CN109704951A

CN109704951A - 一种阿替匹林c的提取方法

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Publication number: CN109704951A
Application number: CN201910156371.1A
Authority: CN
Inventors: 孙圣伟; 何健; 刘美娟; 黎小莉; 殷光玲; 李坤平; 张旭光
Original assignee: BY Health Co Ltd
Current assignee: BY Health Co Ltd
Priority date: 2019-03-01
Filing date: 2019-03-01
Publication date: 2019-05-03
Anticipated expiration: 2039-03-01
Also published as: CN109704951B

Abstract

本发明属于天然成分提取技术领域，尤其涉及一种阿替匹林C的提取方法。本发明提供了一种阿替匹林C的提取方法，包括以下步骤：a)将绿蜂胶置于乙醇中得到乙醇溶液，再在所述乙醇溶液中加入正己烷进行萃取，得到乙醇萃取液；b)在所述乙醇萃取液中加入二氯甲烷进行萃取，得到二氯甲烷萃取液，除去溶剂，得到阿替匹林C。本发明中，采用乙醇对阿替匹林C进行提取，再采用正己烷和二氯甲烷进行萃取，得到阿替匹林C，方法简单，易于操作，解决了现有技术从巴西蜂胶中获取阿替匹林C的单体较为困难的问题。

Description

一种阿替匹林C的提取方法

技术领域

本发明属于天然成分提取技术领域，尤其涉及一种阿替匹林C的提取方法。

背景技术

蜂胶是蜜蜂从植物花苞及树干上采集的树胶，混入其上颚腺分泌物和蜂蜡等物质而成的一种具有芳香气味的胶状固体物质，是蜜蜂用来防护、抵御病虫害和病原微生物入侵巢房的御敌物质，同时也是修补巢房和巢内部环境消毒杀菌的一种特殊物质。

蜂胶的化学成分由蜜蜂采集地区的植物分泌物决定。蜂胶的化学成分主要包括黄酮类化合物、芳香酸与芳香酸酯、醛与酮类化合物、脂肪酸与脂肪酸酯、萜类化合物、甾体化合物、氨基酸、糖类化合物、烃类化合物、醇、酚类及其它化合物。处于南美洲热带地区的巴西绿蜂胶，由于主要植物来源为酒神菊类植物，这种植物本身就含有独特的阿替匹林C(Artepillin C)成分，使得阿替匹林C成为巴西蜂胶中的一类重要的生理活性成分。

阿替匹林C是巴西绿蜂胶特有的成分且含量较高(4％以上)，具有很强的抗菌和抗肿瘤作用。但是，由于阿替匹林C易与蜂蜡结合，从巴西蜂胶中获取阿替匹林C的单体相当困难。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种阿替匹林C的提取方法，用于解决从巴西蜂胶中获取阿替匹林C的单体较为困难的问题。

