 06239及中国专利CN 1152258A公开了一种促钙吸收的方法，在钙源周围形成一种亲水性聚合物基质，增加钙在胃部的停留时间而增加钙的吸收。但此方法对于大多数需要补钙的老年患者来说不一定益处很大，因为，老人胃肠运动本来很馒，再延长钙在胃内的停留时间，是否可促进钙的吸收？老人钙吸收的不足与其维生素D合成及摄入减少和胃酸分泌减少密切相关。增加钙源周围的酸性环境，寻找促钙吸收的物质，有可能是解决钙吸收问题的重要途径。
因此，本发明的目的是充分发掘和利用天然资源，将被废弃或一般性食用的林蛙卵与食品添加剂组合起来形成一种保健食品，成为哺乳动物的钙增补剂，有助于预防骨质疏松。
本发明的内容涉及的是一种促进哺乳动物肠道钙吸收的组合物及其制剂，该组合物由林蛙卵、钙源、维生素D、柠檬酸和基质组成。其中，各组分的重量配比如下：林蛙卵5-80；钙源0-90；其中林蛙卵：碳酸钙为1∶1至5∶3；维生素D0-5；柠檬酸0-20；基质0-5。
本发明中使用的钙源是任何一种食用或药用钙源和钙螯合物，在增补剂中常用的经典钙源如下：碳酸钙(CaCO3)、磷酸钙(Ca3(PO4)2)、柠檬酸钙(C12H10Ca3O14·4H2O)、葡萄糖酸钙(C12H22O14Ca·H2O)、草酸钙(C2CaO4·H2O)、甘氨酸钙(C4H8N2O4Ca)、动物骨钙、牡蛎钙，活性钙。其他形式的钙如果被人体吸收的话也被使用。发明中使用的维生素D是食用或药用的维生素D或其衍生物，首选维生素D3(C27H44O)(式Ⅰ化合物)。发明中使用的柠檬酸是食用或药用的柠檬酸(C6H8O7)(式Ⅱ化合物)。使用的基质是食品和制药业常用的辅料：微晶纤维素、淀粉、糊精、羟甲基纤维素钠、羟基丙基甲基纤维素。使用基质的目的一是有助于制剂，二是有助于增加胃内容物的粘度，以便延长钙源在小肠上部停留的时间并延长酸性环境维持的时间。式Ⅰ化合物 式Ⅱ化合物
此组合物成形的制剂是一些口服固体或半固体制剂，片剂，胶囊是优选的剂型。其制备方法是按传统的制剂方法制备，尚可根据剂型的需要选择其他制剂辅料。
按此组合物组成的配方，给动物服用后，可显著促进钙的吸收。
和以往的发明相比，本发明有以下改进：1．充分合理地利用自然资源，将剥取林蛙油后废弃的林蛙卵制成保健食品。2．建立林蛙卵组合物并将组合物制成多种制剂。3．提供一种补钙方法，为当前亟待解决的补钙问题开辟新途径。
本发明的创造性还可通过如下内容体现：
药理毒理研究一．目的：
林蛙是我国特产的补品和滋补性中药材，林蛙的输卵管即林蛙油作为高档补品，畅销全球，林蛙卵在剥取林蛙油后一般被废弃，本实验将探索被废弃的林蛙卵与食品添加剂组成组合物对钙吸收的影响。二材料和方法1．受试物：
林蛙卵由辽宁省桓仁县拐蘑子镇林蛙管理场提供，为林蛙的干燥卵，呈黑色颗粒状，鱼腥味固体。临用时研细配成水混悬液供试。碳酸钙由上海碳酸钙厂提供维生素D3由东北制药总厂提供；柠檬酸由上海宝山县盛桥柠檬酸厂提供；维丁钙片由江西上饶制药厂提供；钙尔奇D片由立达制药有限公司提供。2．动物：
昆明种小鼠，5-6周龄，体重20±1g；SD大鼠，6-7周龄，体重150±19g雌雄各半，由中国医科大学动物室提供，动物合格证号：辽实动字521号。每笼十只群养，自由摄食饮水。3．实验方法：3．1．血钙测定方法
依文献方法测定Ca标准浪及大鼠小鼠血清钙含量。取CaCl2标准浪或小鼠血清20μl加入2ml偶氮胂Ⅲ溶液混均，室温放置3分钟，在650nm下测定吸光度值(中华医学检验杂志1995；18(3)：270-2)。此方法的标准曲线考察是取CaCl2标准液0．0821mg／ml 10，20，30，40，50μl进行测定，在650nm下读取吸光度值；日内变异系数的测定是取1．9608μmol／L浓度的CaCl2标准液7份，每份20μl，测定吸光度，求出均值和方差计算变异系数；回收率测定是取5份小鼠血清，每份20μl再分别加入CaCl2标准液3．704μmol，尔后测定吸光度，减去空白血清的吸光度值，用此差值代入回归方程求出加入的钙量，再除以加入钙的实际量即求出回收率。钙吸收曲线是取CaCO3644mg／kg给小鼠灌胃给药后0，30，60，90，120，150分钟取血测定血钙浓度(CaCO3给药剂量的确定是取用小鼠与人的等效剂量的5倍)。3．2．不同物质对钙吸收的影响3．2．1维生素D对钙吸收的影响
