CN110596379B - 一种基于elisa的小分子检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子检测领域，涉及一种基于ELISA的小分子检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括：磷酸盐缓冲液、抗体A溶液、复合物溶液、显色溶液和至少一块酶联板；其中，所述抗体A溶液中的抗体A为所述小分子的特异性抗体；所述复合物溶液中的复合物为小分子与识别元件形成的复合物；所述酶联板中固定有预包被抗体B，所述抗体B为所述识别元件的特异性抗体。本发明的小分子的识别元件衍生物在溶液中而非固定化，可以更充分地暴露抗原表位，竞争反应可以更充分地进行，使得该竞争结合反应灵敏度更高。此外，基于预包被抗体可以实现不同待测物的通用性检测。
Description
技术领域
本发明属于分子检测领域，更具体地，涉及一种基于ELISA的小分子检测试剂盒和一种基于ELISA的小分子检测方法。
背景技术
在小分子检测领域，基于抗原抗体特异性识别原理的酶联免疫吸附检测(ELISA)试剂盒的测定原理是：将待测物特异性抗原预先固定到酶联板，在缓冲液体系下，样品中的待测小分子与固定化抗原竞争结合溶液中的标记抗体。酶标孔显色强度或者信号强度与待测小分子含量呈反比。
由于测定灵敏度高、特异性强，ELISA检测法在食品安全、临床医疗等多个领域已经得到越来越广泛的应用。
但是，传统ELSIA技术上存在一定的不足：1、待测物抗原固定化不利于竞争结合反应充分进行，限制了检测灵敏度。2、能够将高灵敏与通用性检测相结合的ELISA检测技术尚未见报道。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是针对现有ELISA试剂盒的不足，提供一种基于ELISA 的小分子检测试剂盒及检测方法。该检测试剂盒和检测方法具有灵敏性和通用性，应用范围广，具有广阔的市场前景。
为了实现上述目的，本发明提供一种基于ELISA的小分子检测试剂盒，该试剂盒包括：磷酸盐缓冲液、抗体A溶液、复合物溶液、显色溶液和至少一块酶联板；其中，
所述抗体A溶液中的抗体A为所述小分子的特异性抗体；
所述复合物溶液中的复合物为小分子与识别元件形成的复合物；
所述酶联板中固定有预包被的抗体B，所述抗体B为所述识别元件的特异性抗体。
现有小分子物质的检测方法多种，例如，通过酶联孔固定化复合物，与待测物竞争结合酶标记抗体经过显色反应，实现小分子物质的检测。而在实际应用中，该方法存在检测灵敏度与通用性难以融合的问题，经研究发现，由于待检测物质在酶联孔上预设的包被原导致免疫反应不够充分，进而影响其检测灵敏度。另外，由于包被原具有待检物特异性，因此使得 ELISA检测反应不具备通用性检测能力。
本发明将待检测物、抗体和复合物孵育，采用在非固定化条件下孵育的方式进行竞争结合反应，使得竞争反应进行更充分，测定灵敏度更高。并且，本发明中酶联孔中的包被原具有通用性识别能力，可以识别复合物中的识别元件，使得ELISA检测方法具备了通用性检测的特点。
本发明中，若待检测物中含有目标小分子，则得到的混合物包括抗体-小分子和抗体-小分子-识别元件；若待检测物中不含有目标小分子，则得到的混合物包括抗体-小分子-识别元件。本发明中的识别元件-小分子作为竞争性反应的原料，通过酶联孔的信号强度判断待检测物中小分子的含量，该方法更准确、更灵敏。本发明提供的小分子检测试剂盒，为小分子物质的通用性检测提供了平台。
根据本发明，所述识别元件优选为具有与目标小分子结合属性的通用性识别元件，采用通用性识别元件物质作为识别小分子物质的结合物质，使得本发明的试剂盒应用范围广。具体地，所述识别原件优选为卵清蛋白 (OVA)、血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA) 和鸡卵白蛋白(THY)中的至少一种。
