CN112526119A - 一种阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒，包括96孔酶标板、酶标记抗体、阿奇霉素标准品、20×浓缩洗涤液、复溶液工作液、底物A液、底物B液、终止液，所述96孔酶标板上包被有阿奇霉素半抗原‑载体蛋白，所述酶标记物浓缩液为辣根过氧化物酶标记的阿奇霉素特异性抗体。本发明还提供了阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒在检测牛奶、蜂蜜样本中的应用。本发明阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒结构简单、使用方便、对检测人员要求低，且本发明试剂盒检测灵敏度高，检测结果的准确度和精密度等技术餐顺均较好，是非常理想的阿奇霉素残留检测产品。

Description

一种阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明生物技术检测领域，具体涉及一种阿奇霉素酶联免疫快速检测试剂盒及其应用。

背景技术

阿奇霉素(azithromycin，AZM)为半合成十五元大环内酯类抗生素，是20世纪80年代研发的。阿奇霉素具有良好的广谱抗菌效果，广泛用于人呼吸道、泌尿道和软组织感染和性传播疾病的预防和治疗，也曾用于畜禽疾病的临床治疗。2005年8月农业部发布560号公告，阿奇霉素属于人医临床控制使用的抗菌药，将其用于食品动物，会产生耐药性问题，影响动物疫病控制、食品安全和人类健康，不符合兽药安全有效审批原则，将阿奇霉素药物列为禁用兽药。虽然阿奇霉素在畜禽中禁用，但是因其具有良好的药代动力学特点，及抗菌效果好，在利益驱使下，仍然存在违规使用的现象。动物可食性组织中阿奇霉素的残留，对人类安全造成了一定的隐患。

目前，阿奇霉素的检测主要为液相色谱法、液相色谱串联质谱法等，而且多集中在制药原料、血液等中的检测。仪器分析法，虽然具有检测结果准确，结果更可靠，重复性好等特点，但是其前处理程序繁琐，测定时间长，仪器成本高，对检测人员要求高，不利于现场快速检测。

发明内容

为克服现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种检测灵敏度高，现场检测反应时间短，检测简便的阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒，能够实现现场大量样本的快速筛查。

本发明技术方案：

本发明阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒包括96孔酶标板、酶标记抗体工作液、阿奇霉素标准品、20×浓缩洗涤液、复溶工作液、底物A液、底物B液、终止液，其中96孔酶标板上包被有阿奇霉素半抗原-OVA偶联物，酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记的阿奇霉素特异性抗体。

其中，阿奇霉素标准品为0μg/L，0.02μg/L，0.06μg/L，0.18μg/L，0.54μg/L，1.62μg/L。

其中，20×浓缩洗涤液的成分是含2％吐温-20，0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.0。

其中，复溶工作液的成分是2％氯化钠溶液。

其中，底物A液为过氧化氢，底物B液为TMB。

其中，终止液为2mol/L H₂SO₄。

进一步地，阿奇霉素半抗原结构式为

由以下步骤得到：

1)称取阿奇霉素1.0g，用20mL丙酮与20mL吡啶溶解，搅拌均匀。

2)称取马来酸酐0.5g加入步骤1)溶液，80℃条件下搅拌，反应6h后停止，蒸干后上硅胶柱，洗脱液为石油醚:乙酸乙酯＝1:1，分离纯化，得阿奇霉素半抗原。

所述阿奇霉素抗体由阿奇霉素半抗原-BSA偶联物作为免疫原制备得到。

本发明的另一个目的，还提供了一种阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒在检测牛奶、鸡肉样本中的应用。酶联免疫检测试剂盒检测具体步骤为：牛奶、鸡肉样本的处理；用本发明阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒检测；分析检测结果。

本发明有益效果：

本发明阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒建立了直接竞争ELISA方法检测阿奇菌素残留。本发明阿奇菌素酶联免疫检测试剂盒对阿奇霉素的检测灵敏度高达0.02μg/L，对牛奶、鸡肉样本的回收率在89～111％之间，板内变异系数小于5％，板间变异系数小于6％。

