CN106918661A - 一种测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林c含量的高效液相色谱测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的高效液相色谱测定方法。采用碱解的方法破坏软胶囊外壳，用酸度调节剂调节pH≤4.0后，用无水乙醇在超声波上提取。本发明采用的方法可以有效测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C的含量，方法准确度和灵敏度高，重现性好。

Description

一种测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的高效液相色谱 测定方法

技术领域

本发明涉及一种巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的高效液相色谱测定方法，更具体是涉及一种用于测定主要由巴西蜂胶、色拉油、明胶、甘油、水、蜂蜡、卵磷脂等材料制成的巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的高效液相色谱方法。

背景技术

巴西蜂胶（外文名：Brazilian Bee Propolis），是指产于巴西的蜂胶，因其外观与成分等与世界其他地区的蜂胶有较大差别，且巴西蜂胶作用明确，药理研究充分而备受世人关注，是世界上品质最好的蜂胶。根据植物学来源和化学成分，巴西蜂胶可分为12类。某些样品符合“巴西蜂胶”，但并不意味着物理、化学和生物特性的相同，且巴西蜂胶分布全国，有着广泛的植物多样性和复杂的化学成分变化。近年来关于巴西蜂胶的研究实际上是来自东南地区的（第十二类），也被称为“绿蜂胶”，其主要植物来源为分布在巴西东南和南部的酒神菊属植物Baccharis dracunculifolia DC。巴西蜂胶是世界公认的高品质蜂胶，因为巴西蜂胶含有更多的萜烯、多酚类以及黄酮类化合物，且具有独特的自然香味。巴西绿蜂胶中含有独特的阿替匹林C（Artepillin C）成分，它是巴西蜂胶中的一类重要的生理活性成分，且目前尚未在其他地区蜂胶中检测到。研究发现阿替匹林C对各种培养的肿瘤细胞和转移的癌细胞具有强的细胞杀灭作用。运用低剂量的阿替匹林C对试验的肿瘤细胞就表现出明显的抑制生长作用，尤其对快速生长的细胞有特别显著的细胞杀灭作用。在培养基中加入阿替匹林C时，对人胃癌细胞、人肺癌细胞和鼠结肠癌细胞，就显示出抑制这些细胞生长的作用。由于阿替匹林C 的功效，以及比较高的含量，已被作为公认的巴西蜂胶的主要的质量评价指标，我国的行业标准 GH/T 1114-2015 就建立了蜂胶中阿替匹林C的测定方法。

由于巴西蜂胶口味的原因，为了使人们更易服用和接受巴西蜂胶产品，生产企业将巴西蜂胶加工成巴西蜂胶软胶囊。生产巴西蜂胶软胶囊的主要成分是巴西蜂胶冻干粉、色拉油、明胶、甘油、水、蜂蜡、卵磷脂等，其中巴西蜂胶粉、色拉油、蜂蜡、卵磷脂等一般为胶囊内容物，明胶，甘油，水组成软胶囊外壳。由于巴西蜂胶软胶囊的主要组分是巴西蜂胶粉，因此评价巴西蜂胶软胶囊产品质量的主要指标仍然是阿替匹林C的含量。现在评价巴西蜂胶软胶囊的主要方法是测定巴西蜂胶软胶囊内容物中阿替匹林C的含量，但经过我们实验研究发现，巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C会明显被明胶组成的外壳吸附，导致内容物中阿替匹林C的含量降低，从而引起产品质量不稳定的问题。因此，我们发明的方法主要是以整个胶囊为单位来计算阿替匹林C的含量，方法主要是选择合适的试剂和处理方法将胶囊壳（明胶层）破坏，使吸附的阿替匹林C释放出来，然后使用高效液相色谱测定。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中不能准确测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的问题，提供一种测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的高效液相色谱测定方法。方法的技术关键是对软胶囊样品的处理方法并以整粒胶囊计阿替匹林C的含量。

为解决以上问题本发明所采用的方案：

本发明提供一种测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的高效液相色谱测定方法，包括下述步骤：

1)样品的预处理

直接称取一粒软胶囊置于均质器中进行高速均质，均质器转速大于5000rpm；

2)样品的碱解

将均质物置于烧杯中，加入碱液；在水浴锅中碱解，水浴温度为30℃～100℃，待样品彻底溶解后，继续水解0.5H；

3）样品的酸化和乙醇提取

将碱解后的样品置于室温放凉至室温，加入酸度调节剂酸化，直至使得溶液pH小于4.0，然后加入无水乙醇进行超声波提取，提取频率40-100Khz，最佳温度在40-60℃，提取时间20-30min，提取后使用0.45µm滤膜过滤，过滤后得超声波提取物；