本发明的试剂盒可用于多种类型目标小分子的检测，进一步地，所述小分子为有机磷类农药、三嗪类农药、拟除虫类农药、氨基甲酸酯类农药、磺胺药物、氯霉素类药物、四环素类药物、大环内酯类药物、氨基糖苷类药物、青霉素类药物、链霉素药物、三聚氰胺和黄曲霉类药物中的至少一种；优选地，所述小分子为三聚氰胺和/或黄曲霉毒素。
根据本发明，优选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.008-0.012mol/L， pH为7-8。
根据本发明，所述显色溶液可以为ELISA检测领域常用的显色体系，具体地，所述显色溶液包括含有酶标二抗的溶液和含有酶底物的溶液；进一步地，所述显色溶液为基于辣根过氧化酶的检测体系，即，所述酶优选为辣根过氧化酶(HRP)，所述酶标二抗为HRP标记的抗IgG抗体，所述酶底物为HRP底物。
根据本发明，试剂盒中采用抗体A溶液和复合物溶液，主要是用于独立储存，其浓度可根据需要设定，优选地，所述抗体A溶液中抗体A的浓度为0.5-5mg/mL；所述复合物溶液中复合物的浓度为0.5-5mg/mL。
本发明提供的试剂盒可以根据试验情况，制备标准曲线图，用于根据信号强度判断小分子物质的含量，也可以试剂盒携带标准曲线图，便于参照标准曲线图得到小分子物质的含量。优选地，所述试剂盒还包括：所述小分子的标准曲线图卡片。
本发明的试剂盒中，所述酶联板可以为一块或多块，优选地，所述酶联板有两块，一块用以进行待检测物、抗体和复合物的孵育反应，另一块用于预包被通用性识别元件并识别孵育产生的免疫复合物。
本发明的第二方面提供一种基于ELISA的小分子检测方法，该检测方法包括以下步骤：
(1)将待检测物、抗体A和复合物在缓冲体系中孵育，得到混合物；
所述抗体A为所述小分子的特异性抗体；
所述复合物为小分子与识别元件的复合物；
(2)将步骤(1)得到的所述混合物加入到固定有预包被抗体B的酶联板中，进行识别反应；
所述抗体B为所述识别元件的特异性抗体；
(3)向体系中加入显色溶液；
(4)根据步骤(3)的显色结果，判断待检测物中是否含有所述小分子，和/或，计算待检测物中所述小分子的含量。
根据本发明，所述检测方法还包括，采用上述方法检测一系列已知浓度的小分子标准品，并绘制小分子的浓度与显色信号强度或强度变化的标准曲线。本发明的方法可以检测含量很低的目标小分子，因此，所述一系列已知浓度的小分子标准品的浓度仅为0-2ng/mL即可。
本发明的方法中，在对待检测物进行检测时，含有目标小分子的待检测物、抗体和复合物可在无预包被的酶标板进行孵育，得到的混合物加入经预包被的酶联板中，若待检测物中含有目标小分子，得到的混合物包括抗体-小分子和抗体-小分子-识别元件，抗体-小分子-识别元件与预包被的抗识别元件的抗体结合，通过显色反应产生的酶标孔信号强度判断待检测物中小分子的含量。
根据本发明，所述识别元件优选为具有与目标小分子结合属性的通用性识别元件，采用通用性识别元件物质作为识别小分子物质的结合物质，使得本发明的试剂盒应用范围广。具体地，所述识别原件优选为卵清蛋白 (OVA)、血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA) 和鸡卵白蛋白(THY)中的至少一种。
本发明的方法可用于多种类型目标小分子的检测，进一步地，所述小分子为有机磷类农药、三嗪类农药、拟除虫类农药、氨基甲酸酯类农药、磺胺药物、氯霉素类药物、四环素类药物、大环内酯类药物、氨基糖苷类药物、青霉素类药物、链霉素药物、三聚氰胺和黄曲霉类药物中的至少一种；优选地，所述小分子为三聚氰胺和/或黄曲霉毒素。
根据本发明的方法，优选地，所述缓冲体系为磷酸盐缓冲液，进一步优选浓度为0.008-0.012mol/L、pH为7-8的磷酸盐缓冲液。