本发明的具体技术方案如下：

一种阿替匹林C的提取方法，包括以下步骤：

a)将绿蜂胶置于乙醇中得到乙醇溶液，再在所述乙醇溶液中加入正己烷进行萃取，得到乙醇萃取液；

b)在所述乙醇萃取液中加入二氯甲烷进行萃取，得到二氯甲烷萃取液，除去溶剂，得到阿替匹林C。

优选的，步骤a)所述将绿蜂胶置于乙醇中得到乙醇溶液具体包括：

将所述绿蜂胶置于所述乙醇中搅拌均匀，进行超声处理，得到所述乙醇溶液。

优选的，步骤b)所述得到二氯甲烷萃取液之后，所述除去溶剂之前，还包括：

步骤c)在所述二氯甲烷萃取液中加入硅胶粉，干燥除去所述二氯甲烷，得到硅胶混合物；

步骤d)将所述硅胶混合物加入至硅胶层析柱后，加入正己烷和乙酸乙酯的二元混合溶液进行洗脱，收集洗脱含阿替匹林C的流分。

优选的，步骤d)所述洗脱的过程中采用薄层色谱进行监测。

优选的，步骤d)所述收集洗脱有阿替匹林C的流分之后，步骤b)所述除去溶剂之前，还包括：

步骤e)将所述流分通过制备色谱进行分离纯化。

优选的，步骤e)所述制备色谱的色谱柱的固定相选自氧化硅、氧化铝、十八烷基键合硅胶或三氧化二铝。

优选的，所述固定相的粒径为5μm～10μm；

所述固定相的孔径为0.2μm～20μm。

优选的，步骤e)所述制备色谱的检测波长为290nm～360nm。

优选的，步骤e)所述制备色谱的流动相包括流动相A和流动相B；

所述流动相A为纯化水，所述流动相B为甲醇。

优选的，步骤e)所述制备色谱的流速为0～10mL/min。

综上所述，本发明提供了一种阿替匹林C的提取方法，包括以下步骤：a)将绿蜂胶置于乙醇中得到乙醇溶液，再在所述乙醇溶液中加入正己烷进行萃取，得到乙醇萃取液；b)在所述乙醇萃取液中加入二氯甲烷进行萃取，得到二氯甲烷萃取液，除去溶剂，得到阿替匹林C。本发明中，采用乙醇对阿替匹林C进行提取，再采用正己烷和二氯甲烷进行萃取，制备得到阿替匹林C，方法简单，易于操作，解决了现有技术从巴西蜂胶中获取阿替匹林C的单体较为困难的问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例3提取得到的阿替匹林C的高效液相色谱图；

图2为本发明实施例3提取得到的阿替匹林C在正离子模式下的一级质谱图谱；

图3为本发明实施例3提取得到的阿替匹林C在负离子模式下的一级质谱图谱；

图4为本发明实施例3提取得到的阿替匹林C的¹H-NMR谱图；

图5为本发明实施例3提取得到的阿替匹林C的¹³C-NMR谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种阿替匹林C的提取方法，用于解决从巴西蜂胶中获取阿替匹林C的单体较为困难的问题。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种阿替匹林C的提取方法，包括以下步骤：

a)将绿蜂胶置于乙醇中得到乙醇溶液，再在乙醇溶液中加入正己烷进行萃取，得到乙醇萃取液；

b)在乙醇萃取液中加入二氯甲烷进行萃取，得到二氯甲烷萃取液，除去溶剂，得到阿替匹林C。

本发明实施例中，采用乙醇对阿替匹林C进行提取，再采用正己烷和二氯甲烷进行萃取，得到阿替匹林C，方法简单，易于操作，解决了现有技术从巴西蜂胶中获取阿替匹林C的单体较为困难的问题。

长期以来，采用巴西绿蜂胶进行抗炎症、抗过敏、抑制细菌、抑制寄生虫、抑制病毒、防治肝病、防治血管疾病、防治血管栓塞、防治心与脑血管疾病、抗化学毒物等的研究很多，而阿替匹林C活性单体的研究相对较少。本发明提供了一种操作简单的制备阿替匹林C的方法，能够为阿替匹林C活性单体的研究提供原料，利于阿替匹林C活性单体研究的开展。

本发明实施例中，步骤a)将绿蜂胶置于乙醇中得到乙醇溶液具体包括：

将绿蜂胶置于乙醇中搅拌均匀，进行超声处理，得到乙醇溶液。

本发明实施例中，绿蜂胶为绿蜂胶粉末，绿蜂胶粉末的粒径为0～1mm。乙醇的体积分数为80％～100％，优选为95％乙醇。步骤a)绿蜂胶的质量与乙醇的体积比为(1～5)g：(20～100)mL。

将绿蜂胶置于乙醇中搅拌均匀具体为将绿蜂胶置于乙醇中间歇搅拌均匀。超声处理的时间为0～60min，超声处理的频率为0～100KHz，超声处理的功率为100W～400W。