本发明技术方案的阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒结构简单，检测灵敏度高，精密度和准确度等技术参数均较好，检测成本低，对检测人员要求不高，检测产品便携性好，适用于大批量样本的现场快速筛查，是理想的阿奇霉素残留检测产品。

附图说明

图1阿奇霉素半抗原合成路线图

图2阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒标准曲线图

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明试剂如无特别说明，均为常规试剂，均可由市场购买得到。

实施例一

1、阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒包含组分：

(1)96孔酶标板，酶标板上包被有阿奇霉素半抗原-OVA偶联物；

(2)辣根过氧化物酶标记的阿奇霉素单克隆抗体，7mL/瓶；

(3)阿奇霉素标准品0μg/L，0.02μg/L，0.06μg/L，0.18μg/L，0.54μg/L，1.62μg/L，1mL/ 瓶。

(4)20×浓缩洗涤液，成分含2％吐温20，0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.0，百分比为质量体积比，30mL/瓶，使用时用去离子水按1:19的比例进行稀释。

(5)复溶液工作液，成分为2％氯化钠溶液，百分比为质量体积比，50mL/瓶。

(6)底物A液为过氧化氢，底物B液为TMB，均为7mL/瓶。

(7)终止液为2mol/L H₂SO₄，7mL/瓶。

2、主要组分制备：

2.1、阿奇霉素半抗原的合成

称取阿奇霉素原料药1.0g，用20mL丙酮和20mL吡啶溶解，搅拌均匀，向其中加入马来酸酐0.5g，80℃搅拌反应6h后停止，蒸干后上硅胶柱，使用石油醚:乙酸乙酯＝1:1的洗脱液洗脱，分离纯化，得阿奇霉素半抗原1.0g。

2.2、免疫原与包被原合成

免疫原为阿奇霉素半抗原-BSA，包被原为阿奇霉素半抗原-OVA，制备过程如下：

称取阿奇霉素半抗原15mg溶解于1mL DMF中，得到阿奇霉素半抗原稀释液；称取20mgEDC和10NHS溶解于0.2mL蒸馏水中，然后将其加入阿奇霉素半抗原稀释液中，室温搅拌反应30min，得到活化阿奇霉素半抗原稀释液；称取载体蛋白BSA或OVA 30mg溶解在 3mLPBS中，将活化阿奇霉素半抗原稀释液逐滴缓慢滴加到载体蛋白溶液中，室温搅拌反应 8h，用0.01mol/L的PBS透析，截留分子质量8000～14000u，4℃透析3d，每天换3次透析液，制备完成后分装保存于-20℃。

2.3、阿奇霉素单克隆抗体制备

2.3.1动物免疫

挑选6-8周龄的纯种Balb/c小鼠，用含有弗氏完全佐剂的阿奇霉素半抗原-BSA偶联物进行皮下多点注射，免疫剂量为200μg/只，第三周加弗氏不完全佐剂，免疫一次，第六周免疫一次，第八周加强免，免疫剂量同第一次，三天后取脾融合。

2.3.2骨髓瘤细胞和脾细胞的制备

SP2/0骨髓瘤细胞采用RPMI-1640培养液培养，取对数生产的骨髓瘤细胞离心，取1×10⁷细胞备用；取经加强免三天后小鼠脾脏，研碎，过细胞筛，取1×10⁸脾细胞悬液。

过200目的不锈钢纱布过滤制成脾细胞悬液，计数后备用。

2.3.3细胞融合和单克隆化

将骨髓瘤细胞和脾细胞按1:10的比例混合，在PEG4000作用下进行融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行单克隆化，直到得到稳定分泌阿奇霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

2.3.4细胞冻存和复苏

将阿奇霉素单克隆杂交瘤细胞株成1×10⁷个/mL的细胞悬液，液氮中保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，转入锥形瓶中，加入15mL完全培养液中，使用CO₂培养箱进行培养。