取30只禁食小鼠，随机分为3组，第1组口服蒸溜水10ml／kg，第2组口服碳酸钙悬液644mg／kg，第3组口服碳酸钙悬液644mg／kg+维生素D3 200iu／kg，给药后半小时取血测定血清钙含量。3．2．2柠檬酸对钙吸收的影响
取30只禁食小鼠，随机分为3组，第1组口服蒸溜水10ml／kg，第2组口服碳酸钙悬液644mg／kg，第3组口服碳酸钙悬液644mg／kg+柠檬酸溶液450mg／kg，给药后半小时取血测定血清钙含量。3．2．3林蛙卵对钙吸收的影响。
取40只禁食小鼠，随机分为4组，第1组口服蒸溜水10ml／kg，第2组口服碳酸钙悬液644mg／kg，第3组口服碳酸钙悬液644mg／kg+林蛙卵1g／kg，第4组口服碳酸钙悬液644mg／kg+维生素D3 200iu／kg+林蛙卵1g／kg，给药后半小时取血测定血清钙含量。3．3最佳处方的选择
将碳酸钙，柠檬酸，维生素D和林蛙卵四个因素各选2个水平进行组合，因素 碳酸钙(A) 柠檬酸(B) 维生素D(C) 林蛙卵(D)水平1 300mg 25mg 25μg 300mg水平2 600mg 50mg 50μg 600mg
取90只禁食小鼠，随机分为9组，第1组口服蒸溜水10ml／kg，第2组口服A1B1C1D1第3组口服A1B1C1D2；第4组口服A1B2C2D1；第5组口服A1B2C2D2；第6组口服A2B1C2D1；第7组口服A2B1C2D2；第8组口服A2B2C1D1；第9组口服A2B2C1D2，给药后30分钟测定血钙含量。3．4．林蛙卵组合物对大鼠血钙的影响
取60只禁食大鼠，随机分为6组，第1组为正常组，第2-6组每周二，五肌肉注射氢化可的松(沈阳第一制药厂)4．5mg／kg连给12周，其中，第1组口服蒸溜水10ml／kg，第2组口服蒸溜水10ml／kg，第3组口服钙尔奇D悬液600mg／kg；第4组口服维丁钙片悬液600mg／kg；第5组口服林蛙卵组合物悬液1300mg／kg(含碳酸钙600mg)；第6组口服林蛙卵组合物悬液650mg／kg(含碳酸钙300mg)；每日给药一次，连给12周，于末次给药30分钟后，大鼠眶静脉取血，测定血清钙含量。3．5毒性实验
取小鼠40只，随机分两组，每组20只，雌雄各半，禁食给水12小时后，第1组小鼠灌胃给予林蛙卵组合物0．5％CMC悬液1300mg／kg，第2组口服林蛙卵组合物0．5％CMC悬液3250mg／ml，20ml／kg，5小时后，第2组再给药一次，尔后，连续观察14天动物的状态和死亡情况。4．统计
各组数据的组间比较用t检验统计。正交设计试验用方差分析F检验统计。三．结果：1．血清钙测定方法
血清钙含量测定方法的标准曲线为C=7．318A+0．0664 r=0．9997；日内变异系数CV％=1．58％；回收率为96．79％(90．71-100．43％)。2．钙吸收曲线
CaCO3灌胃给药后0，30，60，90，120，150分钟的血钙浓度分别为2．35，2．97，2．77，2．67，2．79，2．49mmol／L。钙的吸收在30分钟达到高峰，故实验取材时间定在给药后30分钟。3．不同物质对钙吸收的影响3．1维生素D对钙吸收的影响
对照组，碳酸钙组，碳酸钙+维生素D3组的血钙水平分别为2．51+0．42；2．76+0．49；3．27±0．41 mmol／L，验证维生素D3对钙的吸收有促进作用(与碳酸钙组比p＜0．01)。3．2柠檬酸对钙吸收的影响
对照组，碳酸钙组，碳酸钙+柠檬酸组的血钙水平分别为2．21+0．14；2．60±0．29；3．14±0．36 mmol／L，提示柠檬酸对钙的吸收也有促进作用(与碳酸钙组比p＜0．01)。3．3林蛙卵对钙吸收的影响
对照组，碳酸钙组，碳酸钙+林蛙卵组和碳酸钙+维生素D3+林蛙卵组的血钙水平分别为2．23±0．36；2．62±0．29；3．29±0．29；3．65±0．21mmol／L，提示林蛙卵及其与维生素D3组合对钙的吸收有促进作用(林蛙卵+碳酸钙组与碳酸钙组比p＜0．01；碳酸钙+维生素D3+林蛙卵组与碳酸钙组比p＜0．01)。4最佳处方的选择各组结果如表1所示表1．林蛙卵组合物不同组合对小鼠血钙含量的影响