进行超声处理之后，得到乙醇溶液之前，还包括：将超声处理的溶液封口放置12h～24h使不溶物沉积，进行过滤，得到滤液，再进行减压浓缩。其中，滤液为棕色。

步骤a)乙醇溶液中加入正己烷进行萃取的次数为3～5次，直至正己烷层的颜色很淡或无色。

步骤b)在乙醇萃取液中加入二氯甲烷进行萃取的次数为3～7次，直至二氯甲烷层绿色减淡。

本发明实施例中，步骤b)得到二氯甲烷萃取液之后，除去溶剂之前，还包括：

步骤c)在二氯甲烷萃取液中加入硅胶粉，干燥除去二氯甲烷，得到硅胶混合物；

步骤d)将硅胶混合物加入至硅胶层析柱后，加入正己烷和乙酸乙酯的二元混合溶液进行洗脱，收集洗脱含阿替匹林C的流分。

步骤c)具体包括：将二氯甲烷萃取液减压蒸发浓缩后，再加入硅胶粉搅拌均匀，干燥除去二氯甲烷，得到硅胶混合物。

硅胶粉能够作为二氯甲烷萃取液加入至硅胶层析柱的载体，提高阿替匹林C的洗脱效率，并有利于除去二氯甲烷。

本发明实施例中，步骤d)将硅胶混合物加入至硅胶层析柱具体包括：采用干法在层析柱中装填层析柱硅胶，装填高度距顶部10cm～15cm，再加入硅胶混合物，硅胶混合物的厚度为2cm～5cm，再铺一层石英砂，用真空泵抽紧。

本发明实施例中，步骤d)洗脱的过程中采用薄层色谱进行监测。薄层色谱用于监测阿替匹林C的去向，展开系统为正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸。

本发明实施例中，步骤d)收集洗脱有阿替匹林C的流分之后，步骤b)除去溶剂之前，还包括：

步骤e)将流分通过制备色谱进行分离纯化。

本发明实施例中，步骤e)制备色谱的色谱柱的固定相选自氧化硅、氧化铝、十八烷基键合硅胶或三氧化二铝。

本发明实施例中，固定相的粒径为5μm～10μm；

固定相的孔径为0.2μm～20μm。

本发明实施例中，步骤e)制备色谱的检测波长为290nm～360nm。

本发明实施例中，步骤e)制备色谱的流动相包括流动相A和流动相B；

流动相A为纯化水，流动相B为甲醇。

本发明实施例中，步骤e)制备色谱的流速为0～10mL/min。

本发明实施例中，将流分通过制备色谱进行分离纯化之前，将流分采用微孔膜进行过滤。制备色谱的色谱柱为 Luna C₁₈ 100A(250mm×10mm，5μm)，检测波长为310mm，流速为4mL/min。

洗脱程序：洗脱时间0～15min，20％→5％(流动相A)；洗脱时间15～20min，5％(流动相A)；20～25min，5％→20％(流动相A)；25～30min，20％(流动相A)。

目前国内外阿替匹林C标准品价格昂贵，购买途径较少。本发明实施例采用乙醇对阿替匹林C进行提取，再采用正己烷和二氯甲烷进行萃取，制备得到阿替匹林C，再通过柱层析和制备色谱进行分离纯化，得到纯度达到了95％的阿替匹林C单体。本发明实施例首次建立了采用绿蜂胶制备阿替匹林C的方法，通过本发明提取方法得到的高纯度阿替匹林C可作为单体活性研究的对象，以及为绿蜂胶质量控制过程中的阿替匹林C标准品的出处提供解决办法。本发明提取方法简单易操作，便于实施，制备得到的阿替匹林C具有天然绿蜂胶特有的气味，纯度达到了95％，可用于医疗保健功效研究。

为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。

在具体实施例中，甲醇为色谱纯，购自默克公司；其它所用试剂均为分析纯，实验用水均为实验室一级用水。硅胶层析柱的固定相为柱层析色谱硅胶，粒径为0.015mm～0.040mm，购自默克公司；薄层色谱采用60F₂₅₄高效薄层色谱硅胶板，购自默克公司；C18色谱柱购自安捷伦，C18半制备色谱柱购自 Luna。

实施例1

将200g绿蜂胶粉末置于3000mL体积分数95％乙醇中，间歇搅拌均匀，再经20min超声处理，超声处理的频率为200KHz，超声处理的功率为200W。将超声处理的溶液封口放置12h使不溶物沉积，进行过滤，得到棕色滤液，减压浓缩至200mL流浸膏。将流浸膏转移至分液漏斗中，加入正己烷，充分摇匀，静置24h，分液保留下层乙醇层，重复操作3～4次，直至上层无色，得到乙醇萃取液。

将乙醇萃取液加二氯甲烷置于分液漏斗中，充分摇匀，静置2h，待分层后，保留下层，重复该操作4-5次，直至下层绿色减淡，得到二氯甲烷萃取液。将二氯甲烷萃取液除去溶剂，得到阿替匹林C。

实施例2

本实施例对实施例1得到的阿替匹林C进行分离纯化。

将250mL实施例1二氯甲烷萃取液置于减压蒸发装置中，在60℃下进行蒸发浓缩至100mL浓缩液，在浓缩液中加入5g硅胶粉搅拌均匀，置于通风橱中水浴蒸发锅上蒸发成稠膏，再干燥得到粘性软膏，冷冻后粉碎，得到硅胶混合物。