2.3.5单克隆抗体的大量生产与纯化

取Balb/c雌鼠，腹腔注石蜡油0.5mL/只，10天后腹腔注射阿奇霉素单克隆杂交瘤细胞株 10⁶个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后抗体-20℃保存。

2.3.6阿奇霉素单克隆抗体的特异性

抗体特异性指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力，用交叉反应率表示。交叉反应率小，可证明抗体的特异性高。通过各种药物的标准曲线分别得到其50％抑制浓度(即 IC₅₀)。用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反应率：

交叉反应率(％)＝(阿奇霉素IC₅₀/阿奇霉素类似物IC₅₀)×100％

测得本发明阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒对阿奇霉素的交叉反应率为100％，对红霉素、螺旋霉素、林可霉素、替米考星、泰乐霉素、竹桃霉素等药物均无交叉反应，能特异性检测样本中阿奇霉素。

2.4、酶标记抗体的制备

酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记的阿奇霉素单克隆抗体。将辣根过氧化物酶与阿奇霉素单克隆抗体采用过碘酸钠法进行反应得到。

2.5、酶标板

用0.05mol/L，pH7.2磷酸盐包被液将阿奇霉素半抗原-OVA稀释成0.1μg/mL，每孔加入 100μL，37℃温育2h，用洗涤液洗涤2次，拍干，然后再每孔中加入含有1％脱脂奶粉的0.02mol/L，pH7.2的磷酸盐缓冲液250μL进行封闭，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

组装后的试剂盒，还可以包括说明书、盖板膜、自封袋、合格证，试剂盒在2～8℃条件下，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、阿奇霉素标准品添加实际测定值均在正常范围之内，试剂盒保存期在1年以上。

3、阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒检测原理：

利用阿奇霉素抗体与阿奇霉素抗原可产生特异性结合的性质，先在酶标板上预包被阿奇霉素-OVA偶联抗原，再加入标准品或样本与阿奇霉素抗体，阿奇霉素与固定在酶标板上的抗原竞争阿奇霉素抗体，最后再加入底物催化显色，此时显色深度与标准品或样本中阿奇霉素的含量成反比。

4、试剂盒具体检测步骤

(1)取出需要数量的酶标板条插入酶标板架上，并记录各标准品和样品的位置，为减小检测值波动，做双孔平行实验。

(2)加入标准品/样品50μL到对应的微孔中，然后加入辣根过氧化物酶标记的阿奇霉素单克隆抗体工作液50μL/孔，轻轻振荡5s混匀，盖板后置25℃避光环境中反应20min。

(3)揭开盖板膜，甩干孔内液体，加入洗涤液250μL/孔，洗涤3次，倒掉洗涤液，用吸水纸拍干。

(4)加入底物显色液100μL(A液过氧化氢50μL，底物显色B液四甲基联苯胺50μL，使用前混合)混匀，盖板后置于25℃避光环境中反应10min。

(5)加入终止液50μL/孔，混匀，5min后测定OD值，酶标仪于450nm、630nm处双波长读取吸光度值。

5、检测结果分析

设各标准品(或样品)的吸光度平均值为B，零标准，即浓度为0μg/L的标准品，吸光度平均值B₀以(B/B₀)×100％为各标准品(或样品)对应的吸光度的百分比：使用半对数系统代入标准品对应的吸光度的百分比，与标准品浓度拟合出标准曲线。将待检样品吸光度的百分比代入拟合出的标准曲线方程中，即可得出样品对应的浓度，最后乘以样品相应的稀释倍数，即可得出样品中阿奇霉素含量。

