CN102401830A - 一种食品防腐剂-乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的一种食品防腐剂-乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法，用乳酸链球菌素作为抗原进行动物免疫得到多克隆抗体，以乳酸链球菌素半抗原与卵清蛋白ＯＶＡ的偶联物作为包被抗原，以乳酸链球菌素为标准品，建立免疫检测及对食品样品的处理方法，提供其方法的载体试剂盒。该检测方法的构建包括：对检测样品的处置；包被抗原的制备；多克隆抗体的制备及竞争反应；加酶标二抗、显色等。获得的检测试剂盒包括：包被原的酶标板1块；酶标二抗工作液1瓶；抗体工作液1瓶；乳酸链球菌素标准品溶液6瓶；底物显色液2瓶；终止液1瓶；浓缩洗涤液1瓶；复溶工作液1瓶。

Description

一种食品防腐剂-乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术，获取的食品天然防腐剂—乳酸链球菌素酶联免疫检测方法，尤其适用于乳制品及饮料与肉制品中的乳酸链球菌素含量的测定。 

背景技术

乳酸链球菌素（Nisin）是从乳酸乳球菌或乳酸链球菌发酵产物中提制的一种多肽抗菌素类物质，是一种世界公认的安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂。我国于1990年开始批准使用Nisin，到目前为止，全世界约有50多个国家和地区广泛使用Nisin。 

Nisin是由34个氨基酸组成的多肽，其分子量为3510，属于羊毛硫抗生素（Lantibiotics）,活性部位含有大量的稀有氨基酸，包括羊毛硫氨酸、β-甲基羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸、β-甲基脱氢丙氨酸等一些非编码的氨基酸。Nisin的活性分子常以二聚体和四聚体的形式存在，其分子量为7000和14000。 

乳酸链球菌素能有效杀死或抑制引起食品腐败变质的革兰氏阳性菌，特别是细菌孢子：如葡萄球菌、链球菌、乳杆菌、小球菌、明串珠菌、芽孢杆菌等，对乳酸链球菌素很敏感。 

乳酸链球菌素定量分析的最初测定的方法为1934年Cox GA等人建议采用的甲基蓝还原法，后来相继开发了用于Nisin定量的生物分析方法，包括试管稀释法、浊度分析法、琼脂扩散法、ATP生物发光测定法、绿光荧光蛋白测定法和微量滴定法等。1990年Falahee发展了多克隆抗血清分析乳酸链球菌素的酶联免疫分析法。1996年Suacrez,Rodriguez设计了多克隆抗体酶联免疫吸附法。Bouksaim报道多克隆抗体的酶联免疫分析法。 

目前，我国关于乳酸链球菌素的测定有两种方法，其一是琼脂扩散法，该方法是依据企业标准QB 2394-2007《 食品添加剂 乳酸链球菌素》，采用琼脂扩散法的原理在琼脂表面利用检测菌的生长显示抑菌效果，由抑菌圈直径及标准效价换算出效价，确定其含量，由于该方法具有灵敏度低、无法精确定量、易受干扰因素的影响、易于污染环境等缺点，不易于各检测机构推广使用。其二是液相色谱法，经查2010年建立了液相色谱检测方法并申请了专利，该方法由于所需仪器及耗材均较昂贵，检出限低，且耗时长，不易大范围推广。本次文献检索披露的内容有《天然防腐剂—乳酸链球菌素》）（中国食品与营养，2008年第4期）和《乳酸链球菌素检测技术的研究进展》(中国食品添加剂，2008年第5期)。 

本发明所建立的食品中乳酸链球菌素酶联免疫快速检测方法，既定性也能够定量，是目前国际公认的用于测定食品中添加剂含量的方法，具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高、快速简便、无污染、重现性好等特点，适宜普遍推广和应用。 

发明内容

本发明的目的在于：提供乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法及试剂盒为食品安全保驾护航，所建立的简单、敏感、直接的免疫学方法有重要的实践意义。 

本发明目的是这样实现的：一种食品防腐剂-乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法，用乳酸链球菌素作为抗原进行动物免疫得到多克隆抗体，以乳酸链球菌素半抗原与卵清蛋白ＯＶＡ的偶联物作为包被抗原，以乳酸链球菌素为标准品，构建免疫检测及对样品的处置方法，即获取该方法的载体试剂盒； 