本发明的方法中，显色步骤可以采用传统ELISA操作中的显色方法，即，所述显色溶液包括含有酶标二抗的溶液和含有酶底物的溶液；优选为基于辣根过氧化物酶的显色方法，即，所述酶优选为辣根过氧化酶，所述酶标二抗为HRP标记的抗IgG抗体，所述酶底物为HRP底物。
根据本发明的方法，步骤(1)的缓冲体系中，各组分的浓度可基于本发明的原理确定，优选地，抗体A的浓度为1-20ng/mL，复合物的浓度为 80-120ng/mL。本发明的方法中，待检测物的体积百分比一般为1-10％。
根据本发明的方法，步骤(1)中，所述孵育的温度可以为25-40℃，优选为37℃；所述孵育的时间可以为5-20min。
根据本发明一种优选实施方式，所述待检测物为乳制品，所述检测方法包括对乳制品进行预处理。与传统乳制品需采用高速离心或稀释处理不同，采用本发明的方法，所述预处理的步骤可采用低速离心且无需稀释，具体地，所述预处理的步骤包括：将乳制品进行酸化处理，静置后低速离心，获得上清液；所述低速离心的转速可以为2000-5000rpm。
以识别元件为BSA为例，在实际检测中，发生下列反应：
待测物中目标分子与目标分子-BSA衍生物竞争结合一定含量的目标分子抗体，待测物中目标分子含量越多，所形成的目标分子-抗体免疫复合物就越多于目标分子-BSA-抗体形成的免疫复合物。酶联孔的BSA抗体与目标分子-BSA-抗体形成的免疫复合物相结合。由于抗体含量的多少决定酶标二抗的结合量以及显色后决定信号响应的强度，通过酶联孔信号的强度可判断待测物中目标分子的含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
(1)本发明中，竞争结合反应在预孵育步骤进行，相比现有技术中的酶联孔中固定化抗原与目标分子竞争结合抗体反应，本发明的小分子的识别元件衍生物在溶液中而非固定化，可以更充分地暴露抗原表位，竞争反应可以更充分地进行，使得该竞争结合反应灵敏度更高。
(2)本发明中，预包被的是通用性识别元件，具有较好的通用性，不因待测物的改变而改变，因此，本发明提供的检测方法及试剂盒的适用范围更广，通用性程度高。
(3)本发明实现了免疫反应的灵敏度、特异性与通用性的有机融合，实现待检测物的高灵敏度定量检测。
(4)本发明的试剂盒和检测方法可用于食品安全、临床诊断、检验检疫等诸多领域，具有广阔的市场前景。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为本发明实施例1涉及的小分子物质检测试剂盒的原理示意图；
图2为本发明实施例2中的标准曲线图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例以检测三聚氰胺MEL为例，用于说明本发明的试剂盒，其中，该试剂盒包括：
0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。
MEL抗体溶液：商购MEL抗体，并采用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液配制为溶液，其中MEL抗体的浓度为1mg/mL；
复合物溶液；通过商购获得复合物MEL-BSA，然后用0.01mol/L pH7.4 的磷酸盐缓冲液将其配制为MEL-BSA溶液，其中MEL-BSA的浓度为1 mg/mL。
显色溶液；包括信号物质(底物溶液)和相应的酶，信号物质选用商品化的HRP底物显色液，即含有过氧化氢的A液和含有四甲基联苯胺 (TMB)的显色剂B，酶选用辣根过氧化酶HRP。
两块酶联板，其中至少一块固定有预包被的BSA抗体，用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液将BSA抗体稀释到1μg mL-1，包被量为200μl/孔；将包被好的酶联孔置于37℃条件下反应2小时，然后4℃储存，备用。有效期12个月。
实施例2