n=10，与对照组相比*p＜0．05，**p＜0．01表2方差分析表序号 A B A×B C D Yi2 1 1 1 1 1 1 1 3．19±0．363 1 1 1 1 1 2 2 3．22±0．294 1 2 2 2 1 2 1 2．88±0．545 1 2 2 2 2 1 2 3．36±0．546 2 1 2 2 2 1 1 3．28±0．317 2 1 2 2 1 2 2 3．33±0．318 2 2 1 1 2 2 1 2．99±0．469 1 1 1 1 1 1 1 3．75±0．33
G=∑Yi=26 G2=676CT=G2／8=84．5 Si=Ri／4-CT查F表p＞0．05
| 组别 | 组合 | 血钙含量(mmol/L) |
| 123456789 | 0A1B1C1D1A1B1C1D2A1B2C2D1A1B2C2D2A2B1C2D1A2B1C2D2A2B2C1D1A2B2C1D2 | 2.49±0.173.19±0.36**3.22±0.29**2.88±0.543.36±0.54**3.28±0.31**3.33±0.31**2.99±0.46*3.75±0.33** |
| Ⅰi | 12.65 | 13.02 | 13.15 | 13.15 | 13.15 | 13.58 | 12.34 |
| Ⅱi | 13.35 | 12.98 | 12.85 | 12.85 | 12.85 | 12.42 | 12.66 |
| Ⅰj | 3.16 | 3.26 | 3.29 | 3.29 | 3.28 | 3.40 | 3.09 |
| Ⅱj | 3.34 | 3.25 | 3.21 | 3.21 | 3.21 | 3.11 | 3.42 |
| R | -0.18 | 0.01 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.29 | -0.33 |
| Ⅰ2 j | 160.0 | 169.5 | 172.9 | 172.9 | 172.9 | 184.4 | 152.3 |
| Ⅱ2 j | 178.2 | 168.5 | 165.1 | 165.1 | 165.1 | 154.3 | 186.6 |
| Ri | 338.2 | 338.0 | 338.0 | 338.0 | 338.0 | 338.7 | 338.9 |
| Si | 0.05 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.175 | 0.225 |
| F比 | 0.5 | 0 | 0 | 0 | 2.5 |
结果经方差分析F检验，表明四个影响因素中以林蛙卵的影响最大，四因素中两水平对钙吸收的影响不显著(p＞0．05)，根据临床补钙的经验并结合实验具体数据，A2B2C1D2组合的促钙吸收效果最好，故选此比例作为处方组成。5．林蛙卵组合物对大鼠血钙的影响
各组数据如表3所示
表3．林蛙卵组合物对大鼠血钙的影响(X±SD)
n=10，与模型对照组相比*p＜0．05，**p＜0．01与对照组，钙尔奇D和维丁钙片组相比#p＜0．05
| 组别 | 舍钙剂量(mg/kg) | 血钙含量(mmol/L) |
| 对照组模型对照组钙尔奇D维丁钙片林蛙卵组合物林蛙卵组合物 | --600600600300 | 2.37±0.101.92±0.092.50±0.13**2.18±0.16*2.71±0.14**#2.54±0.21** |
结果表明林蛙卵组合物有很强的促钙吸收作用，不仅对正常动物，对皮质激素所致的骨质疏松动物都同样有效，其效果强于市场畅销的钙尔奇D和维丁钙片。6毒性实验
林蛙卵组合物以最高的浓度，最大的给药容量，给小鼠口服后，连续14天的观察，未见动物出现任何不适和异常反应发生，此高剂量相当于推荐人正常用量的600倍，相当于小鼠与人等效剂量的78倍，说明林蛙卵组合物正常剂量口服是安全的。四．小结
林蛙卵组合物给小鼠大鼠口服，使动物的血钙水平明显升高，其作用强于相同钙含量的钙尔奇D和维丁钙片。以高于人用剂量600倍的剂量口服未见毒性反应发生。
实施例