1）检测方法的构建：

包被抗原的制备：用pH值为9.6 的0.01-0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释包被抗原1000倍，加入酶标板，每孔100μl，37℃孵育2h，倾去包被液，用含有0.05%₀叠氮化钠、0.1%明胶和0.05%吐温的磷酸盐缓冲液，即0.02M、pH 7.4，洗涤2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150μl封闭液，即0.1%₀叠氮化钠和10%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存；

多克隆抗体的制备：将1.0mg/ml的乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏佐剂混合均匀，对首次免疫的兔子实施颈背部皮下多点注射，每点0.2ml；第二次免疫，将1.0mg/ml乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏不完全佐剂混合均匀，对兔子实施颈背部皮下多点注射，每点0.2ml；每次注射间隔2周，采血检测抗血清效价，直到抗体效价大于1：3000为止；

竞争反应：用0.1%牛血清白蛋白的0.03-0.06mol/L的磷酸盐缓冲液，对乳酸链球菌素的标准品实施梯度稀释，其梯度为0.1、0.5、2.5、12.5、62.5μg/ml，每孔加50μl；将制备的多克隆抗体以2.5%酪蛋白的磷酸盐缓冲液按1：1000比例稀释后加入，每孔加入50μl，37℃温育30min，然后用PBST洗涤3-5次；

加酶标二抗：将0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体以１：5000稀释后加入，每孔加入100μl，37℃，30min后，用PBST洗涤3-5次；

显色：每孔加入显色液100μl，37℃显色15min；最后每孔加入终止液２M硫酸溶液50μＬ；用酶标仪450nm测吸光值A₄₅₀，与所作标准曲线对比算出待测样品的乳酸链球菌素的含量；

上述乳酸链球菌素标准品购置于 sigma公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体购置于 Jackson ImmnoResearch LABORATORIES,INC；

2）对检测样品的处置：

乳饮料：将0.1%牛血清白蛋白的0.03-0.06mol/L磷酸盐缓冲液，即为复溶工作液，对样品处置，即稀释10倍；

肉制品：将样品制成粉末状，取1g样品置于50ml离心管里，加入5ml的复溶工作液，充分震荡混匀，后静置10min，提取上清1-2ml，用于分析。

所述的酶联免疫检测方法，该方法的检测试剂盒包括： 

1）包被原的酶标板1块，其包被原为乳酸链球菌素与载体蛋白偶联物；

2）酶标二抗工作液1瓶，其工作液用0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液稀释5000倍的酶标二抗获取，7ml/瓶；

3）抗体工作液1瓶，其工作液用2.5%酪蛋白的磷酸盐缓冲液稀释1000倍的抗体获取，8ml/瓶；

4）乳酸链球菌素标准品溶液，共6瓶，浓度分别为0mg /L，0.1mg/L，0.5mg/L，2.5mg/L，12.5mg/L，62.5mg/L；

5）底物显色液2瓶，由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，7ml/瓶；底物显色液B液为四甲基联苯胺，7ml/瓶；

6）终止液1瓶，含1-2mol/L硫酸，7ml/瓶；

7）浓缩洗涤液1瓶，含0.05%吐温、0.1% 明胶、0.05%叠氮钠的磷酸盐缓冲液0.02M、pH 7.4，40ml/瓶；

8）复溶工作液1瓶， 50ml/瓶。

本发明方法的检测原理：在酶标板微孔条上预包被乳酸链菌素与载体蛋白的偶联物，加入样品溶液或标准品溶液后，再加入乳酸链球菌素抗体溶液，样品中的乳酸链球菌素或标准品与酶标板上包被的乳酸链球菌素偶联抗原竞争乳酸链球菌素抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样品吸光值与样品中乳酸链球菌素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样品中乳酸链球菌素的含量，同时也可根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度乳酸链球菌素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中乳酸链球菌素含量的浓度范围。 

本发明构建并实现的定量检测食品中乳酸链球菌素的快速检测方法—酶联免疫法及市场销售的试剂盒，填补了国内的空白，为行业的食品检测提供了快速精准的检测新产品，彰显技术进步。 

  