本实施例以乳品中MEL的检测为例，用于说明本发明的检测方法。
1、制备标准曲线(以实施例1制得的试剂盒进行试验)：
(1)制备不同浓度的MEL标准品：0ng/mL、0.0195ng/mL、0.039 ng/mL、0.078ng/mL、0.156ng/mL、0.313ng/mL、0.6250ng/mL、1.25ng/mL；
(2)将终浓度为100ng/mL的MEL-BSA复合物溶液与不同浓度的 MEL标准品混合，在37℃条件下与MEL抗体(终浓度为10ng/mL)在空白酶标孔中孵育30min，形成两种免疫复合物：MEL-BSA-MEL抗体-HRP 标记抗体与MEL-MEL抗体-HRP标记抗体；
(3)孵育后，免疫复合物通过排枪转移至包被有BSA抗体的酶标孔中发生显色反应。免疫复合物中，MEL-BSA-MEL抗体-HRP标记抗体通过 BSA末端与包被的BSA抗体识别，然后加入终浓度为10ng/mL的HRP标记二抗和底物显色液反应10min，经过显色后加入2mol/L的H2SO4溶液终止反应，通过酶标仪对酶联孔信号强度进行定量判读，分析记录结果。
(4)得到的数据制得的标准曲线如图2所示。得到的拟合方程如下： y＝4.90+89.24/(x/0.033)^1.54。
从图2可以看出，最低检测浓度低于0.005ng/mL。
实施例3
对待检测样本(纯牛奶加入MEL)进行检测，步骤如下：
实施例1制得的试剂盒平衡至室温；
(1)MEL加标的纯牛奶混匀后用常见的酸化法进行前处理，酸化法处理步骤：1ml奶样经10mg三氯乙酸固体充分混合(500rpm)后静置1min； 3000rpm下离心1min，所得上清液用1mol/L NaOH溶液调整pH至7.0； 3000rpm离心1min，所得上清液进行免疫层析过程；
(2)奶样经前处理后所获得上清液在37℃条件下与MEL抗体及 MEL-BSA在空白酶标板中孵育30min，各组分具体用量同实施例2；形成的免疫复合物加入预包被了抗BSA抗体的酶联孔进行反应，反应温度为 37℃，反应时间为30min，然后加入HRP标记的二抗和HRP底物显色液A 与B，经过显色后加入2mol/L H2SO4终止显色反应，通过酶标仪对酶联孔信号强度进定量判读。根据实施例2中的标准曲线计算奶样中MEL的含量，检测结果如表1所示。
表1样品检测结果
a均数±标准差
从该检测结果可以看出，本发明提供的试剂盒检测准确度高。
另外，需要说明的是，传统奶样前处理包括高速离心，需12000rpm离心15min，或者对奶样进行5倍稀释；本发明采用酸化法处理后，离心可以在低速下实现，并且无需稀释，更利于现场检测中使用，并且避免了稀释带来的检测灵敏度下降与假阴性的出现。
以上实施例对本发明提供的通用性ELISA试剂盒和检测方法进行了详细介绍。本发明所述通用性ELISA试剂盒可针对添加剂、毒素、激素、抗生素、农药等小分子进行检测，可用于食品安全、临床诊断等领域。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
Claims (13)
1.一种基于ELISA的小分子检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：磷酸盐缓冲液、抗体A溶液、复合物溶液、显色溶液和至少一块酶联板；其中，
所述抗体A溶液中的抗体A为所述小分子的特异性抗体；
所述复合物溶液中的复合物为小分子与识别元件形成的复合物；
所述酶联板中固定有预包被的抗体B，所述抗体B为所述识别元件的特异性抗体；
所述显色溶液包括含有酶标二抗的溶液和含有酶底物的溶液；所述酶为辣根过氧化酶；
所述抗体A溶液中抗体A的浓度为0.5-5mg/mL；
所述复合物溶液中复合物的浓度为0.5-5mg/mL；
所述识别元件为通用性识别元件。