下述实施例是为了更好的阐述本发明，并不是用来限制发明的范围。
实施例1
林蛙卵胶囊处方
林蛙卵 300．0g
碳酸钙(CaCO3) 300．0g
维生素D3 12．5mg
柠檬酸 25．0g
可溶性淀粉 25．0g
制成 1000粒制法
取去掉林蛙油后的林蛙，将干燥的卵小心剥出，收集在一起，拣净杂质，将卵粉碎，过6号筛备用，另取处方量的维生素D3、与等量淀粉放入乳钵内研磨混合，研均后，再取25mg淀粉放入此乳钵中研蘑混合，然后，再顺次增加淀粉量与维生素D3混合均匀至淀粉用完。另取处方量的柠檬酸放入另一乳钵中研细，再依次按25，50，100及125g的顺序往此乳钵中加入CaCO3，每次都研均后再加下一份CaCO3至二者混合均匀。再将柠檬酸与CaCO3的混合粉按25，50，100，150g的顺序加入淀粉与维生素D3的混合粉中，至其充分混均，再向此混合物中加入林蛙卵并充分混合均匀。将混均后的灰色的细粉过6号筛，尔后将其装入0号胶囊中即得。
实施例2
林蛙卵油片处方
林蛙卵 500．0g
碳酸钙 300．0g
维生素D3 12．5mg
柠檬酸 25．0g
可溶性淀粉 100．0g
滑石粉 适量
制成 1000片制法1．制备林蛙卵油：取林蛙卵，自然干燥，拣除杂质，用粉碎机粉碎后用1∶2(W／V乙醚冷浸24小时，尔后倾出上清液，再加同样量的乙醚同法浸三次，收集并过虑浸液，用水流唧筒连通减压装置，在水浴上减压回收乙醚，待无乙醚蒸出后，将蒸馏瓶内的黄色油状液体倒入烧杯中于室温放置一周，将乙醚挥散净后即得浅黄棕色卵油(白求恩医科大学学报1991；17增刊：13)，得率为20％。2．压片：按处方比例，称取碳酸钙、维生素D3和柠檬酸混均过6号筛；取林蛙卵油与此混合物混均。另取淀粉加水制成希糊，加入混合粉末中制成米粒大颗粒，60℃干燥2小时后加入适量滑石粉调整流动性，用压片机10mm冲模(平面直角)压片。片重550mg。
Claims (5)
1．一种促钙吸收作用的林蛙卵组合物，其特征是该组合物由林蛙卵、碳酸钙、维生素D、柠檬酸和基质组成，其中，各组分的重量配比如下：林蛙卵5-80；碳酸钙0-90，其中林蛙卵∶碳酸钙为1∶1至5∶3；维生素D 0-5；柠檬酸0-20；基质0-5。
2．根据权利要求1的促钙吸收作用的林蛙卵组合物，其特征在于该组合物中基质是食品和制药业常用的辅料：微晶纤维素、淀粉、糊精、羟甲基纤维素钠、羟基丙基甲基纤维素。
3．根据权利要求1的促钙吸收作用的林蛙卵组合物，其特征在于该组合物可制成口服固体或半固体制剂。
4．根据权利要求3的促钙吸收作用的林蛙卵组合物，其特征在于该组合物可制成林蛙卵胶囊，林蛙卵胶囊配方为：林蛙卵300．0g，碳酸钙(CaCO3)300．0g，维生素D3 12．5mg，柠檬酸25．0g，可溶性淀粉25．0g，制成1000粒，制法：取去掉林蛙油后的林蛙，将干燥的卵小心剥出，收集在一起，拣净杂质，将卵粉碎，过6号筛备用，另取配方量的维生素D3与等量淀粉放入乳钵内研磨混合，研均后，再取25mg淀粉放入此乳钵中研磨混合，然后，再顺次增加淀粉量与维生素D3混合均匀至淀粉用完，另取配方量的柠檬酸放入另一乳钵中研细，再依次按25，50，100及125g的顺序往此乳钵中加入CaCO3，每次都研均后再加下一份CaCO3至二者混合均匀，再将柠檬酸与CaCO3的混合粉按25，50，100，150g的顺序加入淀粉与维生素D3的混合粉中，至其充分混均，再向此混合物中加入林蛙卵并充分混合均匀，将混均后的灰色细粉过6号筛，尔后将其装入0号胶囊中即得。
5．根据权利要求3的促钙吸收作用的林蛙卵组合物，其特征在于该组合物可制成林蛙卵油片，林蛙卵油片原料组成是：林蛙卵500．0g，碳酸钙300．0g，维生素D312．5mg，柠檬酸25．0g，可溶性淀粉100．0g，滑石粉适量，制成1000片，制法：取林蛙卵用乙醚冷浸制取卵油，按原料组成称取碳酸钙、维生素D3和柠檬酸混均过6号筛；取林蛙卵油与此混合物混均，另取淀粉加水制成稀糊，加入混合粉末中制成颗粒，60℃干燥2小时后加入适量滑石粉调整流动性，用压片机10mm冲模压片，片重550mg。
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