附图说明

本发明对照说明书附图作进一步说明。 

附图1 为乳酸链球菌素的标准曲线图； 

如图所示： X轴为浓度的半对数值，Y轴为百分吸光度值。

附图2为技术路线实施示意图； 

如图所示：本技术路线以乳酸链球菌素为免疫原制得了高效价的抗乳酸链球菌素的多克隆抗体，以乳酸链球菌素与卵清蛋白的偶联物作为包被原建立了间接竞争酶联免疫方法，用此方法检测乳制品及肉制品中的乳酸链球菌素。

  

具体实施方式

本发明对照实施例作进一步说明。 

本发明方法的实施步骤： 

1）检测方法的构建：

包被抗原的制备：用pH值为9.6 的0.03mol/L的碳酸盐缓冲液稀释包被抗原1000倍，加入酶标板，每孔100μl，37℃孵育2h，倾去包被液，用含有 0.05%₀叠氮化钠、0.1%明胶和0.05%吐温的磷酸盐缓冲液，即0.02M、pH 7.4，洗涤2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150μl封闭液，即0.1%₀叠氮化钠和10%（质量百分含量）牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存； 

乳酸链球菌素多克隆抗体的制备：取1.0mg/ml的乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏佐剂(自配，液体石蜡与羊毛脂混合液，组分比为2：1，加10mg/ml卡介苗)混匀，首次免疫时每只兔子2.0ml，颈背部皮下多点注射，每点0.2ml，第二次免疫时取乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏不完全佐剂（自配，液体石蜡与羊毛脂混合液，组分比为2：10）混匀，每只兔子2.0ml，颈背部皮下多点注射，每点0.2ml。每次注射间隔2周，免疫期间采血，检测抗血清效价，连续加强免，直到获得满意的抗体效价（大于1：3000）为止。最后一次无佐剂用1.0mg抗原直接腹腔注射。

竞争反应：用0.1%牛血清白蛋白的0.04mol/L的磷酸盐缓冲液，对乳酸链球菌素的标准品实施梯度稀释，其梯度为0.1、0.5、2.5、12.5、62.5μg/ml，每孔加50μl；将制备的多克隆抗体以2.5%酪蛋白的磷酸盐缓冲液按1：1000比例稀释后加入，每孔加入50μl，37℃温育30min，然后用PBST洗涤4次； 

加酶标二抗：将0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体以１：5000稀释后加入，每孔加入100μl，37℃，30min后，用PBST洗涤5次；

显色：每孔加入显色液100μl，37℃显色15min；最后每孔加入终止液２M硫酸溶液50μＬ；用酶标仪450nm测吸光值A₄₅₀，与所作标准曲线对比算出待测样品的乳酸链球菌素的含量；

其中选用的乳酸链球菌素标准品购置于 sigma公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体购置于 Jackson ImmnoResearch LABORATORIES,INC。

2）检测样品的处理：                                                             

乳饮料：用复溶工作液将样品稀释10倍，其中含0.1%牛血清白蛋白的0.06mol/L的磷酸盐缓冲液即为复溶工作液；

肉制品：将样品剁碎成粉末状，取1g样品至50ml离心管里，加入5ml的复溶工作液，充分震荡混匀后静置10min，小心的提取上清2ml用于分析，注意不要吸到表层的油脂和底层的沉淀。

3）酶联免疫试剂盒的制备；以乳酸链球菌素与卵清蛋白的偶联物为包被原的酶联免疫试剂盒包括： 

<1>包被原的酶标板1块，其包被原为乳酸链球菌素与载体蛋白偶联物；

<2>乳酸链球菌素标准品溶液共6瓶，浓度分别为0 mg /L（mg/kg），0.1 mg /L（mg/kg），0.5 mg /L（mg/kg），2.5 mg /L（mg/kg），12.5 mg /L（mg/kg），62.5 mg /L（mg/kg）;

<3>底物显色液共2瓶：底物显色液由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，1瓶，7ml/瓶；底物显色液B液为四甲基联苯胺，1瓶，7ml/瓶;

<4>乳酸链球菌素抗体工作液1瓶：抗体稀释液为含有2.5%（质量百分含量）酪蛋白的磷酸盐缓冲液，抗体工作液稀释浓度为1：1000，8ml/瓶；

<5>辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体工作液1瓶：酶标二抗稀释液为含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，羊抗兔抗抗体稀释浓度为1:5000（质量百分含量）,7ml/瓶；  