3）液相色谱分离

取超声波提取物上样分析，色谱条件为：流动相：甲醇：甲酸或磷酸水溶液=90～20：10～80，按体积比计；检测波长：315nm；采用梯度洗脱方式分离；

色谱分析条件为：色谱柱采用C18柱；流速：0.5～1.4mL/min；柱温：15℃～35℃。

上述一种测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的高效液相色谱测定方法，其中，所述所述磷酸水溶液浓度为0.1%～0.4%，按体积百分比浓度计。

上述一种测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的高效液相色谱测定方法，其中，优选地，所述流动相的甲醇：磷酸水溶液体积比为48：52，所述磷酸水溶液浓度为0.3%，按体积百分比浓度计。

上述一种测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的高效液相色谱测定方法，其中，所述碱解使用的碱液为氢氧化钠溶液浓度为0.5%～30%，按质量百分比浓度计；或氢氧化钾溶液浓度为0.5%～30%，按质量百分比浓度计。

上述一种测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的高效液相色谱测定方法，其中，所述酸度调节剂选自磷酸、盐酸、硫酸、甲酸或乙酸中的一种。

本发明的测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的高效液相色谱测定方法，采用一种简单的样品前处理方法，对巴西蜂胶软胶囊的胶囊外壳进行破坏，使吸附的阿替匹林C释放，然后使用高效液相色谱测定其中的阿替匹林C含量。

本发明采用合适的碱液和处理方法对巴西蜂胶软胶囊的囊壳进行破坏，同时不影响阿替匹林C的含量，碱解破坏后，加入酸度调节剂，将溶液调至酸性，加入无水乙醇对其中的阿替匹林C进行提取。本发明以外标法定量，采用C18柱为固定相，以甲醇与磷酸的混合液作为流动相梯度分离，在315nm测定。根据样品的实际情况(油，明胶的含量)，可以适当的调整碱液和酸度调节剂的浓度和用量，以达到最好的提取效果。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明实施例中所采用的材料如下：

实施例中碱解过程采用水浴锅或电炉；

实施例中液相色谱分离过程采用Dionex P680高效液相色谱仪，配有4通道紫外检测器；

实施例中酸化后测定PH值时采用的pH试纸（1-5）或酸度计。

本实施例中采用的甲醇为色谱纯；水为去离子水；氢氧化钠为分析纯，盐酸为分析纯，磷酸为优级纯，阿替匹林C对照品购自于日本和光纯药工业株式会社，无水乙醇为分析纯，10%的氢氧化钠溶液。

实施例中采用的供试样品为市售的巴西蜂胶软胶囊（100粒每瓶，标注蜂胶含量为1000 mg/粒）。

实施例中采用的的采用的对照品贮备液，制备方法如下：称取阿替匹林C对照品25mg于25mL容量中，用无水乙醇溶解，并定容，制成含量为1.0mg/mL的对照品贮备液，使用时用80%（体积百分比浓度）的乙醇水溶液稀释成0.001、0.005、0.02、0.05、0.1、0.3mg/mL的工作溶液。

实施例1：

一种测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的高效液相色谱测定方法，具有如下步骤：

（1）直接称取一粒胶囊样品置于均质器中，高速均质后，取1.0g样品到烧杯中，加入5.0mL的10%的氢氧化钠溶液（按质量百分比计），然后置于70℃水浴锅中水解，待样品完全溶解后，继续水解15min，自然冷却至常温，加入盐酸酸化，直至溶液的pH为2.0。再加入25mL无水乙醇，超声波提取，提取频率50Khz，温度在40℃，提取时间20min后，将样液转移到50mL的容量瓶中，用少量乙醇清洗烧杯两次，移入容量瓶中，并用无水乙醇定容，摇匀，用0.45µm滤膜过滤后，供测定。

（2）进行液相色谱分离，色谱条件为：色谱柱：waters Symmetry C18(4.6 x150mm，5µm)；波长：315nm；进样量：5µL；柱温：30℃；

流动相：A 甲醇：B 磷酸水溶液（0.3%，体积百分比浓度）

梯度洗脱表

时间min	A%	B%	流速mL/min
				0	20	80	0.8
5	20	80	0.8
				20	70	30	0.8
30	90	10	0.8
				31	20	80	0.8
41	20	80	0.8