实施例2

与实施例1的区别在于酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记的阿奇霉素多克隆抗体。阿奇霉素多克隆抗体的制备：用阿奇霉素半抗原-BSA偶联物与弗氏完全佐剂按1:1比例混合后免疫新西兰大白兔，免疫剂量为200μg，颈背部皮下多点注射，每隔三周免疫一次，二免和三免时，将弗氏完全佐剂换成弗氏不完全佐剂，剂量同首次，三免后，每次免疫间隔时间为2 周。共免疫5次，最后一次免疫7天后颈动脉采血，用硫酸铵分级沉淀得到纯化的阿奇霉素多克隆抗体。

实施例3牛奶、鸡肉样本中阿奇霉素的检测

1、牛奶样本前处理方法

移取1mL牛奶样本至2mL聚苯乙烯离心管中，加入1mL1％三氯乙酸，涡动3min，4000rpm 室温离心5min；移取50μL上清液至2mL聚苯乙烯离心管中，加入450μL复溶工作液，涡动1min，取50μL用于分析。复溶工作液为2％氯化钠溶液，百分比为质量体积比。

2、鸡肉样本前处理方法

称取1.0±0.05g组织样本至50mL聚苯乙烯离心管中，加入0.025M氢氧化钠溶液4mL，用涡动5min，4000rpm室温离心5min；取100μL上清液加入400μL复溶工作液，用涡旋仪充分涡动1min充分混匀；取50μL用于分析。

2、标准曲线拟合

标准曲线由6个浓度组成(0μg/L，0.02μg/L，0.06μg/L，0.18μg/L，0.54μg/L，1.62μg/L)，对6个标准点各测定次数2次，以确定工作浓度范围和IC₅₀。以阿奇霉素标准品浓度对数值为横坐标，各对应浓度的抑制率(B/B₀％)为纵坐标，制作标准曲线。结果见图2。

3、样品精密度和准确度试验

准确度以回收率表示，精密度以变异系数表示。用阿奇霉素对牛奶、鸡肉样品进行添加回收，使终浓度为1.0μg/kg。每个浓度五个平行，抽取不同试剂盒测定，同一份样本测定3 次，分别计算测定样品回收率和变异系数。结果见表1。

表1回收率与变异系数测定

结果显示，添加1.0μg/kg阿奇霉素，牛奶样本的添加回收率均在93～107％之间，板内变异系数在3.2～3.9％之间，板间变异系数在3.9％之间，鸡肉样本的添加回收率均在89～111％之间，板内变异系数在2.3～4.9％之间，板间变异系数在5.7％之间。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒，包括96孔酶标板、酶标记抗体、阿奇霉素标准品、20×浓缩洗涤液、复溶液工作液、底物A液、底物B液、终止液，所述96孔酶标板上包被有阿奇霉素半抗原-载体蛋白，所述酶标记物浓缩液为辣根过氧化物酶标记的阿奇霉素特异性抗体。

2.如权利要求1所述的阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：阿奇霉素半抗原结构式为，

由以下步骤得到：

1)称取阿奇霉素1.0g，用20mL丙酮与20mL吡啶溶解，搅拌均匀；

2)称取马来酸酐0.5g加入步骤1)溶液，80℃条件下搅拌，反应6h后停止，蒸干后上硅胶柱，洗脱液为石油醚:乙酸乙酯＝1:1，分离纯化，得阿奇霉素半抗原。

3.如权利要求1或2所述的阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述阿奇霉素标准品浓度分别为0μg/L，0.02μg/L，0.06μg/L，0.18μg/L，0.54μg/L，1.62μg/L。

4.如权利要求1或2所述的阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：底物A液为过氧化氢，底物B液为TMB，所述终止液为2mol/L H₂SO₄。

5.如权利要求1或2所述的阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤液含2％吐温20，0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.0，所述百分比为质量体积比。

6.如权利要求1或2所述的阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述复溶液工作液为2％氯化钠溶液，所述百分比为质量体积比。

7.如权利要求1或2所述的阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述阿奇霉素特异性抗体由阿奇霉素半抗原-BSA偶联物作为免疫原制备得到。

8.一种将权利要求1～7任一项所述的阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒用于检测牛奶和鸡肉中阿奇霉素残留。

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