2.根据权利要求1所述的基于ELISA的小分子检测试剂盒，其中，所述识别元件为卵清蛋白、血蓝蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白和鸡卵白蛋白中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的基于ELISA的小分子检测试剂盒，其中，所述小分子为有机磷类农药、三嗪类农药、拟除虫类农药、氨基甲酸酯类农药、磺胺药物、氯霉素类药物、四环素类药物、大环内酯类药物、氨基糖苷类药物、青霉素类药物、链霉素药物、三聚氰胺和黄曲霉类药物中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的基于ELISA的小分子检测试剂盒，其中，所述小分子为三聚氰胺和/或黄曲霉毒素。
5.根据权利要求1所述的基于ELISA的小分子检测试剂盒，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.008-0.012mol/L，pH为7-8。
6.根据权利要求1所述的基于ELISA的小分子检测试剂盒，其中，所述试剂盒还包括：所述小分子的标准曲线图卡片。
7.一种基于ELISA的小分子检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：
(1)将待检测物、抗体A和复合物在缓冲体系中孵育，得到混合物；
所述抗体A为所述小分子的特异性抗体；
所述复合物为小分子与识别元件形成的复合物；所述识别元件为通用性识别元件；
步骤(1)的缓冲体系中，抗体A的浓度为1-20ng/mL，复合物的浓度为80-120ng/mL，待检测物的体积百分比为1-10％；
(2)将步骤(1)得到的所述混合物加入到固定有预包被抗体B的酶联板中，进行识别反应；
所述抗体B为所述识别元件的特异性抗体；
(3)向体系中加入显色溶液；所述显色溶液包括含有酶标二抗的溶液和含有酶底物的溶液；所述酶为辣根过氧化酶；
(4)根据步骤(3)的显色结果，判断待检测物中是否含有所述小分子，和/或，计算待检测物中所述小分子的含量。
8.根据权利要求7所述的基于ELISA的小分子检测方法，其中，所述检测方法还包括，采用权利要求7所述的方法检测一系列已知浓度的小分子标准品，并绘制小分子的浓度与显色信号强度或强度变化的标准曲线；所述一系列已知浓度的小分子标准品的浓度为0-2ng/mL。
9.根据权利要求7所述的基于ELISA的小分子检测方法，其中，
所述小分子为有机磷类农药、三嗪类农药、拟除虫类农药、氨基甲酸酯类农药、磺胺药物、氯霉素类药物、四环素类药物、大环内酯类药物、氨基糖苷类药物、青霉素类药物、链霉素药物、三聚氰胺和黄曲霉类药物中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的基于ELISA的小分子检测方法，其中，所述识别性元件为卵清蛋白、血蓝蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白和鸡卵白蛋白中的至少一种；
所述小分子为三聚氰胺和/或黄曲霉毒素。
11.根据权利要求7所述的基于ELISA的小分子检测方法，其中，
所述缓冲体系为磷酸盐缓冲液；
步骤(1)中，所述孵育的温度为25-40℃；所述孵育的时间为5-20min。
12.根据权利要求11所述的基于ELISA的小分子检测方法，其中，所述缓冲体系为浓度为0.008-0.012mol/L、pH为7-8的磷酸盐缓冲液。
13.根据权利要求7所述的基于ELISA的小分子检测方法，其中，
所述待检测物为乳制品，所述检测方法包括对乳制品进行预处理，所述预处理的步骤包括：将乳制品进行酸化处理，静置后低速离心，获得上清液；
所述低速离心的转速为2000-5000rpm。
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