<6>浓缩洗涤液1瓶：含0.05%吐温、0.1% 明胶、0.05%（质量百分含量）叠氮钠的磷酸盐缓冲液（0.02M、pH 7.4）；40ml/瓶；

<7>终止液1瓶：含有2mol/L硫酸， 7ml/瓶；

<8>复溶工作液1瓶：含0.1%（质量百分含量）牛血清白蛋白的0. 06mol/L磷酸盐缓冲液，50ml/瓶。

4）采用试剂盒对样品中乳酸链球菌素含量的检测： 

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测乳酸链球菌素的含量；

向包被有乳酸链球菌素与卵清蛋白偶联物的酶标板微孔中加入乳酸链球菌素标准品溶液或样品溶液50μl，再加入乳酸链球菌素抗体工作液50μl，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min；倒出孔中液体，每孔加入250μl洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干；每孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体工作液100ml，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤；每孔加入底物显色液A液过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺（TMB），各50μl，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min，每孔加入2mol/L终止液硫酸 50ml，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值。

所获得的每个浓度标准品溶液或样品吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100％，即为百分吸光度值。 

公式：百分吸光度值（%）＝  B/B₀×100％ 

公式中B为标准品溶液或样品溶液的平均吸光度值，B₀为0mg/L标准品溶液的平均吸光度值。

以乳酸链球菌素标准品浓度（mg/L）的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，如图1所示；相对应每一个样品中乳酸链球菌素的浓度可以从标准曲线上读出，用同样的方法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，则可从标准曲线上读出样品中乳酸链球菌素的含量。 

将附图1中各个标准品浓度对应的吸光度的平均值列表，见表1。

本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度；还可以利用计算机专业软件实施快速分析，整个检测过程只需1.5小时。 

例如：检测火腿肠样品中乳酸链球菌素含量 

将火腿肠剁碎成粉末状，取1g样品至50ml离心管里，加入5ml的复溶工作液，充分震荡混匀，后静置10min，小心的提取上清1ml至2ml离心管里用于分析，注意不要吸到表层的油脂和底层的沉淀；

取两条酶标板，做好标记后，加标准品/样本各50μl到对应的板孔中，然后每孔加50μl抗体工作液，37℃反应30min，洗板4-5次；每孔加酶标二抗100μl，37℃反应30min，洗板4-5次；加底物显色液A液和B液各50μl到每个孔中，37℃反应15min，终止，读出每孔的吸光度值，各孔标记及吸光度值如        表2所示。

带入计算软件，得到标准曲线1图： 

标准曲线回归方程为：y=-0.277x+0.544；

样品的OD值的平均值为1.122，除以0标准品的OD值；

即样品百分吸光度值（%）＝1.122/2.152×100％=52. 14%，将52.14%带入回归方程，52.14%=-0.277x+0.544  得x=0.08，即log（样品浓度）=0.08，计算出样品浓度为0.9mg/kg，乘以其稀释倍数=0.9×5=4.5 mg/kg，所得样品含量为4.5 mg/kg。

5）检测方法的性能验证： 

评价竞争酶联免疫吸附试验反应灵敏度的方法，常用的有IC₅₀抑制浓度（指0标准溶液吸光度值的50%处所对应的标品浓度）和最低检测限，两者值越低说明试剂盒的灵敏度越高。

IC₅₀值与抗体和酶结合物的质量及检测方法有关，分别测定20次标准曲线的IC₅₀抑制浓度，确定该值浮动范围，测定结果见表3。 

由上表数据得知：统计IC₅₀二十次测定结果，IC₅₀平均值为1.16 mg /L，浮动范围在1.0 mg /L -1.4 mg /L之间。经计算IC₅₀的平均值±3倍标准差的范围为0.8 mg /L -1.5 mg /L；因此确定标准曲线IC₅₀应在0.8 mg /L -1.5 mg /L的范围之内。 