实施例1性能测试：

1、线型范围：

将80%（体积百分比浓度）的乙醇水溶液稀将标准贮备液释成0.001、0.005、0.02、0.05、0.1、0.3mg/mL的工作溶液，按照实施例1中步骤（2）条件进行测定，以峰面积和对照品浓度做校正曲线，Y 代表峰面积，X代表浓度，得到的回归方程为：Y=0.453X-0.0145，r=0.9989。

2、加标回收率：

精密称取供试样品各1g共6份，每份加入对品贮备溶液5mL，按实施例1的方法处理并测定，计算添加回收率。

3、重现性：

取5份样品，每个样品测定五次，计算相对标准偏差（RSD%）。

4、浓度计算方法和检出限：

按外标法以峰面积和标准浓度做标准曲线，计算样品中阿替匹林C的含量。

5、 测试结果

分析5份样品，以整粒胶囊计算阿替匹林C的含量，五份样品的含量分别为2.02%、1.98%、1.96%、1.94%和1.94%。

如果不碱解，按照GH/T 1114-2015 蜂胶中阿替匹林C的测定方法的含量分别为1.04%、0.82%、0.79%、1.22%和1.31%，其结果差异极大。将五份样品在4℃保存一个月后，按我们发明的方法再次计算阿替匹林C的含量，结果为1.98%、1.99%、2.03%、2.01%和1.99%，结果重复可靠。结果表明阿替匹林C的含量没有变化。再用GH/T 1114-2015 蜂胶中阿替匹林C的测定方法含量，结果为0.63%、1.06%、0.87%、1.16%和0.81%。其中阿替匹林C的含量有明显的降低，且没有明显规律。

实验证明，按照我们的方法来提取巴西蜂胶软胶囊以整粒胶囊来计算阿替匹林C的含量，通过碱解分解明胶，酸中和，乙醇提取可以有效的测定王浆胶囊中阿替匹林C的含量。

本发明方法的定量检测限为2.6mg/kg(信噪比≥10)；方法在1mg/L～300mg/L的浓度范围内线性关系良好，相关系数r达到0.999以上；加标回收率在95%以上；相对标准偏差小于2.1%。

实验例 2

根据本发明实施例1的步骤测定存放六个月的含量数据（室温）的巴西蜂胶软胶囊的阿替匹林C含量，阿替匹林C的含量没有明显变化。

表1 不同巴西蜂胶软胶囊样品放置6个月时间中阿替匹林C含量的变化，其中，样品1购自北京市场，样品2购自南京市场，样品3购自南京市场，样品4购自上海市场。

仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围内。因此，本发明不受本实施例的限制，任何采用等效替换取得的技术方案均在本发明保护的范围内。

Claims (5)

1.一种测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的高效液相色谱测定方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)样品的预处理；

直接称取一粒软胶囊置于均质器中进行高速均质，均质器转速大于5000rpm；

2)样品的碱解；

将均质物置于烧杯中，加入碱液；在水浴锅中碱解，水浴温度为30℃～100℃，待样品彻底溶解后，继续水解0.5H；

3）样品的酸化和乙醇提取；

将碱解后的样品置于室温放凉至室温，加入酸度调节剂酸化，直至使得溶液pH小于4.0，然后加入无水乙醇进行超声波提取，提取频率40-100Khz，最佳温度在40-60℃，提取时间20-30min，提取后使用0.45µm滤膜过滤，过滤后得超声波提取物；

3）液相色谱分离；

取超声波提取物上样分析，色谱条件为：流动相：甲醇：甲酸或磷酸水溶液=90～20：10～80，按体积比计；检测波长：315nm；采用梯度洗脱方式分离；

色谱分析条件为：色谱柱采用C18柱；流速：0.5～1.4mL/min；柱温：15℃～35℃。

2.如权利要求1所述的一种测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的高效液相色谱测定方法，其中，所述所述磷酸水溶液浓度为0.1%～0.4%，按体积百分比浓度计。

3.如权利要求1所述的一种测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的高效液相色谱测定方法，其中，所述流动相的甲醇：磷酸水溶液体积比为48：52，所述磷酸水溶液浓度为0.3%，按体积百分比浓度计。

4.如权利要求1所述的一种测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的高效液相色谱测定方法，其中，所述碱解使用的碱液为氢氧化钠溶液浓度为0.5%～30%，按质量百分比浓度计；或氢氧化钾溶液浓度为0.5%～30%，按质量百分比浓度计。

5.如权利要求1所述的一种测定巴西蜂胶软胶囊中阿替匹林C含量的高效液相色谱测定方法，其中，所述酸度调节剂选自磷酸、盐酸、硫酸、甲酸或乙酸中的一种。