将柱层析色谱硅胶装填于层析柱中，充分震实后，装填高度距顶部15cm，在铁架台上固定，再加入硅胶混合物，硅胶混合物的厚度为5cm，再铺一层石英砂，用真空泵抽紧。加入正己烷和乙酸乙酯的二元混合溶液进行洗脱，用锥形瓶在下面收集，收集洗脱含阿替匹林C的流分，除去溶剂，得到阿替匹林C。每收集一瓶，用薄层色谱进行监测，跟踪阿替匹林C的去向，展开系统为正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(50∶40∶0.1-30:60:0.1，v/v/v)，合并相似的组分，直至收集完成为止。

实施例3

本实施例对实施例2得到的阿替匹林C进行分离纯化。

将实施例2得到的含阿替匹林C的流分通过制备色谱进行分离纯化，再除去溶剂，得到阿替匹林C。

其中，制备色谱的条件：采用半制备色谱柱，半制备色谱柱为 LunaC₁₈ 100A(250mm×10mm，5μm)；流速为4mL/min；检测波长为310nm；进样量为200μL；流动相A：纯化水；流动相B：甲醇。采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如表1所示。

表1梯度洗脱程序

实施例4

本实施例对实施例3得到的阿替匹林C进行高效液相色谱分析和质谱鉴定，结果请参阅图1至图3。

图1为本发明实施例3制备得到的阿替匹林C的高效液相色谱图，结果表明阿替匹林C的保留时间为76min，色谱峰单一，纯度较高。图2和图3分别为本发明实施例3制备得到的阿替匹林C在正离子模式和负离子模式下的一级质谱图谱，再经质谱解析后，结果如表2所示，结果表明实施例3制备得到的化合物为阿替匹林C。

表2实施例3制备得到的阿替匹林C的质谱鉴定结果

实施例5

本实施例对实施例3得到的阿替匹林C进行核磁共振检测，结果请参阅图4和图5，分别为本发明实施例3制备得到的阿替匹林C的¹H-NMR谱图和本发明实施例3制备得到的阿替匹林C的¹³C-NMR谱图。

核磁共振波谱数据为：¹H-NMR(500MHz,Methanol-d4)：δH 1.72[6H,s,CH＝CH(CH3)2]，1.77[6H,s,CH＝C(CH3)2]，3.32(4H,d,J＝7.0Hz,H-2′)，5.32(2H,t,J＝7.3,H-2′)，6.20(1H,d,J＝15.9Hz,H-2)7.14(2H,s,H-5,9)，7.53(1H,d,J＝15.9Hz)；

¹³C-NMR(125MHz,Methanol-d4)：δ17.72(C-5',5”)，25.73(C-4',4”)，29.26(C-1',1”)，115.15(C-8)，123.01(C-2',2”)，127.10(C-1)，128.23(C-2,6)，130.33(C-3,5)，133.80(C-3',3”)，1473.01(C-7)，156.03(C-4)，170.95(C-9)。

结果表明实施例3制备得到的阿替匹林C的谱图数据与阿替匹林C标准品一致，实施例3制备得到的阿替匹林C纯度达到了95％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种阿替匹林C的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤a)所述将绿蜂胶置于乙醇中得到乙醇溶液具体包括：

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤b)所述得到二氯甲烷萃取液之后，所述除去溶剂之前，还包括：

4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，步骤d)所述洗脱的过程中采用薄层色谱进行监测。

5.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，步骤d)所述收集洗脱有阿替匹林C的流分之后，步骤b)所述除去溶剂之前，还包括：

步骤e)将所述流分通过制备色谱进行分离纯化。

6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤e)所述制备色谱的色谱柱的固定相选自氧化硅、氧化铝、十八烷基键合硅胶或三氧化二铝。

7.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述固定相的粒径为5μm～10μm；

所述固定相的孔径为0.2μm～20μm。

8.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤e)所述制备色谱的检测波长为290nm～360nm。

9.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤e)所述制备色谱的流动相包括流动相A和流动相B；

所述流动相A为纯化水，所述流动相B为甲醇。

10.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤e)所述制备色谱的流速为0～10mL/min。