最低检测限为乳酸链球菌素试剂盒测定实际样本的最小可检出量，结果见表4、表 5。 

6）检测精密度和准确度的验证： 

取空白肉制品样品以0.5 mg /kg、10 mg /kg和100 mg /kg乳酸链球菌素进行添加，取空白乳制品样品以1 mg /L、30 mg /L和300 mg /L乳酸链球菌素进行添加，每种样品、每个浓度各5个平行，用试剂盒提供的操作方法提取测定；抽取三批试剂盒，每批试剂盒测定同一份样品3次，分别计算测定样品的回收率、板内、批内、批间变异系数，结果见表6、表7。

  

Claims (2)

1.一种食品防腐剂-乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法，其特征在于：用乳酸链球菌素作为抗原进行动物免疫得到多克隆抗体，以乳酸链球菌素半抗原与卵清蛋白ＯＶＡ的偶联物作为包被抗原，以乳酸链球菌素为标准品，构建免疫检测及对样品的处置方法，即获取该方法的载体试剂盒；

1）检测方法的构建：

包被抗原的制备：用pH值为9.6 的0.01-0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释包被抗原1000倍，加入酶标板，每孔100μl，37℃孵育2h，倾去包被液，用含有 0.05%₀叠氮化钠、0.1%明胶和0.05%吐温的磷酸盐缓冲液，即0.02M、pH 7.4，洗涤2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150μl封闭液，即0.1%₀叠氮化钠和10%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存；

多克隆抗体的制备：将1.0mg/ml的乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏佐剂混合均匀，对首次免疫的兔子实施颈背部皮下多点注射，每点0.2ml；第二次免疫，将1.0mg/ml乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏不完全佐剂混合均匀，对兔子实施颈背部皮下多点注射，每点0.2ml；每次注射间隔2周，采血检测抗血清效价，直到抗体效价大于1：3000为止；

竞争反应：用0.1%牛血清白蛋白的0.03-0.06mol/L的磷酸盐缓冲液，对乳酸链球菌素的标准品实施梯度稀释，其梯度为0.1、0.5、2.5、12.5、62.5μg/ml，每孔加50μl；将制备的多克隆抗体以2.5%酪蛋白的磷酸盐缓冲液按1：1000比例稀释后加入，每孔加入50μl，37℃温育30min，然后用PBST洗涤3-5次；

加酶标二抗：将0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体以１：5000稀释后加入，每孔加入100μl，37℃，30min后，用PBST洗涤3-5次；

显色：每孔加入显色液100μl，37℃显色15min；最后每孔加入终止液２M硫酸溶液50μＬ；用酶标仪450nm测吸光值A₄₅₀，与所作标准曲线对比算出待测样品的乳酸链球菌素的含量；

上述乳酸链球菌素标准品购置于 sigma公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体购置于 Jackson ImmnoResearch LABORATORIES,INC；

2）对检测样品的处置：

乳饮料：将0.1%牛血清白蛋白的0.03-0.06mol/L磷酸盐缓冲液，即为复溶工作液，对样品处置，即稀释10倍；

肉制品：将样品制成粉末状，取1g样品置于50ml离心管里，加入5ml的复溶工作液，充分震荡混匀，后静置10min，提取上清1-2ml，用于分析。

2.根据权利要求1所述的酶联免疫检测方法，其特征在于：该方法的检测试剂盒包括：

1）包被原的酶标板1块，其包被原为乳酸链球菌素与载体蛋白偶联物；

2）酶标二抗工作液1瓶，其工作液用0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液稀释5000倍的酶标二抗获取，7ml/瓶；

3）抗体工作液1瓶，其工作液用2.5%酪蛋白的磷酸盐缓冲液稀释1000倍的抗体获取，8ml/瓶；

4）乳酸链球菌素标准品溶液，共6瓶，浓度分别为0mg /L，0.1mg/L，0.5mg/L，2.5mg/L，12.5mg/L，62.5mg/L；

5）底物显色液2瓶，由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，7ml/瓶；底物显色液B液为四甲基联苯胺，7ml/瓶；

6）终止液1瓶，含1-2mol/L硫酸，7ml/瓶；

7）浓缩洗涤液1瓶，含0.05%吐温、0.1% 明胶、0.05%叠氮钠的磷酸盐缓冲液0.02M、pH 7.4，40ml/瓶；

8）复溶工作液1瓶， 50ml/瓶。

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